一种检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒O、A和Asial型的试剂盒及引物和探针的制作方法

本发明涉及一种可用于动物病毒检测的特异性引物对和探针，以及包括有特异性引物对和探针的定量检测试剂盒，确切讲本发明是一种能同时检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒o、a和asial型一步法tapman实时荧光定量pcr检测试剂盒。

背景技术：

塞尼卡谷病毒(senecavalleyvirus,svv)为单股正链的不分节段的rna病毒，为小rna病毒科(picornaviridae)塞尼卡谷病毒属的唯一成员。2015年9月以来，美洲国家多个地区的猪群发生水泡性疫情，感染猪跛行，冠状带和蹄壁周围发红发烫，并出现溃疡性病变，猪的鼻吻，蹄冠状带部为出现水泡样病变，经过实验室病原鉴定，排除为口蹄疫、猪水疱病和水泡性口炎等重要外来动物疫病，最终被确诊为塞尼卡谷病毒感染。2015年夏天在我国广东省出现该病毒的首例报道，后续在2016年4月湖北省也出现了该病毒的爆发，主要临床症状为猪鼻吻、蹄部出现水泡样病变，虽然塞尼卡谷病毒不会引起重大的经济损失，但由于其感染后表现出的临床症状与口蹄疫难以区分，所以急需建立一种快速，敏感和特异的区分塞尼卡谷和口蹄疫的鉴别诊断方法，对该病的控制至关重要。

目前没有同时鉴别检测塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)o、a和asial的多重实时荧光定量检测技术的报道，使用本试剂盒进行realtimert-pcr反应可在同一反应管内连续进行塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型检测，操作简单，敏感性高，并能有效防止污染。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种特异、敏感、快速和便捷的可用于鉴别检测塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型的特异性引物对及探针的检测试剂盒。

本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

本发明是一种用于能同时鉴别检测塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型的引物对及探针基因序列分别为：

塞尼卡谷病毒检测引物和探针：

seq1：(svv-f)5’-agaatttggaagccatgctct-3’

seq2：(svv-r)5’-gagccaacatagaracagattgc-3’

seq3：(svv-probe)5’-ttcaaaccaggaacactactcgaga-3’

(5′fam,3′bhq1)

o型fmdv检测引物和探针：

seq4：(o/fmdv-f)5’-gaagcagccttggacaacacc-3’

seq5：(o/fmdv-r)5’-gtgtggtgccgtgtagggca-3’

seq6：(o/fmdv-probe)5’-caccaacccaacggcgtaycayaaggc-3’

(5′rox,3′bhq1)

a型fmdv检测引物和探针：

seq7：(a/fmdv-f)5’-attcgggccacggagatccrc-3’

seq8：(a/fmdv-r)5’-gtcttgcgacgacacctcc-3’

seq9：(a/fmdv-probe)5’-ttgtgcgcatgaagcgcgccgagct-3’

(5′hex,3′bhq1)

asia1型fmdv检测引物和探针：

seq10：(asia1/fmdv-f)5’-tgcccacttccttcaactacgg-3’

seq11：(asia1/fmdv-r)5’-caagggcctggggcagtatgt-3’

seq12：(asia1/fmdv-probe)5’-ccatcacggagctgttgatccgcatg-3’

(5′cy5,3′bhq1)

其中，y为c/t，r为a/g。

本发明是一种用于能同时检测塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型的实时荧光定量pcr试剂盒，除包含上述引物和探针序列外还包括：

2×onesteprt-pcrbufferⅲ(含dntpmixture，mg2+)、takaraextaqhs(5u/μl)、primescriptrtenzymemixⅱ，不含塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型的rna样品作为阴性样品，和作为阳性对照的含有塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型的rna样品。在具体应用本发明检测塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型的实时荧光定量pcr试剂盒时，pcr扩增条件为：42℃10min，95℃2min，1个循环→95℃10sec，60℃45sec，40个循环，其中荧光信号收集放置在每个循环的60℃45sec末端。

本发明的试剂盒是一种一步法tapman荧光定量pcr检测的试剂盒，本发明的试剂盒应用中是使用5`端带有荧光物质，3`端带有淬灭物质的tapman探针进行荧光检测，当探针完整时，5`端荧光物质受到3`端淬灭物质的制约，不能发出荧光。而当tapman探针被分解后，5`端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。在pcr反应中探针和模板杂交，延伸是聚合酶活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中的荧光强度，从而可以达到检测pcr产物扩增量的目的。

利用本发明试剂盒同时进行塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型一步法tapman荧光定量pcr检测，其优点在于，根据塞尼卡谷病毒3d基因保守区设计两条特异性引物和探针，分别根据口蹄疫病毒o、a和asial型流行株的vp1基因保守区，设计特异性引物和探针，在各自病毒rna提取的基础上，对组织样品进行荧光定量pcr扩增，分别实现对塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型的定量检测。在pcr使用本试剂盒进行realtimert-pcr反应可在同一反应管内连续进行，操作简单，并能有效防止污染。

在使用本发明的试剂盒进行检测时，是对塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型rna提取后直接进行定量pcr扩增，同时本发明对反应体系及反应条件进行了优化，并可提高了检测的精准度，一步法tapman荧光定量在扩增完成后可直接进行标准曲线定量起始病毒拷贝数，同时其操作简单快捷，非常适用于田间样品流行病学调查的应用。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。

图1：含塞尼卡谷病毒3d部分基因和口蹄疫病毒o、a和asial型vp1基因序列重组质粒酶切鉴定电泳图，

其中：m:5000bpdnamarker

1)重组质粒pmd-svv-3d双酶切鉴定

2)重组质粒pmd-fmdv-ovp1双酶切鉴定。

3)重组质粒pmd-fmdv-avp1双酶切鉴定。

4)重组质粒pmd-fmdv-asialvp1双酶切鉴定。

图2：塞尼卡谷病毒一步法tapman荧光定量pcr检测标准曲线，其中：纵坐标代表ct值。横坐标代表样品的拷贝数。

图3：口蹄疫病毒o型一步法tapman荧光定量pcr检测标准曲线，其中：纵坐标代表ct值。横坐标代表样品的拷贝数。

图4：口蹄疫病毒a型一步法tapman荧光定量pcr检测标准曲线，其中：纵坐标代表ct值。横坐标代表样品的拷贝数。

图5：口蹄疫病毒asial型一步法tapman荧光定量pcr检测标准曲线，其中：纵坐标代表ct值。横坐标代表样品的拷贝数。

图6：是检测方法特异性的扩增曲线。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明进行详细说明，以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步说明

一种能同时检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒o、a和asial型的检测试剂盒，其用于检测和鉴别塞尼卡谷病毒、o型口蹄疫病毒、a型口蹄疫病毒和asial型口蹄疫病毒。

其引物和探针序列为：

塞尼卡谷病毒检测引物和探针序列seq1、seq2和seq3；

o型口蹄疫病毒检测引物和探针序列seq4、seq5和seq6；

a型口蹄疫病毒检测引物和探针序列seq7、seq8和seq9；

asia1型口蹄疫病毒检测引物和探针序列seq10、seq11和seq12。

用于检测塞尼卡谷病毒的探针的5'端荧光标记fam，3'端淬灭标记bhq1；

所述用于检测o型口蹄疫病毒的5'端荧光标记rox，3'端淬灭标记bhq1；

所述用于检测a型口蹄疫病毒的5'端荧光标记hex，3'端淬灭

标记bhq1；

所述用于检测asial型口蹄疫病毒的5'端荧光标记cy5，3'端淬灭标记bhq1。

所述试剂盒内包括了一步法荧光定量rt-pcr引物和探针。

所述试剂盒中设置有有：2×onesteprt-pcrbufferⅲ、takaraextaqhs、primescriptrtenzymemixⅱ，不含塞尼卡谷病毒、o型口蹄疫病毒、a型口蹄疫病毒和asial型口蹄疫病毒的rna样品分别作为阴性对照，含有塞尼卡谷病毒、o型口蹄疫病毒、a型口蹄疫病毒和asial型口蹄疫病毒的rna样品作为阳性对照。

所述试剂盒rt-pcr条件为：42℃-10min，95℃-2min，1个循环为95℃-10sec、60℃-45sec，40个循环，其中荧光信号收集放置在每个循环的60℃-45sec末端。

实施例1

1.塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型荧光定量pcr引物的设计与合成：

利用已知的塞尼卡谷病毒3d基因序列和口蹄疫病毒o、a和asial型vp1基因序列比对后，根据保守区域利用primerexpress3.0软件设计引物和探针，送宝生物工程(大连)有限公司合成。上下游引物及探针分别为：

塞尼卡谷病毒检测引物和探针：

seq1：(svv-f)5’-agaatttggaagccatgctct-3’

seq2：(svv-r)5’-gagccaacatagaracagattgc-3’

seq3：(svv-probe)5’-ttcaaaccaggaacactactcgaga-3’(5′fam,3′bhq1)

o型fmdv检测引物和探针：

seq4：(o/fmdv-f)5’-gaagcagccttggacaacacc-3’

seq5：(o/fmdv-r)5’-gtgtggtgccgtgtagggca-3’

seq6：(o/fmdv-probe)5’-caccaacccaacggcgtaycayaaggc-3’

(5′rox,3′bhq1)

a型fmdv检测引物和探针：

seq7：(a/fmdv-f)5’-tcgggccacggagatccrc-3’

seq8：(a/fmdv-r)5’-gtcttgcgacgacacctcc-3’

seq9：(a/fmdv-probe)5’-ttgtgcgcatgaagcgcgccgagctc-3’

(5′hex,3′bhq1)

asia1型fmdv检测引物和探针：

seq10：(asia1/fmdv-f)5’-tgcccacttccttcaactacgg-3’seq11：(asia1/fmdv-r)5’-caagggcctggggcagtatgt-3’seq12：(asia1/fmdv-probe)5’-ccatcacggagctgttgatccgcatg-3’

(5′cy5,3′bhq1)

其中，y为c/t，r为a/g。

2.标准品的制备

(1)塞尼卡谷病毒3d基因和口蹄疫病毒vp1基因的扩增及克隆鉴定

参考塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型在ncbi上登陆的序列，通过比较分析后，设计出能扩增塞尼卡谷病毒3d部分基因和口蹄疫病毒vp1基因序列的上下游引物，送宝生物工程(大连)有限公司合成。扩增塞尼卡谷病毒3d基因的上下游引物分别为：seq13：(svv-3df)5’-tgtcgatgtgccctccctggc-3’seq14：(svv-3dr)5’-tcccagaatcgccggcggcacc-3’。扩增口蹄疫病毒vp1基因通用上下游引物分别为：seq15：(fmdv-vp1f)5’-gcgctggcaaagactttga-3’seq16：(fmdv-vp1r)5’-gacatgtcctcctgcatctggttga-3’。

取适量病毒液，按照trizol提取rna的方法提取病毒的rna，然后使用takara公司一步法rt-pcr试剂盒primescriptonesteprt-pcrkit，操作如下：

以rna提取物为模板进行rt-pcr扩增配制25μl体系，

混匀、低速离心后置pcr自动扩增仪中，按照如下程序扩增：50℃30min，94℃2min一个循环→94℃30sec，57℃30sec，72℃45sec35个循环。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳纯化回收，利用t4连接酶与pmd-20-tvector16℃过夜连接，转化dh5α感受态细胞，挑单克隆斑于lb(amp⁺)中扩大培养，用质粒提取试剂盒提纯质粒pmd-fmdv-vp1和pmd-svv-3d，通过spei/ecori酶切鉴定，确定阳性质粒，见附图1。

(2)体外转录获得标准品rna

以上述线性化的质粒为模板，利用体外反转录试剂盒获得目的rna。反应体系为：10×t7rnapolymerasebuffer2μl，dtt2μl，dntpmixture4μl，rnaseinhibitor0.5μl,templatedna0.5μg，t7rnapolymerase1μl，depch2oto20μl，反应条件：37℃1h后，按照rna的提取和纯化步骤最后得到适量depc水溶解的rna，测定浓度后于-80℃冻存。利用公式：(copies/μl)＝[(ng数×10^-9)×(6.02×10²³)]÷(碱基数×340)换算出目的rna的拷贝数。

3.标准曲线的建立

根据定量后得到的拷贝数，将标准样品制成等6个梯度稀释的检测标准品，为降低误差，提高实验的可重复性，每个稀释度样品都设有三个重复孔，确定ct值(ct即cyclethreshold，指反应管中的荧光信号达到设定的阈值时的所经历的循环数)，从而确定扩增效果最好的标准曲线。

扩增体系为25μl，其中包含2×onesteprt-pcrbufferⅲ(含dntpmixture，mg2+)、takaraextaqhs(5u/μl)、primescriptrtenzymemixⅱ、rnasefreedh2o、上游引物、下游引物、探针、和稀释好的标准品2μl。pcr扩增采用agilenttechologies-mx3005ppcr扩增仪，程序为：42℃10min，95℃2min，1个循环→95℃10sec，60℃45sec，40个循环，其中荧光信号收集放置在每个循环的60℃45sec末端。pcr荧光信号的分析采用安捷伦公司mxpro软件，尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型所得到的荧光定量pcr的标准曲线分别见附图2、3、4和5。

4.特异性的检测

用如下猪常见疫病病原rna：猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎、猪蓝儿病毒、猪伪狂犬病毒和猪口蹄疫病毒，检测已建立方法的特异性，所得到的荧光定量pcr结果见附图6。结果显示该方法只能特异性的扩增出塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型rna阳性对照，特异性良好。

5.敏感性的检测

将塞尼卡谷病毒和口蹄疫病毒o、a和asial型标准样品分别制成1×10⁷-1×10⁰(copies/μl)8个稀释度，检测已建立方法的敏感性，为确保检测的准确性，设置高压灭菌水为本底值对照，将≤32个循环的起峰的样品判定为阳性，此荧光定量检测方法能准确检测到10个拷贝以上的病原，而普通pcr智能检测到1×10⁴个拷贝以上，由此可见本发明检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒o、a和asial型的荧光定量pcr的检测试剂盒敏感性是普通pcr的10³倍，敏感性好。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种检测和鉴别塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒o、a和asial型的试剂盒及引物和探针

<160>0

<170>siposequencelisting1.0