本发明涉及菌株生产多糖技术领域，具体地说，涉及一种粪产碱杆菌发酵生产凝胶多糖的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
凝胶多糖是一种由葡萄糖结构单元以β-d(1→3)连接而成的微生物胞外多糖。凝胶多糖不溶于水，但在加热情况下可形成凝胶，在冷冻和解冻下均能保持优异的稳定性，是继黄原胶、结冷胶之后，被美国fda批准使用的第3种微生物发酵生成的胞外多糖。凝胶多糖由于其良好的加工适应性如保水性、耐冷冻性、耐热性、粘结性、成模性及重要的药理性能而广泛应用于食品、工业、化妆品、制药等重要领域。
目前工业化生产凝胶多糖在国外开展多年，美国日本等已可工业化生产，在部分性能上凝胶多糖不仅优于黄原胶和卡拉胶，而且随着其他新的优越性质的发现，凝胶多糖在食品中潜在的其他应用或在其他行业的广泛应用会得到进一步的开发。近些年我国虽然在凝胶多糖生产方面取得了一些进展，但仍存在多糖产量低、凝胶性能差、凝胶强度低等缺点，在市场上缺乏竞争力。
粪产碱杆菌是常用的凝胶多糖生产菌株，最初是由土壤中分离出来，后经变异产生葡聚糖，凝胶多糖是微生物发酵的产物。菌种产凝胶多糖的量和多糖的凝胶强度之间并无相关性，有的菌种凝胶多糖产量高，但凝胶性能差，凝胶强度低；有的菌种产凝胶多糖凝胶强度高，但产量低。
因此，亟需一种高效制备凝胶多糖的发酵生产方法，既能使凝胶多糖产量高，又能使生产出来的凝胶多糖凝胶性能好、凝胶强度高。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种粪产碱杆菌高效制备凝胶多糖的发酵生产方法，发酵过程中通过氮源控制菌种生长，通过溶氧和耗氧速率our指标控制补糖速率，高效生产凝胶多糖，生产得到的凝胶多糖凝胶性能好、凝胶强度高。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种凝胶多糖的发酵生产方法，第一步，种子培养，在种子培养基中加入活化的粪产碱杆菌进行培养；第二步，深层发酵培养，将培养好的种子液转入发酵培养基进行深层发酵；第三步，发酵液分离提纯，干燥，得到凝胶多糖；其特征在于，第二步，深层发酵培养，在发酵初期，通过氮源控制菌种生长；当菌体生长至对数期时，流加碳源，碳源流加速率为控制发酵液残糖为0.2％～0.3％，发酵过程中溶氧维持在60％～80％，耗氧速率oru维持在10mmol/l/h～20mmol/l/h。
优选地，所述粪产碱杆菌的活化为：从-20℃冰箱中取出试管保存的粪产碱杆菌菌种，以划线法接种于装有活化培养基的试管，培养条件为：30～32℃，培养24～28h后，取8ml～10ml无菌生理盐水将试管斜面的菌体洗下，接种于种子培养基；活化培养基为：0.32％～0.35％牛肉浸膏、0.5％蛋白胨、0.5％nacl、0.12％～0.15％玉米浆、1.5％～2％琼脂。
优选地，所述种子培养基为：碳源22g/l～25g/l，(nh4)2hpo41.2g/l～1.4g/l，kh2po41.1g/l～1.2g/l，caco30.4～0.6g/l，nacl0.9g/l～1.1g/l，玉米浆1g/l，mgso40.4～0.6g/l，调节ph为6.8～7.2，115℃灭菌20min；种子培养条件为：30～32℃培养18～22h，摇床转速200～220r/min。
优选地，所述发酵培养基为：碳源25g/l～30g/l，(nh4)2hpo41.5g/l～1.8g/l，kh2po40.9～1.1g/l，caco30.4～0.6g/l，nacl1g/l～1.2g/l，玉米浆1g/l，(nh4)2so40.8g/l～1g/l，mgso40.4～0.6g/l，调节ph为5.8～7.2，115℃灭菌15min；深层发酵培养条件为：30～32℃发酵4～6d，搅拌转速550～600r/min，风量800～1000l/h，接种量7％～9％。
优选地，所述菌种对数期为发酵液od600值达到12～15。
优选地，所述的分离提纯步骤为取一定量的发酵液按体积比1：1加入2mnaoh溶液，搅拌均匀，静置1～2h，然后4000rpm～5000rpm离心20min～30min，取上清，加6mhcl调节至中性，加3倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，8000rpm～9000rpm离心20min～30min，取沉淀于80～100目滤布过滤后50～60℃烘至衡重。
优选地，所述碳源为葡萄糖和/或蔗糖。
优选地，2％(w/v)凝胶多糖沸水浴加热10min的凝胶强度是880～970g/cm2。
本发明的有益效果是：本发明的生产工艺以粪产碱杆菌为出发菌株，经种子摇瓶培养后接入发酵罐，进一步生产凝胶多糖。发酵过程中通过氮源控制菌种生长，通过溶氧和耗氧速率our指标控制补糖速率，高效生产凝胶多糖，凝胶多糖产量可达69g/l，沸水浴加热后2％(w/v)凝胶多糖的凝胶强度达到970g/cm2左右，本发明提供的凝胶多糖发酵生产方法制备得到的凝胶多糖产量高，凝胶性能好，凝胶强度高。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1种子活化及培养
将-20℃保藏的粪产碱杆菌菌种(agrobacteriumradiobacterg-1，购自于广西大学)划线接种于装有活化培养基的试管，30℃培养箱中培养24h；活化培养基为：0.35g牛肉浸膏、0.5g蛋白胨、0.5gnacl、120μl玉米浆、2g琼脂，分装于试管中，9ml/管，115℃灭菌20min。
800ml摇瓶种子制备，培养基配方：蔗糖18g、(nh4)2hpo41g、kh2po41g、caco30.5g、nacl0.8g、玉米浆800μl、mgso40.4g，ph7.2，115℃灭菌20min。取一支斜面试管，使用9ml无菌生理盐水将菌洗下，接种于摇瓶内，32℃，220r/min，摇床培养18h。
实施例2深层发酵培养
将培养好的种子液转入发酵培养基进行深层发酵，在发酵初期，通过氮源控制菌种生长。
发酵培养基分别添加不同量的氮源(nh4)2hpo4(0.7g/l～1.0g/l、1.1g/l～1.4g/l、1.5g/l～1.8g/l、1.9g/l～2.2g/l)和玉米浆(0.8g/l、0.9g/l、1.0g/l、1.1g/l、1.2g/l)，所得菌种生长浓度和所产凝胶多糖凝胶强度数据如下：
氮源(nh4)2hpo4和玉米浆添加量对菌种od值及凝胶强度的影响
根据菌种生长浓度和所产凝胶多糖的凝胶强度选用的最佳添加量为(nh4)2hpo41.5g/l～1.8g/l和玉米浆1g/l。
15l发酵罐中加入蔗糖300g、(nh4)2hpo415g、kh2po410g、caco35g、nacl10g、玉米浆10ml、(nh4)2so410g、mgso45g，消泡剂2ml，定容至10l，115℃灭菌15min，然后降至32℃，发酵第一阶段，菌种生长阶段ph调节为7，接入第一步的种子培养液800ml后开始发酵，搅拌转速550r/min，风量1000l/h。
发酵18小时后，发酵液od600值增长至15，开始流加蔗糖溶液，每两个小时取样，蔗糖水解后测残糖，维持发酵液中残糖含量为0.2％左右，该阶段调节ph维持在6，溶氧60％～68％，our为22mmol/l/h左右。
发酵118小时后，溶氧回升，our下降，发酵结束。
实施例3分离提纯：
将实施例2制备的发酵液按体积比1：1加入2mnaoh溶液，搅拌均匀，静置1.5h，然后4500rpm离心25min，取上清，加6mhcl调节至中性，加3倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，9000rpm离心25min，取沉淀，80目滤布过滤后60℃烘至衡重，凝胶多糖产量为69g/l；沸水浴加热10分钟，2％凝胶多糖的凝胶强度为893g/cm2。
实施例4凝胶多糖的发酵生产
第一步，种子活化和培养：
将-20℃保藏的粪产碱杆菌菌种划线接种于装有活化培养基的试管，32℃培养箱中培养28h；活化培养基为：0.32g牛肉浸膏、0.5g蛋白胨、0.5gnacl、120μl玉米浆、1.5g琼脂，分装于试管中，9ml/管，115℃灭菌20min。
800ml摇瓶种子制备，培养基配方：葡萄糖20g、(nh4)2hpo40.96g、kh2po40.9g、caco30.4g、nacl0.8g、玉米浆800μl、mgso40.4g，ph7.2，115℃灭菌20min。取一支斜面试管，加8ml生理盐水将菌体洗下，接种于摇瓶内，30℃，200r/min，摇床培养20h。
第二步，深层发酵培养：
15l发酵罐中加入葡萄糖280g、(nh4)2hpo416g、kh2po410g、caco35g、nacl11g、玉米浆10ml、(nh4)2so48g、mgso45g，消泡剂2ml，定容至10l，115℃灭菌15min，然后降至32℃，用氢氧化钠溶液调节ph为7，接入第一步的种子培养液750ml后开始发酵，搅拌转速600r/min，风量800l/h。
发酵21小时后，发酵液od600值增长至13.44，开始流加葡萄糖溶液，每两个小时取样测残糖，维持发酵液中残糖含量为0.2％左右，该阶段调节ph维持在6，溶氧68％～75％，our为15mmol/l/h左右。
发酵121小时后，溶氧回升，our下降，发酵结束。
第三步，分离提纯：
取第二步的发酵液按体积比1：1加入2mnaoh溶液，搅拌均匀，静置1h，然后于5000rpm离心20min，取上清，加6mhcl调节至中性，加3倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，8000rpm离心30min，取沉淀于100目滤布过滤后60℃烘至衡重，凝胶多糖产量为65g/l；沸水浴加热10分钟，2％凝胶多糖的凝胶强度为970g/cm2。
对比例1凝胶多糖的发酵生产
第一步，种子的活化和培养：与实施例4种子的活化和培养步骤一致；
第二步，深层发酵培养：
15l发酵罐中加入葡萄糖280g、(nh4)2hpo416g、kh2po410g、caco35g、nacl11g、玉米浆10ml、(nh4)2so48g、mgso45g，消泡剂2ml，定容至10l，115℃灭菌15min，然后降至32℃，用氢氧化钠溶液调节ph为7，接入第一步的种子培养液750ml后开始发酵，搅拌转速600r/min，风量800l/h。
发酵21小时后，发酵液od600值增长至13，开始流加葡萄糖溶液，每两个小时取样测残糖，维持发酵液中残糖含量为0.1％左右，该阶段调节ph维持在6，溶氧48％～55％，our为8mmol/l/h左右。
发酵120小时后，溶氧回升，our下降，发酵结束。
第三步，分离提纯：
取第二步的发酵液按体积比1：1加入2mnaoh溶液，搅拌均匀，静置1h，然后于5000rpm离心20min，取上清，加6mhcl调节至中性，加3倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，8000rpm离心30min，取沉淀于100目滤布过滤后60℃烘至衡重，凝胶多糖产量为23g/l；沸水浴加热10分钟，2％凝胶多糖的凝胶强度为950g/cm2。
对比例2
第一步，种子的活化和培养：与实施例4种子的活化和培养步骤一致；
第二步，深层发酵培养：
15l发酵罐中加入葡萄糖280g、(nh4)2hpo412g、kh2po410g、caco35g、nacl11g、玉米浆10ml、(nh4)2so48g、mgso45g，消泡剂2ml，定容至10l，115℃灭菌15min，然后降至32℃，用氢氧化钠溶液调节ph为7，接入第一步的种子培养液750ml后开始发酵，搅拌转速600r/min，风量800l/h。
发酵21小时后，发酵液od600值增长至10，开始流加葡萄糖溶液，每两个小时取样测残糖，维持发酵液中残糖含量为0.2％左右，该阶段调节ph维持在6，溶氧68％～75％，our为15mmol/l/h左右。
发酵118小时后，溶氧回升，our下降，发酵结束。
第三步，分离提纯：
取第二步的发酵液按体积比1：1加入2mnaoh溶液，搅拌均匀，静置1h，然后于5000rpm离心20min，取上清，加6mhcl调节至中性，加3倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，8000rpm离心30min，取沉淀于100目滤布过滤后60℃烘至衡重，凝胶多糖产量为25g/l；沸水浴加热10分钟，2％凝胶多糖的凝胶强度为965g/cm2。
对比例3
第一步，种子的活化和培养：与实施例4种子的活化和培养步骤一致；
第二步，深层发酵培养：
15l发酵罐中加入葡萄糖280g、(nh4)2hpo422g、kh2po410g、caco35g、nacl11g、玉米浆10ml、(nh4)2so48g、mgso45g，消泡剂2ml，定容至10l，115℃灭菌15min，然后降至32℃，用氢氧化钠溶液调节ph为7，接入第一步的种子培养液750ml后开始发酵，搅拌转速600r/min，风量800l/h。
发酵21小时后，发酵液od600值增长至20，开始流加葡萄糖溶液，每两个小时取样测残糖，维持发酵液中残糖含量为0.5％左右，该阶段调节ph维持在6，溶氧68％～75％，our为15mmol/l/h左右。
发酵110小时后，溶氧回升，our下降，发酵结束。
第三步，分离提纯：
取第二步的发酵液按体积比1：1加入2mnaoh溶液，搅拌均匀，静置1h，然后于5000rpm离心20min，取上清，加6mhcl调节至中性，加3倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，8000rpm离心30min，取沉淀于100目滤布过滤后60℃烘至衡重，凝胶多糖产量为37g/l；沸水浴加热10分钟，2％凝胶多糖的凝胶强度为920g/cm2。
对比例4
第一步，种子的活化和培养：与实施例4种子的活化和培养步骤一致；
第二步，深层发酵培养：
15l发酵罐中加入葡萄糖280g、(nh4)2hpo416g、kh2po410g、caco35g、nacl11g、玉米浆10ml、(nh4)2so48g、mgso45g，消泡剂2ml，定容至10l，115℃灭菌15min，然后降至32℃，用氢氧化钠溶液调节ph为7，接入第一步的种子培养液750ml后开始发酵，搅拌转速600r/min，风量800l/h。
发酵21小时后，发酵液od600值增长至13，开始流加葡萄糖溶液，每两个小时取样测残糖，维持发酵液中残糖含量为0.1％左右，该阶段调节ph维持在6，溶氧80％～88％，our为30mmol/l/h左右。
发酵110小时后，溶氧回升，our下降，发酵结束。
第三步，分离提纯：
取第二步的发酵液按体积比1：1加入2mnaoh溶液，搅拌均匀，静置1h，然后于5000rpm离心20min，取上清，加6mhcl调节至中性，加3倍体积的无水乙醇，搅拌均匀，8000rpm离心30min，取沉淀于100目滤布过滤后60℃烘至衡重，凝胶多糖产量为32g/l；沸水浴加热10分钟，2％凝胶多糖的凝胶强度为940g/cm2。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。