本发明涉及分子标记
技术领域：
，具体涉及一对高多态性石榴ssr引物及其应用。
背景技术：
：石榴是古老的保健水果，果实富含花青苷、黄酮、安石榴苷等多酚类物质，特别是安石榴苷等鞣花单宁类物质临床医用和保健价值高，具有潜在的抗氧化、抗癌、抗菌等功能，被誉为超级水果，被划为国家规划特色经济林树种之一。石榴在中国有2000多年的栽培历史，不同地域间的引种和品种交换频繁，导致了现有品种间混杂，同物异名或同名异物现象非常普遍。品种混杂，不仅给育种亲本选配带来了困难，对生产中大规模引种也造成了严重影响，一定程度上制约了石榴产业的快速健康发展，因此，开展石榴品种鉴定是生产中需要解决的重要课题。目前，对石榴品种的鉴定主要是通过表型特征，包括树势、叶、花、果实等特征，这些表型特征易受到环境因素影响。分子标记可以直接检测不同品种或个体在dna分子水平上的差异，具有较高的多态性和个体特异性，且不受环境和生长阶段影响，能鉴定形态标记所难以鉴定的个体。ssr分子标记数量丰富且随机均匀分布于基因组中，呈共显性，等位变异高，检测方便，已应用于苹果、葡萄、水稻等品种鉴定中应用。石榴中开发特异性强、多态性高、能稳定鉴定石榴品种的ssr引物对科学合理利用石榴品种具有重要的意义。技术实现要素：本发明第一方面提供了一对高多态性石榴ssr引物pg098，包括正向引物和反向引物，正向引物核苷酸序列如seqidno.1所示，反向引物核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明第二方面提供了上述引物对pg098在石榴育种中的应用。本发明第三方面提供了上述引物对pg098在石榴品种鉴定中的应用。本发明第四方面提供了上述引物对pg098在石榴sxxa1、ahhb24、hn06、hn11、hn13、hy04、hy05、hy25、sd20、sd27、sd57、sxxa09、sxxa16、sd16、sd59品种鉴定中的应用。本发明的有益效果：1.本发明提供的引物对pg098特异性强，利用其对22个石榴品种dna进行扩增，仅sxxa1可特异性的扩增出215bp的条带。2.本发明提供的引物对pg098多态性高，除了可根据特异性条带鉴定sxxa1品种，还可根据条带大小对ahhb24、hn06、hn11、hn13、hy04、hy05、hy25、sd20、sd27、sd57、sxxa09、sxxa16、sd16、sd59品种进行区分。3.利用引物对pg098开展的品种鉴定技术具有取材方便、鉴定技术简便快速、结果高度准确稳定的特点。本方法可取叶、花、果实、芽等组织或器官，苗木或多年生植株均可取样，不受季节、地点限制。该技术是利用pcr扩增结果进行毛细管电泳即可判读结果。检测结果也高度准确稳定。具体实施方式下面结合实施例对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。实施例1用于石榴品种鉴定的ssr引物对pg098的获得：(1)石榴全基因组数据从ddbj/ena/genbank数据库下载，序列号mtkt00000000。利用misa(microsatellitesidentificationtool，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)软件在全基因组范围内挖掘不同重复单元ssr位点，ssr查找的标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的重复次数分别为11、8、6、5、4。(2)ssr引物设计上述获得的ssr位点，在每个染色体上随机选择5对，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用primer3.0设计引物，引物设计的条件是：pcr产物长度为100～350bp；退火温度(tm)为50～70℃，保证两引物间tm值相差不超过4℃；gc％含量为40～65％；引物长度为18～28bp；引物5’端最好是g/c，3’端避免出现a。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～23个碱基。利用该方法，成功设计出45对引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。(3)引物筛选采用合成的45对引物，对6个不同产地有代表性的石榴品种(ahhb04：安徽淮北、sxxa1：陕西西安、cy01：西藏、xj02:新疆、hn4:河南、sd47：山东)的基因组dna进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物，共11对。利用上述11对引物对22个品种(表1)进行复筛，筛选出一对多态性高、扩增稳定的引物pg098用于石榴品种鉴定，pg098正向引物核苷酸序列为：tgccttcttaaggacttcaccaac，反向引物核苷酸序列为：ctaacctcatgcacttgtcatcca。实施例2引物对pg098在石榴品种鉴定中的应用：(1)采用ctab法提取22个不同石榴品种的dna样品。称取0.2～0.3g新鲜的叶片，加入液氮迅速研磨成粉状，将粉末转入2.0ml离心管中；加入1.0ml65℃预热的3×ctab提取液65℃水浴1h；室温下12000rpm离心10min；吸取上清液于2.0ml离心管中；加入于上清液等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，v/v/v)，轻轻颠倒混匀成乳浊液；12000r/min离心8min，取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1，v/v)，混匀后12000r/min离心8min；取上清液加入等体积冷冻的异丙醇和10μl3m醋酸钠，置于-20℃条件下沉淀半个小时；12000r/min离心8min，小心弃上清液，dna留在离心管中；加入75％的乙醇洗2次，再用无水乙醇洗一次，离心后弃无水乙醇；室温下晾干，加入50μlte缓冲液(0.1m)，溶解过夜,-20℃保存备用。(2)采用pg098引物对，提取dna为模版，进行pcr扩增。pcr扩增采用20μl的反应体系，含1.0ngdna，0.4μm正向引物，0.4μm反向引物，4mmmgcl2，400μmdntps，1.0utaq-dna酶，加ddh20至总体积20μl。pcr采用touchdown反应，反应条件如下：5min，95℃；接下来11个循环，每个循环后退火温度下降0.8℃{30s，95℃；30s，65℃；50s，72℃}；22个循环{30s，95℃；30s，55℃；50s，72℃}；最后72℃延伸8min。(3)pcr产物用毛细管电泳确定片断大小。毛细管电泳按照以下步骤进行，将6-fam或hex荧光标记的pcr产物用超纯水稀释30倍，吸取1μl产物加入到dna分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μlliz500分子量内标和8.9μl去离子甲酰胺。95℃变性5min，于4℃冷却10min。瞬时离心10s后置放到dna分析仪上(abi3730xl)进行自动荧光检测。(4)使用genemapper软件分析ssr扩增数据，利用ssr毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。纯合位点的等位变异大小数据记录为x/x，其中x为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为x/y，其中x、y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后。(5)利用引物对pg098扩增22个石榴品种，仅sxxa1可特异性的扩增出215bp，同时根据不同条带的大小，对14个不同品种进行区分，包括：ahhb24、hn06、hn11、hn13、hy04、hy05、hy25、sd20、sd27、sd57、sxxa09、sxxa16、sd16、sd59。具体扩增结果如表1所示。表1pg098对22个石榴品种的扩增结果品种来源扩增结果品种来源扩增结果ahhb13安徽淮北229/229hy25安徽怀远231/233ahhb24安徽淮北213/213sd20山东227/227ahhb45安徽淮北213/229sd27山东217/229hn06河南227/229sd57山东227/231hn11河南217/217sxxa09陕西西安217/231hn13河南213/217sxxa1陕西西安215/229hy02安徽怀远229/229sxxa16陕西西安231/231hy04安徽怀远233/233sd16山东213/231hy05安徽怀远229/233sd52山东213/229hn23河南213/229hy14安徽怀远229/229hs01安徽黄山213/229sd59山东229/231序列表<110>安徽省农业科学院园艺研究所<120>一对高多态性石榴ssr引物及其应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>pg098正向引物(人工序列)<400>1tgccttcttaaggacttcaccaac24<210>2<211>24<212>dna<213>pg098反向引物(人工序列)<400>2ctaacctcatgcacttgtcatcca24当前第1页12