本发明涉及纳米材料与基因干扰领域，具体地说，涉及一种通过昆虫体壁渗透dsRNA干扰昆虫基因表达的方法。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference，RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA分子)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。这些特殊设计的外源dsRNA分子，能够特异、高效、持久地降低特定基因的表达，对于研究未知基因功能、调控昆虫的发育和行为、保护植物免受病毒侵害具有重要意义。RNA干扰已作为一种重要手段，被广泛应用于各类基因功能鉴定、功能基因表达调控领域。同时，由于dsRNA分子高度的特异性、释放后易降解等特性，使其成为一种专门靶向害虫的、对非靶标生物安全的遗传学控制策略。
由于昆虫免疫系统的防卫和器官基底膜与细胞膜的屏障，外源 dsRNA分子难以高效进入昆虫体内细胞；再加上昆虫种类多、基因种类多，注射法和饲喂法应用dsRNA常常效果不佳。其中，dsRNA分子的细胞吸收率低是昆虫基因RNA干扰效果不佳的重要因素之一。注射法和饲喂法是目前最普遍的将dsRNA分子导入细胞的方法，通过显微注射器直接将dsRNA分子注射入昆虫体内指定部位，但对于体积微小、体液较多的昆虫，虫体的机械创伤和术后感染不可避免，且对注射仪器和操作技术要求较高，仅限于中、大型昆虫的实验室科学研究，操作难度高、不利于大量昆虫的实验研究工作，更无法在农田中推广使用。饲喂法相对于注射法具有操作简便，创伤小且耗时少等优点，但饲料中的dsRNA分子穿透昆虫肠道围食膜和肠细胞膜屏障效率低，大量外源dsRNA分子随粪便排出，导致靶标基因的干扰效率低、 dsRNA用量大、成本高等缺点；且有些昆虫缺乏有效的人工饲料，饲喂法容易造成昆虫营养不良和死亡，增加误差，影响实验结果的准确度。
近年来，纳米科技迅猛发展，在农业领域应用迅速发展，其中之一就是利用纳米载体的靶向传输与控释功能，递送核酸药物(DNA 或RNA)至昆虫体内，打破昆虫体内的器官基底膜和细胞膜屏障和肠道围食膜屏障，促进细胞吸收外源核酸分子，提高外源核酸分子的作用效率。目前已在注射法和饲喂法中取得成功应用，纳米载体递送 dsRNA分子能够大幅度提升对昆虫基因的干扰效率。
但即便如此，仍然存在显微注射方式易引起昆虫内部组织受伤、体液流失甚至死亡，而饲喂方式难以排除昆虫因营养不良造成误差的问题。
因此，开发一种无需注射和饲喂即可高效干扰昆虫基因表达的方法，对研究未知基因功能、调控昆虫的发育和行为、保护植物免受病毒侵害具有重要意义。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，弥补注射法和饲喂法中的缺陷，本发明目的是提供一种通过昆虫体壁渗透dsRNA干扰昆虫基因表达的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种通过昆虫体壁渗透dsRNA干扰昆虫基因表达的方法，将纳米载体与dsRNA功能大分子络合，借助表面活性剂的作用，实现外源dsRNA分子在昆虫体表附着、展布、渗透体壁并进入体内各种器官组织，高效干扰基因表达。
所述方法具体包括如下步骤：
1)将纳米载体溶液、dsRNA溶液与表面活性剂混合，得到复合体药液；
2)将所述复合体药液置于昆虫体表。
进一步地，在所述步骤1)中，所述纳米载体溶液中的纳米载体与所述dsRNA溶液中的dsRNA按照电荷比为1:8～8:1的比例混合得到混合液，并将所述表面活性剂与所述混合液按照0.01％～10.0％的体积比混合。
在这个混合过程中，所述纳米载体与所述dsRNA通过静电作用、和/或氢键、和/或范德华力的作用结合成为稳定的载体/dsRNA分子复合体。借助表面活性剂发挥的浸润、除脂作用，溶化昆虫体表蜡质层，降低表皮抗御性，使所得的复合体药液液滴易于吸附至昆虫体表并穿透昆虫体壁进入体腔、组织和细胞内，从而高效干扰靶标基因的表达。
更优的，为了提高混合效率，优选所述纳米载体与所述dsRNA按照电荷比1:1的比例混合得到混合液，并将所述表面活性剂与所述混合液按照1％的体积比混合。
进一步地，本发明所述的dsRNA为能够特异性降解同源 mRNA(信使RNA)的双链RNA分子，不限于其片段大小和二级结构种类。
本发明所述的纳米载体为内部具有空腔结构，且表面携带正电荷的纳米载体，优选为外围具有高密度亲水性官能团(如氨基、羧基等) 的纳米载体。
所述纳米载体的内部空腔结构和高密度官能团结构有利于 dsRNA分子的装载形成稳定复合体，同时保护dsRNA分子生物大分子免受生物体内酸、碱环境的损害和酶的降解。
所述纳米载体的递送作用，促进昆虫体表均匀展布的dsRNA分子穿透昆虫体壁进入体腔、组织和细胞。
所述纳米载体经过亲水性官能团(包括氨基、羧基等)功能化，易与昆虫表皮、细胞膜的亲水性蛋白质组分“相似相溶”，提高所载物质与载体与昆虫表皮和细胞膜的亲和力，促进dsRNA分子穿透昆虫表皮屏障，进入体腔和各个器官组织的细胞内，干扰细胞内靶标基因的表达。
本发明所述的表面活性剂可选自各类天然表面活性剂、有机合成表面活性剂及其衍生物如洗涤剂、洗洁精等。
所述表面活性剂一方面可以破坏昆虫防御蜡质层，增加药液渗透力，另一方面可以降低水相药液表面张力，在喷洒、滴加时更易于昆虫体壁的吸附、展布，扩大受药面积。
在本发明的具体实施方式中，使用市售可得的金鱼洗涤剂作为表面活性剂，但本发明所述的表面活性剂不局限于此，只要具有润湿、乳化和除脂作用中的任一性质，能够降低载体/dsRNA分子复合体药液的表面张力，促进液滴在昆虫体壁油状界面(护蜡层)的浸润和铺展，溶解表皮层中的脂质组分，破坏蜡质层，破坏昆虫体表的抗御功能，促进复合物顺利穿透体壁进入体腔即可。
进一步地，本发明方法所述的步骤2)具体可通过滴加法、喷雾法、浸泡法等施药方法将所述复合体药液加到昆虫体表，包括用适当大小的器具(如移液枪、显微注射针、小型喷雾器等)滴加到昆虫体表，或直接浸泡昆虫。
本发明所述方法直接从昆虫体表渗透导入dsRNA分子，操作简便、快速，避免了传统的注射法、饲喂法导入dsRNA分子引起的基因干扰效率低、不稳定、死亡率高等缺点；同时，特殊设计的载体能够装载dsRNA分子穿透昆虫体壁屏障、进入昆虫体腔内各种器官组织细胞内，高效发挥dsRNA分子的靶标和基因干扰作用，调控昆虫的生长、发育和生殖等生命活动。这种方法能够大幅提高基因干扰效率、显著降低dsRNA分子损耗、无操作创伤、操作简单、安全，为基于RNA 干扰的昆虫基因功能解析实验研究和农田应用dsRNA制剂喷雾防治害虫提供了良好的技术支撑。
第二方面，本发明提供一种按照前述方法制备的复合体药液，以及所述复合体药液在干扰基因表达中的应用。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明借助纳米载体和表面活性剂的双重增效作用，实现外源 dsRNA分子高效、无创导入虫体细胞内。纳米载体的内部空腔结构和外部正电荷基团与核酸分子可通过静电作用、和/或氢键、和/或范德华力而相互吸引，自由络合形成稳定的复合物，载体外围高密度氨基官能团可增强复合物对昆虫体壁表皮层、体内细胞膜等结构的亲和力，加之表面活性剂的浸润和分散作用，有利于复合物溶液形成稳定、均一、表面张力小的药液液滴，促进液滴在昆虫体表附着、展布和滞留，促进dsRNA分子穿透昆虫体壁向体腔渗透、并进入虫体内各种组织和细胞内，最终促进dsRNA分子正确靶向，提升RNA干扰效率。本发明所述方法简单、高效、误差小，对昆虫基因干扰科学研究工作和高效安全、靶向型RNA农药制剂的应用具有重要的实际意义。
本发明所述方法的优势至少包括：
1.适用范围广泛。相比传统的饲喂法和注射法，本发明的昆虫体壁渗透法，不受昆虫口器类型、食物来源、体型大小、体液多少的限制，均能得到良好的应用。
2.操作简便、快速。相比传统的注射法，本发明了省略麻醉、定点、注射、消毒等术前准备和术后善后工作，仅涉及配制混合液和昆虫体表滴加、浸泡或喷雾简单操作，1小时内即可完成，对实验仪器、操作技术容忍度高，易于推广和普及。
3.零死亡、误差小。相比传统的注射法，本方法属无创操作，规避因注射法或饲喂法导入dsRNA分子造成的营养不良、机械损伤、术后感染等不良反应，可保证对照组100％存活率，大幅减少系统误差和个人操作误差对实验结果准确度的影响，尽可能地保证每次操作的有效性，提高工作效率。
4.干扰效率高。纳米载体和洗涤剂的双重增效作用，可保证药液中dsRNA分子能够快速穿透昆虫体壁进入靶标细胞中正确靶向，高效调控基因表达，使昆虫生长、发育畸形，产卵下降甚至死亡，无论是基于RNA干扰的昆虫功能基因解析还是针对害虫的遗传学控制都具有良好的应用价值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述复合体药液的制备方法，具体如下：
1、原料：
(1)纳米载体：本实施例以专利号为201310119837.3公开的荧光纳米载体分子为例，载体内部的荧光核具有高荧光量子产率，良好的光、热和化学稳定性，有利于在生物体内示踪，各个侧链之间形成很好的空腔结构以及带有大量特异性官能团有利于dsRNA分子的结合和组装、并形成稳定dsRNA分子/载体复合体，整个复合体具备良好昆虫细胞亲和性，有利于dsRNA分子快速进入细胞靶向靶标基因。
(2)dsRNA：针对脂肪体中合成的基因进行干扰的dsRNA。
按照Promega提供的体外合成dsRNA标准方法，采用该公司提供的T7RiboMAX Express RNAi System试剂盒合成dsRNA，dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(3)无菌水，一般市售产品。
(4)表面活性剂：采用市售可得的金鱼牌洗涤剂。
2、方法：
(1)将纳米载体采用无菌水配制成浓度为1.0mg/mL的纳米载体溶液。
(2)将dsRNA配制成浓度为600.0ng/μL的dsRNA溶液。
(3)取1.5μg的纳米载体溶液与1.0μg的dsRNA溶液于离心管中混合，通过涡旋振荡使两种物质充分接触，两种分子通过静电作用、氢键和范德华力作用下结合成为稳定的载体/dsRNA分子复合体药液。
(4)加入1％体积的表面活性剂，用枪头吹打混合至均匀，，以便降低后续药液液滴表面张力，形成小体积的药液液滴滴加至昆虫体表。
实施例2
本实施例用于说明如何利用实施例1所述的复合体药液递送 dsRNA进入小型刺吸式口器昆虫大豆蚜中，干扰关键基因表达并控制大豆蚜产卵。
本实施例采用大豆蚜为代表性被试昆虫。其腹部充满体液，显微注射dsRNA分子引起大豆蚜内部组织受伤、大部分体液流失而死亡；植食性大豆蚜缺乏营养全面的人工饲料，饲喂大豆蚜dsRNA分子难以排除供试蚜虫因营养不良造成的误差；其体积微小，体长约2μm，在施药过程中，易被雾化不充分的大体积药液淹死。本实施例以RNA 干扰操作较为困难的大豆蚜为代表性被试昆虫，试图阐明本发明的关键技术。
具体操作如下：
1、利用移液枪反复吹打实施例1制备得到的复合体药液，促进乳化，用适当量程的显微注射器形成10nL～100nL的小液滴并黏附、滴加到大豆蚜体表，洗涤剂中的表面活性剂分子在液滴表面吸附，取代液滴-空气界面的水分子，使液滴分子受力不均的现象减弱，降低液滴表面张力，液滴在大豆蚜体表的油脂界面迅速展布，分布在昆虫体表的表面活性剂疏水部分向内插入体壁脂质组分中，亲水部分朝外，改变昆虫体表的疏水性，进一步促进其对水溶性载体液滴的吸附和吸收。为了更好体现本发明中洗涤剂的作用，引入去除洗涤剂的药液对照处理1：载体/无菌水，处理2：载体/无菌水/洗涤剂，对大豆蚜进行表面渗透处理，对照处理1中药液由于表面张力作用难以吸附在油状表皮界面，难以吸收；处理2中由于洗涤剂的浸润作用药液在蚜虫均匀展布，药液被大豆蚜快速吸收。
为了表明本方法中载体渗透大豆蚜体壁进入体内的渗透效果，1 小时后，在光显微镜检测蚜虫体表和体内的载体定位，此前先用无菌水洗涤整个大豆蚜虫体3-4次，以除去虫体表面的残留物质。
于显微镜下清晰观察到处理2(载体/无菌水/洗涤剂)药液中的荧光纳米载体在整个蚜虫虫体均有分布，而对照处理1(载体/无菌水) 中整个虫体体表均未检测到载体荧光。
将两种处理中蚜虫解剖于荧光显微镜下观察体内组织中载体定位：对照处理1中(载体/无菌水)组织并未检测到载体荧光信号，处理2(载体/无菌水/洗涤剂)中检测到载定位到大豆蚜的各个重要组织：与生殖产卵相关卵室、胚胎，与能量代谢、储存运输相关的脂肪体，以及与消化吸收相关的肠道等。说明本发明所述方法中的表面活性剂能够促进载体水溶液在昆虫体壁油脂界面的吸附、展布和渗透。
2、昆虫体壁渗透法递送dsRNA分子、高效干扰昆虫基因的表达：为了更好地体现本发明中洗涤剂和载体双重增效促进外源dsRNA分子高效、无创导入虫体细胞内干扰基因表达的作用。引入dsRNA分子进行基因干扰实验，对照处理1：载体/无菌水/dsRNA、对照处理2：洗涤剂/无菌水/dsRNA、处理3：载体/洗涤剂/无菌水/dsRNA。以脂肪体中合成的基因为靶标基因设计的dsRNA分子，按照上述方法通过体壁渗透法将3种处理的药液递送到大豆蚜体内脂肪体，48小时后检测基因干扰效率并观察大豆蚜表型。采用本发明所述方法滴加复合体药液处理的大豆蚜的靶标基因在转录水平被抑制，处理3中靶标基因在转录水平被抑制，相对表达量下降超过95％,而对照处理1、对照处理 2中被干扰的靶标基因表达量未出现显著性变化。
同时，相比对照处理1，对照处理2，处理3中大豆蚜正常生长发育受阻，产蚜量下降或停止产蚜，大豆苗中大豆蚜虫口密度显著下降。这表明在洗涤剂和纳米载体的双重增效作用下，外源dsRNA分子能够穿透昆虫的体壁屏障、器官基底膜屏障、细胞膜屏障，快速进入细胞内发挥基因干扰作用，调控昆虫的生命活动，使昆虫生长发育受阻，生殖力下降。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
本发明实施例1所述的纳米材料仅为举例，可替换为专利号为 201310095194.3的中国专利公开的水溶性荧光树枝状大分子，或专利号为201310456288.9的中国专利公开的水溶性超支化荧光聚合物，或专利号为201410258179.0的中国专利公开的荧光树枝状纳米大分子等。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种通过昆虫体壁渗透dsRNA干扰昆虫基因表达的方法
<141> 2017-12-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 493
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tacgtcattt atttgttcca agtccgagtt caatgaattt aatatcttac cggcgtacca 60
cacgtgtccg aatatcggcg actgtccgga aaacagaatc tattacgacg gatgttgcga 120
acagtgcaac aacacgggaa tcattaaaac agaggaccat agtctttgcg ctccagagag 180
cttacccata aatcaaacag tcggtctagt aacagaagac aatccattcc atgatgcgtg 240
cacgaatatc gaaggcatag ttgggttcac ggagtgtcgg ggtctttgcg attcatacac 300
gtatttcaat aaaaaaacaa taaaacacga ttcgaaatgt caatgttgtc agccaatccg 360
tttcgataaa ttgtctgtgg tgttacagtg caaagatggt tatcagtata acaagtctgt 420
tccagtgccg tcggcttgtt cttgtacggc gtgtggcgga gagagctttt cgataaaaaa 480
atccagaaaa ctt 493