土沉香、云南沉香、马来沉香的SNP分子标记及应用的制作方法

本发明涉及木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体地说，涉及用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的snp分子标记及其应用
背景技术：
：沉香，又名“沉水香”，“水沉香”，古语写作“沈香”(沈，同沉)。古来常说的“沉檀龙麝”之“沉”，就是指沉香。沉香香品高雅，而且十分难得，自古以来即被列为众香之首。与檀香不同，沉香并不是一种木材，而是一类特殊的香树“结”出的，混合了油脂(树脂)成分和木质成分的固态凝聚物。而这类香树的木材本身并无特殊的香味，而且木质较为松软。据现在的研究，瑞香科沉香属的几种树木，如马来沉香树、莞香树、印度沉香树等都可以形成沉香。沉香的价格之贵，素有“木中钻石”之称。据知名文化学者扬之水介绍，沉香是中国、日本、印度及其他东南亚国家的传统药材和名贵天然香料，在传统中医学、藏医学和印度传统医学中已有几千年的应用历史，其药用、精油、香料等方面市场需求量巨大。“粗略统计，目前全世界沉香交易额达200亿元以上。据史料记载，在宋代，上等品是一两沉香一两金；到了明代，就变成了一寸沉香一寸金”。形态学鉴定是沉香鉴定中常采用的方法，但形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。近年来，利用分子生物学技术进行物种鉴定已经在一些珍惜物种及检验检疫方面得到了应用，如何利用分子生物学技术建立高效、快速、灵敏且准确度高的鉴定方法将是沉香鉴定领域的关键技术之一。技术实现要素：本发明提供了一种用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的snp分子标记，所述snp分子标记位于seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所示序列的第81-84位碱基为tgcc则鉴定为土沉香，若第81-84位碱基为cgct则鉴定为云南沉香，若第81-84位碱基为cgcc则鉴定为马来沉香。所述snp分子标记在土沉香、云南沉香、马来沉香鉴定中的应用。进一步的，所述应用是从土沉香、云南沉香、马来沉香混合物种中分别鉴定出土沉香、云南沉香、马来沉香。本发明提供了一种用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的寡核苷酸，包括seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3，或者seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3所对应的cdna或mrna，所述核苷酸序列的第81-84位碱基为tgcc则为土沉香，若第81-84位碱基为cgct则为云南沉香，若第81-84位碱基为cgcc则为马来沉香。本发明提供了一种鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的试剂盒，包括用于特异性检测seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3序列第81-84位碱基为tgcc或者cgct或者cgcc的一种或多种引物，或引物和探针的组合。进一步的，所述引物和/或探针选自：用于测序检测的特异性扩增引物和测序引物，引物序列分别为：上游引物f1：5'-cgtaacaaggttttcgtaggtgaac-3'下游引物r1：5'-gctacgttcttcatcgat-3'测序引物：5'-cgtaacaaggttttcgtaggtgaac-3'；或者，用于荧光定量pcr检测的扩增特异性扩增引物和探针，引物和探针序列分别为：上游引物f2：5'-ccgtgaacgttaataacaatgtgc-3'下游引物r2：5'-atcaagttccttggcgcagtc-3'探针2-1：5'-fam-gtgtcgttatgcccattccctcct-bhq1-3'探针2-2：5'-hex-gtgtcgttacgctccattccctcct-bhq1-3'探针2-3：5'-rox-gtgtcgttacgcccattccctcct-bhq1-3'；或者，用于arms-pcr扩增的特异性扩增引物，引物序列为：土沉香特异性引物：上游引物t1：5'-gatgcgcgctatgattgaac-3'下游引物t2：5'-cggtgtatgccatgatgca-3'云南沉香特异性引物：上游引物y1：5'-gatgcgcgctatgattgtgt-3'下游引物y2：5'-cggtgtatgccatgatgcg-3'马来沉香特异性引物上游引物m1：5'-gatgcgcgctatgattgtat-3'下游引物m2：5'-cggtgtatgccatgatgcg-3'。所述的试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品。本发明提供了一种制备鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香试剂盒的方法，包括制备检测反应试剂的步骤，所述反应试剂包含用于特异性检测seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3序列第81-84位碱基为tgcc或者cgct或者cgcc的一种或多种引物，或引物和探针的组合。本发明提供了一种用于鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的寡核苷酸，所述寡核苷酸用于特异性检测seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3序列第81-84位碱基为tgcc或者cgct或者cgcc的一种或多种引物，所述寡核苷酸选自用于测序的特异性扩增引物序列和测序引物序列，分别为上游引物f1：5'-cgtaacaaggttttcgtaggtgaac-3'下游引物r1：5'-gctacgttcttcatcgat-3'测序引物：5'-cgtaacaaggttttcgtaggtgaac-3'；或者，用于荧光定量pcr扩增特异性上游引物f2序列、下游引物r2序列和探针p2序列分别为：上游引物f2：5'-ccgtgaacgttaataacaatgtgc-3'下游引物r2：5'-atcaagttccttggcgcagtc-3'探针2-1：5'-fam-gtgtcgttatgcccattccctcct-bhq1-3'探针2-2：5'-hex-gtgtcgttacgctccattccctcct-bhq1-3'探针2-3：5'-rox-gtgtcgttacgcccattccctcct-bhq1-3'；或者，进行arms-pcr扩增的特异性上游引物序列和下游引物序列分别为：土沉香特异性引物：上游引物t1：5'-gatgcgcgctatgattgaac-3'下游引物t2：5'-cggtgtatgccatgatgca-3'云南沉香特异性引物：上游引物y1：5'-gatgcgcgctatgattgtgt-3'下游引物y2：5'-cggtgtatgccatgatgcg-3'马来沉香特异性引物上游引物m1：5'-gatgcgcgctatgattgtat-3'下游引物m2：5'-cggtgtatgccatgatgcg-3'本发明还提供了一种鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香的方法，包括以下步骤：(1)提取待测植物的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的基因组dna为模板，进行pcr扩增，检测检测seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3序列第81-84位碱基；(3)经检测，若第81-84位碱基为tgcc则鉴定为土沉香，若第81-84位碱基为cgct则鉴定为云南沉香，若第81-84位碱基为cgcc则鉴定为马来沉香。pcr扩增所需的引物或探针选自上游引物f1、下游引物r1、测序引物、上游引物f2、下游引物r2、探针p2、上游引物t1、下游引物t2、上游引物y1、下游引物y2、上游引物m1、下游引物m2。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：本发明在对沉香，尤其是对土沉香、云南沉香、马来沉香三种沉香大量基因信息进行分析比较的基础上，并根据序列位点多态性，设计土沉香、云南沉香、马来沉香的特异引物和探针，建立了土沉香、云南沉香、马来沉香特异性的荧光定量pcr鉴定检测方法。本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过snp分子标记做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明采用arms技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准pcr扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量pcr平台上实现对土沉香、云南沉香、马来沉香检测的高特异性和高灵敏度。附图说明图1是土沉香质控品。图2本发明利用荧光定量pcr法鉴定土沉香的结果。图3云南沉香质控品。图4本发明利用荧光定量pcr法鉴定云南沉香的结果。图5马来沉香质控品。图6本发明利用荧光定量pcr法鉴定马来沉香的结果。图7测序法鉴定土沉香的结果图。图8测序法鉴定云南沉香的结果。图9测序法鉴定马来沉香的结果。图10-1本发明利用arms-pcr法鉴定土沉香的反应管1扩增结果。图10-2本发明利用arms-pcr法鉴定土沉香的反应管2扩增结果。图10-3本发明利用arms-pcr法鉴定土沉香的反应管3扩增结果。图11-1本发明利用arms-qpcr法鉴定云南沉香的反应管1扩增结果图11-2本发明利用arms-qpcr法鉴定云南沉香的反应管2扩增结果图11-3本发明利用arms-qpcr法鉴定云南沉香的反应管3扩增结果图12-1本发明利用arms-pcr法鉴定马来沉香的反应管1扩增结果图12-2本发明利用arms-pcr法鉴定马来沉香的反应管2扩增结果图12-3本发明利用arms-pcr法鉴定马来沉香的反应管3扩增结果图13土沉香、云南沉香、马来沉香的序列对比图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，sambrook等分子克隆实验手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。实施例1用于鉴别土沉香、云南沉香、马来沉香snp分子标记的获得rdna上的5.8、18和28srrna基因有极大的保守性,即存在着广泛的异种同源性。而由于its区不加入成熟核糖体，所以its片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性,即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在its序列上表现出差异，显示最近的进化特征。这种特点使its适合于物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的系统发育关系分析。由于its的序列分析能实质性地反映出属间、种间的碱基对差异,此外its序列片段较小、易于分析，目前已被广泛应用于不同种间或近似属间的系统发育研究中。1、根据ncbi数据库公开的its基因，设计相应的引物进行pcr扩增，采用上游引物f1：5’-cgtaacaaggttttcgtaggtgaac-3’(seqidno.4)、下游引物r1:5’-gctacgttcttcatcgat-3’(seqidno.5)和如下的pcr反应体系和pcr反应程序，以经浙江省出入境鉴定的土沉香(aquilariasinensis(lour.)spreng.)、马来沉香(aquilariamalaccensis)和云南沉香(aquilariayunnanensiss.c.huang)3个沉香属物种基因组dna为模板，进行pcr扩增，扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外凝胶成像系统观察合格后进行测序。其中，vazymeacetaqdna酶(货号p401-d1250u)按传统方法提取植物基因组dna，也可采用商品化dna提取试剂盒进行dna提取。例如，所述沉香属物种基因组dna的提取采用杭州百迈生物股份有限公司的植物基因组dna提取试剂盒(koningtm木质部基因组dna提取试剂盒，货号f2612)，参照试剂盒说明进行操作，将提取的dna置于-20℃下保存备用。2、序列比对及物种特异的分子标记的开发将步骤1获得的3个沉香属物种的its基因序列，通过dnaman软件进行序列比对寻找合适的snp位点。序列比对结果如图13所示，经分析发现位于沉香its基因内的序列(seqidno.1、seqidno.2或seqidno.3)的第81-84位碱基在物种间存在特异性，即该序列的第81-84位碱基为该序列中的特异性位点，若第81-84位碱基为tgcc则鉴定为土沉香，若第81-84位碱基为cgct则鉴定为云南沉香，若第81-84位碱基为cgcc则鉴定为马来沉香。具所述snp位点的土沉香序列(seqidno.1)gggtagtcttgtcgattcttgcacagcagcatgacccgtgaacgttaataacccttgtggccgtcataaccaaaccccggcgcggactgcgccaaggaacttgatcacataatacgtttgcctcgtgcacccagaaatgggggcggtggggatcaagcgttgaaacgaatctaaaatgactcccggcaacggatatctcggctctcgcatcgataag具所述snp位点的云南沉香序列(seqidno.2)tcttagtcttgtcgattcctgcacagcagcatgacccgtgaacgttaataacccttgtggccgtcataaccaaaccccggcgcggactgcgccaaggaacttgatcacataatatgtttgccccgtgcacccagaaatgggggcgttggggatcaagcgttgaaacgaatctaaaatgactcccggcaacggatatctcggctctcgcatcgatgacaacgtagcaa具所述snp位点的马来沉香序列(seqidno.3)aaggatcattgtcgattcctgcacagcagcacgacccgtgaacgttaataacccttgcggccgtcataaccaaaccccggcgcggactgcgccaaggaacttgatcacataatacgtctgccccgcgcacccagaaatgggggcgccggggatcaagcgttgaaatgaatctaaaatgactcccggcaacggatatctcggctcttgcatcgatg实施例2沉香snp分子标记在荧光pcr扩增法鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香中的应用本实施例是在获得土沉香、云南沉香、马来沉香snp位点的基础上，针对包含所述snp位点的基因序列，利用primerpremier5.0分别设计出特异性上游引物f2、下游引物r2和探针p2，引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用所述特异性引物和探针对土沉香样品、马来沉香样品和云南沉香样品进行荧光pcr扩增检测。具体的，所述上游引物f2、下游引物r2和探针p2的序列分别是：上游引物f2：5'-ccgtgaacgttaataacaatgtgc-3'(seqidno.6)下游引物r2：5'-atcaagttccttggcgcagtc-3'(seqidno.7)探针2-1：5'-gtgtcgttatgcccattccctcct-3'(seqidno.8)探针2-2：5'-gtgtcgttacgctccattccctcct-3'(seqidno.9)探针2-3：5'-gtgtcgttacgcccattccctcct-3'(seqidno.10)探针5'端的荧光基团选自fam、thex、tet等，3'端的淬灭基团：bhq1、tamra等。例如带有荧光基团和淬灭基团的探针为：探针2-1：5'-fam-gtgtcgttatgcccattccctcct-bhq1-3'探针2-2：5'-hex-gtgtcgttacgctccattccctcct-bhq1-3'探针2-3：5'-rox-gtgtcgttacgcccattccctcct-bhq1-3'以3个沉香属物种基因组dna为模板，20μlpcr反应体系中包括：荧光pcr反应程序：包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组dna；2)以待测植物的基因组dna为模板，利用引物和探针，pcr扩增沉香its基因；同时分别增加土沉香、云南沉香和马来沉香的质控品对照；3)采用荧光pcr法检测pcr扩增产物，扩增曲线有标准的s型曲线，当fam通路有扩增曲线且ct≤36，其他通路无扩增信号时，则为土沉香；当hex通路有扩增曲线且ct≤36，其他通路无扩增信号时，则为云南沉香；当rox通路有扩增曲线且ct≤36，其他通路无扩增信号时，则为马来沉香。本实施例2采用的土沉香、马来沉香和云南沉香样品也是经现有方法鉴定不同与实施例1的另一组样品，检测结果下图2至6所示，土沉香的扩增结果为：fam通路有扩增曲线且ct≤36(如图2所示)，其他通路无扩增信号；云南沉香的扩增结果为：hex通路有扩增曲线且ct≤36(如图4所示)，其他通路无扩增信号；马来沉香的扩增结果为：rox通路有扩增曲线且ct≤36(如图6所示)，其他通路无扩增信号。这表明本发明的针对沉香its基因snp位点具有极高的特异性，因此可以用于快速鉴定出是土沉香、云南沉香和马来沉香中的哪一物种。利用实施例1所述引物和测序方法，对本实施例2中的土沉香、云南沉香和马来沉香。样品进行鉴定，鉴定结果见图7至9所示。测序结果为，土沉香第81-84位碱基为tgcc，云南沉香第81-84位碱基为cgct，马来沉香第81-84位碱基为cgcc。实施例3沉香snp分子标记在arms-qpcr法鉴定土沉香、云南沉香、马来沉香中的应用本实施例是在获得土沉香、云南沉香、马来沉香snp位点的基础上，针对包含所述snp位点的基因序列，利用primerpremier5.0分别设计出特异性上游引物、下游引物，引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。利用所述特异性引物和探针对土沉香样品、马来沉香样品和云南沉香样品进行荧光pcr扩增检测。具体的，所述上游引物序列、下游引物序列和探针序列p分别是：土沉香特异性引物：上游引物t1：5'-gatgcgcgctatgattgaac-3'(seqidno.11)下游引物t2：5'-cggtgtatgccatgatgca-3'(seqidno.12)云南沉香特异性引物：上游引物y1：5'-gatgcgcgctatgattgtgt-3'(seqidno.13)下游引物y2：5'-cggtgtatgccatgatgcg-3'(seqidno.14)马来沉香特异性引物上游引物m1：5'-gatgcgcgctatgattgtat-3'(seqidno.15)下游引物m2：5'-cggtgtatgccatgatgcg-3'(seqidno.16)探针序列p：5'-fam-agggcatgatgcacatgatgct-bhq1-3'(seqidno.17)以3个沉香属物种基因组dna为模板，每个物种进行3个反应，体系分别如下：arms-pcr反应程序：包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组dna；2)以待测植物的基因组dna为模板，利用引物和探针，pcr扩增土沉香its基因；3)采用arms-pcr法检测pcr扩增产物，每个样本分别进行上述三个反应(反应管1～反应管3)。当反应管1有标准s型扩增曲线，且ct≤36，而反应管2和反应管3均无扩增信号时，则为土沉香；当反应管2有标准s型扩增曲线，且ct≤36，而反应管1和反应管3均无扩增信号时，则为云南沉香；当反应管3有标准s型扩增曲线，且ct≤36，而反应管1和反应管2均无扩增信号时，则为马来沉香；本实施例2采用的土沉香、马来沉香和云南沉香样品也是经现有方法鉴定不同与实施例1的另一组样品，检测结果下图10.1-12.3所示，土沉香的扩增结果为：反应管1有标准s型扩增曲线，且ct≤36，而反应管2和反应管3均无扩增信号；云南沉香的扩增结果为：反应管2有标准s型扩增曲线，且ct≤36，而反应管1和反应管3均无扩增信号；马来沉香的扩增结果为：反应管3有标准s型扩增曲线，且ct≤36，而反应管1和反应管2均无扩增信号。这表明本发明的针对土沉香、云南沉香和马来沉香its基因snp位点具有极高的特异性，因此可以用于快速鉴定土沉香、云南沉香和马来沉香。浙江省出入境鉴定结果本发明鉴定结果测序法结果土沉香土沉香(见图10.1～10.3)tgcc(见图7)云南沉香云南沉香(见图11.1～11.3)cgct(见图8)马来沉香马来沉香(见图12.1～12.3)cgcc(见图9)本申请实施例中所列反应体系，反应程序和检测步骤等只是一种具体的实施方式，本领域技术人员还可以根据实际需要对反应体系，反应程序等进行适应性的调整。序列表<110>杭州百迈生物股份有限公司<120>土沉香、云南沉香、马来沉香的snp分子标记及应用<130>201705<150>2017108141124<151>2017-09-11<160>17<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>269<212>dna<213>土沉香(aquilariasinensis)<400>1gggtagtcttgtcgattcttgcacagcagcatgacccgtgaacgttaataacaatgtgcc60gagttggaattgtgtcgttatgccccattccctcttcggttggcccttgtggccgtcata120accaaaccccggcgcggactgcgccaaggaacttgatcacataatacgtttgcctcgtgc180acccagaaatgggggcggtggggatcaagcgttgaaacgaatctaaaatgactcccggca240acggatatctcggctctcgcatcgataag269<210>2<211>279<212>dna<213>云南沉香(aquilariayunnanensis)<400>2tcttagtcttgtcgattcctgcacagcagcatgacccgtgaacgttaataacaatgtgcc60gagttggaattgtgtcgttacgctccattccctcctcggttggcccttgtggccgtcata120accaaaccccggcgcggactgcgccaaggaacttgatcacataatatgtttgccccgtgc180acccagaaatgggggcgttggggatcaagcgttgaaacgaatctaaaatgactcccggca240acggatatctcggctctcgcatcgatgacaacgtagcaa279<210>3<211>267<212>dna<213>马来沉香(aquilariamalaccensis)<400>3aaggatcattgtcgattcctgcacagcagcacgacccgtgaacgttaataacaatgtgcc60gagttggaattgtgtcgttacgccccattccctcttcggttggcccttgcggccgtcata120accaaaccccggcgcggactgcgccaaggaacttgatcacataatacgtctgccccgcgc180acccagaaatgggggcgccggggatcaagcgttgaaatgaatctaaaatgactcccggca240acggatatctcggctcttgcatcgatg267<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cgtaacaaggttttcgtaggtgaac25<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gctacgttcttcatcgat18<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ccgtgaacgttaataacaatgtgc24<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7atcaagttccttggcgcagtc21<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8gtgtcgttatgcccattccctcct24<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gtgtcgttacgctccattccctcct25<210>10<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gtgtcgttacgcccattccctcct24<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gatgcgcgctatgattgaac20<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cggtgtatgccatgatgca19<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gatgcgcgctatgattgtgt20<210>14<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14cggtgtatgccatgatgcg19<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gatgcgcgctatgattgtat20<210>16<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16cggtgtatgccatgatgcg19<210>17<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17agggcatgatgcacatgatgct22当前第1页12