本发明属于生物催化技术领域，特别涉及一种通过脂肪酶立体选择性催化水解拆分2-(3-氯苯基)丙酸的方法。
背景技术：
据美国《时代周刊》、《医学年鉴》介绍，倍受消费者青睐的布洛芬会引起消化不良、胃烧灼感、胃痛和呕吐等不良反应，长期服用会造成肾功能衰竭。吡氯布洛芬作为布洛芬的衍生物，同样是一种重要的非甾体消炎药，具有显著的抗风湿、镇痛、消炎、解热作用。临床研究表明，吡氯布洛芬对白细胞的趋化性、血小板的黏着和聚集有抑制作用。其镇痛作用较水杨酸类药物强10倍，可明显的改善如静止和运动时的疼痛、清晨僵直、关节压痛和肿胀等一些典型症状，对一些非风湿病所致的中、重度疼痛亦能发挥较强的镇痛作用。偶见轻微的恶心、心口灼热、上腹疼痛或腹泻等不良反应。但与布洛芬不同的是，吡氯布洛芬对关节软骨无不良影响，特别适用于需长期治疗的骨关节疾病。药理实验证明，其药理活性主要由(s)-吡氯布洛芬产生,(s)-吡氯布洛芬药效较(r)-吡氯布洛芬更为显著。为减少药剂用量、减轻机体的代谢负担和降低毒副作用，有必要开发一种高效制备单一对映体(s)-吡氯布洛芬技术。2-(3-氯苯基)丙酸是合成吡氯布洛芬的重要中间体，故获得(s)-2-(3-氯苯基)丙酸对(s)-吡氯布洛芬的制备具有重要的意义。
近年来，酶催化水解外消旋酯化合物拆分手性酸化合物的报道很多。但是，外消旋酯水溶性较差，导致转化率低。专利hk1006469.a催化水解外消旋酮基布洛芬酯制备(s)-酮基布洛芬，其转化率仅15-25%。目前，研究人员采用了多种方法来促进底物的溶解度，以提高转化率。专利zl99126583.1采用在水饱和有机溶剂体系中反应，专利zl00133042.x采用在水-异辛烷两相体系中反应，专利zl03152790.6采用在水-离子液体体系中反应。这些体系在一定程度上提高了转化率，但是存在有机溶剂污染环境，引入其他离子导致反应体系复杂，不易分离等缺陷。
针对上述问题，本发明通过添加表面活性剂peg400，既提高了转化率，又能减少污染，便于产物分离。为手性拆分2-(3-氯苯基)丙酸，制备(s)-吡氯布洛芬提供了一种简便可行的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种脂肪酶催化水解2-(3-氯苯基)丙酸酯拆分2-(3-氯苯基)丙酸对映体的方法。并针对酶催化拆分底物在水相介质溶解度小，导致转化率较低的问题，通过添加表面活性剂，促进底物在水相介质中的分散，从而提高转化率。
本发明采用的技术方案是：
(1)合成外消旋酯：一定量的2-(3-氯苯基）丙酸和不同的醇在甲苯溶剂中反应，对甲基苯磺酸为催化剂，反应温度为110℃，反应12小时；反应液用饱和nahco3溶液洗涤两次(2×20ml)，再用去离子水洗涤至中性，用无水mgso4干燥，抽滤，旋转蒸发得到产品为黄色液体；
(2)在水相反应介质中，含一定浓度的peg400，以外消旋酯为反应底物，加入一定量的脂肪酶，在一定温度下，于封闭体系中搅拌、加热反应一定时间，反应结束后，取一定量的样品通过高效液相色谱仪对产物进行定性和定量检测，并计算产物光学纯度和底物转化率；其反应方程式如式1：
式1脂肪酶催化水解拆分2-(3-氯苯基)丙酸
其中，r表示-ch3、-c2h5、-n-c4h9、-iso-c4h9、-n-c5h11、-iso-c5h11、-c6h13-c7h15、-c8h17；
所述脂肪酶选自褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶a、南极假丝酵母脂肪酶b、荧光假单胞菌脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、米曲霉、疏棉状嗜热胞菌脂肪酶、米黑根毛脂肪酶、雪白根霉。优选洋葱假单胞菌脂肪酶；
所述水相介质为缓冲溶液，选自磷酸氢二钠和磷酸、乙酸铵和乙酸、三羟甲基氨基甲烷(tris)和盐酸缓冲对水溶液。优选磷酸氢二钠和磷酸缓冲溶液；
所述表面活性剂选自peg400、peg1000、peg2000。优选peg400。
本发明相比现有技术有如下优势：
本发明利用洋葱假单胞菌脂肪酶较高的催化活性和立体选择性的特性，在水相介质中拆分2-(3-氯苯基)丙酸，得到较高光学纯度的产物(s)-2-(3-氯苯基)丙酸酯和(r)2-(3-氯苯基)丙酸。在反应体系中加入表面活性剂，增大2-(3-氯苯基)丙酸酯在反应介质中的溶解度，从而大大提高了转化率。该方法反应条件温和，操作简单，且光学纯度≥97%，转化率≥40%。克服了以有机溶剂作为反应介质具有毒性、易挥发，对环境污染大等缺陷，并解决了底物酯在水相介质中溶解度较小，导致转化率较低的问题。
【具体实施方案】
下面结合本发明的实施例对本发明做进一步说明：
一、测试与分析
本发明所述实施例中产物的光学纯度和底物转化率采用美国waters1525高效液相色谱仪分析，inertsil®ods-3色谱柱（250mm×4.6mm，5μm））；流动相组成为v甲醇：v水=64:36，其中水相含0.5%（v:v）乙酸、25mmol/l的羟丙基-β-环糊精，ph=4.0（用三乙胺调节）；流速为0.8ml/min，uv检测波长为225nm，柱温为30℃，进样量10μl；产物光学纯度用对映体过剩量值(eep)评价，按下式计算：
反应转化率(c)按下式计算，下标0表示初始值。
二、实施例
实施例1
将0.020mmol的外消旋2-(3-氯苯基)丙酸庚酯置于25ml反应管中，以1ml的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(ph=5.5)为反应介质，分别加入20mg不同商品化脂肪酶，在600rpm、50℃条件下反应16h。反应结束后，将产物过滤，用高效液相色谱进行分析。结果表明：洋葱假单胞菌脂肪酶为催化剂时，优先识别(r)-2-(3-氯苯基)丙酸庚酯，其eep为98.16%，c为11.09%。
实施例2
将0.020mmol不同种类的外消旋2-(3-氯苯基)丙酸酯置于25ml反应管中，以1ml的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(ph=5.5)为反应介质，加入20mg洋葱假单胞菌脂肪酶，在600rpm、40℃条件下反应15h。反应结束后，将产物过滤，用高效液相色谱进行分析。结果表明：底物为2-(3-氯苯基)丙酸庚酯时，其eep为98.20%，c为7.26%。
实施例3
将0.020mmol的外消旋2-(3-氯苯基)丙酸庚酯置于25ml反应管中，以1ml的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(ph=5.5)为反应介质，加入20mg洋葱假单胞菌脂肪酶，在600rpm、70℃条件下反应4h。反应结束后，将产物过滤，用高效液相色谱进行分析。结果表明：其eep为98.82%，c为10.31%。
实施例4
将0.020mmol的外消旋2-(3-氯苯基)丙酸庚酯置于25ml反应管中，以1ml的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(ph=6.5)为反应介质，加入20mg洋葱假单胞菌脂肪酶，在600rpm、70℃条件下反应16h。反应结束后，将产物过滤，用高效液相色谱进行分析。结果表明：其eep为98.12%，c为19.25%。
实施例5
将0.020mmol的外消旋2-(3-氯苯基)丙酸庚酯置于25ml反应管中，以1ml的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(ph=6.5)为反应介质，含30%peg400，加入20mg洋葱假单胞菌脂肪酶，在600rpm、70℃条件下反应16h。反应结束后，将产物过滤，用高效液相色谱进行分析。结果表明：其eep为98.01%，c为28.86%。
实施例6
将0.020mmol的外消旋2-(3-氯苯基)丙酸庚酯置于25ml反应管中，以1ml的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(ph=6.5)为反应介质，含30%peg400，加入15mg洋葱假单胞菌脂肪酶，开始反应，在600rpm、70℃条件下反应16h。反应结束后，将产物过滤，用高效液相色谱进行分析。结果表明：其eep为98.44%，c为25.84%。
实施例7
将0.020mmol的外消旋2-(3-氯苯基)丙酸庚酯置于25ml反应管中，以1ml的磷酸氢二钠/磷酸缓冲溶液(ph=6.5)为反应介质，含30%peg400，加入15mg洋葱假单胞菌脂肪酶，开始反应，在600rpm、70℃条件下反应36h。反应结束后，将产物过滤，用高效液相色谱进行分析。结果表明：其eep为97.30%，c为41.97%。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做各种改进并实施，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。