本发明属于基因工程领域，更具体地说，crispr-cas9靶向敲除人乳腺癌细胞rassf2基因及其特异性的sgrna。
背景技术：
rassf2(rasassociationdomainfamily2),属于rassf家族成员，该基因位于人类基因组20pl3，全长约43.6kb，编码蛋白约37.8kd，蛋白表达主要富集在核内。1996年，nagase等在研究人类编码区时发现了40个未被鉴定过的cdna克隆片段，于是将这40个转录本命名为kiaa0161200。在对其中一个命名为kiaa0168的研究过程中发现其编码序列中含有rassf家族成员特有的ra结构域，由此将这段基因命名为rassf2。
在人类基因组中，启动子区中cpg岛的去甲基化状态是基因转录所必须的。rassf2的肿瘤抑制功能的丧失，主要是由于rassf2基因启动子区域发生cpg岛的甲基化，导致rassf2的转录活性降低或者丧失。最终导致rassf2的肿瘤抑制功能降低。目前，研究发现，在人类肿瘤组织中，与正常组织比较，rassf2的甲基化水平明显高于正常组织，并且在不同的肿瘤细胞系中也发现了同样的现象。
乳腺癌是威胁女性生命健康的一大疾病,探讨其发病机制寻找有效预防和治疗方法尤为重要。研究表明，正常细胞在向癌细胞和肿瘤细胞转化的过程中，dna甲基化修饰起着重要的作用，rassf2启动子的甲基化是丧失肿瘤抑制功能的主要机制，dna甲基化在肿瘤发生发展中的作用及机制研究是目前分子生物学领域的热点之一。结合表观遗传学进行研究可以让我们更加全面的认识基因在乳腺癌中的作用机制。
crispr/cas9是近几年发现的由rna向导的cas9核酸酶靶向目的基因进行编辑的新兴技术。利用crispr-cas9靶向敲除rassf2基因，相比于传统的锌指核酸酶(zfns)技术，转录激活样效应因子核酸酶（talens）技术等，具有独特的优势：设计更简单，特异性更高，速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点。
参考文献：1)sergioc,biancamc,gabriellamf,etal.isolationandmolecularcharacterizationofrasfadin,anovelgeneinthevicinityofthebovinepriongene［j］.mammaliangenome,2001,12(2):150156.
2)micheledv,chadae,candicee,etal.rass2isanovelkrasspecificeffectorandpotentialtumorsuppressor［j］.thejournalofbiologychemistry,2003,278(30):28045-28051.
3)micheledv，chadae，aaronb,etal.rasusesthenovelsuppressorrassf1asaneffectortomediateapoptosis［j］.thejournalofbiologychemistry,2000,275(46):35669-35672.
4)annebv，channingjd.increasingcomplexityoftherassignalingpathway［j］.jbiolchem,1998,273(32):19925-19928.
5)guhas,lunnja,santiskulvongc,etal.neurotensinstimulatesproteinkinasecdependentmitogenicsignalinginhumanpancreaticcarcinomacelllinepanc1［j］.cancerres,2003,63(10):2379-2387.
技术实现要素：
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种靶向敲除rassf2基因的sgrna。
本发明的另一目的在于提供所述一种靶向敲除rassf2基因的crispr/cas9慢病毒系统的应用。
本发明的另一目的在于提供靶向敲除rassf2基因的人乳腺癌细胞mda-mb-231细胞的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种靶向敲除rassf2基因的sgrna，选自dna序列如下的rassf2sgrna：
rassf2sgrna的序列如下：
rassf2sgrnaoligo1：5’-caccgcgttgtcatcctgcatctgc-3’；
rassf2sgrnaoligo2：5’-aaacgcagatgcaggatgacaacgc-3’；
一种靶向敲除rassf2基因的crispr/cas9慢病毒系统，含有上述靶向敲除rassf2基因的sgrna的dna序列。
所述的靶向敲除rassf2基因的crispr/cas9慢病毒系统的构建，包括如下步骤：
（1）使用bsmbi酶切crispr/cas9慢病毒载体lenticrisprv2，得到酶切后的crispr/cas9慢病毒载体；
（2）将上述靶向敲除rassf2基因的sgrna的dna序列磷酸化后与酶切后的crispr/cas9慢病毒载体连接，得到靶向敲除rassf2基因的crispr/cas9慢病毒系统。
步骤(2)中所述的dna序列是将寡核苷酸链1(oligo1)和寡核苷酸链2(oligo2)退火得到双链序列。
所述的靶向敲除rassf2基因的crispr/cas9慢病毒系统在制备敲除rassf2基因的细胞株中的应用。
一种敲除rassf2基因的细胞株，是将所述的靶向敲除rassf2基因的crispr/cas9慢病毒系统转染目的细胞株得到的。
所述的敲除rassf2基因的细胞株，具体是通过如下步骤构建得到：
(1)将所述的靶向敲除rassf2基因的crispr/cas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；
(2)将慢病毒颗粒感染目的细胞株，得到敲除rassf2基因的细胞株。
所述的目的细胞株优选为肿瘤细胞株。
所述的肿瘤细胞株优选为乳腺癌细胞株。
所述的乳腺癌细胞株优选为人乳腺癌癌永生化细胞mda-mb-231。
所述的敲除rassf2基因的细胞株，是mda-mb-231细胞中的rassf2基因缺失或插入核苷酸得到的细胞株。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供rassf2基因的sgrna能有效靶向rassf2基因,将其构建入crispr/cas9慢病毒系统，该系统能敲除rassf2基因，得到敲除rassf2基因的细胞株，从而有利于研究细胞株中的rassf2的作用机制。
附图说明
图1为本发明实施例中使用的载体质粒lenticrisprv2的质粒图谱；
图2为本发明实施例中使用的表达载体质粒lenticrisprv2-hrassf2sg的质粒图谱；
图3为本发明实施例中使用的包装质粒plp-vsvg的质粒图谱；
图4为本发明实施例中使用的包装质粒pspax2的质粒图谱；
图5为mda-mb-231细胞病毒感染含有rassf2sgrna的活性鉴定测序图；
图6为敲除rassf2基因的单克隆mda-mb-231细胞株1中rassf2基因的测序图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1.使用crispr/cas9技术构建敲除rassf2质粒
1.1sgrna寡核苷酸链合成
使用crispr在线设计工具(http://crispr.mit.edu/)根据评分系统，在rassf2的外显子2上设计1个20bp的sgrna，并通过blast验证无非特异性基因。编码链模板5′端添加cacc，非编码链模板3′端添加aaac，与bsmbi酶切后形成的粘性末端互补，设计1对crispr寡核苷酸链，见表1，表1rassf2靶向位点及sgrna寡核苷酸序列。
1.2载体构建
1.2.1使用bsmbi酶切2μglenticrisprv2质粒(购于addgene公司)，2h，37℃，酶切体系如下为下表：
1.2.2使用genry胶回收试剂盒纯化酶切质粒产物，按说明书进行操作，酶链体系为下表：
1.2.3磷酸化并退火sgrnaoligos，pcr仪器退火程序：37℃30min，95℃维持5min，每分钟降低5℃至25℃，4℃维持。
1.2.4将退火形成的oligo双链和酶切后的lenticrisprv2载体直接连接，室温下，10min。
1.2.5将连接后的质粒转化至感受态细胞dh5α中，均匀涂至lb固体培养基平板中，置于37℃培养箱中培养12-16小时，单个菌落即可出现。
1.3挑取单个菌落扩大培养并质粒小提。
1.4测序鉴定质粒构建成功，并命名为lenticrisprv2-hrassf2sg。
1.5敲除效率验证。
1)用含10％胎牛血清的高糖dmem培养基于5％co2，37℃恒温培养293t细胞(购于美国atcc细胞库)。取对数期细胞以1×105/孔接种到24孔板培养。待细胞融合度达到70％～80％时更换成opti-mem培养基，1小时后将相应的crispr/cas9敲除质粒0.8μg经lipo2000试剂，转染到293t细胞中，转染48小时候，荧光显微镜下观察转染效果，消化收集细胞，采用基因组dna提取试剂盒提取细胞基因组dna。
2)以各组细胞基因组dna为模板，利用表2的引物pcr扩增靶向序列。用rassf2-4-1和rassf2-4-2进行pcr,得到936bp的片段a(高gc)，以a为模板，用rassf2-4-3和rassf2-4-4进行pcr，得到405bp的片段b(高gc)，该片段电泳后胶回收用于测序引物rassf2-4-3,见表2
2.包装慢病毒
100mm皿种入293tn细胞4x106，培养24h(37℃,5％co2)后，更换新鲜培养基，转染包装细胞：
1）混匀以下3个质粒：包装质粒pspax212μg；辅助质粒plp-vsvg10μg；表达质粒lenticrisprv2-hrassf2sg22μg，加入cacl2250μl，加入ddh2o至总体积为500μl，37℃放置20min；
2）2xbes500μl，37℃放置20min；
3）把1）中500μl三质粒混合液逐滴加入2）中，并轻轻混匀；
4）小心的将3）中混合液加入种有293tn的100mm皿中；培养12h后移除感染液，更换10ml新鲜培养基生产病毒液；培养48h后，收获病毒液至50ml离心管中，并重新向100mm皿中补加10ml培养基再次生产病毒；培养24h后，再次收获病毒液，室温离心，1000rpm，10min；使用0.22μm的滤器过滤病毒上清液；将病毒上清液装入超离管中，4℃，100000g，2h；弃去上清液后用opti-mem重悬过夜；再次使用0.22μm的滤器过滤重悬的病毒；分装后，-80℃保存。
3.病毒感染
1)将要感染的mda-mb-231细胞接种到六孔板中，过夜，待细胞融合度约为50％时，移去培养基，更换2ml新鲜培养基；
2)每孔加入50μl病毒液，再加入12μl聚凝胺polybrene，至终浓度为6μg/ml；
3)37℃培养12h后，移除培养液，更换新鲜培养液后继续培养48h。
4.筛选稳定细胞株
感染结束48h后，向每孔加入嘌呤霉素(2.0μg/ml)，隔天换液，并保持培养基的嘌呤霉素浓度恒定，筛选阳性克隆细胞。所得细胞株命名为mda-mb-231-rassf2。并使用有限稀释法挑选mda-mb-231-rassf2单克隆敲除细胞株。
5.稳定细胞株鉴定
提取各组敲除rassf2的单克隆细胞株基因组dna测序，鉴定出sgrna是有活性的（图5），并且找到1种类型的具有rassf2基因缺失或插入突变的稳定细胞株(图6)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>和元生物技术(上海)股份有限公司
<120>crispr-cas9靶向敲除人乳腺癌细胞rassf2基因及其特异性的sgrna
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificalsynthesis)
<400>1
<210>2
<211>24
<212>dna
<213>人工序列(artificalsynthesis)
<400>2
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<212>dna
<213>人工序列(artificalsynthesis)
<400>3
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificalsynthesis)
<400>4
<210>5
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificalsynthesis)
<400>5
<210>6
<211>21
<212>dna
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<400>6
<210>7
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<212>dna
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<400>8
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<212>dna
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<400>9
<210>10
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<212>dna
<213>人工序列(artificalsynthesis)
<400>10