本发明属于生物医学领域，更具体地，涉及一种luc-gfp标记的高转移性人肝癌细胞系及其在原位肝癌模型中的应用。
背景技术：
：原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc，简称肝癌)是全球发病率占第六位、死亡率占第三位的恶性肿瘤。我国是肝癌的高发国，每年新发肝癌约35万例，每年死于肝癌的人数约32万人，已上升至城市和农村恶性肿瘤病死率的第二和第一位。肝癌侵袭转移与复发是患者死亡的主要原因之一。因此，探索肝癌侵袭转移与复发的机制，寻求有效抑制肝癌转移与复发的药物具有重要意义，而建立自发转移且观察方便的人肝癌裸鼠模型是研究人肝癌的复发与转移规律、评价抗肝癌药物疗效的基础。复旦大学肝癌研究所已建立了高转移人肝癌细胞系mhcc97h、hcclm3以及高转移人肝细胞癌裸鼠模型等、为肝癌治疗、转移复发研究提供了有效的手段，但这些模型不能连续、直观地观察原位肿瘤及肺和腹腔转移灶，定量也不够准确。活体成像技术利用一套非常灵敏的光学检测仪器，让研究人员能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面。活体成像技术主要采用荧光(fluorescence)与生物发光(bioluminescence)两种技术。荧光发光采用荧光报告基团(gfp、rfp、cyt及dyes等)进行标记，需要激发光使得荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的发射光，但是生物体内很多物质在受到激发光激发后，也会发出荧光，产生的非特异性荧光。荧光发光不需要底物，费用低廉，操作简单。生物发光是将荧光素酶(luciferase)基因整合到细胞染色体dna上以表达荧光素酶，在atp及氧气存在时，外源(腹腔或静脉注射)给予底物荧光素(fluorescein)，荧光素酶催化荧光素的氧化反应产生发光。作为体内报告源，生物发光在动物体自身不会发光，具有极低的背景。申请公布号为cn102399748a的专利公开了一种表达绿色荧光蛋白和荧光素酶胃癌细胞株，通过将多种慢病毒包装质粒pwpt-gfp，pmd2.g，pspax2，plenti-cmv-puro-luc，vsvg和pcmv-dr8.91按照一定比例用脂质体法转染293t细胞，经过两次转染，获得含有绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶慢病毒颗粒，再以人胃癌细胞系为母细胞，用上述病毒感染，获得稳定表达绿色荧光蛋白和荧光素酶的阳性克隆；所述方法需要用到多种慢病毒包装质粒，且各个质粒需要按照一定比例要求，需要经过两次转染，不仅步骤繁琐，费时费力，而且转染效率不高，有一定的局限性。同时，转染载体的构建也影响着转染结果，病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题(如基因污染)。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要。目前还没有见有成功构建稳定表达荧光素酶(luc)和绿色荧光蛋白(gfp)的人肝癌细胞株的报道。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，通过一步转染法，首先构建稳定表达荧光素酶(luc)和绿色荧光蛋白(gfp)的人肝癌细胞株hcclm3-luc-gfp，采用肝内细胞悬液移植法和肿瘤组织块移植法建立luc-gfp标记的高转移性人肝癌细胞裸鼠原位肝癌模型，通过非侵袭性的生物发光成像技术(bioluminescencetomography)和激发荧光成像技术(fluorescencemoleculartomography)在活体水平观察两种方法建立的裸鼠原位肝癌模型肿瘤生长和转移情况，为活体动物水平监控肿瘤的生长、评价治疗效果以及肿瘤的转移分析提供了一种新的有用工具。本发明的目的是提供一种luc-gfp标记的高转移性人肝癌细胞株。本发明的第二个目的是提供所述luc-gfp标记的高转移性人肝癌细胞株在原位肝癌模型中的应用。本发明的上述目的通过以下技术方案给予实现：luc-gfp标记的高转移性肝癌细胞株，其特征在于，是以肝癌细胞为母细胞，通过慢病毒转染包装有pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro的病毒液，再经嘌呤霉素筛选，获得稳定表达gfp并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株。优选地，所述pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro是以psicheck-2载体为模版，扩增luc基因，再将luc基因重组连接到pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp-t2a-puro载体上构建而得；所述luc基因的序列如seqidno：3所示。优选地，所述luc基因的pcr扩增引物包括上下游引物，其序列依次如seqidno：1～2所示。优选地，在慢病毒转染过程中加入终浓度为4～8μg/ml聚凝胺，一定浓度的聚凝胺可提高转染效率，但是需要考虑其剂量对细胞的毒性。优选地，所述病毒液的mol为8～12。优选地，是先将肝癌细胞株培养于含10％fbs的mem培养基中，再取状态良好的对数生长期肝癌细胞按5×104cell/孔接种于24孔板中，过夜培养后进行慢病毒转染；健康的细胞培养物是成功转染的基础，不同细胞有不同的培养基，血清和添加物，本发明研究发现含10％fbs的mem培养基对肝癌细胞的培养最为适宜，另外，高的转染效率需要一定的细胞密度。优选地，所述肝癌细胞株为人肝癌细胞株。更优选地，所述人肝癌细胞株为高转移性人肝癌细胞hcclm3。本发明还请求保护所述luc-gfp标记的高转移性肝癌细胞株在构建原位肝癌模型中的应用；以及所述luc-gfp标记的高转移性肝癌细胞株在筛选或评估治疗肝癌药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明通过慢病毒转染包装有pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro的病毒液，再经嘌呤霉素筛选，只需一次转染就获得稳定表达gfp并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株。利用本发明luc-gfp标记的高转移性人肝癌细胞，通过细胞悬液法和肿瘤组织块转接法分别建立裸鼠原位肝癌模型，其肝癌模型成瘤率均为100％，肺转移率分别100％和80％，为活体动物水平监控肿瘤的生长、评价抗肝癌转移药物的疗效奠定基础，具有较大的应用前景。附图说明图1为pcr扩增luc基因电泳图；m：200bpdnaladder，1～4：p1、p2为引物扩增的luc基因片段。图2为重组表达载体酶切鉴定图；m1：200bpdnaladder，m2：dl10000dnamarker，1～4：pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro质粒、xbaⅰ单酶切、bamhi单酶切、xbaⅰ和bamhi双酶切。图3为慢病毒转染后荧光显微镜检测；a：白光，b：荧光。图4为未转染细胞荧光显微镜检测；a：白光，b：荧光。图5为肝癌细胞悬液法原位移植瘤的手术过程。图6为肝癌肿瘤组织块法原位移植瘤的手术过程。图7为细胞悬液接种法的活体荧光成像。图8为肿瘤组织块法的活体荧光成像。图9为肝脏肿瘤和肺转移灶实体观察；a为细胞悬液法肿瘤块均匀分布于肝脏，b为肿瘤组织块法肿瘤聚集生长不能渗透于整个肝脏，c为肺组织固定后颜色发黄，肺转移灶是白色。图10为正常肝组织和原位肝癌模型建立后肝脏肿瘤he染色；a为正常肝组织，b为原位肝癌组织。图11为正常肺组织和和原位肝癌模型建立后肺转移灶he染色；a为正常肺组织，b为肝原位癌肺组织。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。mem培养基、胰酶消化液和澳洲胎牛血清(fbs)购自gibco公司，荧光素酶底物-d-荧光素钾盐购自上海翊圣生物科技有限公司。人肝癌细胞株(hcclm3)购自中国典型培养物保藏中心(武汉)，由本实验室保存。spf级balb/c裸小鼠，6～8周龄，雄性，体重18～22g，购于广东省医学实验动物中心【scxk(粤)2013-0002】。实验地点为广东药科大学实验动物中心【syxk(粤)2012-0125】。手术器械：手术剪，眼科弯镊、直镊，持针钳，缝合针(4×10)，0#7缝合线；主要仪器：atp荧光检测仪，小动物活体成像系统，荧光倒置相差显微镜。实施例1人肝癌细胞株hcclm3-luc–gfp的构建1、pcr扩增luciferase基因(1)根据psicheck-2载体上luciferase(luc)基因序列(seqidno：3)和慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp-t2a-puro上多克隆位点设计2条特异性引物：p1：5'-tgctctagaatggaagacgccaaaaacataaaga-3'(seqidno：1)p2：5'cgcggatccttacacggcgatctttccgcccttc-3'(seqidno：2)(注：p1引物中的“tctaga”为xbai酶切位点，；引物p2中的“ggatcc”为bamhi酶切位点)。(2)以psicheck-2载体为模版，引物p1、p2扩增大小1653bpluciferase基因序列。在luciferase序列两端分别引入限制性内切酶xbaⅰ和bamhi位点。引物由上海英潍捷基公司合成。结果显示，以psicheck-2载体为模版，以p1、p2为引物，pcr扩增含有xbaⅰ和bamhi限制性内切酶位点和大小为1653bp的luciferase基因序列。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，在1.6～1.8kb之间，有清晰的特异性目的条带，大小与理论值相符。2、构建pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro重组表达载体限制性内切酶xbaⅰ和bamhi双酶切pcr扩增的luc基因产物，经琼脂糖凝胶电泳分离和dna纯化回收获得的目的基因luc，连接到经相应内切酶酶切的慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp-t2a-puro上，构建重组表达载体pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro，并转化到dh5α感受态中，经抗生素筛选、酶切鉴定后送去测序。pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro载体构建好送去广州赛哲生物股份有限公司进行病毒包装。结果显示，经xbaⅰ和bamhi双酶切鉴定，得到2个片段(如图2所示)，在1.6～1.8kb之间的luc基因，在7.0kb～10.0kb之间的pcdh-cmv-mcs-ef1-gfp-t2a-puro载体片段，酶切结果与预期相符。测序结果与psicheck-2载体上luc基因序列比较分析，目的基因无突变，pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro重组表达载体构建成功。3、luc-gfp标记的人肝癌细胞hcclm3-luc-gfp的构建及鉴定(1)人肝癌细胞株hcclm3培养于含10％fbs的mem培养基中，取状态良好的对数生长期细胞按5x104cell/孔接种于24孔板中，过夜后转导，加入总体积250μl，含50μl包装有pcdh-cmv-luc-ef1-gfp-puro的病毒液(moi＝10)及6μg/mlpolybrene的完全培养基，4h后补加入250μl新鲜培养基以稀释polybrene。24h更换为500μl不含病毒液的完全培养基，72h后倒置荧光显微镜观察细胞荧光发光情况。结果显示，慢病毒转染hcclm3细胞后72h，在倒置荧光显微镜白光下观察，与未转导的细胞形态没有明显差异，生长状态良好；在激发光下观察，转染后的hcclm3细胞有明显绿色荧光，且荧光较均匀的分布于整个细胞，能较好地显示细胞的形态轮廓，而未转染的没有荧光(图3，图4所示)(2)向转导后的hcclm3细胞添加并每2～3天更换含有5μg/mlpuromycin的完全培养基，每天观察细胞形态及荧光发光情况，至无抗性细胞完全死亡，在含浓度5μg/ml的puromycin的完全培养基继续扩大培养，消化调整细胞数为8x105/ml作为初始细胞数，倍比稀释4个梯度。取200μl上述不同密度的细胞悬液分别加入终浓度150μg/ml荧光素酶底物，立即放入荧光检测仪中进行检测。结果显示，随着细胞数量的增加，转染组的荧光值逐渐增多(表1)，且转染组的荧光值远远大于空白对照组。表1体外荧光素酶活性测定浓度对照组转染组8×10520.2295827.254×10520.5645955.972×10521.5612801.601×10522.385543.15表明获得稳定表达gfp并具有荧光素酶活性的高转移性人肝癌细胞株hcclm3-luc-gfp；按上述方法重复多次后，均可获得稳定表达的人肝癌细胞株hcclm3-luc-gfp，可见上述构建方法具有较好的稳定性和重复性。对比例1采用cn102399748a专利中的慢病毒包装质粒pwpt-gfp，pmd2.g，pspax2，plenti-cmv-puro-luc，vsvg和pcmv-dr8.91和构建方法构建luc–gfp标记的人肝癌细胞株hcclm3；结果发现，转染效率很低，且获得的阳性细胞株的遗传性能不稳定，这可能与不同细胞的细胞周期及培养性状不同相关。应用例1裸鼠原位肝癌模型的构建1、裸鼠原位肝癌模型的构建(1)细胞悬液注射法取实施例1构建成功的对数生长期的hcclm3-luc-gfp细胞，胰酶消化，用无血清的mem培养基重悬，调整细胞密度为5×107/ml；取6～8周龄雄性balb/c裸鼠，腹腔注射50mg/kg戊巴比妥溶液麻醉；沿左肋缘下方开腹，切口控制1cm左右，暴露肝脏左叶；用28g的无菌微量进样器分别抽取10μl、20μl、50μl细胞悬液，缓慢注射入肝脏，无菌棉签轻压止血，将肝脏轻轻送回腹腔，7-0缝合线全层缝合腹壁关腹(过程如图5所示)。整个手术操作在无菌超净台内进行，麻醉苏醒后放回笼中spf条件饲养，每天观察裸鼠术后状态。(2)肿瘤组织块植入法皮下移植瘤的建立：将处于对数生长期的hcclm3-luc-gfp细胞，用0.25％的胰酶消化后，1000rpm离心5min，用mem无血清培养基重悬细胞使浓度为2×107cell/ml，取100μl细胞悬液接种于裸鼠右肢腋下。待皮下瘤有明显生长，直径约6mm左右，无菌条件下分离皮下肿瘤块，剥去周围包膜，在无菌生理盐水中切成1mm×1mm×1mm备用。瘤组织离体后30min内植入裸鼠肝脏。肝原位肿瘤组织种植：取6～8周龄雄性balb/c裸鼠，用50mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉。仰卧固定，左肋缘下全层切开腹壁长约1cm左右，暴露肝脏，用尖头眼科镊沿肝脏包膜刺一隧道，植入上述切好的肿瘤组织块，压迫止血1min，将肝脏轻轻送回腹腔，7-0缝合线全层缝合腹壁关腹(过程如图6所示)。整个手术操作在无菌超净台内进行，麻醉苏醒后送回spf笼内饲养，每天观察裸鼠术后状态。2、活体成像观察荷瘤裸鼠肿瘤生长情况细胞悬液注射或肿瘤组织块植入裸鼠肝内后第一周(1w)、第二周(2w)、第三周(3w)、第四周(4w)和第五周(5w)，按荷瘤裸鼠体重，腹腔注射相应体积的150mg/kg荧光素酶底物工作液和50mg/kg戊巴比妥麻醉剂混，将裸鼠腹面朝上摆放于tanon5200mμlti活体成像系统暗箱内，分别在生物发光和绿色荧光下成像，检测荷瘤裸鼠肿瘤进展情况，根据发光的强弱比较两种方法构建的裸鼠原位肝癌模型以及不同发光技术的差异。结果显示，细胞悬液注射法构建裸鼠肝癌模型第1w即可通过活体成像系统检测到生物发光信号，随着时间的延长，荧光信号逐渐增强，在接种后第5w荧光信号达到最强(图7a)，细胞接种量为10μl第3w有远处转移(图7c)，细胞接种量为20μl第1w有远处转移(图7e)，然而gfp标记在肝原位发光不明显(图7b、d、f)。肿瘤组织块植入法构建裸鼠肝癌模型接种后的第2w于种植部位可见生物发光发光信号，随着时间的延长即肿瘤的生长而信号逐渐增强(图8)。3、病理解剖观察荷瘤裸鼠肿瘤形态及肺转移情况第35天成像结束后，深度麻醉裸鼠，打开腹腔和胸腔，观察肝脏肿瘤组织的大体形态、生长浸润情况以及远处转移情况。取肺，用bouin‘s液(苦味酸饱和液(0.9～1.2％)75ml；冰醋酸5ml；40％甲醛25ml)固定24h后，无水乙醇浸泡洗脱12h，观察肺转移灶。发现两种方法肝脏上都有灰白色的肿瘤组织，表面呈结节状，质地较硬，独立或弥漫分布在肝表面和肝边缘处，部分结节可融合成较大的结节。如图9a所示细胞悬液法肿瘤块均匀分布于肝脏，图9b所示肿瘤组织块法肿瘤聚集生长不能渗透于整个肝脏，图9c，肺组织固定后颜色发黄，肺转移灶是白色。4、肿瘤组织he染色观察取荷瘤裸鼠肝脏和肺脏，经10％福尔马林固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，制成5μm切片，经二甲苯和乙醇脱蜡水化后，苏木素-伊红(he)染色，中性树脂封片，光学显微镜观察肝脏肿瘤和肺转移灶的病理情况。病理切片经he染色后观察如图10、图11所示，肝肿瘤组织区域均呈现细胞排列不规则，呈实体性团块状，核大深染的现象，具有明显的异型性；肺组织中肿瘤组织块法肺泡明显不规则且皱缩，细胞悬液法中发现细胞排列呈片状，胞浆少，裸核状周围有坏死。序列表<110>广东药科大学<120>luc-gfp标记的高转移性人肝癌细胞株及其在原位肝癌模型中的应用<130>1714779zbsh042<141>2017-12-15<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>34<212>dna<213>人(homosapiens)<400>1tgctctagaatggaagacgccaaaaacataaaga34<210>2<211>34<212>dna<213>人(homosapiens)<400>2cgcggatccttacacggcgatctttccgcccttc34当前第1页12