一种多肽止血材料的制作方法

本发明属于医学材料技术领域，具体涉及一种多肽止血材料。

背景技术：

在日常生活中，由于外伤、手术等情况下导致大量出血的状况，如果不及时止血，可能会引起感染和创伤加剧，因此控制出血是急救和创伤治疗的重要步骤。合适的止血材料能明显缩短手术时间，对创伤或术后恢复至关重要。在选择止血材料时应当多方面综合考虑，包括出血部位，术腔形态大小，不同渗出血情况的填塞要求，不同止血材料的止血机制，与机体的相容性，患者的凝血功能和经济条件等。

目前局部止血材料主要包括沸石类、多聚糖类如壳聚糖和生物材料类如明胶等。沸石类效果好、成本低但有放热反应且颗粒不易除去；多聚糖类生物相容性好但对伤口大小形状等有要求；因此需要作为止血敷料或止血剂的材料要具备良好的止血性能，优良的生物相容性，无毒副作用，无刺激性，易于加工成型等。

技术实现要素：

本发明提供一种多肽止血材料，在与血液接触后就能形成凝胶状态，具有快速止血功能，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种多肽，其氨基酸序列为如下：asp-glu-leu-lys-val-cys(n)-ile(m)-cys(n)-glu-leu-lys-val-arg(简写为：delkvc(n)i(m)c(n)elkvr)；

其中m为1-2，n为2-3；

作为实施例的一种具体记载，所述的多肽的氨基酸序列为asp-glu-leu-lys-val-cys-ile-cys-glu-leu-lys-val-arg(delkvcicelkvr，seqidno:1)；

作为实施例的另一种具体记载，该多肽的氨基酸序列如下：asp-glu-leu-lys-val-cys-cys-ile-cys-cys-glu-leu-lys-val-arg(delkvcciccelkvr，seqidno:2)；

作为优选，所述的多肽的氨基酸序列如下：

asp-glu-leu-lys-val-cys-cys-cys-ile-ile-cys-cys-cys-glu-leu-lys-val-arg(delkvccciicccelkvr，seqidno:3)。

本发明所提供的多肽用于制备止血制品。

本发明提供了一种多肽，该多肽与血液相接触的时候会形成凝胶态，具有快速止血功能。该多肽生物可降解、生物相容性良好，质量易于控制；其次，止血过程不受正常凝血机制影响，对使用抗凝剂的病人、血小板和全血细胞低的病人仍能发挥止血作用。

附图说明

图1：氨基酸序列为seqidno:3的多肽的原子力显微镜(afm)形貌图，

图2：氨基酸序列为seqidno:3的多肽的原子力显微镜(afm)形貌图。

具体实施方式

首先对本发明所涉及的术语及方法进行描述：

1、氨基酸：氨基酸根据其酸性基团(羧基)和碱性基团(氨基，胍基，咪唑基)的多寡而分为酸性氨基酸，碱性氨基酸和中性氨基酸。酸性氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸有精氨酸，赖氨酸和组氨酸。中性氨基酸：就是除了酸性氨基酸和碱性氨基酸外的氨基酸。其中20种氨基酸的中文名、三字母和单字母对照如下：

甘氨酸glyg；丝氨酸sers；丙氨酸glaa；苏氨酸thrt；缬氨酸valv；异亮氨酸ilei；亮氨酸leul；酪氨酸tyry；苯丙氨酸phef；组氨酸hish；脯氨酸prop；天冬氨酸aspd；甲硫氨酸metm；谷氨酸glue；色氨酸trpw；赖氨酸lysk；半胱氨酸cysc；精氨酸argr。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：多肽的设计及合成

本发明设计的短肽通过非共价键相互作用，使该短肽能在缓冲液中自组装形成纤维结构。其氨基酸序列为asp-glu-leu-lys-val-cys(n)-ile(m)-cys(n)-glu-leu-lys-val-arg(简写为：delkvc(n)i(m)c(n)elkvr)；其中m为1-2，n为2-3。

通过生物公司合成如下三种多肽：

p1多肽的氨基酸序列为asp-glu-leu-lys-val-cys-ile-cys-glu-leu-lys-val-arg(delkvcicelkvr，seqidno:1)；

p2多肽的氨基酸序列如下：asp-glu-leu-lys-val-cys-cys-ile-cys-cys-glu-leu-lys-val-arg(delkvcciccelkvr，seqidno:2)；

p3多肽的氨基酸序列如下：

asp-glu-leu-lys-val-cys-cys-cys-ile-ile-cys-cys-cys-glu-leu-lys-val-arg(delkvccciicccelkvr，seqidno:3)。

合成时多肽的n端进行乙酰化修饰，c端进行氨基化修饰；合成的纯度为95.5％。合成的初始样品为白色冻干粉，使用前无须经过特殊处理。使用时将精密称量后的短肽冻干粉末加入到超纯水中配制成浓度为20mg/ml的母液，密封并避光储存在4℃冰箱中备用，后续使用时将其直接稀释成相应浓度短肽溶液。

实施例2：凝血活性的测定

首先从志愿者采集血液，血液装入含有0.9ml枸橼酸钠的离心管中，混合均匀后血液样本以3000r/min离心10min得到待测血液。

在96孔微孔板中，采用倍比稀释方法进行。首先在每个孔中加入20μl的10mmol的hepes缓冲液(ph7.4)，取合成的多肽溶液(初始浓度为10mg/ml)20μl加入到第一实验孔中；混均后，取20μl加入到第二孔中；混合均匀后，再20μl加入到第三孔中，以此类推作倍比稀释；

然后再每孔中加入40μl的待检测血液，添加结束后再混合仪上震动混均5min，室温下放置1小时后，肉眼检测凝集结果，凝血活性单位定义为表现凝血活性的最高稀释倍数的倒数。结果表明氨基酸序列为seqidno:1的多肽，其最高稀释倍数为6倍，即凝血活性为12；氨基酸序列为seqidno:7的多肽，其最高稀释倍数为8倍，即凝血活性为16；而氨基酸序列为seqidno:3的多肽，其最高稀释倍数为9倍，即凝血活性为18。

上述结果表明上述氨基酸序列为seqidno:1-3的多肽都具有体外凝血活性，且seqidno:3的凝血活性最佳，推测与异亮氨酸和半胱氨酸的数目多少有关系。

实施例3：

对氨基酸序列为seqidno:3的多肽进行原子力显微镜(afm)的检测：

将30μl的多肽溶液置于新解离的云母片上，室温下吸附10秒左右，用超纯水冲洗吸附后的云母片去除多余的溶液，用氮气轻轻吹扫确保云母片干燥。利用原子力显微镜观测组装体的形貌图，实验中采用tesp型探针(veeco,santabarbara,ca)在轻敲模式下扫描云母片表面，扫描速率为1-1.5hz，数字分辨率512×512，利用afm自带软件(nanoscope5.31r1)对图像进行检测。

对氨基酸序列为seqidno:3的多肽进行透射电子显微镜(tem)的检测：

将30μl的多肽溶液滴在封口膜上，然后将300目的镀碳铜网贴放在样品上约30秒，用干净的镊子取出铜网，并用滤纸吸干铜网周围多余的液体静置晾干，然后将吸附有两亲性短肽的铜网一面贴附在2％的乙酸双氧铀溶液液滴(同样品溶液相同放置在封口膜上)上进行负染约1分钟，用镊子取出铜网将多余的液体用滤纸吸干静置晾干。采用jeoljem-2100uhr型电子显微镜观测形貌，加速电压为200kv

其结果显示，通过原子力显微镜和透射电子显微镜观察到的多肽溶液都显示为纤维结构(图1和图2)。

实施例4大鼠受损肝切面止血实验

择sd大鼠10只，雄雌各半，随机分为2组，每组5只小鼠。全部动物均采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为30mg/kg。开腹，用手术剪将大鼠左叶肝肝缘部分切除，形成长1.5cm、深0.2cm的创面，建立大鼠肝脏缺损模型。

将20mg/ml的短肽p3母液用10mmol的hepes缓冲液(ph7.4)稀释为10mg/ml的短肽p3溶液；和棉签用于sd大鼠受损伤肝切面止血，记录出血量和止血时间，以评价材料在实验模型中的止血效果。

1)实验用棉纱组(n＝5，对照组)：大鼠麻醉后，小心解剖，用消毒刀片在其肝叶上划切适当大小伤口，伤口自然流血5s后，用棉签将血擦掉，再用已经剪好大小的灭菌棉纱压住伤口，轻轻按压30s后，期间用棉签吸取周围渗出的血液，移开棉纱观察伤口表面的流血情况，如在10s内伤口继续出血的话，则继续用棉纱按压止血直至止血完成为止。

2)多肽组(n＝5，实验组)：大鼠麻醉后，小心解剖，用刀片在其肝叶上划切适当大小伤口，伤口自然流血5s后，用棉签将血擦掉，此时将已准备好的短肽溶液注入伤口，观察出血情况，期间用棉签吸取周围渗出的血液直至止血。

观测结果表明，多肽溶液与血液接触后很快即在受损伤肝脏表面形成一透明凝胶状物质，粘附于受损伤表面，封闭出血创面，使大量血液包裹在创面和凝胶之间，能够快速达到止血效果；棉纱覆盖创面，阻止血液流出；表明本发明的多肽组与对照组(棉纱组)相比产生的止血作用起效快、止血效果确切，能显著减少对大鼠受损伤肝切面出血的失血量，明显缩短止血时间，因此，可将其发展为一种适于临床使用的实质性脏器出血的生物止血材料。

序列表

<110>青岛大学医学院附属医院

<120>一种多肽止血材料

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>13

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aspgluleulysvalcysilecysgluleulysvalarg

1510

<210>2

<211>15

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aspgluleulysvalcyscysilecyscysgluleulysvalarg

151015

<210>3

<211>18

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aspgluleulysvalcyscyscysileilecyscyscysgluleulys

151015

valarg