本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种提高莫能菌素产量的方法及应用。
背景技术：
：莫能菌素是由肉桂地链霉菌产生的聚醚类抗生素，主要用作家禽的抗球虫剂及反刍动物的增重剂，近年来发现其对于前列腺癌、卵巢癌和直肠癌也有很好的抑制效果。目前工业上获得莫能菌素的方法主要是培养肉桂地链霉菌，收集发酵液并提纯其发酵产物。鉴于莫能菌素的重要应用和较高的经济价值，构建肉桂地链霉菌工程菌株，在工业生产中提高莫能菌素的产量具有十分重要的意义。技术实现要素：本发明的目的是针对目前莫能菌素的生产现状，提供提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本发明的第二个目的是提供上述提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本发明的第三个目的是提供第二种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本发明的第四个目的是提供第二种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本发明的第五个目的是提供第三种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本发明的第六个目的是提供第三种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本发明的第七个目的是提供第四种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本发明的第八个目的是提供第四种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本发明的第九个目的是提供第五种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法。本发明的第十个目的是提供第五种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量中的应用。本发明的技术方案概述如下：一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的syndasr基因片段为模板，以seqidno.1所示序列为上游引物，以seqidno.2所示序列为下游引物，扩增syndasr基因；(2)将syndasr基因以酶切连接的方式，连接到pib139载体上，构建pzy1383载体；(3)将pzy1383载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02113。上述一种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。第二种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的synmonri基因片段为模板，以seqidno.3所示序列为上游引物，以seqidno.4所示序列为下游引物，扩增synmonri基因；(2)将synmonri基因以酶切连接的方式，连接到pzy1383载体上，构建pzy1384载体；(3)将pzy1384载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02114。上述第二种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。第三种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的synmonrii基因片段为模板，以seqidno.5所示序列为上游引物，以seqidno.6所示序列为下游引物，扩增synmonrii基因；(2)将synmonrii基因以酶切连接的方式，连接到pzy1383载体上，构建pzy1385载体；(3)将pzy1385载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02115。上述第三种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。第四种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的synmonh基因片段为模板，以seqidno.7所示序列为上游引物，以seqidno.8所示序列为下游引物，扩增synmonh基因；(2)将synmonh基因以酶切连接的方式，连接到pzy1383载体上，构建pzy1386载体；(3)将pzy1386载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02116。上述第四种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。第五种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建方法，用下述方法构建：(1)以合成的synmonrii基因片段为模板，以seqidno.5所示序列为上游引物，以seqidno.6所示序列为下游引物，扩增synmonrii基因；以合成的synmonh基因片段为模板，以seqidno.7所示序列为上游引物，以seqidno.8所示序列为下游引物，扩增synmonh基因；(2)将synmonrii基因以酶切连接的方式，连接到pzy1384载体上，构建pzy1384rii载体；(3)将synmonh基因以酶切连接的方式，连接到pzy1384rii载体上，构建pzy1387载体；(4)将pzy1387载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02117。上述第五种重组工程菌的构建方法在发酵提高莫能菌素产量的应用。本发明的技术效果：本发明的重组菌的构建方法提高了莫能菌素的产量，有利于降低莫能菌素的工业生产成本，提高经济效益。具体实施方式本发明各实施例所使用的肉桂地链霉菌来源于cgmcc7.240，感受态大肠杆菌为感受态dh5α。本发明使用的肉桂地链霉菌的保藏信息为：保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏时间：2017年10月10日。编号：cgmcc7.240。分类名称：肉桂色链霉菌(streptomycescinnamonensis)。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1一种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建和其发酵的方法，用下述方法构建和发酵：(1)以合成的syndasr基因片段为模板，设计如下引物：以seqidno.1所示序列为上游引物，以seqidno.2所示序列为下游引物，扩增syndasr基因；5’-ggaattccatatgggcaccgaggccgg-3’(下划线处为ndei酶切位点)；seqidno.15’-gctctagatcatcagtcggtcgggcgct-3’(下划线处分别为xbai酶切位点)；seqidno.250μlpcr反应体系为：10μl的5×buffer，5μldntps，5μldmso，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl基因组模板，1μl聚合酶，余量用纯净水补齐。pcr参数如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃+∞。扩增得到syndasr基因片段。用dna纯化试剂盒，回收pcr片段。(2)将syndasr基因以酶切连接的方式，连接到pib139载体(wilkinsoncj,hughes-thomasza,martincj,i,mironenkot,deaconm,wheatcroftm,wirtzg,stauntonj,leadlaypf(2002)increasingtheefficiencyofheterologouspromotersinactinomycetes.jmolmicrobiolbiotechnol4(4):417-426)上，构建了pzy1383载体；50μl酶切体系为：5μl10×buffer，30μl质粒或基因片段，5μl限制性内切酶，余量用纯净水补齐。37℃反应30min。反应结束后，用dna纯化试剂盒，回收酶切产物。用t4连接酶对基因片段和载体片段进行连接，22℃反应30min。连接产物转化感受态大肠杆菌，在lb固体培养基，加入安普霉素抗生素，混匀，铺平板。37℃培养，培养过夜，筛选阳性转化子。将构建好的载体用测序，确保序列的正确性。(3)将pzy1383载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02113。筛选步骤为：按照链霉菌遗传转化的常规方法，包括原生质体转化或大肠杆菌-链霉菌结合转移方法，将pzy1383载体转化到肉桂地链霉菌中。用安普霉素抗生素，筛选获得重组菌株。繁殖孢子，用20％甘油，在-80℃保存。(4)按照常规链霉菌的发酵工艺，制备平板孢子、液体种子，转接到发酵培养基中。在30℃，250r/min下培养10天，结束发酵。肉桂地链霉菌发酵培养基配方(100ml)：葡萄糖3.67g，硝酸钠0.22g，硫酸钠0.2g，硫酸铝0.007g，磷酸氢二钾0.0075g，硫酸亚铁0.01g，抗坏血酸：0.1g，混匀后用蒸馏水定容至100ml，每瓶分装25ml，再分别加入豆油665ml，低温黄豆粉0.4g，轻质碳酸钙粉末0.075g，调溶液ph至6.7-6.8。取第10天的各重组工程菌发酵液，离心，弃掉上清收集菌体。加入乙醇，涡旋震荡使菌体重悬，使用超声细胞破碎仪破碎细胞1h，离心，取上清，用0.22μm有机膜过滤，用于hplc分析。莫能菌素hplc检测条件：使用5μmc18(ods3)的柱子(250×4.6mm)；蒸发光散射检测器；流动相使用20mm的乙酸铵溶液(a)与纯甲醇(b)按照时间调整配比进行梯度洗脱，具体的配比方法为：0-25min，80-100％的b；25-30min，100-80％的b；柱温25℃；流速1.0ml/min。实施例2第二种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建和其发酵的方法，用下述方法构建和发酵：(1)以合成的synmonri基因片段为模板，设计如下引物：以seqidno.3所示序列为上游引物，以seqidno.4所示序列为下游引物，扩增synmonri基因；5’-gggaattccatatgcgctacgagatgctggg-3’(下划线处为ndei酶切位点)；seqidno.35’-gggaattccatatgtcatcagcggccggacagg-3’(下划线处为ndei酶切位点)；seqidno.4pcr反应体系和参数设置同实施例1(其中引物不同)。扩增得到synmonri基因片段。用dna纯化试剂盒，回收pcr片段。(2)将synmonri基因以酶切连接的方式，连接到实施例1获得的pzy1383载体上，构建pzy1384载体。酶切连接、转化、筛选阳性转化子和验证操作同实施例1步骤(2)的操作。(3)将pzy1384载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02114。筛选步骤同实施例1步骤(3)的筛选。(4)重组工程菌的发酵和其莫能菌素产量的测定步骤同实施案例1步骤(4)的发酵和测定。实施例3第三种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建和其发酵的方法，用下述方法构建和发酵：(1)以合成的synmonrii基因片段为模板，设计如下引物：以seqidno.5所示序列为上游引物，以seqidno.6所示序列为下游引物，扩增synmonrii基因；5’-ctagtctagaatgccgggcctgcgcgagcgcaa-3’(下划线处为xbai酶切位点)；seqidno.55’-ctagtctagatcatcacgggcgcaggtcctccagg-3’(下划线处为xbai酶切位点)；seqidno.6pcr反应体系和参数设置同实施例1(其中引物不同)。扩增得到synmonrii基因片段。用dna纯化试剂盒，回收pcr片段。(2)将synmonrii基因以酶切连接的方式，连接到实施例1获得的pzy1383载体上，构建pzy1385载体。酶切连接、转化、筛选阳性转化子和验证操作同实施例1步骤(2)的操作。(3)将pzy1385载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02115。筛选步骤同实施例1步骤(3)的筛选。(4)重组工程菌的发酵和其莫能菌素产量的测定步骤同实施案例1步骤(4)的发酵和测定。实施例4第四种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建和其发酵的方法，用下述方法构建和发酵：(1)以合成的synmonh基因片段为模板，设计如下引物：以seqidno.7所示序列为上游引物，以seqidno.8所示序列为下游引物，扩增synmonh基因；5’-ataagaatgcggccgcatgtccggcgtcgagcgcgg-3’(下划线处为noti酶切位点)；seqidno.75’-ataagaatgcggccgctcatcagcccagggcggcct-3’(下划线处为noti酶切位点)；seqidno.8pcr反应体系和参数设置同实施例1(其中引物不同)。扩增得到synmonh基因片段。用dna纯化试剂盒，回收pcr片段。(2)将synmonh基因以酶切连接的方式，连接到实施例1获得的pzy1383载体上，构建pzy1386载体。酶切连接、转化、筛选阳性转化子和验证操作同实施例1步骤(2)的操作。(3)将pzy1386载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02116。筛选步骤同实施例1步骤(3)的筛选。(4)重组工程菌的发酵和其莫能菌素产量的测定步骤同实施案例1步骤(4)的发酵和测定。实施例5第五种提高莫能菌素产量的重组工程菌的构建和其发酵的方法，用下述方法构建和发酵：(1)以合成的synmonrii基因片段为模板，以seqidno.5所示序列为上游引物，以seqidno.6所示序列为下游引物，扩增synmonrii基因；以合成的synmonh基因片段为模板，以seqidno.7所示序列为上游引物，以seqidno.8所示序列为下游引物，扩增synmonh基因；5’-ctagtctagaatgccgggcctgcgcgagcgcaa-3’(下划线处为xbai酶切位点)；seqidno.55’-ctagtctagatcatcacgggcgcaggtcctccagg-3’(下划线处为xbai酶切位点)；seqidno.65’-ataagaatgcggccgcatgtccggcgtcgagcgcgg-3’(下划线处为noti酶切位点)；seqidno.75’-ataagaatgcggccgctcatcagcccagggcggcct-3’(下划线处为noti酶切位点)；seqidno.8pcr反应体系和参数设置同实施例1(其中引物不同)。分别扩增得到synmonrii和synmonh基因片段，用dna纯化试剂盒，回收pcr片段。(2)将synmonrii基因以酶切连接的方式，连接到实施例2获得的pzy1384载体上，构建了synmonri，syndasr和synmonrii串联的pzy1384rii表达载体。酶切连接、转化、筛选阳性转化子和验证操作同实施例1步骤(2)的操作。(3)将synmonh基因以酶切连接的方式，连接到pzy1384rii载体上，构建了synmonri，syndasr，synmonrii和synmonh串联的pzy1387表达载体。酶切连接、转化、筛选阳性转化子和验证操作同实施例1步骤(2)的操作。(4)将pzy1387载体转化到肉桂地链霉菌，筛选，获得提高莫能菌素产量的重组工程菌st02117。筛选步骤同实施例1步骤(3)的筛选。(5)重组工程菌的发酵和其莫能菌素产量的测定步骤同实施案例1步骤(4)的发酵和测定。各重组工程菌的发酵结果见表1。表1重组工程菌的发酵效价菌株莫能菌素效价(mg/l)cgmcc7.240菌株556实施例1构建的菌st02113(导入pzy1383的重组菌)982实施例2构建的菌st02114(导入pzy1384的重组菌)1141实施例3构建的菌st02115(导入pzy1385的重组菌)1278实施例4构建的菌st02116(导入pzy1386的重组菌)1176实施例5构建的菌st02117(导入pzy1387的重组菌)1328序列表：syndasr序列:atgggcaccgaggccggctccaccggcaccgacgtctccgccccgtccgagggcccgtccgtcggccgcaccgcccgcgtcccgaagtactaccgcctgaagcgccacctgctggacatgaccgagaccctgccgccgggcaccccggtcccgccggagcgcaccctggccgccgagttcgacacctcccgcaccaccgtccgccaggccctgcaggagctggtcgtcgagggccgcctggagcgcatccagggcaagggcaccttcgtcgccaagccgaaggtctcccaggccctgcagctgacctcctacaccgaggacatgcgcgcccagggcctggagccgacctcccagctgctggacatcggctacatcaccgccgacgacaccctggccggcctgctggacatctccgccggcggccgcgtcctgcgcatcgagcgcctgcgcctggccaacggcgaggccatggccatcgagaccacccacctgtccgccaagcgcttcccggccctgcgccgctccctggtcaagtacacctccctgtacaccgccctggccgaggtctacgacgtccacctggccgaggccgaggagaccatcgagacctccctggccaccccgcgcgaggccggcctgctgggcaccgacgtcggcctgccgatgctgctgctgtcccgccactcccaggacggcgacggccgcccggtcgagtgggtccgctccgtctcccgcggcgaccgctacaagttcgtcgcccgcctgaagcgcccgaccgactgatgasynmonh序列:atgtccggcgtcgagcgcggcgtcggctccgccggcccggtcgagcagggcgacggcctggccggcctggtcgagcgcgccgaggccctggccgccctgcgcggcgccttcgacggctccccgggcaccggcggctccctggtcgtcctgtccggcgccgtcggcaccggcaagaccgccctgctgcgcgcctgggccgaccgcatcggcgccgacgccgacgccctggtcctgaccgccaccgcctgccgcgccgagcgcgacctgccgctgggcgtcctggagcagctggtccgctccccgggcctgccgccggcctccgccgagcgcgccctggcctggtgggacgaggaggcctccgccaccccgggcaagaccgacgccaacggcacctccgccaacggcaccgacgccaacggcaccggcgccggccagaccggcgccggccaggccggcgtcggccagaccggcgtcggcggcgagccggtcctggccgcctccgccctgcgcggcctgtgcgaggtcctgcgcgacctgctggccgagcgcccggtcgtcgtcgccgtcgacgacgcccaccacgccgacgccgcctccctgcagtgcctgctgtccgtcgtccgccgcctgcgctccgcccgcctgcacgtcctgttcaccgagtacgcccaccagaaggcccagaacgccctgctgtcctccgagttcctgcacgagccggccctgcgccgcatccgcctggagccgctgtccaaggccggcgtcgaggccctgctggcccgccacctggacgagcgcaccgcccaggacctgaccccggtcgtccacggcatgtccgccggccacccgctgctggtccgcgccctggccgaggaccaccgcgccgccggcggcgccggcgaggcctacggccgcgccgtcctgtccttcctgtaccgccacgagaccccggtcacccaggtcgcccgcgccatcgccgccctgggcgcccacgccggcccgggccaggtcggccgcctgctggacgtcgacgccgcctccgtcgagcgcgccgtccgccagctgaccgtcgccgaggtcctgcacgagggccgcctgtgccacccggccttcgccgccgccgtcctggacggcatgccgccggaggagcgccgcgccctgcacggccgcgtcgccgacctgctgcacgaggagggcgccccggccaccgaggtcgccgcccacctggtcgccgccgaccgctccgacgccccgtgggccgtcccggtcttccaggaggccgcccagctggccctggacgaggaccaggtcgagaccggcgtcgactacctgcgcgccgcccaccagcgctgccggggcgccgcccagcgcgccgccgtcgtcggcgccctggccgacgccgagtggcgcctggacccggccaaggtcctgcgccacctgccggacccggccgccatggccccgcagaccgacccggccgccctggccccgcacaccgacccggccccgaccgccgccccgaccgccgccccgaccccgaccccgatcccgaccaccccgccgctgccgacccacctgctgtggcacggccgcgtcgaggagggcctggacgccatcggcaccctgaccggcccgggcccgaacccggccggcgccccgccgatgaacccggccgacctggacaccccgtggctgtggggcgcctacctgtacccgggccacgtcaaggagcgcctgggctccggcgccctgtccccgcagcgctccaccccgccggccgtcaccccggagctgcagggcgccggcaccctgatgaacgacctgctgcacggcggcgagcgcgacgccaccgaggccgccgagcgcgccctgaaccgctaccgcctgggcccgcgcaccatcgccgtccagaccgccgccctggccgccctgacctaccgcgaccgcccgcaccgcgccgccgcctggtgcgacggcctggtcgcccaggccgacgagcgcaactccccgacctggcgcgccctgttcaccgcctggcgcgccctgctgcacctgcgccagggcgacccggccgccgccgagcagcgcgccgagaccgccctggccctgctgggctccaagggctggggcgccgccatcggcctgccgctggccgccgccgtccaggccaaggccgccctgggcgacgtcgacggcgccgccgccctgctggagcgcccggtcccgcaggccgtcttccagacccgcaccggcctgcactacctggccgcccggggccgctaccacctggccaccggctgccactacgccgccctgtgcgacttctacgcctgcggcacccgcatgtcctcctggggcgtcgacctgccggccctggagccgtggcgcctgggcgccgccgaggcctacctggccctgggcgagggcctgctggcccgccagctggtcgacggccagctgccgctgccgaccccggacgacggccgcacctggggcatgaccctgcgcctgcgcgccgccacctccccggccccggcccgcgccgagctgctggacgaggccgtcgccgtcctgcgcgagtccggcgacaccttcgagctggcccgcgccgtcgccgaccaggccgtcgccgtccgcgagggcggcgaggccgagcgcgcccgcctgctggcccgcaaggccgagctgctggcccgccgctggggctccgccccggccccggccaccgtcccggagccgccggagcgcccgggcccggccaccccggacgccgagctgacctccgccgagcgccgcgtcgccgagctggccgccgagggcttcaccaaccgcgagatctcccgcaagctgtgcgtcaccgtctccaccgtcgagcagcacctgacccgcatctaccgcaagctggacgtccgccgcctggacctgcaggccgccctgggctgatgasynmonri序列:atgcgctacgagatgctgggcccgctgcgcatcaaggacggcaacgactacgccaccatcaacgcccagaaggtcgagatcgtcctgaccgtcctgctgatccgcgccgaccgcgtcgtctccctggagcagctgatgcgcgagatctggggcgaggacctgccgcgccgcgccaccgccggcctgcacgtctacatctcccagctgcgcaagttcctgaaggtcccgggctccgccggcaacccggtcgagacccgcgccccgggctacgtcctgcacaagcgcgacgacgaccagatcgacgcccagatcttcccggagctggtcgacgtcggccgctccctgctgcgcgagaagcgcttcgacgaggccgcctcctgcttcggccaggccctggccctgtggcgcggcccgatcctgggccagggcggcaacggcccgggcaccaacggcccgatcatcgacggcttctccacctggctgaccgagatccgcctggagtgccaggagatgctggtcgagtgccagctgcagctgggccgccaccgcgaggccgtcggcatgctgtacgccctgaccgccgagaacccgatgtgcgaggccttctaccgccagctgatgctggccctgtaccgctccgagcgccaggccgacgccctgaaggtctaccagtccgtccgcaagaccctgaacgacgagctgggcctggagccgggccgcccgctgcaggagctgcagcgcgccatcctggccggcgacatgcacctgatgtccccgccgccgctggccctgtccggccgctgatgasynmonrii序列:atgccgggcctgcgcgagcgcaagaaggcccgcaccaaggccgccatccagcgcgaggccgtccgcctgttccgcgagcagggctacaccgccaccaccatcgagcagatcgccgaggccgccgaggtcgccccgtccaccgtcttccgctacttcgccaccaagcaggacctggtcttctcccacgactacgacctgccgttcgccatgatggtccaggcccagtccccggacctgaccccgatccaggccgagcgccaggccatccgctccatgctgcaggacatctccgagcaggagctggccctgcagcgcgagcgcttcgtcctgatcctgtccgagccggagctgtggggcgcctccctgggcaacatcggccagaccatgcagatcatgtccgagcaggtcgccaagcgcgccggccgcgacccgcgcgacccggccgtccgcgcctacaccggcgccgtcttcggcgtcatgctgcaggtctccatggactgggccaacgacccggacatggacttcgccaccaccctggacgaggccctgcactacctggaggacctgcgcccgtgatga当前第1页12