本发明属于生物化工
技术领域：
，具体涉及霉菌的用途及制备d-(+)-泛解酸的方法。
背景技术：
：d-泛酸是b族维生素，在体内作为辅酶a的组成成分参与糖、脂肪、蛋白质的代谢。由于d-泛酸在酸、碱、光和热等条件下均不稳定，因此其商品形式主要为d-泛酸钙。目前工业上主要通过d-(-)-泛酰内酯与-氨基丙酸钙缩合制备d-泛酸钙。可见，d-(-)-泛酰内酯是合成d-泛酸钙的重要手性中间体。d-(-)-泛酰内酯的制备可通过化学法或生物法实现。化学法是通过采用手性拆分剂(奎宁化合物、二甲马钱子碱等)与dl-泛酰内酯形成复盐，利用复盐在溶剂中溶解度不同，将d-型和l-型的复盐分离，然后通过化学处理，从而得到d-(-)-泛酰内酯。该方法的缺点是所用的手性拆分试剂价格昂贵，分离困难，并且存在严重的毒性问题和环境污染问题，故不适用于工业化生产。生物法制备d-(-)-泛酰内酯又可分为两种。一种是利用产l-(+)-泛酰内酯水解酶的微生物选择性水解dl-泛酰内酯中的l-(+)-泛酰内酯，从而得到未被水解的d-(-)-泛酰内酯。该方法需要将l-(+)-泛酰内酯彻底水解，否则难以保证d-(-)-泛酰内酯的光学纯度。这就对酶及其水解条件有很高的要求，所需的反应时间也很长。另一方法是利用产d-(-)-泛酰内酯水解酶的微生物选择性水解dl-泛酰内酯中的d-(-)-泛酰内酯，得到d-(+)-泛解酸后再经酸化环合即可获得d-(-)-泛酰内酯，未水解的内酯经消旋化后还可以重复使用。这一方法不要求水解彻底，反应时间短且易于控制，产品质量有保障。日本第一制药株式会社和中国浙江杭州鑫富药业股份有限公司采用此法，分别利用尖镰孢fusariumoxysporumif0000与串珠镰孢菌fusariummoniliformecgmcc0536进行工业生产。(三)技术实现要素：本发明的目的在于研究更多的能高效生产d-(-)-泛酰内酯水解酶的菌种。本发明的d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌，其能使含有溴百里香酚蓝和d-(-)-泛酰内酯的筛选培养基产生黄色变色圈，所述产生菌为烟草镰孢、直喙镰孢、甘蔗镰孢、禾赤镰孢、节状镰孢厚垣变种、瓦克青霉和环带曲霉，该类微生物能选择性水解dl-泛酰内酯制备d-(+)-泛解酸。本发明的d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc)，其菌株编号分别是cgmcc3.5219、cgmcc3.2899、cgmcc3.6853、cgmcc3.6854、cgmcc3.686、cgmcc3.5241、cgmcc3.4469。本发明包括以下步骤：(1)d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌的筛选；(2)d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌的培养；(3)利用d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌对dl-泛酰内酯进行选择性水解。优选的，所述d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌的筛选包括初筛和复筛两个步骤。初筛培养基组成为：甘油0.5～1.5％，蛋白胨0.5～1.5％，酵母膏0.5～1.5％，玉米浆0.5～1.5％，ph值7.0，琼脂1.0～2.0％，d-(-)-泛酰内酯1.0～2.5％，溴百里酚蓝0.005～0.01％。初筛培养温度25～26℃，培养时间5-6天。挑取能使初筛培养基产生黄色变色圈的菌株，接种到pda斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)，准备进行复筛。复筛培养基组成为：甘油1～3％，蛋白胨0.5～1.5％，酵母膏0.5～1.5％，玉米浆0.5～1.5％，ph7.0。250ml三角瓶装复筛培养基50ml。复筛培养条件：在25～28℃、转速150～250rpm下培养3-5天。优选的，所述d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌的产酶培养所用培养基组成为：蔗糖0.5～5％、玉米浆0.1～5％、蛋白胨0.5～5％、酵母膏0.5～5％，ph6.0～9.0。产酶培养条件：在25～30℃、转速100～300rpm下培养1～5天。选择性水解dl-泛酰内酯的方法：配制5～50％的dl-泛酰内酯水溶液，以发酵得到的湿菌体或固定化菌体为催化剂，催化剂：dl-泛酰内酯＝0.2～2∶1(质量比)，反应温度20～50℃，控制ph6.0～8.0，反应时间5～15小时。所述的d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌，是烟草镰孢、直喙镰孢、甘蔗镰孢、禾赤镰孢、节状镰孢厚垣变种、瓦克青霉、环带曲霉。具体包括以下之一：烟草镰孢fusariumtabacinumcgmcc3.5219、直喙镰孢fusariumorthocerascgmcc3.2899、甘蔗镰孢fusariumsaccharicgmcc3.6853、禾赤镰孢fusariumgraminumcgmcc3.6854、节状镰孢厚垣变种fusariummerismoidesvar.chlamydosporalecgmcc3.686、瓦克青霉penicilliumwaksmaniicgmcc3.5241、环带曲霉aspergilluszonatuscgmcc3.4469。本发明详细的过程如下：1.产d-(-)-泛酰内酯水解酶菌株的筛选用于产d-(-)-泛酰内酯水解酶菌株筛选的微生物主要有烟草镰孢、直喙镰孢、甘蔗镰孢、节状镰孢厚垣变种、禾赤镰孢、乳酸镰孢、融粘帚霉、青霉状粘帚霉、环带曲霉、肇庆曲霉、温特曲霉原变种、绿垂曲霉、矮棒曲霉、黄曲霉柱头变种、瓦克青霉、狐粪青霉、鲜绿青霉等17种，均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc)。首先根据《cgmcc菌种目录》(第四版)所述，选用相应的活化培养基，对上述17种菌株的冻干粉进行活化。然后将这17种菌株分别接种到pda斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)。pda斜面培养基配方：马铃薯浸汁20％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，ph自然。在25℃-26℃下培养4-5天。从生长好的斜面上挑取一小块菌体，在有玻璃珠的无菌三角瓶中，用无菌水制成孢子悬液，稀释至每毫升约104～106个孢子，涂布于初筛平板培养基上，进行产酶菌株的初筛。初筛培养基组成为：甘油1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，玉米浆0.5％，ph值7.0，琼脂1.5％，d-(-)-泛酰内酯1.5％，溴百里酚蓝0.01％。初筛培养温度25～26℃，培养时间5-6天。挑取能使初筛培养基产生黄色变色圈的菌株，接种到pda斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)。将在pda斜面培养基上生长好的菌体转接至复筛培养基中，进行产酶菌株的复筛。复筛培养基组成为：甘油1～3％，蛋白胨0.5～1.5％，酵母膏0.5～1.5％，玉米浆0.5～1.5％，ph7.0。250ml三角瓶装复筛培养基50ml。复筛培养条件：在25～28℃、转速150～250rpm下培养3-5天。培养完成后，收集菌体，测定其所产d-(-)-泛酰内酯水解酶的活力。d-(-)-泛酰内酯的旋光性是左旋的，其水解产物d-(+)-泛解酸的旋光性则是右旋的。dl-泛酰内酯经d-(-)-泛酰内酯水解酶选择性水解后，水解液中剩下未被水解的、旋光性是右旋的l-(+)-泛酰内酯，以及旋光性是右旋的d-(+)-泛解酸，因此水解液应是富右旋的。d-(-)-泛酰内酯水解酶的活性越好，则水解液的旋光值越高，所以测定水解液的旋光值，可判断水解的反应程度。酶活力单位的定义：取20ml发酵液，过滤出菌丝体，与50ml5％dl-泛酰内酯溶液混合，以自动电位滴定仪控制反应液ph6.8～7.0，30℃下磁力搅拌反应30分钟，过滤除去菌丝体，以hplc测定d-(+)-泛解酸。在上述条件下，每分钟水解dl-泛酰内酯生成1μmold-(+)-泛解酸的酶量定义为1酶活力单位(u)。d-(+)-泛解酸的hplc测定条件：色谱柱为ultimatelp-c18(5μm，4.6×250mm)，流动相为乙腈∶kh2po4溶液(0.02mol/l)＝1∶9，用hcl调节ph至3.0，紫外检测波长215nm，柱温25℃。2.产酶培养将上述产酶筛选中能使培养基出现黄色变色圈的菌株，尤其是复筛时立体选择性高的菌株，如烟草镰孢fusariumtabacinumcgmcc3.5219、直喙镰孢fusariumorthocerascgmcc3.2899、甘蔗镰孢fusariumsaccharicgmcc3.6853、禾赤镰孢fusariumgraminumcgmcc3.6854、节状镰孢厚垣变种fusariummerismoidesvar.chlamydosporalecgmcc3.686、瓦克青霉penicilliumwaksmaniicgmcc3.5241、环带曲霉aspergilluszonatuscgmcc3.4469等菌株，进行产酶培养。斜面培养采用pda培养基，培养方法如前所述。上述菌株全部购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc)。将pda斜面培养基培养好的产酶菌株接种至产酶培养基，在25～30℃、转速100～300rpm下培养时间1～5天。产酶培养基组成为：蔗糖0.5～5％、玉米浆0.1～5％、蛋白胨0.5～5％、酵母膏0.5～5％，ph6.0～9.0。适合于产酶培养的碳源有葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、菜籽油、果糖和蔗糖等，其中蔗糖为最佳碳源。适合于产酶培养的氮源有玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、豆饼粉、花生饼粉、酵母膏、硫酸铵、硝酸钠等，其中玉米浆、蛋白胨、酵母膏为最佳氮源。3.选择性水解用水将市售工业级dl-泛酰内酯溶解，配制成5～50％的dl-泛酰内酯水溶液，以发酵得到的湿菌体或固定化菌体作为催化剂，催化剂的用量则按照每1克dl-泛酰内酯加入0.2～2克催化剂的量加入。反应温度控制在20～50℃，其中25～45℃之间较适宜。反应体系的ph控制在6.0～8.0之间，其中ph在6.5～7.5之间最适宜。水解反应在8～12小时内完成时，底物浓度配制成15～25％较适宜，此时水解率在15～30％。通过实验，本发明人发现烟草镰孢、直喙镰孢、甘蔗镰孢、禾赤镰孢、节状镰孢厚垣变种、瓦克青霉、环带曲霉的菌株，能有效用于选择性水解dl-泛酰内酯制备d-(+)-泛解酸。(四)具体实施方式以下用具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：实施例1d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌的初筛将购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter，cgmcc)的烟草镰孢、直喙镰孢、甘蔗镰孢、节状镰孢厚垣变种、禾赤镰孢、乳酸镰孢、融粘帚霉、青霉状粘帚霉、环带曲霉、肇庆曲霉、温特曲霉原变种、绿垂曲霉、矮棒曲霉、黄曲霉柱头变种、瓦克青霉、狐粪青霉、鲜绿青霉等微生物进行初筛。配制含甘油1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，玉米浆0.5％，ph值7.0，琼脂1.5％的培养基，115℃灭菌30分钟。完成灭菌后，冷却至50℃，加入1.5％的d-(-)-泛酰内酯和0.01％的溴百里酚蓝，混匀倒平板。挑取活化平板上的菌落，用无菌水制成孢子悬液，稀释至每毫升约104～106个孢子，涂布于初筛平板培养基上。为排除菌体因自身代谢产酸而造成的假阳性，需设置对照培养基，对照培养基除不加入d-(-)-泛酰内酯外，其余同初筛培养基。将初筛培养基和对照培养基置于25-26℃的环境下培养时间5-6天。观察上述平板培养基的变色情况，结果如表1所示。表1初筛平板变色情况注：(“++”表示有较大黄色变色圈；“+”表示有黄色变色圈；“-”表示无变色圈)实施例2d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌的复筛配制复筛培养基，其组成为：甘油1％，蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，玉米浆0.5％，ph7.0。将初筛中平板培养基呈现黄色变色圈的烟草镰孢、直喙镰孢、甘蔗镰孢、节状镰孢厚垣变种、禾赤镰孢、环带曲霉、瓦克青霉等微生物的菌株接种到含有50ml复筛培养基的250ml三角瓶中，26℃、180rpm下培养5天。离心，收集湿菌丝体。取3g湿菌丝体，置于50ml烧杯中，加入25ml20％dl-泛酰内酯溶液，以自动电位滴定仪控制反应液ph6.8～7.0，30℃下磁力搅拌反应10小时.然后过滤除去菌丝体，测定滤液的旋光值，结果见表2。表2产d-(-)-泛酰内酯水解酶菌株的酶促拆分反应实施例3～5d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌的培养及选择性水解dl-泛酰内酯配制产酶培养基，其组成为：蔗糖2％、玉米浆5％、蛋白胨2％、酵母膏2％，ph7.0。1000ml三角瓶装种子培养基200ml。将经过初筛与复筛的变色圈大、旋光值高的菌株直喙镰孢fusariumorthocerascgmcc3.2899、甘蔗镰孢fusariumsaccharicgmcc3.6853、禾赤镰孢fusariumgraminumcgmcc3.6854，分别接种至产酶培养基，在28℃、180rpm下培养时间4天。培养结束后过滤收集菌体。配制60ml浓度为15％的dl-泛酰内酯水溶液，向其中加入4.5克湿菌体，在30℃、磁力搅拌转速150rpm、ph控制在6.9～7.1之间(以10％氨水溶液进行调节)的条件下进行dl-泛酰内酯的选择性水解。水解反应在12小时后测定水解率和产物的光学纯度，结果见表3。表3d-(-)-泛酰内酯水解酶产生菌选择性水解dl-泛酰内酯实施例6产酶菌株的固定化及反复分批选择性水解dl-泛酰内酯按实例3方法，发酵培养直喙镰孢fusariumorthocerascgmcc3.2899。称取一定量的菌丝体，先用去离子水配成50ml的菌悬液，然后加入2ml的戊二醛溶液(50％)，室温下搅拌均匀后静置4小时。离心，用去离子水充分洗涤3次，以除去未参与菌体交联的戊二醛，得到固定化菌体。将此固定化菌体，按实例3方法进行选择性水解dl-泛酰内酯。反复分批选择性水解dl-泛酰内酯5次，结果见表4。表4固定化菌体反复分批选择性水解dl-泛酰内酯试验转化次数12345水解率(％)22.723.523.121.021.3与现有发明相比，本发明的特征主要体现在：本发明提供了新的能高效生产d-(-)-泛酰内酯水解酶的菌种，这些菌应用于选择性水解dl-泛酰内酯制备d-(+)-泛解酸，具有培养成本低、立体选择性好等优点。当前第1页12