用于鉴定东北红豆杉的SNP分子标记及应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于东北红豆杉的snp分子标记及其应用。

背景技术：

东北红豆杉(学名：taxuscuspidatas.etz.)，又名紫杉。为红豆杉科(taxaceae))乔木植物，是第三纪孑遗的珍贵树种。其材质优良，纹理通直，结构致密，富弹性，力学强度高，具光泽，有香气，耐腐朽，不易开裂反翘，不含松脂，边材幅狭黄白色，心材紫赤褐色(紫杉因此而得名)。该种不仅是材用植物，也是重要的药用植物，其茎、枝、叶、根可入药，主要成分含紫杉醇、紫杉碱、双萜类化合物。具有抗癌功能，并有抑制糖尿病及治疗心脏病的作用。东北红豆杉除有极高的药用价值外，尚有极佳的观赏价值，这是其它品种的红豆杉所无法企及的另一大优势。东北红豆杉侧枝多，红枝绿叶，株形娇美，所结红豆艳丽多姿，酷似南方的"相思豆"。因而用于制作珍稀观赏盆景，也可用于制作园林风景树。

红豆杉有"植物活化石"和"国宝"之称。从中提取的紫杉醇是世界公认的抗癌药物，每公斤市场价在一千万美元以上，是世界上濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，属国家一级保护植物，至今已有250万年的历史。由于它的根、茎、叶、皮及种子含有紫杉醇，所以价格相当昂贵，不少国家将其列为"国宝"。美国、英国、俄罗斯、韩国和中国对紫杉进行多年研究，将紫杉醇从紫杉中提炼出来，用于临床治疗癌症。经验证明，紫杉醇具有独特的抗肿瘤机制和显著的抑制肿瘤的作用，被专家和学者确认为本世纪初国际上最有开发前途的抗癌药物。

东北红豆杉不仅是珍稀的药用植物也是园林、庭院绿化、美化的佳品，是目前最珍贵稀有的高档绿化树种。具有独特的盆景观赏价值是东北红豆杉的又一大特色，应用矮化技术处理的东北红豆杉盆景造型古朴典雅，枝叶紧凑而不密集，舒展而不松散，红茎、红枝、绿叶、红豆使其具有观茎、观枝、观叶、观果的多重观赏价值。光滑的红茎代表坦荡与高贵，常绿的针叶表达坚毅与永恒，酷似"相思豆"的红豆彰现了爱心与思念。整株造型含而不露，超凡脱俗，具有浓厚的生活气息和文化底蕴。东北红豆杉因其资源稀少，被列为中国一级珍稀树种加以保护。

形态学鉴定是东北红豆杉鉴定中常采用的方法，但形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。

近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍惜物种及检验检疫方面得到了应用，如何利用分子生物学技术建立高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将是东北红豆杉鉴定领域的关键技术之一。

技术实现要素：

本发明提供了一种用于鉴定东北红豆杉的snp分子标记，所述snp分子标记位于seqidno.1所示序列的第444位碱基，若第444位的碱基为t，则鉴定为东北红豆杉。

上述snp分子标记在东北红豆杉鉴定中的应用。

进一步的，从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出东北红豆杉。

本发明提供了一种用于鉴定东北红豆杉的核苷酸序列，包括seqidno.1，或者seqidno.1所对应的cdna或mrna，所述seqidno.1序列的第444位的碱基为t。

本发明提供了一种鉴定东北红豆杉的试剂盒，包括用于特异性检测seqidno.1序列第444位的碱基为t存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的组合。

进一步的，所述引物和探针选自：

用于测序检测的特异性扩增引物和测序引物，引物序列分别为：

上游引物f1：5'-gcagagactcaacggaagat-3'，

下游引物r1：5'-ccctatttatcatccaagcg-3'，

测序引物：5'-gcagagactcaacggaagat-3'；

或者，用于荧光定量pcr检测的特异性扩增引物和探针，引物和探针序列分别为：

上游引物f2：5'-aggttgatcgtaagatcaactcatat-3'

下游引物r2：5'-aattgtatgtataatacaattatac-3'

探针p2：5'-ttataatagaaatttataatggtaactt-3'；

或者，用于arms-pcr检测的特异性扩增引物，引物序列为：

上游引物f3：5'-aggttgatcgtaagatcaactcacat-3'

下游引物r3：5'-cagaacctgagctcaggtcaact-3'。

进一步的，所述试剂盒用于从南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉中鉴定出东北红豆杉。

所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。

本发明提供了一种制备鉴定东北红豆杉试剂盒的方法，包括制备检测反应试剂的步骤，所述反应试剂包含用于特异性检测seqidno.1序列第444位的碱基为t存在与否的一种或多种引物，或引物和探针的组合。

本发明还提供了一种用于鉴定东北红豆杉的寡核苷酸，其用于特异性检测seqidno.1序列第444位的碱基为t存在与否，所述寡核苷酸选自：

用于测序的特异性扩增引物序列和测序引物序列，分别为

上游引物f1：5'-gcagagactcaacggaagat-3'，

下游引物r1：5'-ccctatttatcatccaagcg-3'，

测序引物：5'-gcagagactcaacggaagat-3'；

或者，用于荧光定量pcr扩增特异性上游引物f2序列、下游引物r2序列和探针p2序列，分别为：

上游引物f2：5'-aggttgatcgtaagatcaactcatat-3'

下游引物r2：5'-aattgtatgtataatacaattatac-3'

探针p2：5'-ttataatagaaatttataatggtaactt-3'；

或者，进行arms-pcr扩增的特异性上游引物f3序列和下游引物r3序列，分别为：

上游引物f3：5'-aggttgatcgtaagatcaactcacat-3'

下游引物r3：5'-cagaacctgagctcaggtcaact-3'。

进一步的，探针p2的5'端的荧光基团选自fam、thex或tet，3'端的淬灭基团选自bhq1或tamra。

本发明还提供了一种鉴定东北红豆杉的方法，包括以下步骤：

提取待测植物的基因组dna；

以步骤(1)提取的基因组dna为模板，进行pcr扩增，检测seqidno.1序列第444位的碱基为t存在与否；

经检测，snp位点为t时，则判断该待测植物鉴定为东北红豆杉。

进一步的，pcr扩增所需的引物或探针选自上游引物f1、下游引物r1和测序引；或者，上游引物f2序列、下游引物r2序列和探针p2序列；或者，上游引物f3和下游引物r3。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：本发明在对红豆杉大量基因信息进行分析比较的基础上，并根据序列位点多态性，设计东北红豆杉种属特异引物和探针，建立了东北红豆杉特异性的荧光定量pcr鉴定检测方法。本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过东北红豆杉snp分子标记做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明采用arms技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准pcr扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量pcr平台上实现对东北红豆杉检测的高特异性和高灵敏度。

附图说明

图1本发明利用荧光定量pcr检测阳性质控品(东北红豆杉叶片基因组dna)的结果。

图2本发明利用荧光定量pcr法鉴定南方红豆杉的结果。

图3本发明利用荧光定量pcr法鉴定曼地亚红豆杉的结果。

图4本发明利用荧光定量pcr法鉴定欧洲红豆杉的结果。

图5本发明利用荧光定量pcr法鉴定西藏红豆杉的结果。

图6本发明利用荧光定量pcr法鉴定云南红豆杉的结果。

图7本发明利用荧光定量pcr法鉴定东北红豆杉的结果。

图8测序法鉴定南方红豆杉的结果。

图9测序法鉴定曼地亚红豆杉的结果。

图10测序法鉴定欧洲红豆杉的结果。

图11测序法鉴定西藏红豆杉的结果。

图12测序法鉴定云南红豆杉的结果。

图13测序法鉴定东北红豆杉的结果。

图14电泳结果：1泳道为质控品pcr结果；2泳道为东北红豆杉样品pcr结果；3泳道为西藏红豆杉pcr结果；4泳道为南方红豆杉pcr结果；5泳道为云南红豆杉pcr结果；6泳道为欧洲红豆杉pcr结果；7泳道为曼迪亚红豆杉pcr结果；8泳道为100bpladdermaker。

图15六种不同品种红豆杉的序列对比图

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法，如sambrook等分子克隆实验手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1东北红豆杉snp分子标记的获得

1、根据ncbi数据库公开的trn基因，设计相应的引物进行pcr扩增，采用上游引物f1：5'-gcagagactcaacggaagat-3'(seqidno.2)，下游引物r1：5'-ccctatttatcatccaagcg-3'(seqidno.3)，和如下的pcr反应体系和pcr反应程序，以经鉴定的南方红豆杉(taxusmaireisyhu)、曼地亚红豆杉(taxusmadia)、欧洲红豆杉(taxusbaccata)、西藏红豆杉(taxuswallichianazucc.)、东北红豆杉(taxuscuspidatas.etz.)和云南红豆杉(taxusyunnanensischengetl.k.f)6个红豆杉属物种基因组dna为模板，进行pcr扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外凝胶成像系统观察合格后进行测序。

其中，vazymeacetaqdna酶(货号p401-d1250u)。

按传统方法提取植物基因组dna，也可采用商品化dna提取试剂盒进行dna提取。例如，所述红豆杉属物种基因组dna的提取采用杭州百迈生物股份有限公司的植物基因组dna提取试剂盒(koing^tm通用型基因组提取试剂盒，货号f1612)，参照试剂盒说明进行操作，将提取的dna置于-20℃下保存备用。

2、序列比对及物种特异的分子标记的开发

将步骤1获得的6个红豆杉属物种的trn基因序列，通过dnaman软件进行序列比对寻找合适的snp位点。序列比对结果见图15，经分析发现位于东北红豆杉trn基因内的序列第444位上的碱基为t，而其它红豆杉属物种相应位置处的碱基为c。即序列seqidno.1的第444位上的碱基为t是东北红豆杉的snp位点(seqidno.1序列中方框所示位置)，seqidno.1的核苷酸序列如下：

实施例2东北红豆杉snp分子标记在荧光pcr扩增法鉴定东北红豆杉中的应用

本实施例是在获得东北红豆杉snp位点的基础上，针对包含所述snp位点的基因序列，利用primerpremier5.0分别设计出特异性上游引物f2、下游引物r2和探针p2，引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用所述特异性引物和探针对南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉进行荧光pcr扩增检测。具体的，所述上游引物f2序列、下游引物r2序列和探针p2序列分别是：

上游引物f2：5'-aggttgatcgtaagatcaactcatat-3'(seqidno.4)

下游引物r2：5'-aattgtatgtataatacaattatac-3'(seqidno.5)

探针p2：5'-ttataatagaaatttataatggtaactt-3'(seqidno.6)

探针5'端的荧光基团选自fam、thex、tet等，3'端的淬灭基团：bhq1、tamra等。

例如探针5'-fam-ttataatagaaatttataatggtaactt-bhq1-3'。

以6个红豆杉属物种基因组dna为模板，20μlpcr反应体系中包括：

pcr扩增程序：

包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组dna；2)以待测植物的基因组dna为模板，利用引物和探针，pcr扩增东北红豆杉trn基因。同时设置阳性和阴性对照组，所述阳性和阴性对照组分别以含有或不含有提取的东北红豆杉叶片基因组dna为模板进行扩增；3)采用荧光pcr法检测pcr扩增产物，若扩增曲线有标准的s型曲线，且ct≤36，则待测植物为东北红豆杉物种。

本实施例2采用的南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉样品也是经现有方法鉴定不同与实施例1的另一组样品，按本发明所述方法对样品进行荧光pcr法检测，检测结果如图1至7所示，其中图1为阳性质控品(东北红豆杉叶片基因组dna)的扩增结果；其余样品中，仅东北红豆杉出现s型曲线(如图7所示)，且ct≤36,而其他红豆杉类没有出现s型曲线(如图2至6所示)，这表明本发明针对南方红豆杉trn基因snp位点具有极高的特异性，因此可以用于快速鉴定南方红豆杉。

利用实施例1所述引物和测序方法，对本实施例2中的南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉样品进行鉴定，鉴定结果见图8至13。测序结果为只有东北红豆杉在第444位上的碱基为t，其余的样品在相应位点的碱基为c。

实施例3东北红豆杉snp分子标记在arms-pcr法鉴定东北红豆杉中的应用

本实施例是在获得东北红豆杉snp位点的基础上，针对包含所述snp位点的基因序列，利用primerpremier5.0分别设计出特异性上游引物f3、下游引物r3，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用所述特异性引物对南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉样品进行arms-pcr法检测。具体的，所述上游引物f3序列、下游引物r3序列分别是：

上游引物f3：5'-aggttgatcgtaagatcaactcacat-3'(seqidno.7)

下游引物r3：5'-cagaacctgagctcaggtcaact-3'(seqidno.8)

以6个红豆杉属物种基因组dna为模板，20μlpcr反应体系中包括：

arms-pcr反应程序：

包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组dna；2)以待测植物的基因组dna为模板，利用引物，进行arms-pcr扩增；3)采用电泳法检测pcr扩增产物。东北红豆杉的电泳有明显的条带，而其他红豆杉则无扩增条带。

本实施例3采用的南方红豆杉、曼地亚红豆杉、欧洲红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉和云南红豆杉也是经现有方法鉴定不同与实施例1的另一组样品，检测结果如图14所示，其中东北红豆杉的电泳结果有显著扩增条带，其他红豆杉的电泳结果为无扩增条带。这表明本发明的针对东北红豆杉trn基因snp位点具有极高的特异性，因此可以用于快速鉴定东北红豆杉。

实施例2和3的鉴定结果汇总表见下表：

本申请实施例中所列反应体系，反应程序和检测步骤等只是一种具体的实施方式，本领域技术人员还可以根据实际需要对反应体系，反应程序等作出适应性的调整。

序列表

<110>杭州百迈生物股份有限公司

<120>用于鉴定东北红豆杉的snp分子标记及应用

<130>2017

<150>2017108141463

<151>2017-09-11

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>645

<212>dna

<213>东北红豆杉(taxuscuspidata)

<400>1

gactattatttgatttgaccaatattctatctacagagtgtagtatgttattgaaaactt60

tgaaagtgttctgtatcatcgttaaaacttgtttcaacgattagaacttgagttgttcta120

ggcttgcctagcttaatgaatacttaattaaagtaattcaattaagaaataaatagaatt180

tattccatttttgaattattggacgaggataaagatagagtccaattctacatgtaaatg240

ccaacaacaacaatgcaaattgcagtagtcggaaaatccgttggttttataaaccgtgag300

ggttcaagtccctctatccccaggtgtatttccgaattaaagaaagatcaaatattatta360

ctcttgacaattttataagcaatccagaatatagagctatattcccataaatttagaaag420

gttgatcgtaagatcaactcatatattttgtcagatataacatttgtgtatgtataattg480

tattatacatacaatttaaatttataatagaaatttataatggtaacttaccaatccaaa540

agtataatttaaaaaggtaaataaaaaaaaggattttcttttgtctttttagttgacctg600

agctcaggttctgcgctgagaaaaaaaaaagggggaaaaagataa645

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcagagactcaacggaagat20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ccctatttatcatccaagcg20

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aggttgatcgtaagatcaactcatat26

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>6

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ttataatagaaatttataatggtaactt28

<210>7

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

aggttgatcgtaagatcaactcacat26

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cagaacctgagctcaggtcaact23