本发明涉及一种骆驼蓬子的分离方法及其产品和应用。
背景技术：
：骆驼蓬子为蒺藜科植物骆驼蓬(peganumharmalal.)的干燥成熟种子，是维吾尔族和蒙古族民间沿用已久的习用药材，已被列入中华人民共和国卫生部维吾尔药分册药品标准(ws3-bw-0080-98)。具有坚固筋脉，助阳暖阴，清除粘稠体液，消散寒湿之气的功效。临床用于治疗关节疼痛，筋脉软弱，外阴冰凉，阳弱尿少等病症。临床上使用的复方木尼孜其颗粒、复方骆驼蓬子软膏等均为维吾尔药典收录品种，其均含有骆驼蓬子。骆驼蓬碱(harmaline)是骆驼蓬子中主要的活性成分，是一种β咔啉类生物碱，具有抗肿瘤，抑制单胺氧化酶，抗包虫，抑制细胞免疫和体液免疫，防护辐射等药理作用。正因为其如此广泛的用途，越来越多的制剂品种采用骆驼蓬碱作为其质量控制的对照品，如何进一步提高骆驼蓬子中有效成分的收率是本领域亟待解决的问题。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是现有的从骆驼蓬子中分离有效成分的方法收率低、产品纯度难以达到对照品的要求等缺陷，而提供了一种骆驼蓬子的分离方法及其产品和应用，该方法制得的有效成分纯度高，符合国家对于对照品的要求，且工艺稳定、绿色友好。本发明提供了一种骆驼蓬子的分离方法，其包括以下步骤：(1)将骆驼蓬子乙醇提取液进行ab-8大孔吸附树脂层析，所述大孔吸附树脂层析的流动相为乙醇水溶液，得有效成分粗品；(2)将步骤(1)所述有效成分粗品进行高效反相层析，所述高效反相层析的流动相为甲醇和三氟乙酸水溶液，得有效成分。所述步骤(1)中的“有效成分粗品”和所述步骤(2)中的“有效成分”里的有效成分是指骆驼蓬子中的活性成分，可为去氢骆驼蓬碱和/或骆驼蓬碱，又可为骆驼蓬碱。在所述步骤(1)中，优选地，大孔吸附树脂层析前，所述乙醇提取液还进行浓缩步骤。进一步优选地，“大孔吸附树脂层析前，所述乙醇提取液还进行过滤、浓缩步骤”，或者，“大孔吸附树脂层析前，所述乙醇提取液还进行浓缩、过滤步骤”。更优选地，大孔吸附树脂层析前，所述乙醇提取液还进行过滤、浓缩、再过滤步骤。所述浓缩的方式可为本领域常规的浓缩方式，例如减压浓缩。在所述步骤(1)中，所述乙醇提取液的制备方法可按照本领域常规的制备方法，例如将骆驼蓬子在乙醇水溶液中进行提取，即得骆驼蓬子乙醇提取液。所述乙醇提取液的制备方法中，所述乙醇水溶液的浓度优选为30-80％，进一步优选为50％-70％，更优选为70％，所述百分比是指体积百分比。所述乙醇水溶液的重量优选为所述骆驼蓬子的8-20倍重量，进一步优选为8-10倍重量，更优选为8倍重量。所述乙醇提取液的制备方法中，所述提取的次数优选为1-3次，进一步优选为2-3次，更优选为2次。所述乙醇提取液的制备方法中，所述提取的时间优选为每次20-60min，进一步优选为每次30-60min，更优选为每次30min。所述乙醇提取液的制备方法中，所述提取的方式优选为热回流提取、超声提取或常压渗滤提取，进一步优选为热回流提取。本领域技术人员均知，当提取的次数大于1次时，可合并提取液进行浓缩(例如，上述的浓缩步骤)。在所述步骤(1)中，所述乙醇提取液的制备方法优选为将骆驼蓬子在乙醇水溶液中进行提取；所述乙醇水溶液的浓度为30-80％，所述百分比是指体积百分比；所述乙醇水溶液的重量为所述骆驼蓬子的8-20倍重量；所述提取的次数为1-3次；所述提取的时间为每次20-60min；所述提取的方式为热回流提取、超声提取或常压渗滤提取。在所述步骤(1)中，本领域技术人员均知，在所述大孔吸附树脂层析前应进行上样。所述上样的流速优选为0.5-1bv/h，更优选为1bv/h。优选地，在所述上样后可用水洗脱除杂再进行大孔吸附树脂层析。所述水的洗脱体积优选为1-4bv，更优选为2bv。在所述步骤(1)中，所述乙醇水溶液的浓度优选为20-40％，进一步优选为30-40％，更优选为40％，所述百分比是指体积百分比。在所述步骤(1)中，所述流动相的流速优选为1-2bv/h，更优选为2bv/h。在所述步骤(1)中，经所述流动相洗脱后获得的含有效成分的洗脱液可按本领域常规进行后处理，例如减压浓缩、干燥，得到所述有效成分粗品。在所述步骤(2)中，所述有效成分粗品可按本领域常规进行前处理，具体地，甲醇溶解后，微孔滤膜过滤即可。在所述步骤(2)中，所述三氟乙酸水溶液优选为0.1％三氟乙酸水溶液。在所述步骤(2)中，所述甲醇和所述三氟乙酸水溶液的体积比优选为30:70-50:50，进一步优选为30:70-44:56，更优选为44:56。在所述步骤(2)中，所述高效反相层析的色谱柱优选为ods柱(即c18柱)。所述ods柱的填料粒径优选为5μm。所述ods柱的直径优选为10mm。所述ods柱的长度优选为250mm。所述ods柱优选为sunfiretmprec18,5μm,10×250mm。在所述步骤(2)中，所述高效反相层析的色谱柱优选为制备柱。在所述步骤(2)中，所述高效反相层析的流动相的流速优选为5-15ml/min，进一步优选为10-15ml/min，更优选为10ml/min。在所述步骤(2)中，所述高效反相层析的进样量优选为0.5ml。在所述步骤(2)中，所述高效反相层析的检测波长优选为210nm。在所述步骤(2)中，所述有效成分的收集可按本领域常规的收集方法，依据紫外吸收图谱即可(当所述有效成分含有多个物质时，可分开收集)。优选地，将含所述有效成分的色谱峰的馏分合并，回收溶剂，干燥，即得有效成分对照品。当所述有效成分为骆驼蓬碱时，收集最大吸收峰为216、259、377nm的色谱峰即可(例如，保留时间为21.873min的色谱峰)。本发明中，所述骆驼蓬子是指蒺藜科植物骆驼蓬(peganumharmalal.)的干燥成熟种子。本发明还提供了一种采用上述分离方法制得的骆驼蓬碱或去氢骆驼蓬碱。本发明还提供了一种如上所述的骆驼蓬碱或去氢骆驼蓬碱作为对照品(或标准品)的应用。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：(1)本发明首次提出了结合大孔树脂和高效制备色谱的方法从骆驼蓬子中制备有效成分对照品，例如去氢骆驼蓬碱、骆驼蓬碱，结果显示，本发明的方法制备得到的骆驼蓬碱纯度大于90％，收率为1.84-1.92mg/骆驼蓬子g。(2)本发明以骆驼蓬子为原料，其含有大量的有效成分，原料价格低廉，成本低，且在过程使用的溶剂均为无毒无害的溶剂，无污染环境，工艺技术稳定，产品质量可靠。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1(1)取骆驼蓬子药材500g，用5000ml，70％乙醇水溶液(百分比是指体积百分比)，热回流提取2次，每次30分钟。合并提取液，过滤，减压浓缩得到骆驼蓬子浓缩液500ml。(2)将步骤(1)得到的骆驼蓬子浓缩液500ml，过滤，上样于ab-8大孔吸附树脂上，上样流速为1bv/h，上样后用2bv的水洗脱除杂，然后用40％的乙醇水溶液洗脱(百分比是指体积百分比)，洗脱流速为2bv/h，直至洗脱液中检测不到骆驼蓬碱为止。收集全部洗脱液，减压浓缩，干燥得到骆驼蓬碱粗品8.7g，纯度≥40％。(3)将步骤(2)得到的骆驼蓬碱粗品经高压制备色谱(phplc)进一步纯化。配置流动相为甲醇和0.1％三氟乙酸水，流动相比例为(44:56)，制备柱为ods柱(sunfiretmprec18,5μm,10×250mm)，流速为10ml/min，检测波长210nm；具体操作如下：取8.7g的骆驼蓬碱粗品，加入40ml甲醇溶解，用微孔滤膜过滤不溶物，每次进样0.5ml，收集紫外最大吸收峰为216，259，377nm的色谱峰；反复如此制备，最后根据hplc检测收集到的目标馏分，将含有骆驼蓬碱的馏分合并，回收溶剂，干燥得到骆驼蓬碱960mg，纯度≥98％。实施例2(1)取骆驼蓬子药材500g，用4000ml，70％乙醇水溶液(百分比是指体积百分比)，超声提取2次，每次60分钟。合并提取液，过滤，减压浓缩得到骆驼蓬子浓缩液500ml。(2)将步骤(1)得到的骆驼蓬子浓缩液500ml，过滤，上样于ab-8大孔吸附树脂上，上样流速为0.5bv/h，上样后用2bv的水洗脱除杂，然后用30％的乙醇水溶液洗脱(百分比是指体积百分比)，洗脱流速为2bv/h，直至洗脱液中检测不到骆驼蓬碱为止。收集全部洗脱液，减压浓缩，干燥得到骆驼蓬碱粗品8.2g，纯度≥40％。(3)将步骤(2)得到的骆驼蓬碱粗品经高压制备色谱(phplc)进一步纯化。配置流动相为甲醇和0.1％三氟乙酸水，流动相比例为(30:70)，制备柱为ods柱(sunfiretmprec18,5μm,10×250mm)，流速为15ml/min，检测波长210nm；具体操作如下：取8.2g的骆驼蓬碱粗品，加入40ml甲醇溶解，用微孔滤膜过滤不溶物，每次进样0.5ml，收集紫外最大吸收峰为216，259，377nm的色谱峰；反复如此制备，最后根据hplc检测收集到的目标馏分，将含有骆驼蓬碱的馏分合并，回收溶剂，干燥得到骆驼蓬碱935mg(其鉴定数据基本同实施例1)，纯度≥95％(其纯度分析条件同实施例1)。实施例3(1)取骆驼蓬子药材500g，用10000ml，50％乙醇水溶液(百分比是指体积百分比)，常压渗滤提取3次，每次30分钟。合并提取液，过滤，减压浓缩得到骆驼蓬子浓缩液500ml。(2)将步骤(1)得到的骆驼蓬子浓缩液500ml，过滤，上样于ab-8大孔吸附树脂上，上样流速为0.5bv/h，上样后用1bv的水洗脱除杂，然后用20％的乙醇水溶液洗脱(百分比是指体积百分比)，洗脱流速为2bv/h，直至洗脱液中检测不到骆驼蓬碱为止。收集全部洗脱液，减压浓缩，干燥得到骆驼蓬碱粗品7.8g，纯度≥40％。(3)将步骤(2)得到的骆驼蓬碱粗品经高压制备色谱(phplc)进一步纯化。配置流动相为甲醇和0.1％三氟乙酸水，流动相比例为(50:50)，制备柱为ods柱(sunfiretmprec18,5μm,10×250mm)，流速为5ml/min，检测波长210nm；具体操作如下：取7.8g的骆驼蓬碱粗品，加入40ml甲醇溶解，用微孔滤膜过滤不溶物，每次进样0.5ml，收集紫外最大吸收峰为216，259，377nm的色谱峰；反复如此制备，最后根据hplc检测收集到的目标馏分，将含有骆驼蓬碱的馏分合并，回收溶剂，干燥得到骆驼蓬碱920mg(其鉴定数据基本同实施例1)，纯度≥90％(其纯度分析条件同实施例1)。效果实施例取实施例1制备所得的骆驼蓬碱进行结构鉴定及纯度分析。1.结构鉴定骆驼蓬碱(harmaline)：黄色粉末，positive-esi-msm/z:215.09[m+h]；1h-nmr(400mhz,dmso)δ12.33(1h,s),7.67(1h,d,j＝8.8hz),6.92(1h,d,j＝2.2hz),6.85(1h,dd,j＝8.8,2.2hz),3.85(3h,s),3.85(1h,t),3.16(1h,t),2.66(3h,s)；13c-nmr(100mhz,dmso)δ165.2,160.7,142.5,125.6,124.5,123.0,118.7,114.0,93.7,55.4,41.6,18.8,18.4。2.骆驼蓬碱纯度分析hplc-uv检测条件：仪器：waterse2695型高效液相色谱仪(1260dad检测器)；色谱柱：分析柱(watersxselectcsh4.6×250mm，5μm)；柱温30℃；波长215nm；流速1.1ml/min；进样量20μl；流动相0.2％磷酸(d)-甲醇(a)体系。时间(分钟)0.2％磷酸甲醇0～487134～4587→4613→5445～48465448～5246→8754→1352～608713分析结果如下表所示：骆驼蓬碱的保留时间为21.873min，纯度为99.11％。当前第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