一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法与流程

文档序号：14705819发布日期：2018-06-15 23:24阅读：358来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法。

背景技术：

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)，是指携带植物目的基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导内源基因的mRNA发生特异性降解，使该基因发生转录水平后的基因沉默，相应表型发生变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。与传统遗传转化的方法相比，VIGS技术是一种免去大规模筛选突变体，能够在当代完成目的基因验证，操作简单、适用于植物基因功能分析，成为了功能基因组学研究领域很有吸引力的技术手段之一。

VIGS技术被广泛用于植物的生长发育、抗病虫、代谢调控等相关基因的功能研究中。VIGS技术也被应用于不同类型的植物，如烟草、拟南芥、矮牵牛、番茄、大豆、小麦、草莓等，但多局限在一、二年生的草本植物上，在木本植物方面有较少的应用。由于木本植物本身生理结构特点，植物生长周期较长，造成VIGS技术难以在木本植物中应用。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术中的不足，本发明提供了一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，实现简单、快速、鉴定月季RhPDS基因。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法，包括如下步骤：

1)构建重组病毒质粒pTRV2-RhPDS；

2)利用所述重组质粒pTRV2-RhPDS通过电击转化法转化农杆菌GV3101，含有pTRV1和pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液，按照1:1混合，制备侵染液；

3)将所述侵染液避光室温静置活化4小时后分别使用高压喷枪法侵染4片复叶的月季植株、使用真空渗透法侵染2片复叶的扦插苗和生根组培苗；

4)将所述步骤3)中侵染后的月季植株和扦插苗经暗处理24小时之后置于常规栽培基质，在植物培养室分别培养60天和30天，将所述步骤3)中侵染后的生根组培苗栽种到生根培养基中进行无菌培养30天；

5)从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面对所述步骤4)中培养后的月季植株、扦插苗和组培苗进行分析比较，从而得到VIGS沉默体系的优化方案。

进一步，步骤1)中构建重组质粒pTRV2-RhPDS的方法为：

步骤一，提取月季的总RNA并进行反转录,得到cDNA；

步骤二，用酶切引物对所述cDNA进行PCR扩增,得到RhPDS基因386bp片段；

步骤三，对所述PCR扩增产物和pTRV2质粒进行双酶切，采用连接酶进行过夜连接，重组质粒转化入大肠杆菌中扩繁，然后提取重组质粒，进行双酶切验证。

进一步，所述步骤二中所述PCR扩增时的引物1的核苷酸序列为序列表中序列2，所述引物2的核苷酸序列为序列表中序列3。

进一步，所述步骤2)中制备侵染液的过程为：将分别含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上培养36-48小时，挑取各自单菌落，于5ml含有相同种类和浓度的LB液体培养基培养24小时，转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、200μM AS、10mM MES的200ml LB培养基中培养过夜；当菌液的OD600约为0.8时，4000rpm离心10分钟，用含有200μM AS、10mM MES、10mM MgCl2的悬菌液分别收集菌液,调节各个菌液OD600均为1.0，将含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2的农杆菌GV3101菌液、含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液按照1:1混合，避光室温静置活化4小时后，侵染液制备完成。

进一步，所述步骤3)中所述高压喷枪法的方法为：对4片复叶时期的月季植株叶片的正面和背面喷射，直到有菌液渗透为止，随后用灭菌去离子水冲洗2次，侵染完成；所述高压喷枪法侵染的压力为75psi。

进一步，所述步骤3)中的真空渗透法的方法为：在真空泵中，将2片复叶时期的月季扦插苗和已经生根月季组培苗浸没在侵染液中，真空状态下反复抽吸两次，每次一分钟，最后用灭菌去离子水冲洗2次，侵染完成。

进一步，所述步骤5)中RhPDS基因的相对表达量采用qRT-PCR方法进行分析，步骤如下：选取pTRV2-RhPDS侵染过的植株提取总RNA，并反转录为cDNA，在RhPDS基因沉默片段以外设计得到引物3、引物4，以18S为内参基因扩增内参基因引物为引物5、引物6，采用qRT-PCR分析检测，得到RhPDS基因的相对表达量。

进一步，所述步骤4)中的生根培养基包括50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢霉素、1/2MS、0.05mg/LNAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂。

一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法得出的优化方案，采用月季组培苗通过真空渗透法侵染。

本发明的有益效果为：

本实验成功构建pTRV2-RhPDS重组载体，并分别采用高压喷枪法对月季植株进行侵染、采用真空渗透法对扦插苗以及组培苗进行侵染，通过统计表型数据、RhPDS基因qRT-PCR表达分析，从而比较得出针对于月季的VIGS技术体系的更优方法。结果显示，采用真空渗透法侵染组培苗是最为快速、高效的实验方法。为之后VIGS技术体系在月季上的大规模应用奠定了基础。

附图说明

图1是RhPDS基因片段的PCR扩增结果电泳图；

图2是pTRV2-RhPDS重组载体双酶切检测电泳图；

图3是喷枪法侵染月季植株表型图；

图4是真空渗透法侵染月季扦插苗表型图；

图5月季扦插苗不同处理下RhPDS基因的相对表达量；

图6是真空渗透法侵染月季组培苗表型图；

图7月季组培苗不同处理下RhPDS基因的相对表达量。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

1、材料与方法

1.1、材料

选用的月季品种为‘karina’；盆栽植株在温室中常规养护直至4片复叶；扦插条在培养基质中生根，在温室中常规养护直至长出两片复叶；组培苗选自北京农学院组培试验中心正常生长的生根组培苗。购置商品化的pTRV1和pTRV2载体。

1.2载体构建

1.2.1带有酶切位点的RhPDS基因片的扩增

采用多糖多酚RNA快速提取试剂盒提取月季叶片中的总RNA，再采用cDNA反转试剂盒反转录为cDNA。以RhPDS基因为模板设计引物，设计引物时引入EcoR I、BamH I酶切位点序列，

引物1：PDS-F1：CGCGGATCCCTCCCACAGGCTTAGTGAAAA；(序列表2)

引物2：PDS-R1：CCGGAATTCGGACTGAACTCCGTCGTTCT。(序列表3)

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶检测并回收目的条带，经测序验证后，得到386bp的片段，用于下一步实验。

1.2.2pTRV2-RhPDS重组载体的构建及验证

采用内切酶BamH I和EcoR I对带有酶切位点的386bp的RhPDS基因片段(完整基因序列见序列表6)扩增产物和pTRV2质粒进行双酶切，将双酶切产物分别经琼脂糖凝胶检测并回收目的条带后，采用T4DNA连接酶进行过夜连接，将连接产物转化到E.coli DH5α中，选取阳性克隆菌液进行测序验证，并提取重组质粒pTRV2-RhPDS(完整基因序列见序列表1)，进行双酶切验证。

1.3侵染方法

将质粒pTRV1、pTRV2、重组质粒pTRV2-RhPDS通过电击转化法转化农杆菌GV3101；将分别含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-RhPDS的农杆菌GV3101菌液在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素和50mg/L利福平的LB固体培养基上培养36-48小时，挑取各自单菌落，于5ml含有相同种类和浓度的LB液体培养基培养24小时，转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、200μM AS、10mM MES的200mlLB培养基中培养过夜。当菌液的OD600约为0.8时，4000rpm离心10分钟，用含有200μM AS、10mM MES、10mM MgCl2的悬菌液分别收集菌液。调节各个菌液OD600均为1.0，将pTRV1菌液与pTRV2菌液、pTRV1菌液与pTRV2-RhPDS菌液按照1:1混合，避光室温静置活化4小时后侵染；

采用高压喷枪法侵染4片复叶的月季植株，压力保持在75psi；采用真空渗透法侵染2片复叶的扦插苗和生根组培苗，真空状态下反复抽吸两次，每次一分钟。；经过以上侵染后用灭菌去离子水冲洗2次；

扦插苗栽种到新的常规培养基质中，组培苗接种到新的含有50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢霉素的生根培养基(1/2MS，0.05mg/LNAA，30g/L蔗糖，6g/L琼脂)中，其中，组培苗要注意在操作过程中严格保持无菌环境；经暗处理24h后，月季植株、扦插苗于植物培养室中培养，组培苗于组培试验中心培养。

1.4RhPDS基因的沉默分析

对月季植株、扦插苗、组培苗分别进行表型性状观测统计，采用qRT-PCR分析方法检测RhPDS基因的转录表达水平，在RhPDS基因沉默片段以外设计得到RhPDS基因扩增引物3和引物4；以18S为内参基因，扩增引物引物5和引物6；得到RhPDS基因的相对表达量。

引物3：PDS-F2：CGGGACGAGCGAGAGCGG；(序列9)

引物4：PDS-R2：TGAAGCATGCACCCAACTCT；(序列10)

引物5：18S rRNA F：CCTGAGAAACGGCTACCACAT；(序列7)

引物6：18S rRNA R：CACCAGACTTGCCCTCCA。(序列8)

2、结果

2.1RhPDS基因片段的克隆结果

经琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1)，图1表明RhPDS基因片段的PCR扩增产物约在400bp处有清晰条带，回收后经测序验证，使用DNAMAN软件进行比对，与预期结果RhPDS基因386bp片段序列一致，表明RhPDS基因片段的克隆成功。

2.2pTRV2-RhPDS重组载体的验证结果

将pTRV2-RhPDS重组载体转化E.coli DH5α后，提取阳性克隆的菌液质粒，采用内切酶BamH I、EcoR I对pTRV2-RhPDS重组质粒进行双酶切验证。经琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图2)，图2表明目的条带约为386bp，符合预期目标，证明pTRV2-RhPDS重组载体构建成功。

2.3RhPDS基因沉默结果

2.3.1月季植株的沉默结果

采用喷枪法对月季植株进行侵染，侵染60天后，侵染植株一直未有白化表型出现(结果见图3)。

2.3.2月季扦插苗的沉默结果

采用真空渗透法对月季扦插苗进行侵染。侵染30天后(结果见图4)，TRV空载体植株未有白化表型，而TRV-RhPDS植株出现明显白化表型，并且新生嫩叶也出现明显白化表型，结果表明RhPDS基因沉默成功。对接种的植株以及空白对照植株进行qRT-PCR分析(结果见图5)，结果显示TRV-RhPDS植株的RhPDS基因的表达量明显降低，进一步证明了TRV-RhPDS植株的白化表型是由RhPDS基因沉默引起。而TRV空载体植株RhPDS基因的表达量与空白对照相比并未出现明显变化。

2.3.3月季组培苗的沉默结果

采用真空渗透法对月季组培苗进行侵染。侵染30天后(结果见图6)，TRV空载体组培苗未有白化表型，仅在部分老叶中出现边缘轻微黄化。而TRV-RhPDS组培苗的新生叶片出现明显白化表型。结果表明RhPDS基因沉默成功。对接种的组培苗以及空白对照组培苗进行qRT-PCR分析(结果见图7)，结果显示TRV-RhPDS组培苗的RhPDS基因的表达量明显的降低，进一步证明了TRV-RhPDS组培苗的白化表型是由RhPDS基因沉默引起。而TRV空载体组培苗RhPDS基因的表达量与空白对照组培苗相比并未出现较明显变化。

2.4VIGS构建体系的比较

从上述结果来看，喷枪法并不适于月季的革质叶片，未成功引起RhPDS基因沉默出现白化表型。而真空渗透法能够成功的引起RhPDS基因沉默从而出现白化表型。因此，对月季扦插苗与组培苗这两种不同的侵染材料的TRV-RhPDS植株，从沉默植株的数量效率、植株出现白化时间、RhPDS基因的相对表达量三个方面进行比较，从而得到VIGS技术体系的更优方法(结果见表1)。

表1月季扦插苗与组培苗TRV-RhPDS植株的比较

结果显示月季组培苗无论是沉默植株的数量上，还是RhPDS基因的沉默效果都比扦插苗更为高效；从出现白化表型的时间上来看侵染月季组培苗比侵染扦插苗更为快速。

PDS基因是在光合作用过程中类胡萝卜素合成的关键酶，其基因的沉默能够引起白化现象，因此常作为VIGS实验中的指示基因。本研究以RhPDS基因作为研究对象，成功构建pTRV2-RhPDS重组载体，并分别采用高压喷枪法对月季植株进行侵染、采用真空渗透法对扦插苗以及组培苗进行侵染，通过统计表型数据、RhPDS基因qRT-PCR表达分析，从而比较得出VIGS技术体系的更优方法，结果发现高压喷枪法虽然适用于番茄等叶片具有粘质腺毛的植物，但对于叶片具有革质层的月季并不适用；真空渗透法对于月季叶片具有较好的侵染效果，其中扦插苗虽能够出现一定的沉默效果，但组培苗能够更高效、快速的呈现效果。并且，组培苗在进行侵染操作时，具有体积小，较便捷、易操作的优势。结果显示，采用真空渗透法侵染组培苗是最为快速、高效的VIGS实验方法。为之后VIGS技术体系在月季上的大规模应用奠定了基础。

以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

序列表

<110> 北京农学院

<120> 一种优化的鉴定月季RhPDS基因的VIGS沉默体系的方法

<130> 2010

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9992

<212> DNA

<213> pTRV2-RhPDS

<400> 1

ataaaacatt gcacctatgg tgttgccctg gctggggtat gtcagtgatc gcagtagaat 60

gtactaattg acaagttgga gaatacggta gaacgtcctt atccaacaca gcctttatcc 120

ctctccctga cgaggttttt gtcagtgtaa tatttctttt tgaactatcc agcttagtac 180

cgtacgggaa agtgactggt gtgcttatct ttgaaatgtt actttgggtt tcggttcttt 240

aggttagtaa gaaagcactt gtcttctcat acaaaggaaa acctgagacg tatcgcttac 300

gaaagtagca atgaaagaaa ggtggtggtt ttaatcgcta ccgcaaaaac gatggggtcg 360

ttttaattaa cttctcctac gcaagcgtct aaacggacgt tggggttttg ctagtttctt 420

tagagaaaac tagctaagtc tttaatgtta tcattagaga tggcataaat ataatacttg 480

tgtctgctga taagatcatt ttaatttgga cgattagact tgttgaacta caggttactg 540

aatcacttgc gctaatcaac atgggagata tgtacgatga atcatttgac aagtcgggcg 600

gtcctgctga cttgatggac gattcttggg tggaatcagt ttcgtggaaa gatctgttga 660

agaagttaca cagcataaaa tttgcactac agtctggtag agatgagatc actgggttac 720

tagcggcact gaatagacag tgtccttatt caccatatga gcagtttcca gataagaagg 780

tgtatttcct tttagactca cgggctaaca gtgctcttgg tgtgattcag aacgcttcag 840

cgttcaagag acgagctgat gagaagaatg cagtggcggg tgttacaaat attcctgcga 900

atccaaacac aacggttacg acgaaccaag ggagtactac tactaccaag gcgaacactg 960

gctcgacttt ggaagaagac ttgtacactt attacaaatt cgatgatgcc tctacagctt 1020

tccacaaatc tctaacttcg ttagagaaca tggagttgaa gagttattac cgaaggaact 1080

ttgagaaagt attcgggatt aagtttggtg gagcagctgc tagttcatct gcaccgcctc 1140

cagcgagtgg aggtccgata cgtcctaatc cctagggatt taaggacgtg aactctgttg 1200

agatctctgt gaaattcaga gggtgggtga taccatattc actgatgcca ttagcgacat 1260

ctaaataggg ctaattgtga ctaatttgag ggaatttcct ttaccattga cgtcagtgtc 1320

gttggtagca tttgagtttc gcaatgcacg aattacttag gaagtggctt gacgacacta 1380

atgtgttatt gttagataat ggtttggtgg tcaaggtacg tagtagagtc ccacatattc 1440

gcacgtatga agtaattgga aagttgtcag tttttgataa ttcactggga gatgatacgc 1500

tgtttgaggg aaaagtagag aacgtatttg tttttatgtt caggcggttc ttgtgtgtca 1560

acaaagatgg acattgttac tcaaggaagc acgatgagct ttattattac ggacgagtgg 1620

acttagattc tgtgagtaag gttaccgaat tcggactgaa ctccgtcgtt ctggcgaaca 1680

acgaagagac ggtgctgctt ccgatgaacg agccggtgta cgggacgaag aggaagagcc 1740

agattcagac gtacctggag cacaacgaag gcgccggagt ccagcacctg gctctggtca 1800

gcggagacat attcaggacc ttgagggaga tgaggaagcg gagcggagtc ggaggatttg 1860

acttcatgcc ggcgccgccg ccgacgtatt accggaattt gaagaagagg gccggcgatg 1920

tgttgacgga tgagcagatc aaggagtgag gagttgggga ttttggttga tagggatgac 1980

caggggaccc tgcttcagat tttcactaag cctgtgggag ggatccggta ccgagctcac 2040

gcgtctcgag gcccgggcat gtcccgaaga cattaaacta cggttcttta agtagatccg 2100

tgtctgaagt tttaggttca atttaaacct acgagattga cattctcgac tgatcttgat 2160

tgatcggtaa gtcttttgta atttaatttt ctttttgatt ttattttaaa ttgttatctg 2220

tttctgtgta tagactgttt gagatcggcg tttggccgac tcattgtctt accatagggg 2280

aacggacttt gtttgtgttg ttattttatt tgtattttat taaaattctc aacgatctga 2340

aaaagcctcg cggctaagag attgttgggg ggtgagtaag tacttttaaa gtgatgatgg 2400

ttacaaaggc aaaaggggta aaacccctcg cctacgtaag cgttattacg cccgtctgta 2460

cttatatcag tacactgacg agtccctaaa ggacgaaacg ggagaacgct agccaccacc 2520

accaccacca cgtgtgaatt acaggtgacc agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt 2580

tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 2640

tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 2700

agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 2760

atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 2820

gaattaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg 2880

tttattagaa taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt 2940

atgtgcatgc caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg 3000

ctgctatagt gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc 3060

gcacaagtcc taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt 3120

cgcgtgtttt agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat 3180

gaacaagagc gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga 3240

cttgaccaac caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa 3300

gatcaccggc accaggcgcg accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc 3360

tggcgacgtt gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact 3420

ggacattgcc gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg cagagccgtg 3480

ggccgacacc accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga 3540

gttcgagcgt tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg 3600

aggcgtgaag tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga 3660

gctgatcgac caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg 3720

ctcgaccctg taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg 3780

gcgcggtgcc ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa 3840

tgaacgccaa gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc 3900

attaccgaag agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg 3960

cacgtctcaa ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg 4020

gcctggccgg ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt 4080

gtatttgagt aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat 4140

aaacaaatac gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt 4200

caggcaagac gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg 4260

ttctgttagt cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag 4320

atcaaccgct aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca 4380

tcggccggcg cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt 4440

ccgcgatcaa ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat 4500

gggccaccgc cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc 4560

tacaagcggc ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg 4620

ccgaggcgct ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga 4680

gctacccagg cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg 4740

ctgcccgcga ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg 4800

aggtaaagag aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg 4860

cagcagcaag gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa 4920

ctttcagttg ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa 4980

gaccattacc gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg 5040

aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac 5100

caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa 5160

gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg 5220

cgtgacggtc gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg 5280

gtggagaagt tgaaggccgc gcaggccgcc cagcggcaac gcatcgaggc agaagcacgc 5340

cccggtgaat cgtggcaagc ggccgctgat cgaatccgca aagaatcccg gcaaccgccg 5400

gcagccggtg cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc 5460

gttccgatgc tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt 5520

ttccgtctgt cgaagcgtga ccgacgagct ggcgaggtga tccgctacga gcttccagac 5580

gggcacgtag aggtttccgc agggccggcc ggcatggcca gtgtgtggga ttacgacctg 5640

gtactgatgg cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga 5700

gacaagcccg gccgcgtgtt ccgtccacac gttgcggacg tactcaagtt ctgccggcga 5760

gccgatggcg gaaagcagaa agacgacctg gtagaaacct gcattcggtt aaacaccacg 5820

cacgttgcca tgcagcgtac gaagaaggcc aagaacggcc gcctggtgac ggtatccgag 5880

ggtgaagcct tgattagccg ctacaagatc gtaaagagcg aaaccgggcg gccggagtac 5940

atcgagatcg agctagctga ttggatgtac cgcgagatca cagaaggcaa gaacccggac 6000

gtgctgacgg ttcaccccga ttactttttg atcgatcccg gcatcggccg ttttctctac 6060

cgcctggcac gccgcgccgc aggcaaggca gaagccagat ggttgttcaa gacgatctac 6120

gaacgcagtg gcagcgccgg agagttcaag aagttctgtt tcaccgtgcg caagctgatc 6180

gggtcaaatg acctgccgga gtacgatttg aaggaggagg cggggcaggc tggcccgatc 6240

ctagtcatgc gctaccgcaa cctgatcgag ggcgaagcat ccgccggttc ctaatgtacg 6300

gagcagatgc tagggcaaat tgccctagca ggggaaaaag gtcgaaaagg tctctttcct 6360

gtggatagca cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggaa cccgtacatt 6420

gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg tcacacatgt aagtgactga tataaaagag 6480

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