本发明是用荧光定量pcr方法检测胃癌患者外周血中环状rnahsa_circ_0006148的异常表达及意义，属于分子诊断技术领域，涉及检测环状rnahsa_circ_0006148的引物、试剂盒和检测方法及其在胃癌患者在早期诊断、治疗效果评价和预后判断中的应用。
技术背景
胃癌在我国发病率和死亡率均很高。据《中国肿瘤登记年报》报道，全国胃癌发病率为36.21/10万，居恶性肿瘤第二位；其死亡率为25.88/10万，居恶性肿瘤第三位。晚期胃癌患者五年生存率不到10％[1]，肿瘤的复发和转移是其致死的主要原因。因此，胃癌的早期诊断及控制转移发生对患者预后至关重要。然而，临床上常用的传统的血清胃癌标志物(cea、ca125、ca72-4、ca199)的敏感性和特异性均较低。发现新的调控胃癌细胞转移的肿瘤相关基因，不但有助于深入了解肿瘤发生发展的分子机制，补充和完善现有的细胞癌变理论体系，而且有助于鉴定新的胃癌特异的生物标志物和药物靶点，为胃癌的防、诊、治提供重要的理论依据。
circrna是一类最新发现的环状单链非编码rna，在真核生物和人的所有组织中均有表达，且稳定性较好，其主要作用是充当mirna海绵或rna结合蛋白(rnabindingproteins，rbps)海绵，进而调控基因表达。circrna来源于内含子或外显子，可以充当微小rna海绵，还能与蛋白质相结合，从而参与基因表达调控并影响蛋白质的功能。一些circrna含有mirna的结合位点，可以调控mirna的生物学功能，从而间接参与癌症的发生和发展过程。在非编码rna的调控网络中，circrna和mirna的结合与竞争关系为我们理解癌症发生和发展过程提供了新思路。
在寻找肿瘤诊断标志物方面，因采集体液(唾液、外周血等)创伤小、易于获得等特点，一直是研究者们最理想的选择。然而，目前尚无circrna检测试剂应用于胃癌等肿瘤患者外周血检测。因此，开拓建立circrna的引物、试剂盒和检测方法，应用于胃肿瘤监测，在探索胃癌新型诊断标志物的领域具有重要意义。
技术实现要素：
为了克服上述缺陷，本发明提供一种检测环状rnahsa_circ_0006148的引物、试剂盒和检测方法及其应用，公开了环状rnahsa_circ_0006148在胃癌患者及正常人外周血外周血中的表达情况，包括荧光定量pcr检测环状rnahsa_circ_0006148的引物、试剂盒和检测方法，以及该引物或试剂盒在胃癌中的应用。环状rnahsa_circ_0006148可用于胃癌患者的早期诊断、治疗效果评价和预后判断。
为进一步鉴定与胃癌进展相关的circrna并探索其功能与机制，本发明对胃癌及其配对正常组织采用circrna芯片进行检测，进行了基因重注释分析，并对数据结果进行合并，发现差异表达在2倍以上的circrna有100个，其中因癌症上调的circrna有44个，下调的有56个。上调明显的circrna为环状rnahsa_circ_0006148。本发明采用实时定量反转录pcr(quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction,qrt-pcr)方法在90例胃癌及50例正常人外周血中验证，发现健康组及胃癌组外周血环状rnacirc_0006148表达(2-△ct)分别为0.0067±0.0031、0.0250±0.0055。与健康者组比较，胃癌组的外周血环状rnacirc_0006148表达水平来说明显增高，差异明显(p<0.0001)；进一步做受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线，结果显示血浆中环状rnacirc_0006148诊断胃癌的曲线下面积(auc)为0.94，诊断胃癌的环状rnacirc_0006148最优截断值为3.22，结果显示其灵敏度和特异度各为95.56％和88.89％，为了明确该分子的临床意义，本发明研究了该分子与胃癌患者临床参数的相关性。结果显示：外周血hsa_circ_0006148表达水平与患者tnm分期、淋巴结转移、远处转移、5年生存期显著相关(p值分别为0.021，0.010，0.031和0.000)，而与其患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度和外周血癌胚抗原水平无明显相关(p值分别为0.626,0.847,0.569,0.126和0.217)。见表1。
上述结果表明，circ_0006418在胃癌患者外周血中异常表达上调，并可能作为胃癌早期诊断，疾病进展，预后情况，并可评价癌症的治疗效果。
本发明所采取的技术方案为用于检测的所设计的引物对：检测环状rnahsa_circ_0006148的引物，其特征在于，所设计正向引物为hsa_circ_0006148-f:5’-tcttagacaggcagcggagg-3’(见seqno.1)；所设计反向引物为hsa_circ_0006148-r:5’-agaggaggagaccggagatc-3’(见seqno.2)。所述设计的引物相较与其他引物，在qpcr扩增过程中溶解曲线整条曲线更光滑。溶解曲线的作用主要是检测pcr过程中有无非特异扩增，溶解曲线能够检测你的片段扩增的特异性。所述设计的环状rnahsa_circ_0006148的引物具有较强的特异性。见图4。
检测环状rnahsa_circ_0006148的试剂盒，其特征在于，包括外周血外周血样本的rna提取试剂、前述所设计的引物、去基因组dna反应体系、逆转录反应体系、qpcr反应体系。
去基因组dna反应体系：
逆转录反应体系为：
qpcr反应体系为：
去基因组dna反应体系采用含有1μg/μldnase的0.1mmcacl2缓冲液体系(即gdna去除剂可加入缓冲液中，此时无需单独加入gdna去除剂)；逆转录反应体系中采用含有200u/μl逆转录酶的125mmmgcl2、12.5mmdntps缓冲液体系(即逆转录酶可加入缓冲液中合并使用，此时无需单独加入逆转录酶)；rt引物为oligedt引物和随机六聚引物；qpcr反应体系中的荧光定量pcr预混液中，rna酶1μg/μl，taq酶0.5u/μl。
去基因组dna反应的条件为：42℃2min、4℃∞。
逆转录反应条件为：37℃15min；85℃5s；4℃∞。
qpcr反应条件分为三个阶段。如下所示：
阶段1：95℃、30s、1次循环。
阶段2：95℃、5s、40次循环；60℃、31s、40次循环。
阶段3：95℃、15s、1次循环；60℃、60s、1次循环；95℃、15s、1次循环。
检测环状rnahsa_circ_0006148的方法，采用所述的试剂盒，包括如下步骤：
(1)获得待检外周血样本；
(2)从待检外周血样本中提取rna；
(3)从提取的rna中去除基因组dna；
(4)对于获得的rna进行逆转录至cdna；
(5)对于获得的cdna通过qpcr法进行检测。
待检外周血样本来自于癌症病人及正常人，所述的癌症为胃癌，癌症病人样本为癌症患者的加促凝剂外周血样本。待检外周血样本rna提取时采用了takara公司的rnaisoblood试剂。
待检外周血样本中rna提取步骤为：
(1)待检外周血样本rna提取时采用了takara公司的rnaisoblood试剂。将0.25ml外周血样品或冷冻外周血样品移至离心管中，添加0.75mlrnaisoblood，用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解；
(2)向上述匀浆裂解液中加入氯仿，氯仿的量为样品液+rnaisoblood总体积量的1/5体积量，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；
(3)室温静置5分钟；
(4)12,000×g、4℃离心15分钟；从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的含rna的上清液、中间的大部分为dna的白色蛋白层及带有颜色的下层有机层；
(5)吸取上清液移至新的离心管中；
(6)向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10min；
(7)12,000×g、4℃离心10min，试管底部会出现rna沉淀；
(8)弃上清，加入等量的75％乙醇，使用vortex振荡清洗沉淀后，7,500×g、4℃离心5min，弃上清；
(9)室温干燥沉淀。沉淀干燥后，加入适量的无rna酶的纯净水20～30μl溶解沉淀。
本发明还提供前述的引物或试剂盒作为癌症早期诊断、治疗效果评估或预后情况评估的试剂的应用，所述的癌症为胃癌。
本发明提供了胃癌及正常人中的一种环状rnahsa_circ_0006148的荧光定量pcr检测方法，包括了外周血样本rna提取试剂，去基因组试剂，逆转录试剂，引物及qpcr试剂。本发明所述的检测癌症为胃癌。本发明所述的检测样本为胃癌及正常人中的外周血外周血样本。本发明所述的pcr引物为seqidno:1和seqidno:2；方法为荧光定量pcr。
总之，本发明具有如下优点：本发明创造性地得到与胃癌高度相关的分子标记物rnahsa_circ_0006148，并且设计相应的引物序列，通过逆转录和rt-pcr实现对环状rnahsa_circ_0006148的检测。
附图说明
图1胃癌患者外周血样本中环状rnahsa_circ_0006148检测的扩增曲线；
图2胃癌患者外周血样本中环状rnahsa_circ_0006148的表达情况示意图；
图3胃癌患者外周血中环状rnahsa_circ_0006148曲线下面积示意图；
图4引物qpcr扩增溶解曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
步骤一获得待检外周血样本
90例胃癌，50例常人的外周血样本。
样本为所述癌症患者以及正常人的加促凝剂外周血外周血样本。步骤二从待检外周血样本中提取rna
将0.25ml外周血样品或冷冻外周血样品移至离心管中，添加0.75mlrnaisoblood，用移液枪上下反复吸打直至细胞完全裂解。向上述匀浆裂解液中加入氯仿(样品液+rnaisoblood体积量的1/5体积量)盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。室温静置5分钟。12,000×g、4℃离心15分钟。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含rna)、中间的白色蛋白层(大部分为dna)及带有颜色的下层有机层。吸取上清液移至新的离心管中。向上清中加入等量体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，室温下静置10分钟。12,000×g、4℃离心10分钟，试管底部会出现rna沉淀。弃上清，加入等量的75％乙醇，使用vortex振荡清洗沉淀后，7,500×g、4℃离心5分钟，弃上清。室温干燥沉淀。沉淀干燥后，加入适量的rnase-free水(20～30μl)溶解沉淀。步骤三从提取的rna中去除基因组dna
去基因组dna反应体系如表1。
表1去基因组dna反应体系
去基因组dna反应参数为：
42℃2min
4℃∞
步骤四对于获得的rna进行逆转录至cdna
逆转录反应体系如表2。
表2逆转录反应体系
逆转录反应参数为
37℃15min
85℃5s
4℃∞
步骤五对于获得的cdna通过qpcr法进行反应检测
20μl反应体系如表3。
表3qpcr反应体系
循环参数：
阶段1：95℃、30s、1次循环
阶段2：95℃、5s、40次循环；60℃、31s、40次循环；
阶段3：95℃、15s、1次循环；60℃、60s、1次循环；95℃、15s、1次循环。
结果：
1胃癌患者外周血样本环状rnahsa_circ_0006148扩增曲线
采用荧光实时定量pcr方法检测胃癌患者组和健康者组外周血中环状rnahsa_circ_0006148的表达(图2)。pcr扩增曲线见图1。
2胃癌及正常人外周血分子检测结果
荧光实时定量pcr结果显示，健康组及胃癌组患者外周血中环状rnahsa_circ_0006148表达分别为0.02541±0.00686、0.00771±0.00681。与健康者组比较，胃癌组的环状rnahsa_circ_0006148表达水平来说明显增高，差异明显(p<0.0001)，见图3。
3环状rnahsa_circ_0006148临床意义
进一步分析外周血hsa_circ_0006148表达与胃癌性别、年龄、肿瘤直径、tnm分期、组织分化程度、淋巴结转移情况、远处转移、外周血癌胚抗原(cea)水平、5年生存时间，结果发现，外周血hsa_circ_0006148表达水平与患者tnm分期、淋巴结转移、远处转移、5年生存期显著相关(p值分别为0.021，0.010，0.031和0.000)，而与其患者性别、年龄、肿瘤直径、组织分化程度和外周血癌胚抗原水平无明显相关(p值分别为0.626,0.847,0.569,0.126和0.217)。见表4。
表4环状rnahsa_circ_0006148临床分析结果
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110>镇江市第一人民医院
<120>检测环状rnahsa_circ_0006148的引物、试剂盒和检测方法及其应用
<130>2018030701
<141>2018-03-07
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>homosapiens
<400>1
tcttagacaggcagcggagg20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>homosapiens
<400>2
agaggaggagaccggagatc20