一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法及其发酵设备与流程

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法及其设备。

背景技术：

嗜酸乳杆菌一般通过液态发酵获得，对设备和控制要求比较严格，在高温干燥过程中极易死亡，生产上一般采用冻干的工艺，成本高昂。丁酸梭菌既可以通过液态发酵获得，也可以通过固态发酵获得，但目前国内生产水平普遍不高，成本比较高。固态发酵生产丁酸梭菌容易污染杂菌，也会降低原料的利用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵的生产方法，其能够利用嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌对杂菌的协同抑制作用，可以有效抑制杂菌的生长，有效控制生产过程中的杂菌。

本发明的另一目的在于提供一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵的生产设备，其可用于厌氧菌或兼性厌氧菌的固态发酵生产，可以提高活菌生长繁殖能力。

本发明是这样实现的：

一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法，其包括：在未灭菌的固态培养基上先接种嗜酸乳杆菌菌液进行发酵，再接种丁酸梭菌菌液进行发酵。

一种发酵设备，其用于上述嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法，其包括密闭的容器主体，容器主体设有单向出气口通道。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法，其包括：在未灭菌的固态培养基上先接种嗜酸乳杆菌菌液进行发酵，再接种丁酸梭菌菌液进行发酵。其能够利用嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌对杂菌的协同抑制作用，可以有效抑制杂菌的生长，有效控制生产过程中的杂菌，且可以在原料不灭菌的条件下，将嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌进行发酵，降低成本，实用性强。此外，本发明还提供一种发酵设备，其可用于厌氧菌或兼性厌氧菌的固态发酵生产，这种设备通过出气管，将挥发性代谢产物，如氢气、二氧化碳等排放到外界空气种，解除代谢抑制，可以释放活菌生长繁殖能力，提高发酵活菌数。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明第一实施例提供的发酵设备在第一视角下的结构示意图；

图2为本发明第一实施例提供的发酵设备在第二视角下的结构示意图；

图3为本发明第一实施例提供的发酵设备在第三视角下的结构示意图；

图4为本发明第一实施例提供的发酵设备的顶盖的结构示意图。

图标：10-发酵设备；100-容器主体；110-顶盖；200-出气管；201-通气孔。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法以及发酵设备进行具体说明。

一方面，本发明提供的嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法，其包括有以下步骤：

在未灭菌的固态培养基上先接种嗜酸乳杆菌菌液进行发酵，再接种丁酸梭菌菌液进行发酵。

嗜酸乳杆菌，属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中，释放乳酸、乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素，是益生菌。嗜酸乳杆菌是厌氧菌，其存活于人体整个胃肠道中，调节微生态环境。

丁酸梭菌，又名酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸菌，属于芽孢杆菌科，梭菌属，是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，其两端钝圆，中间部分轻度膨胀，细菌呈直杆状或稍有弯曲，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周身鞭毛。孢子卵圆，偏心或次端生。其具有调整肠道菌落平衡，促进肠道有益菌群增殖，增强免疫功能等特点。

上述嗜酸乳杆菌菌液是指，将酵母膏2～4份、红糖1～3份、豆粕粉0.5～1.5份、92～96份水混合均匀，调初始ph为7～8，110～130℃，灭菌20～40分钟，冷却至35～39℃，即为嗜酸乳杆菌液体培养基。取一支甘油管保藏的嗜酸乳杆菌菌种，按0.05～0.15％的接种量，将菌种接到嗜酸乳杆菌培养基中，逐级放大扩培，即为嗜酸乳杆菌菌液。

上述丁酸梭菌菌液是指，将葡萄糖1～3份，蛋白胨1～2份，酵母浸粉1～2份、硫酸铵0.05～0.15份、碳酸钠0.05～0.15份、玉米浆0.2～0.4份、硫酸锰0.03～0.07份、硫酸镁0.03～0.07份、水93～97份混合均匀，调初始ph7～8，110～130℃，灭菌20～40分钟，冷却至36～38℃，即为丁酸梭菌液体培养基。取一支甘油管保藏的丁酸梭菌菌种，按0.05～0.15％的接种量，将菌种接到丁酸梭菌培养基中，逐级放大扩培，即为丁酸梭菌菌液。

上述固态培养基是指，用天然的固体状物质制成的，在本发明的一些实施例中，固态培养基的发酵原料可以包括有麸皮粉23～27份、豆粕粉30～34份、玉米粉9.5～13.5份，优选地，豆粕粉以及玉米粉均经过破碎后，过40目筛。过40目筛是因为麸皮、豆粕、玉米等都是颗粒状原料，且颗粒较大，如果在发酵、干燥后，再进行粉碎，那么粉碎过程中，嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌将经历粉碎机高速运行时产生的剪切力和高温，影响菌体稳定性。且如果发酵前进行粉碎，那么发酵、干燥后，物料只是黏结在一起，就可以用剪切力和产热非常小的粗粉设备(辊式破碎机)进行破碎，避开了剪切力和高温，对菌体是一种保护。通过本发明提供的方法制成的活菌产品物理结构没有被严重破坏，活菌会更加稳定。

嗜酸乳杆菌的培养过程大多都是液态培养，由于肠道菌所生存的环境本身为固态或者半固态，且液体培养基培养后的嗜酸乳杆菌无鞭毛，不能运动，菌体过于密集，代谢产物浓度高，菌体的生长受到抑制。固态培养基相较于液态培养基，具又成本少，操作方便等优点。

在未灭菌的固态培养基上发酵，是因为嗜酸乳杆菌发酵糖类产生大量的酸、过氧化氢、丁二酮、细菌素等多种抑菌物质，降低发酵基质环境ph值，抑制致病菌的生长。而丁酸梭菌能够促进有益的双歧杆菌、乳酸菌、拟杆菌的生长，并且有效抑制有害菌葡萄球菌、念珠菌、克雷伯菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌和伤寒沙门氏菌以及腐败菌的繁殖。丁酸梭菌和双歧杆菌都能抑制梭菌的生长，并且与单独培养相比，两菌共同培养时显示出更强的生物拮抗作用。

固态培养基没有经过灭菌，先接种嗜酸乳杆菌，后接种丁酸梭菌，是因为丁酸梭菌在发酵过程中，产生大量丁酸和氢气，产生的代谢产物导致培养基逐渐黏结在一起。而嗜酸乳杆菌在发酵过程中，不会产生大量的黏性物质。如果先接种丁酸梭菌，那么在接种嗜酸乳杆菌时，混合不均匀，不利于发酵。如果先接种嗜酸乳杆菌，再接种丁酸梭菌，则在接种丁酸梭菌的时候，混合比较均匀，利于发酵。

进一步地，上述发酵原料还包括有碳酸钙1～3份、碳酸钠0.5～1.5份、硫酸锰0.01～0.05份、硫酸镁0.02～0.08份。

上述在未灭菌的固态培养基上先接种嗜酸乳杆菌菌液进行发酵是指，将固态培养基80～96份、水30～50份、嗜酸乳杆菌菌液4～6份，混合均匀后装入发酵设备中，装料系数87％～93％，进行发酵，然后，再接种丁酸梭菌的菌液4～6份，混合均匀后，再次装入发酵设备中，再发酵。发酵结束后，用低温流化床进行干燥，干燥过程中，物料温度不超过50℃，干燥后水分小于12％。用40目旋转振动筛过筛，筛下物，包装成品，筛上物用对辊式破碎机进行二次破碎后再过40目筛，筛下物，包装成品。采用辊式破碎机是因为其只有一个短暂的辊压过程，产热小，剪切力小，对菌体破坏小。且因为在发酵前，就已经将原料进行了粉碎，所以，发酵并干燥后，可以用辊式破碎机。

进一步地，在本发明的一些实施例中，嗜酸乳杆菌菌液与丁酸梭菌菌液的混合比为(0.8～1.2):(0.8～1.2)。换言之，在上述固态培养基上接种的嗜酸乳杆菌菌液与丁酸梭菌菌液的混合比等于或接近1：1。

进一步地，在固态培养上，接种嗜酸乳杆菌的菌液的发酵时间为6～12小时，接种丁酸梭菌的菌液后的发酵时间为24～36小时。

另一方面，本发明提供了一种发酵设备，其用于上述嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法，其包括容器主体，容器主体设有单向出气口通道。

进一步地，在本发明的一些实施例中，单向出气口通道为出气管，出气管的一端位于容器主体内，出气管的另一端设于容器主体外，出气管的位于容器主体外的一端设有单向透气阀封口。

具体地，出气管设于容器主体内的一端可以设有多个通气孔，通气孔的孔径为0.5～2mm。

容器主体的顶部还设有顶盖，出气管可以与顶盖连接。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

第一实施例

请参照附图1～2，本发明提供一种发酵设备10，其包括容器主体100，容器主体100设有单向出气口通道。

进一步地，在本实施例中，容器主体100为柱体结构，可以采用不锈钢材质、玻璃材质或瓷器，容器主体100的直径可以为300～1000mm，高300～1000mm，底部和圆周密封。

容器主体100用于容纳发酵原料进行发酵过程，容器主体100上设有单向出气通道是为了在发酵过程中，能够通气，排放丁酸梭菌发酵过程中产生的氢气，同时解除氢气对丁酸梭菌产生的代谢抑制。丁酸梭菌为严格厌氧菌，主要在物料底部发酵，如果没有排气通道，底部产生的氢气将会把物料顶起，直至顶出罐外。

进一步地，请参照附图3～4，单向出气口通道为出气管200，具体为多个出气管200，出气管200的一端位于容器主体100内，出气管200的另一端设于容器主体100外，出气管200的位于容器主体100外的一端设有单向透气阀封口。

具体地，出气管200设于容器主体100内的一端可以设有多个通气孔201，通气孔201可以使固态培养基中的所产生的废气及时排出，防止菌体发酵排出的气体抑制菌体的生长。通气孔201的孔径为0.5～2mm。当孔径小于0.5mm时，透气能力不足；孔径大于2mm时，发酵物料从孔中穿到孔管中，容易堵住出气管200。

进一步地，容器主体100的顶部还设有顶盖110，出气管200可以与顶盖110连接。因为气体是往上排，将出气管200设置于顶部有利于气体的排放。

本发明提供的发酵设备10优点在于，如果是在液态发酵罐中发酵，发酵过程中，必须往罐外排出氢气，否则，罐内压力将持续提高，高浓度的氢气抑制丁酸梭菌生长繁殖。如果是在普通固态发酵设备中进行发酵，如果无法排除氢气，发酵设备底部的氢气将会把物料顶出罐外，造成污染，导致发酵失败。该发明设计的设备，解决了固态发酵容器中氢气排放的问题，解除了氢气对丁酸梭菌的生长抑制，保持固态物料整体处于发酵容器中，始终是一个密闭隔氧的环境，丁酸梭菌的生长就是需要密闭隔氧的环境。

第二实施例

本实施例提供一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法。

将酵母膏3份、红糖2份、豆粕粉1份、94份水混合均匀，调初始ph7.5，121℃，灭菌30分钟，冷却至37℃，即为嗜酸乳杆菌液体培养基。取一支甘油管保藏的嗜酸乳杆菌菌种，按0.1％的接种量，将菌种接到嗜酸乳杆菌培养基中，逐级放大扩培，即为嗜酸乳杆菌菌液，检测酸乳杆菌的活菌数，得出嗜酸乳杆菌菌液活菌数为2.2亿cfu/g。

将葡萄糖2份，蛋白胨1.5份，酵母浸粉1.5份、硫酸铵0.1份、碳酸钠0.1份、玉米浆0.3份、硫酸锰0.05份、硫酸镁0.05份、水95份混合均匀，调初始ph7.5，121℃，灭菌30分钟，冷却至37℃，即为丁酸梭菌液体培养基。取一支甘油管保藏的丁酸梭菌菌种，按0.1％的接种量，将菌种接到丁酸梭菌培养基中，逐级放大扩培，即为丁酸梭菌菌液。检测丁酸梭菌的活菌数，得出丁酸梭菌活菌数为0.5亿cfu/g。

将麸皮、豆粕、玉米进行粉碎，全部过40目筛。将麸皮粉25份、豆粕粉32份、玉米粉11.5份、氯化钠0.5份、碳酸钙2份、碳酸钠1份、硫酸锰0.01份、硫酸镁0.05份混合均匀，混合固态物料(固态培养基)不灭菌，检测杂菌和霉菌的数量得出，发酵前，混合固态物料的霉菌总数低于5万cfu/g,杂菌总数低于10万cfu/g。

取混合固态物料88份、水40份、嗜酸乳杆菌菌液5份，混合均匀后装入第一实施例提供的发酵设备中，装料系数90％，盖上顶盖，密封，发酵6小时，再接种丁酸梭菌菌液5份，混合均匀后，再次装入该发酵设备中，盖上顶盖，再发酵26小时。

发酵结束后，用低温流化床进行干燥，干燥过程中，物料温度不超过50℃，干燥后水分小于12％。用40目旋转振动筛过筛，筛下物，包装成品，筛上物用对辊式破碎机进行二次破碎后再过40目筛，筛下物，包装成品。反复进行，直至全部通过40目筛。

发酵后，检测成品中嗜酸乳杆菌活菌数为42亿cfu/g，丁酸梭菌活菌数为11亿cfu/g，丁酸梭菌芽孢数为10亿cfu/g。

第三实施例

本实施例提供的一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法，原理与第二实施例提供的相同，区别在于参数不同，区别如下：

将酵母膏2份、红糖1份、豆粕粉0.5份、92份水混合均匀，调初始ph7，120℃，灭菌35分钟，冷却至36℃，即为嗜酸乳杆菌液体培养基。取一支甘油管保藏的嗜酸乳杆菌菌种，按0.08％的接种量，将菌种接到嗜酸乳杆菌培养基中，逐级放大扩培，即为嗜酸乳杆菌菌液。

将葡萄糖1份，蛋白胨1份，酵母浸粉1份、硫酸铵0.05份、碳酸钠0.05份、玉米浆0.2份、硫酸锰0.03份、硫酸镁0.03份、水93份混合均匀，调初始ph7.5，121℃，灭菌30分钟，冷却至36℃，即为丁酸梭菌液体培养基。取一支甘油管保藏的丁酸梭菌菌种，按0.1％的接种量，将菌种接到丁酸梭菌培养基中，逐级放大扩培，即为丁酸梭菌菌液。

将麸皮、豆粕、玉米进行粉碎，全部过40目筛。将麸皮粉25份、豆粕粉32份、玉米粉11.5份、氯化钠0.5份、碳酸钙2份、碳酸钠1份、硫酸锰0.01份、硫酸镁0.05份混合均匀，混合固态物料(固态培养基)不灭菌。

取混合固态物料88份、水40份、嗜酸乳杆菌菌液5份，混合均匀后装入第一实施例提供的发酵设备中，装料系数87％，盖上顶盖，密封，发酵8小时，再接种丁酸梭菌菌液4份，混合均匀后，再次装入该发酵设备中，盖上顶盖，再发酵24小时。

第四实施例

本实施例提供的一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法，原理与第二～三实施例提供的相同，区别在于参数不同，区别如下：

将酵母膏3份、红糖2份、豆粕粉1.5份、96份水混合均匀，调初始ph7，123℃，灭菌40分钟，冷却至38℃，即为嗜酸乳杆菌液体培养基。取一支甘油管保藏的嗜酸乳杆菌菌种，按0.12％的接种量，将菌种接到嗜酸乳杆菌培养基中，逐级放大扩培，即为嗜酸乳杆菌菌液，检测酸乳杆菌的活菌数，得出嗜酸乳杆菌菌液活菌数为2.2亿cfu/g。

将葡萄糖2份，蛋白胨1.5份，酵母浸粉2份、硫酸铵0.12份、碳酸钠0.15份、玉米浆0.4份、硫酸锰0.07份、硫酸镁0.07份、水97份混合均匀，调初始ph7.5，121℃，灭菌40分钟，冷却至38℃，即为丁酸梭菌液体培养基。取一支甘油管保藏的丁酸梭菌菌种，按0.11％的接种量，将菌种接到丁酸梭菌培养基中，逐级放大扩培，即为丁酸梭菌菌液。检测丁酸梭菌的活菌数，得出丁酸梭菌活菌数为0.5亿cfu/g。

将麸皮、豆粕、玉米进行粉碎，全部过40目筛。将麸皮粉25份、豆粕粉32份、玉米粉11.5份、氯化钠0.5份、碳酸钙2份、碳酸钠1份、硫酸锰0.01份、硫酸镁0.05份混合均匀，混合固态物料(固态培养基)不灭菌。

取混合固态物料88份、水40份、嗜酸乳杆菌菌液5份，混合均匀后装入普通发酵设备中，装料系数90％，盖上顶盖，密封，发酵8小时，再接种丁酸梭菌菌液6份，混合均匀后，再次装入该发酵设备中，盖上顶盖，再发酵26小时。

发酵结束后，用低温流化床进行干燥，干燥过程中，物料温度不超过50℃，干燥后水分小于12％。用40目旋转振动筛过筛，筛下物，包装成品，筛上物用对辊式破碎机进行二次破碎后再过40目筛，筛下物，包装成品。反复进行，直至全部通过40目筛。

发酵后，检测成品中嗜酸乳杆菌活菌数为20亿cfu/g，丁酸梭菌活菌数为5亿cfu/g，丁酸梭菌芽孢数为5亿cfu/g。

第五实施例

验证第二～四实施例中的嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵的发酵时间。

按照第一实施例提供的发酵方法，将酵母膏3份、红糖2份、豆粕粉1份、94份水混合均匀，调初始ph7.5，121℃，灭菌30分钟，冷却至37℃，即为嗜酸乳杆菌液体培养基。取一支甘油管保藏的嗜酸乳杆菌菌种，按0.1％的接种量，将菌种接到嗜酸乳杆菌培养基中，逐级放大扩培，即为嗜酸乳杆菌菌液，检测嗜酸乳杆菌菌液的活菌数。

将葡萄糖2份，蛋白胨1.5份，酵母浸粉1.5份、硫酸铵0.1份、碳酸钠0.1份、玉米浆0.3份、硫酸锰0.05份、硫酸镁0.05份、水95份混合均匀，调初始ph7.5，121℃，灭菌30分钟，冷却至37℃，即为丁酸梭菌液体培养基。取一支甘油管保藏的丁酸梭菌菌种，按0.1％的接种量，将菌种接到丁酸梭菌培养基中，逐级放大扩培，即为丁酸梭菌菌液，检测丁酸梭菌的活菌数。

将麸皮、豆粕、玉米进行粉碎，全部过40目筛。将麸皮粉25份、豆粕粉32份、玉米粉11.5份、氯化钠0.5份、碳酸钙2份、碳酸钠1份、硫酸锰0.01份、硫酸镁0.05份混合均匀，检测霉菌总数和杂菌总数。

混合固态物料(固态培养基)不灭菌。取该混合固态物料88份、水40份、嗜酸乳杆菌菌液5份，混合均匀后装入不锈钢桶中，装满，盖上顶盖，密封发酵。每隔1个小时，取样检测一次嗜酸乳杆菌活菌数。该检测试验重复三次。

再接种丁酸梭菌的菌液5份，混合均匀后装入不锈钢桶中，不装满，距离盖口10cm，盖上顶盖，继续发酵。每隔3小时取样检测一次丁酸梭菌活菌数和芽孢数。该检测试验重复三次。

2.结果分析

发酵前，嗜酸乳杆菌菌液的活菌数约1亿cfu/g，丁酸梭菌的活菌数约0.5亿cfu/g，混合固态物料的霉菌总数低于5万cfu/g,杂菌总数低于10万cfu/g。

发酵后，嗜酸乳杆菌的对数生长期为6～12h，所以选择6～12小时为嗜酸乳杆菌理想发酵时间，丁酸梭菌的对数生长期为18～24h，在发酵18h后，即开始形成少量芽孢，在发酵24h后，芽孢率大于70％，在发酵36h时，芽孢率大于90％，之后，芽孢率不再增加。所以选择24h～36h为丁酸梭菌发酵时间。

综上，本发明提供一种嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌混合发酵方法，其包括：在未灭菌的固态培养基上先接种嗜酸乳杆菌菌液进行发酵，再接种丁酸梭菌菌液进行发酵。其能够利用嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌对杂菌的协同抑制作用，可以有效抑制杂菌的生长，有效控制生产过程中的杂菌，且可以在原料不灭菌的条件下，将嗜酸乳杆菌和丁酸梭菌进行发酵，降低成本，实用性强。此外，本发明还提供一种发酵设备，其可用于厌氧菌或兼性厌氧菌，如丁酸梭菌、嗜酸乳杆菌等的固态发酵生产，这种设备通过出气管，将挥发性代谢产物，如氢气、二氧化碳等排放到外界空气种，解除代谢抑制，可以释放活菌生长繁殖能力，提高发酵活菌数。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。