本发明提供一种酶促法催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。本发明属于生物工程技术领域。
背景技术：
熊去氧胆酸化学名称为：3α，7β-二羟基-5β-胆烷酸，与鹅去氧胆酸的分子式相同，立体结构不同，化学上把这两种化合物的结构关系成为同分异构体。熊去氧胆酸是白色结晶粉末，无臭，味苦。易溶于乙醇、氯仿、冰醋酸、稀碱液、略溶于乙醚，难溶于水和稀矿酸，熔点203℃。熊去氧胆酸udca是一种无毒性亲水胆酸，能竞争性地抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收，通过激活钙离子、蛋白激酶c组成的信号网络，并通过激活分裂活性蛋白基酶来增加胆汁淤积的作用。熊去氧胆酸还能竞争性地取代细胞磨合细胞器上的毒性胆酸分子，防止肝细胞和胆管细胞受到更多毒性胆酸的损害。在临床上，熊去氧胆酸主要用于溶解胆固醇型胆结石，原发性胆汁肝硬化pbc，慢性丙型肝炎，同时还用于酒精性肝病，非酒精性脂肪肝、良性复发性肝内胆汁淤积症、先天性内胆管囊性扩张症。
目前国内外主要使用胆酸和鹅去氧胆酸为原料经过多步化学反应制备熊去氧胆酸，反应过程中使用大量的溶剂、氧化剂和还原剂，对环境的污染比较严重；且鹅去氧胆酸转化率较低，后处理复杂。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种工艺简单，合成路线短，转化率高，后处理更容易，环境更友好的熊去氧胆酸制备方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征包括如下步骤：
a、将鹅去氧胆酸放入反应容器中，加入磷酸缓冲液溶解，调节溶液ph值，加入nad、nox2、7-α类固醇脱氢酶，通入氧气、控制反应温度和反应ph值，反应5小时，反应直到鹅去氧胆酸在溶液中的残留量低于1％，反应完成后升温搅拌，然后降温至常温；
b、反应液中加入l-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶，控制反应温度和反应ph值，反应3小时，反应直到7-酮基石胆酸残留低于0.1％，反应完成后，加碱升温搅拌，然后降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液加酸结晶得到udca。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤a中所述的磷酸缓冲液浓度为50-100mm。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤a中所述的溶液ph值为7.5-8.5。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤a中所述的nad用量为鹅去氧胆酸重量的0.10-0.30％；所述的nox2用量为鹅去氧胆酸重量的1.0-3.0％；所述的7-α类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.30-0.50％。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤a中氧气的流速为20-100ml/l/min，反应温度为常温，反应ph值为7.5-8.0。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤a中所述的反应后温度上升至40-80℃；搅拌时间控制在20-60分钟。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤b中所述的l-苹果酸钠用量为鹅去氧胆酸重量的40-70％；所述的苹果酸脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的1.0-3.0％；所述的7-β类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.1-0.3％。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤b中反应温度为25-30℃，反应ph为7.0-7.5。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤b中反应后升温至60-80℃，搅拌时间控制在1-3小时。
如上所述的一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于步骤b中所述的结晶所用的酸为无机酸，结晶ph为2-3。
综上所述，本发明的有益效果：
一、本发明中酶促反应条件温和，不使用化学法用到的各种溶剂、氧化剂、还原剂，工业化放大生产容易控制而且安全。产生的废水容易处理，环境友好。
二、本发明中酶促反应选择性高，与化学法比较副产物少，产品后提取和精制更简单。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
在反应瓶中加入鹅去氧胆酸10g，50mmph9.0磷酸缓冲液100ml，缓慢加入10％氢氧化钠调节溶液ph7.5-8.0之间，鹅去氧胆酸完全溶解。加入nad10mg、nox0.15g、7-α类固醇脱氢酶30mg，通入氧气，控制氧气流速为5ml/min，室温下反应至cdca残留低于1.0％。反应完全后，停止通入氧气，升温至50-55度并维持温度搅拌20分钟。
将物料降温至室温，反应液中加入l-苹果酸钠4.5g、苹果酸脱氢酶0.18g、7-β类固醇脱氢酶15mg，25-30度下控制ph7.0-7.5之间反应，直到7-酮基石胆酸残留低于0.1％。反应完成后，加入10％氢氧化钠溶液调节溶液ph8.0以上，升温至70-75度并维持温度搅拌2小时，然后降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸调节溶液ph2-3，过滤，大量水洗涤滤饼至洗水ph中性，干燥，得到熊去氧胆酸9.8g。
实施例2
在反应瓶中加入鹅去氧胆酸10g，50mmph9.0磷酸缓冲液100ml，缓慢加入10％氢氧化钠调节溶液ph7.5-8.0之间，鹅去氧胆酸完全溶解。加入nad15mg、nox0.20g、7-α类固醇脱氢酶33mg，通入氧气，控制氧气流速为5.5ml/min，室温下反应至cdca残留低于1.0％。反应完全后，停止通入氧气，升温至50-55度并维持温度搅拌30分钟。
将物料降温至室温，反应液中加入l-苹果酸钠5.0g、苹果酸脱氢酶0.18g、7-β类固醇脱氢酶20mg，25-30度下控制ph7.0-7.5之间反应，直到7-酮基石胆酸残留低于0.1％。反应完成后，加入10％氢氧化钠溶液调节溶液ph8.0以上，升温至70-75度并维持温度搅拌2小时，然后降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸调节溶液ph2-3，过滤，大量水洗涤滤饼至洗水ph中性，干燥，得到熊去氧胆酸9.9g。
实施例3
在反应瓶中加入鹅去氧胆酸10g，50mmph9.0磷酸缓冲液100ml，缓慢加入10％氢氧化钠调节溶液ph7.5-8.0之间，鹅去氧胆酸完全溶解。加入nad18mg、nox0.25g、7-α类固醇脱氢酶35mg，通入氧气，控制氧气流速为6.0ml/min，室温下反应至cdca残留低于1.0％。反应完全后，停止通入氧气，升温至50-55度并维持温度搅拌25分钟。
将物料降温至室温，反应液中加入l-苹果酸钠5.5g、苹果酸脱氢酶0.25g、7-β类固醇脱氢酶25mg，25-30度下控制ph7.0-7.5之间反应，直到7-酮基石胆酸残留低于0.1％。反应完成后，加入10％氢氧化钠溶液调节溶液ph8.0以上，升温至70-75度并维持温度搅拌2小时，然后降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液中加入1:1盐酸调节溶液ph2-3，过滤，大量水洗涤滤饼至洗水ph中性，干燥，得到熊去氧胆酸9.9g。
实施例4
一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，包括如下步骤：
a、将鹅去氧胆酸放入反应容器中，加入磷酸缓冲液溶解，调节溶液ph值，加入nad、nox2、7-α类固醇脱氢酶，通入氧气、控制反应温度和反应ph值，反应直到鹅去氧胆酸在溶液中的残留量低于1％，反应完成后升温搅拌，然后降温至常温；
b、反应液中加入l-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶，控制反应温度和反应ph值，反应直到7-酮基石胆酸残留低于0.1％，反应完成后，加碱升温搅拌，然后降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液加酸结晶得到udca。
步骤a中所述的磷酸缓冲液浓度为50m。
步骤a中所述的溶液ph值为7.5。
步骤a中所述的nad用量为鹅去氧胆酸重量的0.10％；所述的nox2用量为鹅去氧胆酸重量的1.0％；所述的7-α类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.30％。
步骤a中氧气的流速为20-ml/l/min，反应温度为常温，反应ph值为7.5。
步骤a中所述的反应后温度上升至40℃；搅拌时间控制在20分钟。
步骤b中所述的l-苹果酸钠用量为鹅去氧胆酸重量的40％；所述的苹果酸脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的1.0％；所述的7-β类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.1％。
步骤b中反应温度为25℃，反应ph为7.0。
步骤b中反应后升温至60℃，搅拌时间控制在1小时。
步骤b中所述的结晶所用的酸为无机酸，结晶ph为2。
实施例5
一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，包括如下步骤：
a、将鹅去氧胆酸放入反应容器中，加入磷酸缓冲液溶解，调节溶液ph值，加入nad、nox2、7-α类固醇脱氢酶，通入氧气、控制反应温度和反应ph值，反应直到鹅去氧胆酸在溶液中的残留量低于1％，反应完成后升温搅拌，然后降温至常温；
b、反应液中加入l-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶，控制反应温度和反应ph值，反应直到7-酮基石胆酸残留低于0.1％，反应完成后，加碱升温搅拌，然后降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液加酸结晶得到udca。
步骤a中所述的磷酸缓冲液浓度为100mm。
步骤a中所述的溶液ph值为8.5。
步骤a中所述的nad用量为鹅去氧胆酸重量的0.30％；所述的nox2用量为鹅去氧胆酸重量的3.0％；所述的7-α类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.50％。
步骤a中氧气的流速为20-100ml/l/min，反应温度为常温，反应ph值为8.0。
步骤a中所述的反应后温度上升至80℃；搅拌时间控制在60分钟。
步骤b中所述的l-苹果酸钠用量为鹅去氧胆酸重量的70％；所述的苹果酸脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的3.0％；所述的7-β类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.3％。
步骤b中反应温度为30℃，反应ph为7.5。
步骤b中反应后升温至80℃，搅拌时间控制在3小时。
步骤b中所述的结晶所用的酸为无机酸，结晶ph为3。
实施例6
一种酶促法合成熊去氧胆酸的方法，包括如下步骤：
a、将鹅去氧胆酸放入反应容器中，加入磷酸缓冲液溶解，调节溶液ph值，加入nad、nox2、7-α类固醇脱氢酶，通入氧气、控制反应温度和反应ph值，反应直到鹅去氧胆酸在溶液中的残留量低于1％，反应完成后升温搅拌，然后降温至常温；
b、反应液中加入l-苹果酸钠、苹果酸脱氢酶、7-β类固醇脱氢酶，控制反应温度和反应ph值，反应直到7-酮基石胆酸残留低于0.1％，反应完成后，加碱升温搅拌，然后降温至常温，过滤除去溶液中的固形物，滤液加酸结晶得到udca。
步骤a中所述的磷酸缓冲液浓度为80mm。
步骤a中所述的溶液ph值为8。
步骤a中所述的nad用量为鹅去氧胆酸重量的0.20％；所述的nox2用量为鹅去氧胆酸重量的2.0％；所述的7-α类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.40％。
步骤a中氧气的流速为50ml/l/min，反应温度为常温，反应ph值为7.8。
步骤a中所述的反应后温度上升至60℃；搅拌时间控制在40分钟。
步骤b中所述的l-苹果酸钠用量为鹅去氧胆酸重量的60％；所述的苹果酸脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的2.0％；所述的7-β类固醇脱氢酶用量为鹅去氧胆酸重量的0.2％。
步骤b中反应温度为28℃，反应ph为7.3。
步骤b中反应后升温至70℃，搅拌时间控制在2小时。
步骤b中所述的结晶所用的酸为无机酸，结晶ph为2.5。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。