接种菌剂玉米的根际原核微生物多样性检测方法与流程

本发明涉及的是一种土壤微生物检测领域的技术，具体是一种基于16srdna高通量测序检测施加巨大芽孢杆菌菌剂的玉米根际原核微生物多样性的方法。

背景技术：

根际微生物指在植物根系周围，受根系生长影响的土体中的微生物。根际微生物同土壤和植物根际相互作用，能够直接影响土壤的生物化学活性、土壤养分的组成和转化以及植物的生长。因此，根际微生物多样性是土壤理化性质的重要生物指标之一。研究植物根际细菌群落结构能够反映土壤肥力高低，从而揭示施加微生物菌剂对植物根际微环境的影响。

技术实现要素：

本发明针对现有技术检测通量低、规模小、精确度低、覆盖度低等不足，，提出一种玉米根际原核微生物多样性检测方法，利用了16srdna高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势，实现菌剂对根际土壤原核微生物群落影响的准确评估。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种接种菌剂玉米的根际原核微生物多样性检测方法，通过从种植有玉米幼苗的根际土壤中提取宏基因组dna，通过pcr扩增其中的16srdna的v4v5高变区片段以构建文库；经过双端测序后进行分类学单元(otu)分类，与文库进行对比和注释，最后通过根际土壤原核微生物的群落结构分析，比较不同处理之间的异同，具体为：alpha多样性分析、分类学组成分析和beta多样性分析，得到微生物群体分类。

所述的宏基因组dna，采用omegasoildnakit试剂盒提取得到。

所述的土壤，其中含有不同硝态氮浓度且施加有巨大芽孢杆菌nct-2菌剂；

所述的土壤，优选在种植有玉米幼苗35天后将玉米植株连根从土中取出，用抖根法收集根际土，混合均匀并去除根毛，于-80℃保存。

所述的巨大芽孢杆菌nct-2菌剂，通过将58.9％的巨大芽孢杆菌nct-2发酵液与23.5％的秸秆粉和17.6％的葡萄糖混匀得到。

所述的不同硝态氮浓度，采用但不限于：22mg/kg、72mg/kg、122mg/kg；优选以高温灭菌的巨大芽孢杆菌nct-2制成对比菌剂，即n1号菌剂：含nct-2菌剂2+22mg/kg硝态氮、n2号菌剂：含nct-2菌剂且配有72mg/kg硝态氮、n3号菌剂：含nct-2菌剂且配有122mg/kg硝态氮、s1号菌剂：含nct-2灭菌菌剂且配有22mg/kg硝态氮、s2号菌剂：含有nct-2灭菌菌剂且配有72mg/kg硝态氮、s3号菌剂：含nct-2灭菌菌剂且配有122mg/kg硝态氮。

所述的巨大芽孢杆菌nct-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.4698。；

所述的秸秆粉取自水稻秸秆，经粉碎后长度小于0.5cm且含水率低于20％。

所述的混匀是指：混合后的菌剂随机选取5个点的样品检测葡萄糖含量，各点之间的葡萄糖含量应无显著差异。

所述的pcr扩增，选用特异性引物515f，如seqidno.1所示和907r，如seqidno.2所示分别作为前引物和后引物做pcr扩增所述宏基因组dna中16srdna的v4v5高变区片段以构建文库；

所述的特异性引物具体为：前引物515f序列为5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3’，后引物907r序列为5’-ccgtcaattcmtttragttt-3’。

所述的双端测序，采用illumina公司的truseqnanodnaltlibraryprepkit制备测序文库，将合格的测序文库使用miseq测序仪进行2×300bp的双端测序；

所述的分类，通过原始下机数据根据序列质量进行筛查、处理和质量控制，对获得的高质量序列进行otu归并划分。

技术效果

与现有技术相比，本发明能够准确检测接种菌剂作物的根际微生物群落组成、结构、多样性及相对丰度差异，是判断和评价菌剂对土壤微环境影响的重要基础，也是评估菌剂功效的重要基础，本发明检测大规模、高通量，可以检测到土壤中的绝大部分不可培养的原核微生物种类，更加直接、原位地研究巨大芽孢杆菌菌剂对于不同浓度硝酸盐土壤原核微生物群落组成、结构和多样性的影响。

附图说明

图1为实施例中样品宏基因组dna电泳图谱；

图中：m：dl1,5000dnamarker；1-3：原始土壤；4-6：s1处理；7-9：s2处理；10-12：s3处理；13-15：n1处理；16-18：n2处理；19-21：n3处理。

图2为实施例中otu划分和分类地位鉴定结果统计图。

图3为实施例中各分类水平的微生物类群数统计图。

图4为实施例中门水平的群落分类学组成和丰度分布图。

图5为实施例中pca分析的样本二维排序图。

具体实施方式

本实施例包括以下步骤：

步骤1)58.9％的巨大芽孢杆菌nct-2发酵液与23.5％的秸秆粉和17.6％的葡萄糖混匀，制备巨大芽孢杆菌nct-2菌剂，并施用于三种硝态氮浓度的土壤中，三种硝态氮浓度分别为22mg/kg、72mg/kg、122mg/kg。巨大芽孢杆菌nct-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno.4698。

步骤2)将玉米幼苗种植于装有上述土壤的盆中，每盆一棵，并以高温灭菌的巨大芽孢杆菌nct-2制成菌剂作为对照处理。共包含6个不同的处理，分别为n1号菌剂：含nct-2菌剂且配有22mg/kg硝态氮、n2号菌剂：含nct-2菌剂且配有72mg/kg硝态氮、n3号菌剂：含nct-2菌剂且配有122mg/kg硝态氮、s1号菌剂：含nct-2灭菌菌剂且配有22mg/kg硝态氮、s2号菌剂：含有nct-2灭菌菌剂且配有72mg/kg硝态氮、s3号菌剂：含nct-2灭菌菌剂且配有122mg/kg硝态氮。；

步骤3)35天后将玉米植株连根从土中取出，用抖根法收集根际土，混合均匀并去除根毛，于-80℃保存；

步骤4)用omegasoildnakit试剂盒提取上述根际土壤样品中的宏基因组dna，如图1所示。

步骤5)选用特异性引物515f和907r分别作为前引物和后引物做pcr扩增所述宏基因组dna中16srdna的v4v5高变区片段以构建文库，前引物515f序列为5’-gtgccagcmgccgcggtaa-3’，后引物907r序列为5’-ccgtcaattcmtttragttt-3’；

步骤6)采用illumina公司的truseqnanodnaltlibraryprepkit制备测序文库，具体包括：

6.1)末端修复过程:利用试剂盒中的endrepairmix2将dna5’端突出的碱基切除，3’端缺失的碱基补齐，同时在5’端加上一个磷酸基团将合格的测序文库使用miseq测序仪进行2×300bp的双端测序；

6.2)3’端加a，在这一过程中，dna的3’端会单独加上一个a碱基，以防止dna片段的自连，同时保证dna与3’端有一个突出t碱基的测序接头相连；

6.3)加一个有特异性标签的接头，此过程是为了让dna最终杂交到flowcell上；

6.4)通过pcr扩增已经加上接头的dna片段，然后利用beckmanampurexpbeads纯化pcr体系；

6.5)通过2％琼脂糖凝胶电泳来对文库做最终的片段选择与纯化。

步骤7)对合格的文库，在miseq机器上利用miseqreagentkitv3号菌剂：含600cycles)进行2×300bp的双端测序。首先将需要上机的文库(index不可重复)梯度稀释到2nm，然后按所需数据量比例混样。混好的文库经0.1nnaoh变性成单链进行上机测序。

步骤8)原始下机数据根据序列质量进行筛查、处理和质量控制，运用qiime软件识别疑问序列。随后，通过qiime软件调用usearch检查并剔除嵌合体序列。

步骤9)使用qiime软件，调用uclust这一序列比对工具，对前述获得的高质量序列按97％的序列相似度进行归并和otu划分，并选取每个otu中丰度最高的序列作为该otu的代表序列。通过与greengenes数据库对比，对otu进行注释,得到out划分和分类地位鉴定结果，如图2所示。

步骤10)使用qiime软件分别对每个样本计算四种alpha多样性指数：体现群落丰富度chao1指数和ace指数，以及兼顾群落均匀度的shannon指数和simpson指数。

步骤11)根据otu划分和分类地位鉴定结果，可以获得每个样本在各分类水平的具体组成，使用r软件将上述数据绘制成柱状图，以直观地比较不同样本在同一水平的分类单元数的差异，如图3所示。

步骤12)使用r软件，获取各样本在门水平上的组成和丰度分布表，并通过柱状图呈现分析结果，如图4所示。

步骤13)beta多样性分析的主要目的是考察不同样本之间群落结构的相似性。通过r软件，对属水平的群落组成结构进行pca分析，并且以二维图像描述样本间的自然分布特征，如图5所示。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110>上海交通大学

<120>接种菌剂玉米的根际原核微生物多样性检测方法

<130>f-b016e

<141>2017-11-21

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>前引物515f()

<400>1

gtgccagcmgccgcggtaa19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>后引物907r()

<400>2

ccgtcaattcmtttragttt20