脂肪酶突变体Gly183Cys/Gly212Cys及其基因和应用的制作方法

文档序号：14923858发布日期：2018-07-13 09:50阅读：263来源：国知局

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪酶ttl突变体ttl-gly183cys/gly212cys及其基因和应用。

背景技术：

脂肪酶(ec3.1.1.3)全称三酰基甘油酰水解酶，属于α/β折叠酶家族，是一种丝氨酸水解酶。脂肪酶不仅可以在油水界面上催化天然底物油脂水解，释放更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸，而且在非水相体系中脂肪酶还可催化酸解、转酯和酯合成等反应。工业饲料用脂肪酶主要来源于微生物，微生物分泌的脂肪酶具有较广的作用ph值和作用温度。随着酶催化技术的不断推广，酶制剂的应用条件也越来越严格，如高温、强酸强碱等特殊条件。脂肪酶作为一种重要的酶种被广泛地应用到食品加工、饲料、洗涤、医药等领域。油脂加工和饲料制粒等工艺通常需在较高温度下进行，热稳定性差的脂肪酶在上述工艺中易失活变性，因此开发高热稳定性脂肪酶一直是学术和产业界努力的目标。

为了得到更优的酶制剂，一方面可以从自然界筛选合适的酶基因，另一个途经就是将现有产业化的酶蛋白通过分子生物学技术进行改造，以适应不同产业的需求。现今改造酶蛋白的策略主要有两个，其一是非理性设计，通过随机突变改造酶的基因，再根据特定的改造目的，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。此策略优点是无须深入研究酶的结构和作用机理，但需要极大的工作量去完成筛选，效率偏低。

有文献报道科学家从突尼斯南部火山地区分离得到一株嗜热裸足菌，其分泌脂肪酶具有较好的耐热性，70℃处理1h后剩余50％酶活。毕赤酵母培养条件简单、易于工业化生产且高效分泌表达外源蛋白，已成功表达多个外源源脂肪酶。本发明利用毕赤酵母高效分泌表达嗜热裸足菌来源的脂肪酶，并以嗜热裸足菌脂肪酶基于为模板，通过定点突变技术获得热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供高热稳定性的脂肪酶ttl。所述高热稳定性脂肪酶ttl，是由亲本脂肪酶ttl进行定点突变，获得的脂肪酶突变体。用于表达所述脂肪酶的突变体的表达载体为ppiczαa和ppic9k；用于所述表达载体转化的宿主细胞是毕赤酵母x33和gs115。所述脂肪酶突变体为：ttl-gly183cys/gly212cys。

野生型的脂肪酶基因全长825个碱基(seqidno.1)及其编码的274个氨基酸(seqidno.2)

seqidno.1

tctccagtcagacgtgaggtttctcaggacttgttcgaccagtttaatttgttcgctcagtactctgctgctgcctactgtgccaagaataacgatgccccagctggtgctaacgttacctgtagaggttccatctgcccagaggttgagaaggctgacgccaccttcttgtactctttcgaggactctggagttggtgacgttaccggtttcttggctttggacaacaccaacagattgatcgtcttgtctttccgtggttcccgttcccttgagaattggatcggtaacattaatttggatttgaagggtatcgacgacatctgctctggttgcaagggacacgatggtttcacctcctcttggagatccgttgccaacaccttgacccaacaggttcagaacgccgttagagagcatccagactaccgtgtcgtcttcactggtcactctttgggtggtgctttggctaccgttgctggtgcctctttgagaggtaacggttacgacatcgacgttttctcctacggtgctcctcgtgttggtaacagagccttcgctgtcttcttgaccgctcagaccggtggtaccttgtacagaatcacccataccaacgatatcgtcccacgtttgccaccaagagagcttggatactcccactcttccccagagtactggatcacctccggtactttggttccagttaccaagaacgatattgttaaggttgagggaattgactccaccgacggtaacaaccagccaaataccccagacattgctgcccacttgtggtacttcggtttgattggtacttgtttgtaa

seqidno.2

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突变后脂肪酶基因全长825个碱基(如核苷酸序列seqidno.3所示)，其编码的274个氨基酸(如氨基酸序列seqidno.4所示)。

seqidno.3

tctccagtcagacgtgaggtttctcaggacttgttcgaccagtttaatttgttcgctcagtactctgctgctgcctactgtgccaagaataacgatgccccagctggtgctaacgttacctgtagaggttccatctgcccagaggttgagaaggctgacgccaccttcttgtactctttcgaggactctggagttggtgacgttaccggtttcttggctttggacaacaccaacagattgatcgtcttgtctttccgtggttcccgttcccttgagaattggatcggtaacattaatttggatttgaagggtatcgacgacatctgctctggttgcaagggacacgatggtttcacctcctcttggagatccgttgccaacaccttgacccaacaggttcagaacgccgttagagagcatccagactaccgtgtcgtcttcactggtcactctttgggtggtgctttggctaccgttgctggtgcctctttgagatgtaacggttacgacatcgacgttttctcctacggtgctcctcgtgttggtaacagatgtttcgctgtcttcttgaccgctcagaccggtggtaccttgtacagaatcacccataccaacgatatcgtcccacgtttgccaccaagagagcttggatactcccactcttccccagagtactggatcacctccggtactttggttccagttaccaagaacgatattgttaaggttgagggtattgactctaccgacggtaacaaccagccaaataccccagacattgctgcccacttgtggtacttcggtttgattggtacttgtttgtaa

seqidno.4

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亲本脂肪酶ttl在80℃水浴5min后剩余酶活为18.3％。本发明利用分子生物学技术定点突变脂肪酶ttl，获得了热稳定性提高的脂肪酶突变体ttl-ala36ser/asp49his/ala52val/asn55asp。突变体ttl-gly183cys/gly212cys在80℃水浴5min后剩余酶活为46.2％，提高至亲本脂肪酶的2.52倍。

附图说明

图1含ppiczαa-ttl的毕赤酵母x33重组菌50l罐发酵图。

图2发酵各时间段酶液的蛋白电泳图。

图3脂肪酶ttl的酶学性质图。

图4脂肪酶突变体的酶学性质图

具体实施方式

为了增加脂肪酶的工业应用价值，本发明将脂肪酶基因ttl在毕赤酵母中进行表达，进一步研究此脂肪酶三维结构后，针对其关键特性的氨基酸突变以增进其热稳定性。以下将详述本发明改造脂肪酶的方法及其所得到的改良的脂肪酶。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株topl0、毕赤酵母x33，gs115、载体ppiczαa，ppic9k，zeocin购自invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

pcr酶，限制性内切酶，质粒提取和凝胶纯化试剂盒购自上海生工公司。

实施例1、脂肪酶ttl在毕赤酵母x33中的高效表达

1.将脂肪酶基因ttl作为目标基因，野生型的脂肪酶基因全长825个碱基(seqidno.1)及其编码的274个氨基酸(seqidno.2)，利用限制性切酶ecori和xbai酶切后，构建到ppiczαa载体中得到表达载体ppiczαa-ttl，再将ppiczαa-ttl转化top10感受态细胞，经抗生素zeocin筛选后，得到阳性克隆。将上述重组表达载体用saci进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母x33，得到毕赤酵母重组菌株转化子。将上述重组菌单菌落进行高密度发酵培养。在发酵过程中的定时取样测定酶活，脂肪酶的表达情况如图1所示，发酵189h时脂肪酶酶活为31500u/ml。将上述发酵液中的脂肪酶通过硫酸铵分级沉淀、充分透析、再通过离子交换柱层析纯化，将纯化后的蛋白液进行12％sds－page检测，结果如图2。

2.脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化液水解滴定法，酶活的定义为：脂肪酶在40℃、ph7.0条件下水解橄榄油乳化液产生1μmol/min脂肪酸所消耗的酶量，即为1个脂肪酶活力单位。脂肪酶热处理采用水浴法，将酶液适当稀释后置于玻璃试管中，在不同温度水浴锅(70℃～90℃)中保温5min。

实施例2、脂肪酶ttl的酶学性质测定

1.脂肪酶ttl的最适反应温度和热稳定性测定

在30℃～80℃下，以10℃为间隔，分别测定脂肪酶的活力，以50℃下的酶活力为对照，测定不同温度下的相对酶活。结果如图3(a)，脂肪酶作用的最适合温度为50℃。将脂肪酶酶液置于玻璃试管中，在不同温度下(70℃～90℃)热处理5min，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，热处理后的酶活与之相比，即得到该温度下剩余的相对酶活。结果如图3(b)，80℃热处理5min后脂肪酶剩余酶活为18.3％。

2.脂肪酶ttl的最适反应ph和ph稳定性测定

在不同ph(3.0～9.0)的缓冲液体系中分别测定脂肪酶的酶活，以ph值7.0的酶活为对照，计算不同ph值下的相对酶活。结果如图3(c)，脂肪酶作用的最适ph值为7.0。向上述不同ph的缓冲液体系中分别加入稀释好的酶液，室温处理2h，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，计算该ph下剩余的相对酶活。测定结果如图3(d)该酶的ph稳定范围较广，在ph5.0～9.0范围内酶活稳定。

实施例3、热稳定性提高的脂肪酶突变体ttl-gly183cys/gly212cys

1/以质粒ppiczαa-ttl为模板，分别以引物f1、pic-r和引物r1、pic-f进行pcr扩增，再将得到2个dna片段进行融合pcr，得到重组载体ppiczαa-ttl-g183c。以质粒ppiczαa-ttl-g183c为模板，分别以引物f2、pic-r和引物r2、pic-f进行pcr扩增，再将得到2个dna片段进行融合pcr，得到重组载体ppiczαa-ttl-g183cg212c。将上述重组载体转化top10感受态细胞，经抗生素zeocin筛选后，得到阳性克隆。将上述重组表达载体用saci进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母x33，得到毕赤酵母重组菌株转化子。突变后脂肪酶基因全长825个碱基，由此推导出274个氨基酸。

所用引物如下：

f1:5’-ctctttgagatgtaacggttacgacatcgacg-3’

r1:5’-cgtaaccgttacatctcaaagaggcaccagc-3’

f2:5’-ctcagacctgtggtaccttgtacagaatcaccc-3’

r2:5’-gtacaaggtaccacaggtctgagcggtcaaga-3’

pic-f：5’-cttgcttgagaaggttttgggacgc-3’

pic-r：5’-cttggagcgaacgacctacaccgaa-3’

2、重组脂肪酶的最适反应温度和热稳定性测定

在30℃～80℃下，以10℃为间隔，分别测定脂肪酶的活力，以50℃下的酶活力为对照，测定不同温度下的相对酶活。结果如图4(a)，脂肪酶作用的最适合温度为50℃。将脂肪酶酶液在不同温度(70℃～90℃)热处理5min，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，计算得到该温度下剩余的相对酶活。结果如图4(b)，80℃热处理5min后脂肪酶剩余酶活为46.2％。

3、重组脂肪酶的最适反应ph和ph稳定性测定

在不同ph(3.0～9.0)的缓冲液体系中分别测定脂肪酶的酶活，以ph值7.0的酶活为对照，测定不同ph值下的相对酶活。结果如图4(c)所示：该脂肪酶作用的最适ph值为7.0。向上述不同ph的缓冲液体系中分别加入稀释好的酶液，室温处理2h，测定残留脂肪酶活力，以未处理的酶活力为对照，处理后酶液的酶活与之相比，即得到该ph下剩余的相对酶活。测定结果如图4(d)，该酶的ph稳定范围较广，在ph5.0～9.0范围内酶活稳定。

序列表

<110>广东溢多利生物科技股份有限公司

<120>脂肪酶突变体gly183cys/gly212cys及其基因和应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>825

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tctccagtcagacgtgaggtttctcaggacttgttcgaccagtttaatttgttcgctcag60

tactctgctgctgcctactgtgccaagaataacgatgccccagctggtgctaacgttacc120

tgtagaggttccatctgcccagaggttgagaaggctgacgccaccttcttgtactctttc180

gaggactctggagttggtgacgttaccggtttcttggctttggacaacaccaacagattg240

atcgtcttgtctttccgtggttcccgttcccttgagaattggatcggtaacattaatttg300

gatttgaagggtatcgacgacatctgctctggttgcaagggacacgatggtttcacctcc360

tcttggagatccgttgccaacaccttgacccaacaggttcagaacgccgttagagagcat420

ccagactaccgtgtcgtcttcactggtcactctttgggtggtgctttggctaccgttgct480

ggtgcctctttgagaggtaacggttacgacatcgacgttttctcctacggtgctcctcgt540

gttggtaacagagccttcgctgtcttcttgaccgctcagaccggtggtaccttgtacaga600

atcacccataccaacgatatcgtcccacgtttgccaccaagagagcttggatactcccac660

tcttccccagagtactggatcacctccggtactttggttccagttaccaagaacgatatt720

gttaaggttgagggaattgactccaccgacggtaacaaccagccaaataccccagacatt780

gctgcccacttgtggtacttcggtttgattggtacttgtttgtaa825

<210>2

<211>274

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

serprovalargarggluvalserglnaspleupheaspglnpheasn

151015

leuphealaglntyrseralaalaalatyrcysalalysasnasnasp

202530

alaproalaglyalaasnvalthrcysargglyserilecysproglu

354045

valglulysalaaspalathrpheleutyrserphegluaspsergly

505560

valglyaspvalthrglypheleualaleuaspasnthrasnargleu

65707580

ilevalleuserpheargglyserargserleugluasntrpilegly

859095

asnileasnleuaspleulysglyileaspaspilecysserglycys

100105110

lysglyhisaspglyphethrsersertrpargservalalaasnthr

115120125

leuthrglnglnvalglnasnalavalarggluhisproasptyrarg

130135140

valvalphethrglyhisserleuglyglyalaleualathrvalala

145150155160

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165170175

glyalaproargvalglyasnargalaphealaglupheleuthrala

180185190

glnthrglyglythrleutyrargilethrhisthrasnaspileval

195200205

proargleuproproarggluleuglytyrserhisserserproglu

210215220

tyrtrpilethrserglythrleuvalprovalthrlysasnaspile

225230235240

vallysvalgluglyileaspserthraspglyasnasnglnproasn

245250255

thrproaspilealaalahisleutrptyrpheglyleuileglythr

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cysleu

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3