检测塞内加谷病毒的RT‑LAMP引物组合物及其试剂盒和方法与流程

本发明公开了一种引物组合物，具体地说，是一种检测塞内加谷病毒(sva)的rt-lamp引物组合物，本发明还公开了检测塞内加谷病毒的试剂盒和方法；属于生物检测技术领域。

背景技术：

塞内加谷病毒(sva)是一种新出的、能引起猪水泡的rna病毒，属于小核糖核酸病毒科，塞内加谷病毒属，基因组全长约7.2kb。临床上以猪鼻镜和蹄部出现与口蹄疫、水泡性口炎、猪水泡病难以区分的水泡、溃烂症状；仔猪还伴有精神沉郁、嗜睡、腹泻等症状。该病在1988年在猪上首次分离，后一直被用于研究肿瘤性疾病。直到2007年才被认定为sva病毒。在巴西出现并大规模传播才引起重视。pcr检测猪口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和水疱性疹均为阴性，而sva却为阳性，从而认为sva可导致原发性水疱性疾病。该病对猪没有致病性，但会引起仔猪死亡。据统计塞内加谷病毒致使生猪流涎症状将持续很长一段时期。sva抗体在猪、老鼠及牛身上均被检测到，目前尚未有报道证实sva可感染人并引发临床症状(poirieretal.,2013)。

因在临床上难以与口蹄疫、水泡性口炎、猪水泡病区分，实验室主要依靠rt-pcr、elisa等技术检测，但操作步骤复杂、依赖较昂贵的仪器设备。所以需要建立一种新型、快速、实用、灵敏的检测技术。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种检测塞内加谷病毒的rt-lamp引物组合物；本发明的第二个目的是提供一种灵敏度高的检测塞内加谷病毒的试剂盒，本发明的第三个目的是检测塞内加谷病毒的方法。

为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种检测塞内加谷病毒的rt-lamp引物组合物，包括由正向内引物sva-fip、反向内引物sva-bip、正向外引物sva-f3、反向外引物sva-b3、正向环引物sva-lf和反向环引物sva-lb组成；引物sva-f3核苷酸序列如seqidno：1所示；

引物sva-b3核苷酸序列如seqidno：2所示；

引物sva-fip核苷酸序列如seqidno：3所示；

引物sva-bip核苷酸序列如seqidno：4所示；

引物sva-lf核苷酸序列如seqidno：5所示；

引物sva-lb核苷酸序列如seqidno：6所示。

本发明的第二个技术方案是提供一种sva的rt-lamp检测试剂盒，该试剂盒含上述的rt-lamp引物组合物。

本发明提供的后一个技术方案是一种检测塞内加谷病毒的方法，包括下述步骤：

1)从样品中提取病毒的rna；

2)取步骤1)提取的rna加入到rt-lamp反应液中混合，建立扩增体系，在60℃-65℃恒温条件下进行环介导等温扩增；

3)将荧光染料加入步骤2)得到的扩增产物中，利用deaou-308c恒温荧光检测仪检测。

进一步的，上述的一种检测塞内加谷病毒的方法，所述rt-lamp反应液为：总体积为25μl，反应缓冲液2.5μl；mgso41.5μl；dntpmix10mm3.5μl；primermix1μl；甜菜碱4μl；rna2.0μl；bst2.0dna聚合酶1μl；逆转录酶0.5μl；荧光染料0.5μl。进一步的，上述的一种检测塞内加谷病毒的方法，所述的mgso4浓度为100mm，dntpmix浓度为10mm；甜菜碱浓度为5m；逆转录酶浓度为1u/μl；荧光染料浓度为5mm。

进一步的，上述的一种检测塞内加谷病毒的方法，所述环介导等温扩增程序为63℃扩增1h。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

1、本发明提供的技术方案采用环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalampli-fication,rt-lamp)技术，依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且使靶序列呈环介导等温扩增的bstdna聚合酶，在等温条件下可高效、快速、特异地扩增靶序列。

2、本发明提供的技术方案采用lamp扩增方式为环介导等温扩增，扩增效率高，由于lamp识别的是核酸上的6个特异性的位点，所以其特异性强。

3、本发明提供的技术方案lamp只在60℃-65℃进行恒温扩增，过程只需水浴锅即可，也不需要特殊的仪器，因此非常简便；且由于lamp是恒温扩增，不需要反转录步骤及pcr仪升降温的时间，所以扩增时间短。

4、本发明提供的技术方案lamp反应中加入荧光物质后，合成大量的dna时，在荧光恒温扩增仪器上可以看到扩增曲线，扩增过程一目了然，且极大地提高了灵敏度。

5、本发明提供的技术方案设计特异性引物，多病毒验证此方法的特异性，对rt-lamp技术检测值与rt-pcr检测值进行了比较，检验了其重复性与稳定性，建立了适用于现场检测塞内加谷病毒的快速检测方法。

附图说明

图1是rt-pcr测定时脂糖凝胶电泳结果图。

图2是rt-pcr和rt-lamp测定检测结果比较图；

图3是特异性检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，对于本申请为详细披露的信息，均按照本领域常规技术手段进行。

实施例1

本发明提供的一种检测塞内加谷病毒的rt-lamp引物组合物，包括由正向内引物sva-fip、反向内引物sva-bip、正向外引物sva-f3、反向外引物sva-b3、正向环引物sva-lf和反向环引物sva-lb组成；

引物sva-f3核苷酸序列如seqidno：1所示；

引物sva-b3核苷酸序列如seqidno：2所示；

引物sva-fip核苷酸序列如seqidno：3所示；

引物sva-bip核苷酸序列如seqidno：4所示；

引物sva-lf核苷酸序列如seqidno：5所示；

引物sva-lb核苷酸序列如seqidno：6所示。

实施例2

本发明的一种sva的rt-lamp检测试剂盒，该试剂盒含实施例1的rt-lamp引物组合物。

实施例3

本发明提供的检测塞内加谷病毒的方法，所使用的材料如下：

dna/rna核酸抽提试剂盒tguidevirusdna/rnakit试剂盒(货号#q5724天根生化科技有限公司)

核酸自动提取仪t-guideose-m48(天根生化科技有限公司)

恒温荧光检测仪deaou-308c(广州迪澳生物科技有限公司)

bst2.0聚合酶bst2.0(warmstartdnapolymerase货号#m5038lnewenglangbiolabs公司)

100mm的硫酸镁溶液100mm(mgso4solution货号#b1003snewenglangbiolabs公司)

10×反应缓冲液isothermalamplificationbuffer(货号#b0537snewenglangbiolabs公司)，组分：20mmtris-hcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，50mmkcl，0.1％tween20，ph8.8@25℃。

dntpmix(货号d7373碧云天生物技术公司)

甜菜碱(货号bcbs087vsigma公司)

amv反转录酶(amvrerversetranscriptase，货号m510apromega公司)

syto9荧光染料(syto^tm9greenfluorescentnucleicacidstain，货号s34854invitrogen公司)

一步法反转录pcr试剂盒primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2试剂盒(货号#rr055atakara公司)

一步法荧光定量pcr试剂盒onestepprimescript^tmrt-pcrkit(perfectrealtime)试剂盒(货号#rr064atakara公司)

其中：rna病毒

使用总核酸提取试剂盒(tguidevirusdna/rnakit)，利用全自动核酸抽取机对接了sva病毒的细胞上清液，用细胞培养的vsv、fmdv、svdv的细胞液进行核酸抽取，抽取完放-80℃保存。

rt-lamp检测方法包括下述步骤：

1)设计引物

从ncbi下载50条sva的全基因序列，进行比对，挑选出相对保守序列(登录号:dq641257.1)用lamp引物设计在线网站：http://primerexplorer.jp/e/设计引物，lamp引物：

2)取步骤1)提取的rna加入到rt-lamp反应液中混合，建立扩增体系，在63℃恒温条件下进行环介导等温扩增，扩增结束后在80℃灭活酶活性20min；

所述的rt-lamp反应液为：

3)利用deaou-308c恒温荧光检测仪检测，参数设置：时间60min检测间隔30s温度63℃阀值设置3-6min方差倍数10。

为了验证本申请提供的方法的准备性可靠性、特异性，下面给出本申请提供的技术方案和普通rt-pcr、荧光定量rt-pcr检测对比试验例。

1)rt-pcr法和荧光定量rt-pcr法

rt-pcr：(实验室自用的引物)

上游引物：gctgtaaaaaccttctc(1337-1353)

下游引物：atagtatgtgccaagag(1648-1664)

荧光定量rt-pcr(引用：赵晓亚猪塞内加谷病毒(svv)的分离鉴定及致病性研究[r]广州：华南农业大学2016：27-32)

上游引物：gagcttcaatctcctaga

上游引物：gtgtcatcattctcgttag

探针：cagacattcgagccaagcaacaa(5`6-fam，3`bhq1)

2)rt-lamp和荧光定量rt-pcr法灵敏度检测

rna进行连续十倍稀释，用rt-pcr方法进行10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸，并做阴性样品，检测灵敏性，后取产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果见图1。

将rna稀释梯度中10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹，并做阴性样品，采用rt-lamp方法的灵敏性，并与rt-pcr测定进行比较，检测结果见图2。

3)特异性检测

将sva阳性核酸、vsv、fmdv、svdv阴性核酸和ddh2o做特异性比较，检测结果见图3。

4)重复性检测

分别挑选10、10¹、10⁴、10⁶、10⁸，5个浓度的rna模板；挑选不同时间抽提的rna模板，按已建立的rt-lamp检测方法分别进行6个重复的试验，验证其重复性和稳定性。

5)临床样本检测对35个疑似患有sva的样品用rt-pcr、荧光定量rt-pcr、rt-lamp分别检测，检测结果见表1。

临床样本经rt-lamp、普通rt-pcr、荧光定量rt-pcr三种方法检测结果如下：

通过上述实验可以证明，本申请技术方案设计特异性引物，多病毒验证此方法的特异

性，对rt-lamp技术检测值与rt-pcr检测值进行了比较，检验了其重复性与稳定

性，建立了适用于现场检测塞内加谷病毒的快速检测方法。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>广州维佰生物科技有限公司

<120>检测塞内加谷病毒的rt-lamp引物组合物及其试剂盒和方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

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<211>18

<212>dna

<213>塞内加谷病毒(senecavirusa)

<400>1

tatccacggctcgatcca18

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<213>塞内加谷病毒(senecavirusa)

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ccggttacgtcttcaaaggt20

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<212>dna

<213>塞内加谷病毒(senecavirusa)

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aaggcacgctaaggcctagctttttggcatgatccccctagca43

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<212>dna

<213>塞内加谷病毒(senecavirusa)

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<212>dna

<213>塞内加谷病毒(senecavirusa)

<400>6

aggtagcacatacaactatgcaga24