用于合成大黄素的工程改造的宿主细胞和方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于合成大黄素的工程改造的宿主细胞和方法。更具体的，本发明涉及工程改造的宿主细胞和用于使用所述工程改造的宿主细胞微生物生物合成大黄素的方法。

背景技术：

大黄素主要存在于蓼科植物掌叶大黄（rheumpalmatuml.）、虎杖（polygonumcuspidatum）、何首乌（fallopiamultiflora）等植物的干燥的根、茎和叶中。大黄素为蒽醌类天然色素化合物，具有抗菌、抗炎、保护肝肾、利胆、促进胃肠蠕动、扩张血管及利尿等多种作用。大黄素主要通过调控炎症细胞因子，尤其是nf-кb活化达到抗炎效果，并且对人中性粒细胞无明显毒害作用。大黄素还可以减少肾小管对na⁺的重吸收，使尿钠明显增多，从而起到利尿的效果。大黄素对肠道运动具有双向调节作用，可达到调节性治疗肠麻痹和肠痉挛的效果。研究结果显示，大黄素能使血清透明质酸及层黏连蛋白显著降低，肝组织胶原蛋白含量明显减少，肝组织纤维化程度明显改善，肝细胞损伤减轻，为临床治疗急性肝炎提供了重要的药理依据。大黄素还表现出能够抑制癌细胞的dna、rna和蛋白质的生物合成，抑制癌细胞的氧化脱氢，从而达到抗肿瘤的效果。

大黄素已被确认可用于治疗ⅱ型糖尿病。

尽管大黄素拥有诸多功效作用，目前获取大黄素的方式仍局限于从天然植物中提取，一方面种植时间长、含量低、提炼工艺复杂，另一方面名贵中草药的养成受到环境等诸多复杂因素影响，而过度开采则会造成生态破坏。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种用于合成大黄素的工程改造的宿主细胞，实现低成本高效率获取大黄素。

本发明的另一目的在于提供一种使用工程改造的宿主细胞微生物生物合成大黄素的方法，该方法成本低，工艺简单且生产效率高。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于合成大黄素的工程改造的宿主细胞，所述宿主细胞包含以下核酸组合：

emoa和acte1；

或者包含emoa、acte1和acc1；

或者包含emoa、acte1和tpck；

或者包含emoa、acte1和hyp3；

或者包含emoa、acte1、acc1和tpck；

或者包含emoa、acte1、acc1和hyp3。

其中，emoa(emoa)是一类能够用于合成蒽醌类化合物，特别是大黄素的非还原性核酮糖聚合酶及其序列。

其中，acte1(acte1)是一种硫酯酶，特别是能够用于蒽醌类化合物合成的金属-β-内酰胺酶类型的硫酯酶及其序列。

其中，tpck(tpck)/hyp3(hyp3)是指一类脱羧酶及其序列。

大黄素分子式如下：

优选地，所述宿主细胞为细菌细胞或酵母细胞。

优选地，所述细菌细胞为大肠杆菌。

优选地，所述酵母细胞为酿酒酵母或毕赤酵母。

本发明的另一目的通过下述技术方案实现：

一种宿主细胞合成大黄素的方法，包括以下步骤：

（1）构建及培养宿主细胞，其中所述宿主细胞用emoa和acte1；或者用emoa、acte1和acc1；或者用emoa、acte1和tpck；或者用emoa、acte1和hyp3；或者用emoa、acte1、acc1和tpck；或者用emoa、acte1、acc1和hyp3转化；诱导工程改造的宿主细胞进行上述任意一组核酸组合的表达；

（2）对大黄素进行收集和分离纯化。

优选地，所述宿主细胞为酵母细胞，所述酵母细胞的培养方法包括以下步骤：

a1.培养所构建的工程菌酵母，先在含有6.7g/l酵母氮源、20g/l葡萄糖的酵母sc缺陷培养基中培养，并添加省却成分氨基酸混合物；30℃，250rpm下培养直至od600达到0.6；

a2.转移至含有ypd培养基中，根据培养效果调整培养温度、振荡频率和培养时间根；

a3.通过a2步骤培养所得的工程菌酵母在sc培养基中培养，并滴加相应的缺少成分，30℃，250rpm，直至od600达到1.0，添加入1%酵母提取物和2%蛋白胨，28℃，250rpm下持续发酵6~8天，得发酵液；

a4.发酵液通过3500rpm离心4-6分钟,收集细胞体，细胞体采用有机物提取，并于离心所得上清液混合后蒸发浓缩，随后进行分析。

优选地，所述添加省却成分氨基酸混合物的步骤具体为：含有1个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.77g/l-uradosupplement；含有2个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.72g/l-trp/-uradosupplement；含有3个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.62g/l-trp/-ura/-leudosupplement；含有4个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.60g/l-trp/-ura/-leu/-hisdosupplement。

本发明所述的宿主细胞可应用于生产大黄素。

本发明还提供一种用于扩增emoa的pcr引物，所述emoa扩增的正向引物基因序列如seqidno.1所示，emoa的反向引物基因序列如seqidno.2所示。

本发明还提供一种用于扩增acte1的pcr引物，所述acte1扩增的正向引物基因序列如seqidno.3所示，acte1的反向引物基因序列如seqidno.4所示。

本发明的有益效果在于：本发明通过对植物合成大黄素的代谢途径深入分析解剖，确认其合成的核心序列及功能酶，并在自然微生物资源中发掘出具有相同甚至更优秀效果的酶，进一步鉴定出其特有的基因序列特征，通过组合并利用宿主细胞表达的方式，实现低成本高效率获取大黄素。

附图说明

利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。

图1为本发明五种核酸组合的载体图谱，其中a为在指定载体的的限制性位点之间插入emoa基因序列，限制性位点可以选择为nhei和pmli，b为在指定载体的的限制性位点之间插入acte1基因序列，限制性位点可以选择为ndei和pmei，c为在指定载体的的限制性位点之间插入acc1基因序列，限制性位点可以选择为ndei和pmei，d为在指定载体的的限制性位点之间插入tpck或hyp3基因序列，限制性位点可以选择为ndei和pmei，f为在指定载体的的限制性位点之间组合插入tpck、acte1、npga基因序列，根据基因功能的保持选择相应的限制性位点，限制性位点包括ndei、noti、asci和snabi。

图2为大黄素的液相分析鉴定图，其中线框内部分为大黄素，可以看到，通过本发明的基因信息并通过组合优化，可以有效提高大黄素的产量。

图3为大黄素紫外图谱。

图4为大黄素质谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，见附图1-4。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1构建工程改造的宿主细胞

1.1设计特定引物序列获取相应的基因片段，emoa及acte1的概述引物序列如表1所示。acc1(genbankaccessionnumbercaa96294.1)，tpck(genbankaccessionnumberq4wqy7.1)，hyp3(genbankaccessionnumberaiw00659)，上述基因信息可通过查询获取并设定引物实现。其中引物可以根据基因序列信息自行设计，并不局限于此处说明的引物。emoa的相似序列同样具有本发明合成大黄素的相关功能，并不局限于本发明所公开的序列。

表1中各引物基因序列的下划线部分为限制性位点。

通过常用的生物技术手段构建表达大黄素的途径，通过pcr将上述的基因组序列进行扩增，构建如图a-f的载体，并转化至选用的酵母菌株中。

本实施例中，emoa与原生合成大黄素的基因序列同源性为80%.

实施例2培养宿主细胞及收集细胞体

2.1培养所构建的酵母，先在含有6.7g/l酵母氮源、20g/l葡萄糖的酵母sc缺陷培养基中培养。其中，含有1个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.77g/l-uradosupplement；含有2个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.72g/l-trp/-uradosupplement；含有3个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.62g/l-trp/-ura/-leudosupplement；含有4个质粒的工程菌酵母培养时在培养基中添加0.60g/l-trp/-ura/-leu/-hisdosupplement，30℃，250rpm下培养直至od600达到0.6。

2.2再转移至含有10g/l酵母提取物和20g/l蛋白胨的ypd培养基中，30℃，250rpm，72小时。上述培养基成分、培养温度、振荡频率和培养时间可根据培养效果适当调整。

2.3通过2.2培养所得的工程酵母菌在sc培养基中培养，并滴加相应的缺少成分，30℃，250rpm，直至od600达到1.0，添加入1%酵母提取物和2%蛋白胨，28℃，250rpm下持续发酵7天。

2.4发酵液通过3500rpm离心5分钟并收集细胞体，细胞体使用乙酸乙酯和甲醇进行有机物提取，并于离心所得上清液混合后蒸发浓缩，待进行分析。

实施例3样品分析

3.1使用agilent1200hplc分析样品，在agilenteclipseplusc18（5μm,4.6mm×250mm）上分离化合物，并在420nm检测。流动相由含有0.1%三氟乙酸的乙腈/水组成。梯度程序为在45分钟内，乙腈/水的体积比由10%提升至90%，流速为1ml/min。

大黄素的分离化合物氢谱（500mhz）分析数据（dmso-d6）如表2所示：

大黄素的分离化合物碳谱（125mhz）分析数据（dmso-d6）如表3所示：

本发明合适的宿主细胞可以是，例如，细菌细胞和酵母细胞。合适的细菌细胞可以是，例如，大肠杆菌。合适的酵母细胞类型可以是，酵母（saccharomyces）和毕赤酵母（pichia）。特别合适的酵母可以是，例如，酿酒酵母（saccharomycerevisiae）。特别适合的毕赤酵母可以是，例如，巴斯德毕赤酵母。

本发明的工程改造的宿主细胞和使用所述工程改造的宿主细胞微生物生物合成大黄素的方法，用于生产大黄素，成本低且生产效率高。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

<110>杭州唯铂莱生物科技有限公司

<120>用于合成大黄素的工程改造的宿主细胞和方法

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<213>人工序列

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