本发明涉及棉花分子育种技术领域，具体涉及来自海岛棉海1与黄萎病抗性有关的分子标记及其应用。
背景技术：
棉花黄萎病(Verticillium wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Klebahn)引起的一种侵染维管束组织的土传病害，在棉花生产中普遍发生且危害最为严重，被称为“棉花的癌症”，给世界各主要产棉国家和地区植棉业造成严重威胁(马存，2005.)。近年来，在我国产棉区有逐年加重的趋势。因此，培育抗黄萎病的棉花新品种势在必行。
海岛棉具有高抗黄萎病的特性，但产量低，种植面积小，而陆地棉产量高，适应性广，被大面积种植，但对黄萎病敏感。因此挖掘海岛棉的抗黄萎病基因，把海岛棉的抗黄萎病基因转移到陆地棉背景中，对我国陆地棉黄萎病抗性的提高有着重要的意义。
棉花黄萎病抗性表型性状也是受多种条件(环境温度、湿度、土壤菌种等)的影响，其鉴定稳定性差、重复性差、费时费力等。实践证明，采用传统的育种方法改良黄萎病抗性很难。由于传统育种的整个过程中的选择主要是表型选择，这对质量性状而言一般是有效的，但对黄萎病抗性这样的数量性状来说，则存在准确性差、效率低等许多缺点。要提高选择的效率，理想的方法应该是能够直接对基因型进行选择。
分子标记辅助选择是借助分子标记对目标性状的基因型直接进行选择，而不必考虑作物生长发病时期，可在早期进行选择，又能减少来自同一位点不同等位基因或不同位点的非等位基因间的相互干扰，有利于快速垒集目标基因，加速回交育种进程，克服不利性状连锁，极大地缩短了育种时间，减少了群体种植规模。
在海岛棉黄萎病抗性性状的基因挖掘方面，利用不同的陆海杂种群体或其衍生品系有关的群体进行分子连锁图谱的构建和黄萎病抗性性状QTLs(Quantitative trait loci,简写QTL)筛选，取得了很大研究进展，为黄萎病抗性状的分子标记辅助选择打下了良好的基础，有少数QTLs或与之连锁的分子标记已应用于辅助选择育种中。但是，前人的研究中多数是利用分离群体，或只在单个环境下检测得到的结果，因此缺乏可靠性和稳定性，且有些研究最初的目的只是为了进行目标基因的定位，在实验材料的选择上没有考虑和育种材料相结合，难以应用到育种中。
技术实现要素：
为了克服传统育种中表型选择准确性差、效率低、周期长、成本高等许多缺点，解决改良黄萎病抗性育种进展缓慢的问题。本发明以生产上大面积种植的陆地棉品种中棉所36为受体亲本，高抗黄萎病的海岛棉品系海1为供体亲本，构建了陆海杂交回交高代棉花代换系，并进行了多环境黄萎病抗性性状的评价，为挖掘海岛棉海1黄萎病抗性性状的QTLs、直接培育用于育种的棉花新品系奠定了基础。
本发明的目的是提供来自海岛棉海1与黄萎病抗性有关的分子标记。
本发明的再一目的是提供一种陆地棉黄萎病抗性辅助育种方法。
本发明的再一目的是提供上述来自海岛棉海1与黄萎病抗性有关的分子标记的应用。
本发明提供的技术方案查：来自海岛棉海1与黄萎病抗性有关的分子标记，所述分子标记为CER0086、NAU3405和NAU2026，其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①CER0086
正向引物序列为 TTCCATTGCTCGCTTTACAA，
反向引物序列为 TTTAAGAGGCAAGTCCTTTATTAG，
扩增长度为120bp的海1的DNA片段；
②NAU3405
正向引物序列为 AATAGCAAAGCCTTCAGTGC，
反向引物序列为 GAAGTGCAAAAACCGTACCT，
扩增长度为240bp的海1的DNA片段；
③NAU2026
正向引物序列为 GAATCTCGAAAACCCCATCT，
反向引物序列为 ATTTGGAAGCGAAGTACCAG，
扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
本发明还提供一种陆地棉黄萎病抗性辅助育种方法，该方法包括以下步骤：
(1)DNA提取，使用与海岛棉海1黄萎病抗性性状紧密连锁的分子标记CER0086、NAU3405和NAU2026对群体单株的基因型进行分子检测；
(2)对检测结果进行分析，选择带有海岛棉海1特征条带的植株，获得黄萎病抗性得到提高的陆地棉品种，其中，所述与海岛棉海1黄萎病抗性性状紧密连锁的分子标记CER0086、NAU3405和NAU2026的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①CER0086
正向引物序列为 TTCCATTGCTCGCTTTACAA，
反向引物序列为 TTTAAGAGGCAAGTCCTTTATTAG，
扩增长度为120bp的海1的DNA片段；
②NAU3405
正向引物序列为 AATAGCAAAGCCTTCAGTGC，
反向引物序列为 GAAGTGCAAAAACCGTACCT，
扩增长度为240bp的海1的DNA片段；
③NAU2026
正向引物序列为 GAATCTCGAAAACCCCATCT，
反向引物序列为 ATTTGGAAGCGAAGTACCAG，
扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
根据本发明的与陆地棉黄萎病抗性辅助育种方法，使用SSR标记CER0086、NAU3405和NAU2026在与海岛棉海1等有关的育种群体中对黄萎病抗性性状进行分子标记选择，可提高陆地棉的黄萎病抗性。该方法所用的分子标记CER0086、NAU3405和NAU2026分别与黄萎病抗性性状的3个QTLs：qVW-6-1、qVW-19-1和qVW-22-1(VW是黄萎病的英文单词Verticillium wilt的缩写。QTL的命名：q+性状名称英文缩写+染色体序号+同一染色体上控制该性状QTL的顺序编号。如：qVW-6-1表示在第6条染色体上黄萎病抗性的第1个QTL。)紧密连锁。这3个黄萎病抗性性状的QTLs：qVW-6-1、qVW-19-1和qVW-22-1，分别位于染色体Chr6、Chr19和Chr22上，都来源于海岛棉海1，对黄萎病抗性的贡献率分别为3.98-7.50％、4.66-7.96％和4.39-7.06％，加性效应分别为6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。
本发明不仅有助于筛选高抗黄萎病材料，为今后海岛棉海1杂交、回交后代及其衍生品系的黄萎病抗性性状育种利用提供了极大的便利，同时也为主效QTL的精细定位及基因克隆奠定了基础。
使用本发明可以在苗期预测黄萎病抗性的高低并进行淘汰，进而可以快速筛选高抗黄萎病的株系用于棉花抗病育种，辅助育种选择目标明确，节约成本。通过与高抗黄萎病性状的QTLs紧密连锁的分子标记在与海岛棉海1等有关的育种群体中的分子标记选择，快速地提高现有陆地棉品种的黄萎病抗性，以克服现有技术存在的上述不足。
本发明本发明还提供一种与海岛棉海1相关的陆地棉黄萎病抗性性状提高的分子标记选择方法，使用与海岛棉海1黄萎病抗性性状紧密连锁的SSR标记CER0086、NAU3405和NAU2026在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高陆地棉棉黄萎病抗性6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。该方法包括以下步骤：苗期单株提取DNA；使用分子标记CER0086、NAU3405和NAU2026对群体单株的基因型进行分子检测；对检测结果进行分析；选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的黄萎病抗性得到不同程度的提高。
通过这些分子标记选择可获得黄萎病抗性得到提高的陆地棉品种，加速棉花黄萎病抗性的育种进程。
上述一种提高陆地棉黄萎病抗性性状的分子选择育种方法，所涉及的分子标记是通过以下方法按照下列步骤获得的：
(1)以海岛棉海1为供体亲本、分别以中棉所36为轮回亲本，通过杂交高代回交，连续自交，构建了陆海不同回交世代的群体及杂交高代回交自交的渐渗系群体；
(2)以中棉所36×海1BC1F1为作图群体，构建SSR分子连锁图谱；
(3)从36×海1BC5F3:5渐渗系中按照黄萎病抗性从高到低挑选代换系，设置田间试验，进行田间农艺性状的调查、纤维品质和产量的测定，同时在每年的黄萎病发病的7月份和8月进行黄萎病性状的调查，并提取每个代换系DNA，以所述步骤(2)构建的分子连锁图谱为基础，在每条染色体上每5-10cM选择一个标记，对渐渗系DNA进行基因型检测；
(4)利用黄萎病病指的数据和基因型数据，进行QTL定位和综合分析，获得多环境稳定的黄萎病抗性QTLs，其中3个QTLs：qVW-6-1、qVW-19-1和qVW-22-1，分别位于染色体Chr6、Chr19和Chr22上，增效基因都来源于海岛棉海1。
对黄萎病抗性的贡献率分别为3.98-7.50％、4.66-7.96％和4.39-7.06％，加性效应分别为6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。与这3个黄萎病抗性性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CER0086、NAU3405和NAU2026在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高陆地棉棉黄萎病抗性6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。与这3个黄萎病抗性性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CER0086、NAU3405和NAU2026。
上述一种提高陆地棉黄萎病抗性性状的分子标记选择方法，所涉及的分子标记是通过以下较为具体方法获得的：
(1)以海岛棉海1为供体亲本、分别以中棉所36为轮回亲本，通过杂交高代回交，连续自交，构建了陆海不同回交世代的群体及杂交高代回交自交的渐渗系群体。
(2)以中棉所36×海1BC1F1为作图群体(135个单株)，构建了一张含有2292个标记位点、总图距5115.16 8cM的陆海种间高密度SSR分子连锁图谱(Shi et al.2015)。
(3)从36×海1BC5F3:5的300个代换系，设置2年4个生态环境(2015安阳和新疆石河子、2016年安阳和新疆石河子)的两个重复的田间试验，黄萎病发病的7月份和8月按小区进行黄萎病性状的调查，并提取每个代换系DNA(2015年安阳)，以上述(2)构建的分子连锁图谱为基础，在每条染色体上每5-10cM选择一个标记，共选择597个标记引物，对代换系DNA进行基因型检测。
(4)利用2年4个生态环境(2015安阳和新疆石河子、2016年安阳和新疆石河子)的黄萎病病指的8个发病时期(或8个环境)的数据和基因型数据，采用王建康的QTL IciMapping V4.0软件(http://www.isbreeding.net/software/)，进行QTL定位和综合分析，获得多环境稳定的黄萎病抗性QTLs，其中3个QTLs：qVW-6-1、qVW-19-1和qVW-22-1，分别位于染色体Chr6、Chr19和Chr22上，增效基因都来源于海岛棉海1，对黄萎病抗性的贡献率分别为3.98-7.50％、4.66-7.96％和4.39-7.06％，加性效应分别为6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。与这3个黄萎病抗性性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CER0086、NAU3405和NAU2026在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高陆地棉棉黄萎病抗性6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。与这3个黄萎病抗性性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CER0086、NAU3405和NAU2026。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种提高陆地棉黄萎病抗性性状的分子标记选择方法，使用分子标记CER0086、NAU3405和NAU2026在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高黄萎病抗性6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。
使用这些分子标记可以在棉花苗期进行选择，提高黄萎病抗性性状的选择效率。本发明不但有助于解决我国棉花抗病育种进展缓慢的问题，而且有助于克服现有育种技术对黄萎病抗性鉴定存在的成本高、时间长、稳定性低、准确性差、效率低等不足，快速地提高现有陆地棉品种的黄萎病抗性，大大加快我国抗黄萎病新品种的培育与种子产业化进程。
具体实施方式
下面通过具体实施例方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1筛选分子标记
(1)代换系的构建及表型数据的获得
以纤维优异的高抗黄萎病的海岛棉品系海1为供体亲本、以早熟的高产感黄萎病的陆地棉推广品种中棉所36为轮回亲本，构建了陆海杂交高代回交的渐渗系群体。中棉所36(CCRI36)是中国农业科学院棉花研究所培育的早熟的陆地棉推广品种(国审棉990007)。
2009年种植133个BC5F3家系，收获2660株单株，按单株收取自然铃，种植成株行，混收，种植成系，鉴定黄萎病抗性。按照黄萎病病指的高低选择300个BC5F3:5系，设置2年2个地点(2015安阳和新疆石河子、2016年安阳和新疆石河子)的试验，田间种植采用地膜覆盖的方式播种，安阳单行区两重复种植，行长5m，行宽80cm，株距25cm，新疆库尔勒2行区两重复种植，行长3m，行距按新疆当地宽窄行设置，株距为10cm。对代换系按照小区进行常规田间调查及每年的7月份和8月黄萎病性状的调查。每个表型性状都成连续的正态分布。获得的表型数据(见表1)。
表1 8个发病时期(或8个环境)中代换系群体黄萎病病指描述性统计分析
(2)采用CTAB法提取300个代换系DNA及双亲DNA。
(3)分子基因型检测
以本实验室构建的中棉所36×海1BC1F1的陆海种间高密度SSR分子连锁图谱(Shi et al.2015)为基础，在每条染色体上每5-10cM选择一个标记，对300个代换系DNA进行基因型检测。引物由上海生工和北京三博公司合成。
SSR扩增反应体系为10μ1，其中超纯水6.40μ1，10×Buffer 1.0μ1，10mM dNTPs 0.50μ1，正向引物(10μM)0.50μ1，反向引物(10μM)0.50μ1，模板DNA(30ng/μ1)1.0μ1，Taq DNA聚合酶(5U/μ1)0.10μ1。SSR扩增反应程序：94℃预变性45s；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min，29个循环。94℃变性60s，57℃退火45s，72℃延伸2min。扩增反应在BIOMETRA公司TGRADIENT及BIO-RAD公司PTC-200上进行，扩增产物在8％的聚丙烯凝胶中进行电泳，按照张军(2000)的方法进行凝胶银染，记录结果。
(4)黄萎病抗性QTL定位
利用2年8个环境(2015安阳和新疆石河子、2016年安阳和新疆石河子)的8个发病时期(或8个环境)的病指数据和基因型数据，采用王建康的QTL IciMapping V4.0软件(http://www.isbreeding.net/software/)，进行QTL定位。获得多环境稳定的黄萎病抗性QTLs，其中3个QTLs：qVW-6-1、qVW-19-1和qVW-22-1，分别位于染色体Chr6、Chr19和Chr22上，增效基因都来源于海岛棉海1，对黄萎病抗性的贡献率分别为3.98-7.50％、4.66-7.96％和4.39-7.06％，加性效应分别为6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。与这3个黄萎病抗性性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CER0086、NAU3405和NAU2026。这3个黄萎病抗性QTLs没有被报道，是新发现的。在这3个QTLs中，黄萎病抗性的QTL qVW-6-1能在4个环境中检测到，黄萎病抗性增效基因都来源于海岛棉海1，对棉花黄萎病抗性的贡献率为3.98-7.50％、降低病指6.62-10.06；黄萎病抗性的QTL qVW-19-1能在4个环境中检测到，黄萎病抗性增效基因都来源于海岛棉海1，对棉花黄萎病抗性的贡献率为4.66-7.96％、降低病指5.01-7.75；黄萎病抗性的QTL qVW-22-1能在3个环境中检测到，黄萎病抗性增效基因都来源于海岛棉海1，对棉花黄萎病抗性的贡献率为4.39-7.06％、降低病指4.58-6.28。
与这3个黄萎病抗性性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CER0086、NAU3405和NAU2026，在与海岛棉海1有关的育种群体中进行分子标记选择，可提高陆地棉棉黄萎病抗性6.62-10.06、5.01-7.75和4.58-6.28。与这3个黄萎病抗性性状的QTLs紧密连锁的SSR分子标记分别为CER0086、NAU3405和NAU2026(具体结果见见表2)。
各分子标记的引物序列和扩增的目的片段长度如下：
①CER0086
正向引物序列为 TTCCATTGCTCGCTTTACAA，
反向引物序列为 TTTAAGAGGCAAGTCCTTTATTAG，可扩增长度为120bp的海1的DNA片段；
②NAU3405
正向引物序列为 AATAGCAAAGCCTTCAGTGC，
反向引物序列为 GAAGTGCAAAAACCGTACCT，可扩增长度为240bp的海1的DNA片段；
③NAU2026
正向引物序列为 GAATCTCGAAAACCCCATCT，
反向引物序列为 ATTTGGAAGCGAAGTACCAG，可扩增长度为220bp的海1的DNA片段。
表2多环境稳定的黄萎病抗性性状的QTLs。
根据本发明的提供一种陆地棉黄萎病抗性改良的辅助育种方法，使用SSR标记CER0086、NAU3405和NAU2026在与海岛棉海1及其衍生品系(品种)有关的育种群体中对黄萎病抗性进行分子标记选择，可获得黄萎病抗性提高的单株或株系。
实施例2陆地棉黄萎病抗性性状提高的分子标记选择方法
使用实施例1获得的分子标记CER0086、NAU3405和NAU2026在与海岛棉海1等有关的育种群体中进行分子标记选择，包括以下步骤：
(1)DNA提取：以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种或品系(如中棉所60、鲁棉研28)为受体亲本，进行杂交、回交，获得分离群体，或者以海岛棉海1为供体亲本，陆地棉品种(如中棉所60、鲁棉研28、新陆早60)为受体亲本杂交高代回交获得的代换系及其衍生品系，或者其代换系与陆地棉品种杂交、回交的后代群体，在苗期采用CTAB法提取分离群体单株DNA；
(2)使用分子标记CER0086、NAU3405和NAU2026对上述(1)群体单株的基因型进行分子标记检测；
(3)对检测结果进行分析；
(4)选择带有海岛棉海1特征条带的植株，这些中选单株的黄萎病抗性可能得到不同程度的提高。
通过本发明可获得黄萎病抗性得到提高的陆地棉品种(系)，可加速黄萎病抗性育种进程。