平滑化突变体和其使用方法与流程

本申请要求于2016年2月4日提交的美国临时专利申请序列号62/291,346的优先权。前述申请的公开内容通过引用整体并入本文。

背景技术

分子靶向癌症治疗已在临床中显示出强大的活性。一些最受关注的例子包括在费城染色体阳性慢性髓细胞性白血病(cml)或试剂盒/pdgfr突变型胃肠道间质瘤(gist)中的酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼和在egfr突变型非小细胞肺癌(nsclc)中的厄洛替尼(krause，d.s.和r.a.vanetten(2005)《新英格兰医学杂志(n.engl.j.med)》353(2):172-187)。使用这些药物的治疗已在具有这些分子异常的患者人群中产生显著的抗肿瘤反应。然而，虽然最初的临床反应令人印象深刻，但大多数患者由于产生耐药性而最终导致疾病发展(engelman,j.a.和j.settleman(2008年)《遗传学与发育新见(curt.opin.genet.dev.)》18(1):73-79)。耐药性机制的识别已开启了更加合理的联合用药和可以潜在地克服或避免耐药性出现的“第二代”抑制剂的开发的大门。

髓母细胞瘤是小脑的原始神经外胚叶肿瘤，所述肿瘤代表了儿童中最常见的脑恶性肿瘤(polkinghorn，w.r.和n.j.tarbell(2007年)《自然眼科学临床应用(nat.clin.pract.oncol.)》4(5):295-304)。用于髓母细胞瘤的一种治疗形式是辅助性放射治疗。虽然存活率有所提高，但辅助性放射治疗也带来使人变虚弱的副作用，因此支持对新分子靶向治疗的需求。

刺猬(hh)信号传导途径已直接地与髓母细胞瘤的发病机制有关。构成性hh信号传导最经常是由抑制性受体ptch1中的功能突变的潜在丢失而导致，这已在大约30％的散发病例中得到证实(zurawel，r.h.等人(2000年)《基因染色体癌症(genechromosomescancer)》27(1):44-51；kool,m.等人(2008年)《公共科学图书馆期刊(plosone)》3(8):e3088；dellovade,t.等人(2006年)《神经科学年鉴(annu.rev.neurosci.)》29:539；rubin,l.l.和f.j.desauvage(2006年)《自然评论:药物发现(nat.rev.drugdiscov.)》5:1026)。ptchl(ptchl+/-)的小鼠杂合子可以自发地发展髓母细胞瘤，并且使用hh途径抑制剂的治疗导致肿瘤消除和生存期延长(goodrich,l.v等人(1997年)《科学(science)》277(5329):1109-1113；romer,j.t等人(2004年)《癌细胞(cancercell)》6(3):229-240)。然而，近来已观察到用新型hh途径抑制剂gdc-0449治疗的患者最初显示出对治疗的显著反应(charlesm.rudin等人(2009年)《新英格兰医学杂志(n.engl.j.med)》(提交))，但未能对肿瘤的治疗和复发具有持久的反应。

bcc是最常见的人类癌症并且主要地是由hh途径的超活化所驱动(oro等人，1997年；xie等人，1998年)。hh信号与癌症之间的关联首先在对髓母细胞瘤(mb)和bcc高度易感的患有gorlin或基底细胞痣综合征(bcns)的患者中被发现。这些患者通常在补缀同源物1(ptch1)中具有杂合子胚系突变，所述补缀同源物1编码用于hh配体的受体(hahn等人，1996年；johnson等人，1996年)。hh配体结合减轻蛇形跨膜(tm)信号转导平滑蛋白(smo)的ptch1抑制。绝大多数的散发bbc是通过使在ptch1中的突变和杂合性丢失(loh)失活而驱动，并且其余中的大多数在smo中具有激活突变(reifenberger等人，2005年)。smo通过对融合阻抑蛋白(sufu)和蛋白激酶a(pka)的抑制而促进gli转录因子的激活和核定位。sufu通过结合并隔绝细胞质中的gli转录因子而负性调节hh途径(stone等人，1999年)。sufu中的功能丧失突变也与gorlin综合征相关(pastorino等人，2009年；smith等人，2014年；taylor等人，2002年)。大约50％的散发bcc也具有tp53突变(jayaraman等人，2014年)。

数个hh途径抑制剂(hpi)目前处于针对bcc和mb两者的临床研究中(amakye等人，2013)。维莫德吉，以前被称为gdc-0449，是被批准用于治疗转移的和局部晚期bcc的平滑蛋白抑制剂(sekulic等人，2012年)。大多数用维莫德吉治疗的bcc患者获得临床收益，包括完全缓解和部分缓解两者(sekulic等人，2012年)。

然而，初步估计表明高达20％的晚期bcc患者在治疗的第一年内对维莫德吉产生耐药性(chang和oro，2012年)。到目前为止，在临床上获得的对维莫德吉的耐药性的唯一功能性特征机制来自转移性mb的患者。在来自复发转移性肿瘤的活检中检测到smo-d473h突变，并且所述突变在体外显示消除药物结合(yauch等人，2009年)。最近有报告称，在耐维莫德吉bcc中有四种其它临床smo突变，但未进行功能检查(brinkhuizen等人，2014年；pricl等人，2014年)。已从临床前模型中描绘了针对smo抑制剂的数个耐药性机制，包括另外的smo突变、下游hh途径成员(如gli2)的扩增，和旁路信号传导途径的激活，包括磷脂酰肌醇3-激酶(p13k)和非典型蛋白激酶cι/λ(apkc-ι/λ)(atwood等人，2013年；buonamici等人，2010年；dijkgraaf等人，2011年)。然而，尚不清楚是哪种机制促使患者产生耐药性。

在本领域中迫切需要可识别另外的耐gdc-0449突变smo蛋白并找到调节这种突变smo蛋白中的smo活性以便克服用gdc-0449进行治疗时的耐药性的化合物。还需要一种用来诊断可能会通过其smo基因型的自然变异或通过获得性突变和耐药性而对治疗产生抗性的患者。

技术实现要素：

在某些实施例中，本公开涉及经分离的突变smo核酸和蛋白质(例如与肿瘤的化疗耐药性和筛选与smo突变体结合或调节smo活性的化合物的方法有关的那些)，涉及癌症诊断和治疗，特别是对用于耐药性肿瘤的诊断和/或预诊和治疗的突变的检测。

在一些实施例中，本公开提供一种对突变smo蛋白进行编码的核酸分子(例如经分离核酸分子)，其中所述突变smo蛋白包括与seqidno:1至少95％一致的氨基酸序列，所述氨基酸序列在氨基酸529处包括除甘氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，突变smo蛋白包括seqidno:2的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在氨基酸529处包括丝氨酸(s)。在一些实施例中，所述核酸分子包括seqidno:3的亲代核酸序列，其中所述序列含有改变编码氨基酸529以便编码不同氨基酸的序列的突变。

在一些实施例中，本公开提供一种核酸探针，所述核酸探针能够特异性地与编码突变smo蛋白或其片段的核酸进行杂交，从而将突变并入编码氨基酸529的序列。在一些实施例中，所述探针与编码突变的smo或其片段的核酸互补。在一些实施例中，所述探针具有约10至约50个核苷酸的长度。在一些实施例中，所述探针包括可检测的标记。

在一些实施例中，本公开提供一种包括与seqidno:2至少95％一致的氨基酸序列的经分离的突变smo蛋白，其中氨基酸序列在氨基酸529处包括除甘氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，蛋白质包括seqidno:2的氨基酸序列，其中氨基酸序列在氨基酸529处包括除甘氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸序列在氨基酸529处包括丝氨酸(s)。

在一些实施例中，本公开提供一种特异性地与本文中所公开的任何突变smo蛋白结合的经分离的抗体，其中所述抗体不与在氨基酸529处具有甘氨酸的野生型smo结合。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或其抗原-结合片段。在一些实施例中，抗体与细胞毒药物结合。在一些实施例中，抗体与可检测标记结合。在一些实施例中，抗体抑制smo活性。

在一些实施例中，本公开提供一种鉴定样本中的至少一个smo突变的方法；所述方法包括使取自样本的核酸与核酸探针接触，所述核酸探针能够与编码突变smo蛋白或其片段的核酸特异性地杂交，从而将改变编码氨基酸529的序列的突变并入除甘氨酸外的氨基酸；以及对杂交进行检测。在一些实施例中，探针被可检测地标记。在一些实施例中，探针是反义寡聚体。在一些实施例中，利用探针使核酸样本中的smo基因或其片段扩增并接触。

在一些实施例中，本公开提供一种用于鉴定对使用gdc-0449的治疗有抗性或变得有抗性的人类受试对象的肿瘤的方法，所述方法包括确定肿瘤样本中突变smo基因或突变smo蛋白的存在，其中突变smo基因对在氨基酸29处包括突变的smo进行编码，并且其中smo蛋白在氨基酸529处包括突变，因此突变smo基因或突变smo蛋白的存在表明所述肿瘤对使用gdc-0449的治疗有抗性。在一些实施例中，所述方法还包括对使用与突变smo结合的化合物gdc-0449的治疗不敏感或不再敏感的患有肿瘤的受试对象进行治疗。在一些实施例中，突变的存在或不存在是通过检查核酸样本而确定。在一些实施例中，突变的存在或不存在是通过检查蛋白质样本而确定。

在一些实施例中，本公开提供一种对抑制在氨基酸529处包括突变的突变smo蛋白的信号传导的化合物进行筛选的方法；所述方法包括使突变smo蛋白与试验化合物接触并且检测化合物与突变smo的结合，由此试验化合物与突变smo的结合表明试验化合物是突变smo的抑制剂。

在一些实施例中，本公开提供一种筛选抑制在氨基酸529处包括突变的突变smo蛋白的信号传导的化合物的方法；所述方法包括使表达突变smo蛋白的细胞与试验化合物接触并且对细胞中gli的活性进行检测，由此gli活性的存在表明试验化合物不是突变smo的抑制剂。

在一些实施例中，本公开提供一种抑制具有异常刺猬信号传导的细胞的增殖或生长的方法；所述方法包括将布罗莫结构域(bromo区)抑制剂施用于细胞，其中所述细胞表达在seqidno:1的氨基酸位置529处具有突变的平滑蛋白。在一些实施例中，细胞是在受试对象中。在一些实施例中，细胞是癌细胞。在一些实施例中，细胞还包括sufu突变。在一些实施例中，细胞是人类细胞，其中所述细胞包括10q缺失突变，所述突变导致sufu基因的拷贝的丢失。在一些实施例中，10q缺失还导致pten基因的拷贝的丢失。在一些实施例中，布罗莫结构域抑制剂是i-bet762、jq1或jq2。

在一些实施例中，本公开提供一种鉴定猬途径抑制剂的方法；其中所述方法包括：使细胞与一定量的试验药剂接触，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者具有增强的刺猬信号传导和/或刺猬信号传导途径的激活，并且其中所述细胞表达本文中所公开的任何突变smo蛋白，并且确定与对照物相比试验药剂是否抑制细胞中的刺猬信号传导，其中如果相对于对照物试验药剂抑制细胞中的刺猬信号传导，则将试验药剂鉴定为刺猬途径抑制剂。在一些实施例中，试验药剂抑制细胞中的刺猬信号传导的能力是利用gli1表达分析而确定。

在一些实施例中，本公开提供一种鉴定刺猬途径抑制剂的方法；其中所述方法包括：使细胞与一定量的试验药剂接触，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者具有增强的刺猬信号传导和/或刺猬信号传导途径的激活，并且其中所述细胞表达本文中所公开的任何突变smo蛋白，并且确定与对照物相比试验药剂是否抑制细胞的生长和/或增殖，其中如果相对于对照物试验药剂抑制细胞的生长和/或增殖，则将试验药剂鉴定为刺猬途径抑制剂。在一些实施例中，对照物是表达野生型smo蛋白的细胞。在一些实施例中，对照物是表达与试验药剂接触的细胞相同的突变smo蛋白的细胞，其中对照物用对照药剂来处理，突变smo蛋白对所述对照药剂是部分或完全耐受的。在一些实施例中，对照药剂是维莫德吉、ly2940680、lde225和/或化合物5。在一些实施例中，试验药剂与突变smo蛋白结合而不是野生型smo蛋白。在一些实施例中，试验药剂与突变smo蛋白和野生型smo蛋白两者均结合。在一些实施例中，与在表达野生型smo蛋白的细胞中相比，试验药剂在表达突变smo蛋白的细胞中可更有效地抑制刺猬信号传导途径。在一些实施例中，与表达野生型smo蛋白的细胞相比，试验药剂可更有效地抑制表达突变smo蛋白的细胞的生长和/或增殖。

在一些实施例中，本公开提供一种包括本文中所公开的任何核酸的载体。

在一些实施例中，本公开提供一种包括本文中所公开的任何载体的宿主细胞。

在一些实施例中，本公开提供一种包括并且能够表达本文中所公开的任何载体的宿主细胞。

在一些实施例中，本公开提供一种鉴定刺猬途径抑制剂的方法；其中所述方法包括：(a)使细胞与一定量的试验药剂接触，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者具有增强的刺猬信号传导和/或对信号传导途径的激活，并且其中所述细胞表达本文中所公开的任何载体；和(b)确定与对照物相比试验药剂是否抑制细胞中的刺猬信号传导，其中如果相对于对照物试验药剂抑制细胞中的刺猬信号传导，则将试验药剂鉴定为刺猬途径抑制剂。在一些实施例中，试验药剂抑制细胞中的刺猬信号传导的能力通过gli1表达分析而确定。

在一些实施例中，本公开提供一种鉴定刺猬途径抑制剂的方法；其中所述方法包括：(a)使细胞与一定量试验药剂接触，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者具有增强的刺猬信号传导和/或刺猬信号传导途径的激活，并且其中所述细胞表达本文中所公开的任何载体，和(b)确定与对照物相比试验药剂是否抑制细胞的生长和/或增殖，其中如果相对于对照物试验药剂抑制细胞的生长和/或增殖，则将试验药剂鉴定为刺猬途径抑制剂。

附图说明

当结合附图阅读以下的详细说明时本公开的上述及其它目的和优点将是显而易见的，其中在所有附图中相同的附图标记指代相同的元件，并且其中：

图1列出了在本文中所描述的用维莫德吉治疗的mbcc患者的特征。

图2示出了取自各患者的各肿瘤活检样本的突变负荷。“-p”表示进展样本，“-a”表示档案样本，“-i”或“-ii”分别表示第一或第二活检样本。

图3示出了在对取自各患者的各肿瘤活检样本而实施的foundationone操作板中所使用的检测的基因组改变。

图4示出了在取自各患者的肿瘤活检样本中所观察到的smo基因中的氨基酸变化和对应的突变的等位基因频率。aa＝氨基酸；af＝等位基因频率；nd＝未检测到；nr＝不相关；a＝以前报告与对维莫德吉的耐受性有关；b＝以前报告在体外赋予途径激活。“-p”表示进展样本，“-a”表示档案样本，“-i”或“-ii”分别表示第一或第二活检样本。

图5示出了来自给定区域的卷曲蛋白(fzd)的蛋白质序列和来自一系列脊椎动物和昆虫的smo蛋白的蛋白质序列的多序列比对。

图6示出了与维莫德吉耐药性相关的smo突出残基以及以前未相关的残基g529的维莫德吉结合口袋。

图7示出了维莫德吉剂量反应实验的结果，所述试验比较了用400ngsmo-wt或smo-g529s表达构造共转染的c3h10t1/2细胞中对萤光素酶报告基因活性，和用400ng9x-gli-bs和200ngprl-tk共转染的c3h10t1/2细胞中对萤光素酶报告基因活性。所标绘的数据是一式三份的，平均值±标sd。

具体实施方式

本公开的发现是，与用于刺猬依赖性肿瘤的化学治疗的耐受性相关的突变事件发生在平滑蛋白(smo)中，所述突变事件使得肿瘤对使用抑制刺猬信号传导的化合物(如环巴胺和gdc-0449)的治疗产生的耐药受性。本公开提供可用作依赖于刺猬信号传导的癌症的预诊、诊断以及治疗的组合物和方法。

本文中所描述或引用的技术和步骤通常是本领域技术人员公知的并且通常使用常规方法来应用，例如在以下所描述的广泛应用的方法：sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》，第三版(2001年)冷泉港实验室出版社，纽约州冷泉港；《最新分子生物学实验方法汇编(currentprotocolsinmolecularbiology)》(f.m.ausubel等人编著(2003年))；《酶学方法(methodsinenzymology)》(学术出版公司)系列：《pcr2：实用方法(pcr2:apracticalapproach)》(m.j.macpherson，b.d.hames和g.r.taylor编著(1995年))，harlow和lane编著(1988年)《抗体、实验室手册和动物细胞培养(antibodies,alaboratorymanual,andanimalcellculture)》(r.i.freshney编著(1987年))；《寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)》(m.j.gait编著，1984年)；《分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)》，胡马纳出版社；《细胞生物学：实验室笔记(cellbiology:alaboratorynotebook)》(j,e.cellis编著，1998年)学术出版社；《动物细胞培养(animalcellculture)》(r.i.freshney编著，1987年)；《细胞与组织培养实验手册(introductiontocellandtissueculture)》(j.p.mather和p.e.roberts，1998年)，普莱南出版公司；《细胞和组织培养：实验室程序(cellandtissueculture:laboratoryprocedures)》(a.doyle，j.b.griffiths和d.g.newell编著，1993-8)j.wiley和sons；《实验免疫学手册(handbookofexperimentalimmunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编著)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(genetransfervectorsformammaliancells)》(j.m.miller和m.p.calos编著，1987年)；《pcr：聚合酶链式反应(pcr:thepolymerasechainreaction)》(mullis等人编著，1994年)；《免疫学实验指南(currentprotocolsinimmunology)》(j.e.coligan等人编著，1991年)；《精编分子生物学实验指南(shortprotocolsinmolecularbiology)》(wiley和sons，1999年)；《免疫生物学(immunobiology)》(c.a.janeway和p.travers，1997年)；《抗体(antibodies)》(p.finch，1997年)；《抗体：实用方法(antibodies:apracticalapproach)》(d.catty编著，irl出版社，1988-1989年)；《单克隆抗体：实用方法(monoclonalantibodies:apracticalapproach)》(p.shepherd和c.dean编著，牛津大学出版社，2000年)；《使用抗体：实验室手册(usingantibodies:alaboratorymanual)》(e.harlow和d.lane(冷泉港实验室出版社，1999年))；《抗体(antibodies)》(m.zanetti和j.d.capra编著，哈伍德学术出版社，1995年)；以及《癌症：肿瘤学的原理和实践》(v.t.devita等人编著，j.b.lippincott公司，1993年)。所引用参考文献通过引用整体并入本文。

为了解释本说明书的目的，以下的定义将适用，并且在任何适当的情况下，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。

如果下面所陈述的任何定义与通过引用并入本文的任何文件有冲突，则以下面所陈述的定义为准。

在继续更详细地描述本公开之前，应当理解的是本公开并不局限于特定的组合物或工艺步骤，因为这些可能有变化。必须指出的是，在本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数所指对象，除非上下文另有明确说明。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的技术人员通常所理解的具有相同的含义。例如，《生物医学和分子生物学简明词典(concisedictionaryofbiomedicineandmolecularbiology)》，juo，pei-show，第二版，2002年，crc出版社；《细胞与分子生物学词典(dictionaryofcellandmolecularbiology)》，第三版，1999年，学术出版社；以及《牛津生物化学与分子生物学词典(oxforddictionaryofbiochemistryandmolecularbiology)》，修订版，2000年，牛津大学出版社，给本领域技术人员提供了本公开所使用许多术语的通用词典。

在本文中氨基酸可用它们公知的三字母符号或者由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸可用它们的普遍接受的单字母代码来表示。

这里方便指出的是，本文中所使用的“和/或”应被视为具有或没有另一个的两个指定特征或成分的每一个中的具体公开。例如“a和/或b”应被视为(i)a、(ii)b和(iii)a与b中每一个的具体公开，就如同在本文中各自单独地陈述。

在本文中，术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”可互换地使用，用以指代氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，并且适用于天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。本文中所使用的术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”包括至少本文中所描述的任何突变smo蛋白、其变体或片段。

本文中的术语“抗体”以最广泛的意义而使用，并且特异性地包含单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体和抗体片段所构成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们展示出期望的生物活性。

“经分离的”抗体是已从其自然环境的成分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物成分是将会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶类、激素类以及其它蛋白质或非蛋白质溶质。在一些实施例中，将抗体纯化(1)到大于95重量％的抗体(如利用例如lowry法所测定)，并且在一些实施例中纯化到大于99重量％；(2)通过使用例如转杯式测序仪纯化到足以获得至少15个n末端或内部氨基酸序列残基的程度；或者(3)使用例如考马斯亮蓝或银染色在还原或非还原条件下通过sds-page被纯化到均质。经分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的自然环境的至少一个成分将不存在。然而，通常经分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。

“天然抗体”通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其是由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链所构成。各轻链经由一个共价二硫键连接到重链，同时二硫键的数量在不同免疫球蛋白同种型的重链中有变化。各重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。各重链在一端具有可变域(vh)，接着是若干个恒定域。各轻链在一端具有可变域(vl)，在另一端具有恒定域：轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并且轻链可变域与重链的可变域对齐。据信，特定的氨基酸残基在轻链可变域与重链可变域之间形成界面。

抗体的“可变区”或“可变域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变域可被称为“vh”。轻链的可变域可被称为“vl”。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分并且含有抗原结合位点。

术语“可变”是指在抗体中可变域的某些部分的序列广泛地不同，并且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性在抗体的整个可变域中并不是均匀地分布。它集中于轻链和重链可变域中的所谓高变区(hvr)的三个区段中。可变域的更加高度保守的部分被称为框架区(fr)。天然重链和轻链的可变域各自包括四个fr区，这些fr区主要采用β-片层结构，经由三个hvr连接，由此形成连接β-片层结构的环且在一些情况下形成部分的β-片层结构。在各链中的hvr被fr区紧密地聚在一起，并且与来自其它链的hvr一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》，第五版，美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991年))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展示出各种效应物功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。

取自任何脊椎动物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”，基于它们的恒定域的氨基酸序列，可以归入被称为kappa(κ)和lambda(λ)的两个显著不同类型中的一个。

基于它们重链的恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可以归入不同的类别。存在五个主要类别的免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg以及igm，并且这些类别中的数个可进一步被划分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1以及iga2。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定域分别被称为α、δ、ε、γ以及μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的并且一般性地描述于例如abbas等人，《细胞和分子免疫学(cellularandmol.immunology)》第4版(w.b.saunders公司，2000年)。抗体可以是通过抗体与一个或多个其它蛋白质或肽的共价或非共价结合而形成的较大融合分子的一部分。

术语“全长抗体”、“完整抗体”以及“整体抗体”在本文中可互换地使用，用以指代大体上完整形式的抗体，而不是如下面所定义的抗体片段。所述术语尤其指代具有含有fc区的重链的抗体。

用于本文目的之“裸抗体”是不与细胞毒性部分或放射性标记缀合的抗体。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，并且在一些实施例中包括其抗原结合区。抗体片段的例子包括fab、fab'、f(ab')2以及fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；以及由抗体片段所构成的多特异性抗体。

抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原-结合片段，被称为“fab”片段(各“fab”片段具有单个抗原结合位点)和剩余的“fc”片段，其名称反映了其快速结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够与抗原交联的f(ab')2片段。

“fv”是含有完整的抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施例中，双链fv物种是由紧密非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体所组成。在单链fv(scfv)物种中，一个重链可变域和一个轻链可变域可经由柔性肽接头而共价地连接，使得轻链与重链可以类似于双链fv物种中的“二聚”结构结合。在此构型中，各可变域的三个hvr相互作用从而限定在vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。共同地，六个hvr赋予抗体抗原-结合特异性。然而，甚至单可变域(或者仅包括对抗原具有特异性的三个hvr的fv的一半)都具有识别并结合抗原的能力，尽管是以与整个结合位点相比较低的亲和力而结合。

fab片段含有重链和轻链可变域并且也含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同在于在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链ch1域的羧基末端加入几个残基。在本文中fab'-sh是本文中对fab'的命名，其中恒定域的半胱氨酸残基具有三个巯基。f(ab')2抗体片段最初是以fab'片段对的形式而产生，这些对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。

“单链fv”或“scfv”抗体片段包括抗体的vh和vl域，其中这些域存在于单个多肽链中。通常，scfv多肽还包括vh域与vl域之间的多肽接头，所述接头使得scfv能够形成用于抗原结合的期望结构。关于scfv的综述，可参见，例如pluckthün，《单克隆抗体药理学(thepharmacologyofmonoclonalantibodies)》，第113卷，rosenburg和moore编著(施普林格出版社，纽约，1994年)，第269-315页。

术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，这些片段包括在相同的多肽链(vh-vl)中连接到轻链可变域(vl)的重链可变域(vh)。通过使用过短从而不允许在相同链上的两个域之间配对的接头，迫使域与另一个链的互补域配对并且形成两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更充分地描述于，例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等人，《自然医学(nat.med.)》9:129-134(2003)；和hollinger等人，《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》90:6444-6448(1993)。三链抗体和四链抗体也描述于hudson等人，《自然医学(nat.med.)》9:129-134(2003)。

本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从大体上为均质性抗体群体中获得的抗体，即除可以少量存在的可能突变(例如天然突变)外其余都是相同的群体的单独抗体。因此，修饰语“单克隆的”表示抗体的特征为非分立抗体的混合物。在某些实施例中，这种单克隆抗体通常包括包含与靶结合的多肽序列的抗体，其中所述靶结合多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单个靶结合多肽序列的过程而获得。例如，选择过程可以是从多个克隆中选择独特的克隆，例如一系列的杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组dna克隆。应当理解的是，可以对所选择的靶结合序列做进一步修改，例如用以提高与靶的亲和力，使靶结合序列人源化，增加其在细胞培养中的产量，降低其体内免疫原性，形成多特异性抗体等；并且包括改变的靶结合序列的抗体也是本公开的单克隆抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不被其它免疫球蛋白所污染。

修饰语“单克隆的”表示抗体的特征为从大体上为均质性抗体群体中获得，并且不应被理解成要求利用任何特定方法产生抗体。例如，根据本公开所使用的单克隆抗体可通过多种技术制造，包括例如杂交瘤方法(例如，kohler和milstein，《自然(nature)》，256:495-97(1975)；hongo等人，《杂交瘤(hybridoma)》，14(3):253-260(1995)，harlow等人，《抗体：实验室手册(antibodies:alaboratorymanual)》(冷泉港实验室出版社，第二版，1988年)；hammerling等人，《单克隆抗体和t-细胞杂交瘤(monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas)》563-681(elsevier，纽约州，1981年))、重组dna方法(参见例如美国专利第4,816,567号)、噬菌体展示技术(参见例如clackson等人《自然(nature)》，352:624-628(1991)；marks等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》222:581-597(1992)；sidhu等人《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》338(2):299-310(2004)；lee等人《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》340(5):1073-1093(2004)；fellouse，《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》101(34):12467-12472(2004)；以及lee等人《免疫学方法杂志(j.immunol.methods)》284(1-2):119-132(2004))，以及用于在具有部分或全部的编码人免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因座或基因的动物中产生人源或类人抗体的技术(参见例如wo1998/24893；wo1996/34096；wo1996/33735；wo1991/10741；jakobovits等人《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》90:2551(1993)；jakobovits等人《自然(nature)》362:255-258(1993)；bruggemann等人《免疫学年鉴(yearinimmunol)》7:33(1993)；美国专利第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016号；marks等人，《生物技术(bio/technology)》10:779-783(1992)；lonberg等人《自然(nature)》368:856-859(1994)；morrison，《自然(nature)》368:812-813(1994)；fishwild等人，《自然生物技术(naturebiotechnol.)》14:845-851(1996)；neuberger，《自然生物技术(naturebiotechnol)》.14:826(1996)；以及lonberg和huszar，《国际免疫学综述(intern.rev.immunol.)》13:65-93(1995))。

本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中一部分的重链和/或轻链与来源于特定物种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，同时剩余的链与来源于另一物种或者属于另一抗体类别或亚类的抗体和这种抗体的片段中的对应的序列相同或同源，只要它们展示出期望的生物活性(参见，例如美国专利第4,816,567号；和morrison等人《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括抗体，其中抗体的抗原结合区来源于抗体，而抗体通过例如用目的抗原使猕猴免疫而产生。

“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在一个实施例中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的hvr的残基被来自具有期望的特异性、亲和力、和/或能力的来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长目动物)的hvr的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fr残基被对应的非人残基所取代。此外，人源化抗体可包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可进行这些修饰用以进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括至少一个，通常为两个的可变域的大体上的全部，其中全部或大体上全部的高变环与非人免疫球蛋白的高变环相对应，并且全部或大体上全部的fr是人免疫球蛋白序列的fr。人源化抗体任选地也将包括至少一部分的免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。为了获得更详细的内容，可参见例如jones等人《自然(nature)》321:522-525(1986)；riechmann等人《自然(nature)》332:323-329(1988)；和presta，《结构生物学的新观点(curr.op.struct.biol.)》2:593-596(1992)。也可参见例如vaswani和hamilton，《过敏、哮喘及免疫学年鉴(ann.allergy,asthma&immunol.)》1:105-115(1998)；harris《生化学会会刊(biochem.soc.transactions)》23:1035-1038(1995)；hurle和gross《生物技术近期述评(curr.op.biotech.)》5:428-433(1994)；以及美国专利第6,982,321和7,087,409号。

“人抗体”是具备与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的人抗体和/或利用如本文中所公开的制造人抗体的任何技术而制造的人抗体。人抗体的所述定义特别地排除包括非人抗原-结合残基的人源化抗体。人抗体可利用本领域已知的各种技术来产生，包括噬菌体展示文库。hoogenboom和winter，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》，227:381(1991)；marks等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》，222:581(1991)。也可用于制备人单克隆抗体的方法描述于cole等人《单克隆抗体和癌症治疗(monoclonalantibodiesandcancertherapy)》，alanr.liss，77页(1985年)；boerner等人《免疫学杂志(j.immunol.)》，147(l):86-95(1991)。也可参见vandijk和vandewinkel，《药理学新见(curr.opin.pharmacol.)》，5:368-74(2001)。人抗体可通过将抗原施用于转基因动物来制备，所述转基因动物已经过修饰以便响应于抗原刺激产生这种抗体，但其内源性基因座已被禁用，例如免疫的转基因小鼠(参见例如关于xenomouse^tm技术的美国专利第6,075,181和6,150,584号)。也可参见例如li等人关于利用人b细胞杂交瘤技术产生的人抗体的《美国国家科学院学报(proc.natlacad.sci.usa)》，103:3557-3562(2006)。

本文中所使用的术语“高变区”、“hvr”或“hv”是指序列高度可变的并且/或者形成结构限定环的抗体可变域的区域。通常，抗体包括六个hvr；三个是在vh(h1、h2、h3)中，而三个是在vl(l1、l2、l3)中。在天然抗体中，h3和l3显示六个hvr的最多的多样性，并且h3尤其被认为在赋予抗体优良特异性中发挥独特的作用。参见例如xu等人，《免疫(immunity)》13:37-45(2000)；johnson和wu《分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)》248:1-25(lo编著，human出版社，新泽西州托托瓦市，2003年)。实际上，仅由重链组成的天然骆驼科动物抗体在轻链不存在的情况下是功能性且稳定的。参见例如hamers-casterman等人《自然(nature)》363:446-448(1993)；sheriff等人《自然结构生物学(naturestruct.biol.)》3:733-736(1996)。

一些hvr描述正在被使用并且包括在本文中。kabat互补决定区(cdr)基于序列变异性并且是最常用的(kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》，第五版，公共卫生署，国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991年))。而chothia则提到结构环的位置(chothia和lesk《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》196:901-917(1987))。abmhvr代表在kabathvr与chothia结构环之间的折中，并且是由oxfordmolecular的abm抗体模型化软件而使用。“接触”hvr基于对可获得络合物晶体结构的分析。下面给出了来自这些hvr的每一个的残基。

环c接触

----------

l1llll30-l36

l2llll46-l55

l3llll89-l96

h1h31-h35bh26-h35bhh30(kabat编号)

hihhhh30(chothia编号)

h2hhhh47-h58

h3h95-h102h95-h102h9h93-h101

hvr可包括如下的“伸展hvr”：在vl中的24-36或24-34(l1)、46-56或50-56(l2)及在vh中的89-97或89-96(l3)和26-35(h1)、50-65或49-65(h2)和93-102、94-102、或95-102(h3)。可变域残基是根据kabat等人(同上)的这些定义的每个定义而进行编号。

“框架”或“fr”残基是除本文中所定义的hvr残基以外的可变域残基。

术语“如在kabat中的可变域残基编号”或“如在kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指在kabat等人中(同上)用于抗体编绘的重链可变域或轻链可变域的编号系统。利用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可含有对应于可变域的fr或hvr的缩短或插入的更少或额外的氨基酸。例如，重链可变域可包括在h2的残基52之后的单个氨基酸插入片段(残基52a，根据kabat)和在重链fr残基82之后的插入的残基(例如残基82a、82b和82c等，根据kabat)。对于给定的抗体，残基的kabat编号可通过在抗体序列的同源区与“标准的”kabat编号序列进行比对而确定。

kabat编号系统通常当指代可变域的残基(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时被采用(例如，kabat等人，《具有免疫学意义的蛋白质序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》，第五版，公共卫生署，国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达(1991年))。“eu编号系统”或“eu索引”通常当指代免疫球蛋白重链恒定区的残基时被采用(例如，在kabat等人中所报道的eu索引，同上)。“如在kabat中的eu索引”是指人igg1eu抗体的残基编号。除非在本文中另有说明，对在抗体可变域中的残基号的引用表示利用kabat编号系统的残基编号。除非在本文中另有说明，对在抗体恒定域中的残基号的引用表示利用eu编号系统的残基编号(例如参见美国临时专利申请第60/640,323号，用于eu编号的附图)。

“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个hvr中具有一个或多个变更的抗体，这导致与不具有这些变更的亲本抗体相比抗体对抗原的亲和力得到提高。在一个实施例中，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔的与靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可利用本领域中已知的某些步骤而产生。例如，marks等人《生物技术(bio/technology)》10:779-783(1992)描述了由vh和vl域混编所导致的亲和力成熟。hvr和/或框架残基的随机突变描述于例如barbas等人《美国国家科学院学报(procnat.acad.sci.usa)》91:3809-3813(1994)；schier等人，《基因(gene)》169:147-155(1995)；yelton等人《免疫学杂志(j.immunol.)》155:1994-2004(1995)；jackson等人，《免疫学杂志(j.immunol.)》154(7):3310-9(1995)；以及hawkins等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》226:889-896(1992)。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体是抑制或降低其所结合的抗原的生物活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体大体上或完全地抑制抗原的生物活性。

本文中所使用的“激动性抗体”是部分地或完全地模拟感兴趣多肽的至少一个的功能活性的抗体。

“生长抑制性”抗体是防止或减少表达抗体与之结合的抗原的细胞的增殖的抗体。例如，所述抗体可防止或减少在体外和/或体内表达smo或突变体的癌细胞的增殖。

“诱导细胞凋亡”的抗体是诱导由标准细胞凋亡测定所确定的程序性细胞死亡的抗体，例如膜联蛋白v的结合、dna的断裂、细胞皱缩、内质网的扩张、细胞碎裂和/或膜性小泡(被称为凋亡小体)的形成。

抗体“效应物功能”指代归因于抗体fc区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)的生物活性，并且随着抗体同种型而变化。抗体效应物功能的例子包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调；以及b细胞活化。

本文中使用的术语“fc区”用于限定免疫球蛋白重链的c末端区，包括天然序列fc区和变体fc区。尽管免疫球蛋白重链的fc区的边界可能会有变化，但人igg重链fc区通常被限定为从在位置cys226处的氨基酸残基，或从pro230处延伸至其羧基末端。可将fc区的c末端赖氨酸(根据eu编号系统的残基447)去除，例如在抗体的生产或纯化期间，或者通过对编码抗体重链的核酸的实施重组工程。因此，完整抗体的组合物可包括其中将所有k447残基去除的抗体群、其中未将k447残基去除的抗体群以及包括具有k447残基和没有k447残基的抗体的混合物的抗体群。

“功能性fc区”具备天然序列fc区的“效应物功能”。示例性的“效应物功能”包括c1q结合；cdc；fc受体结合；adcc；吞噬作用；细胞表面受体(例如b细胞受体；bcr)的下调等。这种效应物功能通常需要将fc区与结合域(例如，抗体可变域)结合，并且可以利用各种测定进行评估，例如本文定义中所公开的。

“天然序列fc区”包括与在自然界所发现的fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人fc区包括天然序列人igg1fc区(非a和a同种异型)；天然序列人igg2fc区；天然序列人igg3fc区；和天然序列人tgg4fc区以及其天然变体。

“变体fc区”包括与天然序列fc区的氨基酸序列的不同之处在于至少一个氨基酸修饰并且在一些实施例中一个或多个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施例中，与天然序列fc区或亲本多肽的fc区相比，变体fc区具有至少一个氨基酸取代，例如从约一个至约十个的氨基酸取代，并且在一些实施例中，具有在天然序列fc区或亲本多肽的fc区中的从约一个至约五个氨基酸取代。在一些实施例中，本文中的变体fc区将与天然序列fc区和/或与亲本多肽的fc区具有至少约80％的同源性，并且在一些实施例中至少约90％的同源性，在一些实施例中至少约95％的同源性。

“fc受体”或“fcr”描述与抗体fc区结合的抗体。在一些实施例中，fcr是天然的人fcr。在一些实施例中，fcr是与igg抗体(γ受体)结合并且包括fcγri、fcγrii和fcγriii亚类的受体，包括等位基因变体和可替代地这些受体的剪接形式。fcγrii受体包括fcγriia(“活化性受体”)和fcγriib(“抑制性受体”)，这两种受体具有相似的氨基酸序列，主要的不同之处在于其胞浆域。活化性受体fcγriia在其胞浆域中含有免疫受体酪氨酸活化基序(itam)。抑制性受体fcγriib在其胞浆域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)(参见例如，《免疫学年鉴(annu.rev.immunol.)》15:203-234(1997)。fcrs综述于例如ravetch和kinet，《免疫学年鉴(annu.rev.immunol.)》9:457-92(1991)；capel等人，《免疫方法(immunomethods)》4:25-34(1994)；以及dehaas等人，《实验室和临床医学杂志(j.lab.clin.med.)》126:330-41(1995)。其它的fcr，包括在将来所鉴定的，被包括在本文的术语“fcr”中。

术语“fc受体”或“fcr”也包括新生儿受体fcrn，其职能是将母亲的igg转移到胎儿(guyer等人，《免疫学杂志(j.immunol.)》117:587(1976)；和kim等人，《免疫学杂志(j.immunol.)》24:249(1994))，及对免疫球蛋白的稳态的调节。测量与fcrn的结合的方法是已知的(参见例如ghetie和ward.，《今日免疫学(immnuol.today)》18(12):592-598(1997)；ghetie等人，《天自然生物技术(naturebiotechnology)》，15(7):637-640(1997)；hinton等人，《生物化学杂志(j.biol.chem.)》279(8):6213-6216(2004)；wo2004/92219(hinton等人)。

可在例如表达人fcrn的转基因小鼠或转染人细胞系中，或者在施用有具有变体fc区的多肽的灵长目动物中，对在体内与人fcrn的结合和人fcrn高亲和力结合多肽的血清半衰期进行测定；wo2000/42072(presia)描述了具有改善的或减弱的与fcrs结合的抗体变体。也可参见例如shields等人《生物化学杂志(j.biol.chem.)》9(2):6591-6604(2001)。

“人效应细胞”是表达一个或多个fcr并且执行效应物功能的白细胞。在某些实施例中，这些细胞表达至少fcγriii并且执行adcc效应物功能。介导adcc的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(pbmc)、自然杀伤(nk)细胞、单核细胞、细胞毒t细胞以及中性粒细胞。效应细胞可从天然源中分离，例如从血液中。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“adcc”是指一种形式的细胞毒性，其中分泌的ig结合到存在于某些细胞毒细胞(例如nk细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)中的fc受体(fcrs)上从而使这些细胞毒效应细胞特异性地结合到携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。用于介导adcc的主要细胞，自然杀伤细胞，仅表达fcγriii，而单核细胞则表达fcγri、feγrii以及fcγriii。在ravetch和kinet《免疫学年鉴(annu.rev.immunol)》9:457-92(1991)464页的表3中对在造血细胞上的fcr表达进行了总结。为了评估感兴趣分子的adcc活性，可执行体外adcc测定，例如在美国专利第5,500,362或5,821,337号或者美国专利第6,737,056号(presta)中所描述的。用于这种测定的有用效应细胞包括pbmc和nk细胞。可替代地或另外地，可在体内对感兴趣分子的adcc活性进行评估，例如在动物模型中，如在clynes等人《美国国家科学院学报(pnas(usa))》95:652-656(1998)中所公开的。

“补体依赖性细胞毒性”或“cdc”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典的补体途径的激活是通过使补体系统的第一成分(c1q)与结合到它们的同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体激活，可执行cdc测定，例如在gazzano-santoro等人，《免疫学方法(j.immunol.methods)》202:163(1996)中所描述。具有经改变的fc区氨基酸序列(具有变体fc区的多肽)和增强的或减弱的c1q结合能力的多肽变体描述于例如美国专利第6,194,551b1号和wo1999/51642。也可参见例如idusogie等人，《免疫学杂志(j.immunol.)》164:4178-4184(2000)。

术语“包含fc区的抗体”是指包含fc区的抗体。可将fc区的c末端赖氨酸(残基447，根据eu编号系统)去除，例如在抗体的纯化期间，或者通过对编码抗体的核酸实施重组工程。因此，根据本公开的包含具有fc区的抗体的组合物可以包括具有k447的抗体、其中将所有k447去除的抗体、或者具有和没有k447残基的抗体的混合物。

“结合亲和力”通常是指在分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的全部非共价相互作用的强度。除非另有说明，本文中所使用的“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子x与其配偶体y的亲和力通常可以用解离常数(kd)来表示。可以利用本领域中已知的常用方法(包括在本文中所描述的)来测量亲和力。低亲和力抗体通常与抗原缓慢地结合并且往往会快速地解离，而高亲和力抗体通常更快地与抗原结合并且往往会保持保持结合状态更长时间。多种测量结合亲和力的方法在本技术领域中是已知的，其中的任何方法可用于本公开的目的。下面对用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例进行描述。

在一个实施例中，根据本公开的“kd”或“kd值”通过如在以下的测定中所描述的使用感兴趣抗体和其抗原的fab变体所执行的放射性标记抗原结合测定(r1a)进行测量。fab与抗原的溶液结合亲和力是通过以下进行测量：在滴定系列的未标记抗原的存在下用最小浓度的(¹²⁵i)标记的抗原使fab平衡，然后用抗fab抗体包被板捕捉结合抗原(参见例如chen等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》293:865-881(1999))。为了获得用于测定的条件，用溶解于50mm碳酸钠(ph9.6)的5μg/ml捕捉抗fab抗体(cappellabs)包被多孔板(thermoscientific)达一夜，随后在室温(大约23℃)下用溶解于pbs的2％(w/v)牛血清白蛋白进行阻断达2至5小时。在非吸附性板(nunc#269620)中，将100pm或26pm[¹²⁵i]抗原与感兴趣fab的系列稀释液加以混合(例如，与抗vegf抗体fab-12的评估一致，如在presta等人《癌症研究(cancerres.)》57:4593-4599(1997))中所描述。然后将感兴趣的fab进行一夜温育；然而，所述温育可持续更长时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕捉板在室温下进行温育(例如，达一小时)。然后将溶液取出，并且用溶解于pbs的0.1％tween-20^tm将板清洗八次。当板干燥后，添加150μl/孔的闪烁剂(microscint-20^tm；packard)，并且将板在topcount^tmγ计数器(packard)上进行计数达10分钟。对提供小于或等于20％的最大结合的各fab的浓度进行选择，以便用于竞争性结合测定。

根据另一个实施例，在25℃下使用固定化抗原cm5芯片在约10反应单位(ru)处，利用-2000或-3000(biacore公司，新泽西州皮斯卡塔韦)通过表面等离子共振测定对kd或kd值进行测量。简单地说，根据供应商的说明书，用n-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)将羧甲基化右旋糖酐生物传感器芯片(cm5，biacore公司)激活。在以5μl/分钟的流率注射之前，用10mm醋酸钠(ph4.8)将抗原稀释至5g/ml(-0.2μμ)，以获得大约10反应单位(ru)的偶联蛋白。在抗原的注射之后，注入1m乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，于25℃以大约25μl/min的流率，将fab的两倍系列稀释液(0.78nm至500nm)注入含有0.05％tween-20^tm表面活性剂(pbst)的pbs。利用简单的一对一朗缪尔结合模型(评估软件版本3.2)通过同时地拟合结合和解离传感图，来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。以比率koff/kon的形式计算平衡解离常数(kd)。参见例如chen等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》293:865-881(1999)。如果上述表面等离子共振测定的结合速率超过10⁶m^-1s^-1，那么可荧光猝灭技术来确定结合速率，所述技术在浓度增加的抗原存在下，在ph为7.2的pbs中测量抗-抗原抗体(fab形式)在25℃下的荧光发射强度的增加或减少，如在分光仪中所测量，例如停流分光光度计(avivinstruments)或带搅拌槽的8000序列slm-aminco^im分光光度计(thermospectronic)。

根据本公开的“结合速率(on-rate)”、“结合速率(rateofassociation)”、“结合速率(rateofassociation)”或“kon”也可以如上所述使用-2000或-3000系统(biacore公司，新泽西州皮斯卡塔韦)来确定。

本文中使用的术语“大体上相似”或“大体上相同”表示两个数值(例如，一个与本公开的抗体有关而另一个与参比/比较抗体有关)之间有足够高程度的相似性，使得本领域技术人员将会认为在通过所述值(例如，kd值)测量的生物特征的背景中这两个值之间的差异具有很小的或不具有生物学和/或统计学意义。在所述两个值之间的差异，作为参比/比较值的函数，例如小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％和/或小于约10％。

本文中所使用的短语“大体上减小”、或“大体上不同”表示两个数值(通常一个与分子有关而另一个与参比/比较分子有关)之间有足够高程度的差异，使得本领域技术人员将会认为在通过所述值(例如，kd值)测量的生物特征的背景中这两个值之间的差异具有统计学意义。所述两个值之间的差异，作为用于参比/比较分子的值的函数，例如大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％和/或大于约50％。

“纯化”表示分子以其中含有所述分子的样本的至少95重量％或至少98重量％的浓度存在于样本中。

“经分离的”核酸分子是从通常与之结合(例如在其自然环境中)的至少一个其它核酸分子中所分离的核酸分子。经分离的核酸分子还包括通常表达核酸分子的细胞中所含有的核酸分子，但所述核酸分子是存在于染色体外或者存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置。

“经分离的”蛋白是从通常与之结合(例如在其自然环境中)的至少一个其它细胞成分中所分离的蛋白。在一些实施例中，“经分离的”蛋白是在通常不表达蛋白的细胞中表达的蛋白。在一些实施例中，经分离的蛋白是重组蛋白。

本文中所使用的术语“载体”意指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指另外的dna区段可连接到其内部的环状双链dna。另一类型的载体是噬菌体载体。另一类型的载体是病毒载体，其中可将另外的dna区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有复制的细菌起源的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在导入宿主细胞时可将其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)并入宿主细胞的基因组中，由此与宿主基因组一起被复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。在本文中，这种载体被称为“重组表达载体”，或简单地“表达载体”。一般而言，表达载体在重组dna技术中的应用常常采用质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换地使用，因为质粒是最常用形式的载体。

在本文中“多核苷酸”或“核酸”可互换地使用，它们指代任意长度核苷酸的聚合物，并且包括dna和rna。在一些实施例中，核酸是cdna分子或其片段。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可以是通过dna或rna聚合酶或通过合成反应被并入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包括修饰核苷酸，如甲基化核苷酸和它们的类似物。如果存在，可在所述聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸可包括在合成后所进行的修饰，如与标记的接合。其它类型的修饰包括例如“加帽”、用类似物对一个或多个天然核苷酸的取代，核苷酸间修饰，例如具有不带电荷键(如，膦酸甲酯类、磷酸三酯类、磷酰胺类、氨基甲酸酯类，等)和带电荷键(如，硫代磷酸酯类、二硫代磷酸酯类等)的那些，含有侧链部分的那些，例如蛋白质(如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-l-赖氨酸，等)，具有嵌入剂(如，吖啶、补骨脂素，等)的那些，含有螯合剂(例如，金属、放射线金属、硼、氧化性金属等)的那些、含有烷化剂的那些、具有经修饰的键(如，α-端基异构核酸，等)以及未修饰形式的多核苷酸)。另外，可将通常存在于糖类中的任何羟基取代，例如用膦酸酯基、磷酸酯基；用标准保护基进行保护，或者被活化以便与其它核苷酸形成其它键，或者可与固体或半固体载体结合。可以将5'和3'末端oh磷酰化或者用胺类或1至20个碳原子的有机封端基取代。也可将其它羟基衍生化为标准保护基。多核苷酸也可以含有在本领域中所熟知的类似形式的核糖或脱氧核糖，包括例如2'-o-甲基-、2'-o-烯丙基-、2'-氟-或2"-叠氮-核糖、碳环糖类似物、α-端基异构糖、嵌合糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚糖、无环类似物；以及碱性核苷类似物(如甲基核苷)。一个或多个磷酸二酯键可被替代的连接基所取代。这些替代的连接基包括但不限于：其中磷酸酯被p(o)s(“硫代磷酰酯”)、p(s)s(“二硫代酯”)、(o)nr2(“酰胺化物”)、p(o)r、p(o)or'、co、或ch2(“甲缩醛(formacetal)”)取代的实施例，其中各r或r'独立地是h或者任选地含有醚(-o-)键的取代或未取代的烷基(1-20c)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。在多核苷酸中的所有键无需是相同的。前面的描述适用于本文中所提及的所有多核苷酸，包括rna和dna。

本文中所使用的“寡核苷酸”通常是指短的、通常是单链的、通常是(通常但非必须)长度小于约200个核苷酸的合成聚核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不相互排斥。上面对多核苷酸的描述同样地且完全地适用于寡核苷酸。

在本文中的术语“smo”或“smo”或“平滑蛋白”可互换地使用，它们指代来自任何脊椎动物源(包括哺乳动物，如灵长目动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然平滑蛋白或核酸，除非另有说明。所述术语包括“全长”未经处理的smo，以及在细胞中进行处理而形成的任何形式的smo。所述术语也包括天然的smo的变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一些实施例中，本文中所使用的“突变smo”或“突变smo多肽”或“突变smo蛋白”是指在人smo的位置529处的smo的第七跨膜中具有突变的smo。在一些实施例中，本文中所使用的“突变smo”或“突变smo多肽”或“突变smo蛋白”是指在与seqidno:1或2的位置529相对应的氨基酸位置包括突变的平滑化多肽。在一些实施例中，本文中所使用的“突变smo”或“突变smo多肽”或“突变smo蛋白”是指在与seqidno:1或2的位置529相对应的氨基酸位置包括突变，并在与seqidno:i的位置241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任意一个或多个氨基酸处包括至少一个另外的突变的平滑化多肽。在一些实施例中，在与位置529相对应的氨基酸位置的突变是g529s取代。在一些实施例中，至少一个另外的突变与t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e518as533n和/或w535l中的任何一个或多个相对应。类似地，突变smo蛋白被描述为在野生型人smo的任何一个或多个前述位置处具有变异。本公开预期本文中所描述的任何突变多肽或核酸可以相对于序列标识符进行描述或者相对于野生型人smo进行描述。此外，突变可以相对于seqidno:1进行描述或者相对于任何其它序列标识符进行描述。

在一些实施例中，本文中所使用的“治疗(treatment)”(及其变体如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指进行临床干预以试图改变正在进行治疗的个体或细胞的自然进程，并且可以实施用来预防或者在临床病理的过程期间实施。治疗的期望效果包括防止疾病的发生或复发、缓解症状、减小疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本公开的抗体是用于延缓疾病或病症的发展或者减慢疾病或病症的进展。在一些实施例中，本文中所使用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”是指改善、缓解正在进行治疗的疾病的的一个或多个症状，和/或减轻严重程度。举例来说，治疗癌症是指改善(改善患者的状况)、缓解、延缓或减慢进展或发病；降低癌症的一个或多个症状的严重程度。例如，治疗癌症包括下列中的任何一个或多个：减小肿瘤大小、降低肿瘤大小增加的速率、停止肿瘤大小的增加、减少转移的数量、减轻疼痛、提高存活率以及提高无进展存活率。

“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”是指改善、缓解正在进行治疗疾病的一个或多个症状，和/或减轻严重程度。举例来说，治疗癌症是指改善(改善患者的状况)、缓解、延缓或减慢进展或发病；减轻癌症的一个或多个症状的严重程度。例如，治疗癌症包括下列中的任何一个或多个：减小肿瘤大小、减小肿瘤大小增加的速率、停止肿瘤大小的增加、减少转移的数量、减轻疼痛、提高存活率以及提高无进展存活率。“诊断”是指鉴定或确定疾病或肿瘤的显著特征的过程。在癌症的情况下，诊断的过程有时也被表示为基于严重程度或疾病进展对肿瘤的分级或分类。

“诊断”是指鉴定或确定疾病或肿瘤的显著特征的过程。在癌症的情况下，诊断的过程有时也被表示为基于严重程度或疾病进展对肿瘤的分期或分类。

“个体”、“受试对象”或“患者”是脊椎动物，如人。在某些实施例中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于：家畜(如奶牛)、运动动物、宠物(如猫、狗、和马)、灵长目动物、小鼠和大鼠。在某些实施例中，哺乳动物是人。

术语“药物制剂”是指采用使活性成分的生物活性能够有效的剂型，并且不含对于施用所述制剂的受试对象而言存在不可接受的毒的其它成分的制剂。这种制剂可以是无菌的。在某些实施例中，所述药物制剂是无热原的。

“无菌”制剂是无菌的或者不含所有活的微生物和它们的孢子。“有效量”是指在必需的剂量和时间段下有效地实现期望的治疗或预防效果的量。

本公开的物质/分子的“治疗有效量”可根据下列因素变化：如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及物质/分子的能力。治疗有效量包括其中物质/分子的治疗有益作用超过任何有毒的或有害作用的量。“预防有效量”是指在必需的剂量和时间段下有效地获得期望的预防效果的量。通常但非必需，因为在疾病之前或在疾病的早期将预防剂量用于受试对象，所以预防有效量将会小于治疗有效量。

本文中所使用的术语“细胞毒性药剂”是指抑制或防止细胞功能并且/或者导致细胞死亡或损伤的物质。所述术语的意图包括放射性同位素(例如，at²¹¹、i¹³¹、i¹²⁵、y⁹⁰、re¹⁸⁶、re¹⁸⁸、sm¹⁵³、bi²¹²、p³²、pb²¹²以及lu的放射性同位素)、化疗剂(例如，氨甲蝶呤、亚德里亚霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、阿霉素、美法仑、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它插入剂、酶(如溶核酶)及其片段、抗生素以及细菌、真菌、植物或动物来源的毒素(如小分子毒素)或酶活性毒素(包括其片段和/或变体)和下面所公开的各种抗肿瘤或抗癌药剂。下面描述了其它的细胞毒性药剂。杀肿瘤剂导致肿瘤细胞损伤。

“毒素”是能够对细胞生长或增殖具有不利作用的任何物质。

“化学治疗剂”是可用于癌症治疗的化学化合物。化学治疗剂的例子包括烷化剂，如塞替派和环磷酰胺烷基磺酸酯类，如白消安、英丙舒凡以及哌泊舒凡；氮杂环丙烷类，如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌、以及和脲多巴；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺以及三羟甲蜜胺；番荔枝内酯类(特别是泡番荔枝辛和泡番荔枝辛酮)；δ-9-四氢大麻醇(屈大麻酚，)；β-拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康cpt-11(伊立替康，)、乙酰基喜树碱、东莨菪素以及9-氨基喜树碱)；苔藓虫素；卡利他汀；cc-1065(包括其阿多来新、卡折来新以及比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素类(具体地隐藻素1和隐藻素8)；尾海兔素；倍癌霉素(包括合成类似物、kw-2189以及cbl-tml)；五加素；水鬼蕉碱；珊瑚类二萜；软海绵素；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀以及雷莫司汀：抗生素，如烯二炔类抗生素(例如，卡里奇霉素，特别是卡里奇霉素γli和卡里奇霉素ωi1(参见例如nicolaou等人，《应用化学国际英文版(angew.chemintl.edengl.)》，33:183-186(1994))；cdp323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；达内霉素，包括达内霉素a；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、氮杂丝氨酸、博来霉素类、放线菌素c、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素类、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉基阿霉素、氰基吗啉基阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素、盐酸阿霉素脂质体注射剂脂质体阿霉素tlcd-99聚乙二醇化脂质体阿霉素以及脱氧阿霉素)、表阿霉素、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类(如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢剂，如氨甲蝶呤、吉西他滨替加氟卡培他滨埃博霉素以及5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素类，如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂；抗肾上腺素类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；比曲比新；比生群；依达曲沙；地佛法明(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇类，如美登素和安丝菌素类；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；甲基苄肼；多糖络合物(jhsnaturalproducts，俄勒冈州尤金市)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2'-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(特别是t-2毒素、verracurina、杆孢菌素a以及蛇形菌素)；氨基甲酸酯；长春地辛达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托新(gacytosine)；阿糖胞苷(“arα-c”)；塞替派；紫杉烷，例如紫杉醇紫杉醇白蛋白工程纳米粒制剂以及多烯紫杉醇苯丁酸氮芥；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂剂，如顺铂、奥沙利铂(例如，)以及卡铂；长春花生物碱，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春花碱长春新碱)、长春地辛以及长春瑞滨依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；亚叶酸；盐酸米托恩醌；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；维甲酸类，如视黄酸，包括贝沙罗汀双磷酸盐，如氯膦酸盐(例如，或)、羟乙磷酸盐ne-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿仑磷酸盐帕米膦酸二钠替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐曲沙他滨(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，尤其是在参与异常细胞增殖的信号传导途径中抑制基因表达的那些，例如pkc-α、raf、h-ras以及表皮生长因子受体(egf-r)；疫苗，如疫苗和基因治疗疫苗，例如疫苗、疫苗、和)疫苗：拓扑异构酶1抑制剂(例如，)；rmrh(例如，)；bay439006(索拉非尼；拜耳公司)；su-11248(舒尼替尼，辉瑞公司)；哌立福辛、cox-2抑制剂(例如塞来考昔或依托考昔)、蛋白酶体抑制剂(例如ps341)；硼替佐米cci-779；替吡法尼(r11577)；索拉非尼、abt510；bcl-2抑制剂，如奥利默森钠匹杉琼；egfr抑制剂(参见下面的定义)；酪氨酸激酶抑制剂(参见下面的定义)；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如雷帕霉素(西罗莫司，)；法尼基转移酶抑制剂，如洛那法尼(sch6636、sarasar^tm)；任何上述的药学上可接受的盐类、酸类或衍生物；以及上述两个或更多个的组合如chop(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱以及泼尼松龙的联合治疗的缩写)；和folfox(奥沙利铂与5-fu和亚叶酸结合的治疗方案的缩写)。

本文中所定义的化疗药剂包括用于调节、减少、阻断或抑制可促进癌生长的激素的作用的“抗激素药剂”或“内分泌治疗”。它们可以是激素自身，包括但不限于：具有混合型激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他莫昔芬4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬吲哚昔酚、屈洛昔芬、那洛昔芬曲沃昔芬、雷洛昔芬以及选择性雌激素受体调节剂(serm)如serm3；没有激动剂特性的纯抗雌激素类，如氟维司群和em800(这种药剂可阻止雌激素受体(er)二聚化，抑制dna结合、提高er转换和/或抑制er水平)；芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂(如福美司坦和依西美坦)和非甾体芳香酶抑制剂(如阿那曲唑来曲唑和氨鲁米特)以及其它芳香酶抑制剂，包括伏氯唑醋酸甲地孕酮法屈唑、和4(5)-咪唑类；促黄体生成激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(和)、戈舍瑞林、布舍瑞林以及曲普瑞林；性类固醇激素，包括孕激素类，如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮；雌激素类，如二乙基已烯雌酚和普雷马林，和雄激素类/维甲酸类，如氟羟甲基睾酮、全反式维甲酸以及维甲酰酚胺；奥那司酮；抗孕酮类；雌激素受体下调剂(erd)；抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；和任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述的两个或更多个的组合。

本文中所使用的“生长抑制剂”是指在体外或者在体内抑制细胞生长(如表达smo的细胞)的化合物或组合物。因此，所述生长抑制剂可以是显著地降低处于s期的细胞(如表达smo的细胞)的百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻止细胞周期进展(在除s期外的位置)的药剂，例如诱导g1阻滞和m期阻滞的药剂。典型的m期阻断剂包括长春花生物碱(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷类以及拓扑异构酶ii抑制剂，如阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、依托泊苷以及博来霉素。使g1阻滞的药剂也溢出进入s期阻滞，例如dna烷化剂，如他莫昔芬、泼尼松、达卡巴嗪、结果氮芥、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷。更多的信息可以参见mendelsohn和israel编著的，《癌症分子基础(themolecularbasisofcancer)》，第1章，murakami等人的题为《细胞周期调节、癌基因、和抗癌药(cellcycleregulation,oncogenes,andantineoplasticdrugs)》(w.b.saunders，费城，1995年)，例如13页。紫杉烷类，紫杉醇和多烯紫杉醇，两者是来源于紫杉的抗癌药物。多烯紫杉醇(rhone-poulencrorer)，来源于欧洲紫杉，是紫杉醇(bristol-myerssquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多烯紫杉醇促进来自微管蛋白二聚体的微管的组装并且通过防止解聚使微管稳定化，从而抑制细胞中的有丝分裂。

“突变smo拮抗剂”是抑制smo的生物活性的化合物，所述smo在与人smo的氨基酸529相对应的氨基酸位置处具有氨基酸取代，将在此位置的野生型氨基酸改变为任何其它氨基酸。在一些实施例中，smo的生物活性是在用刺猬刺激以激活gli转录因子时转导信号的能力。

本文中所使用的术语“刺猬途径抑制剂”意指能够抑制细胞中的刺猬信号传导的药剂。在具体实施例中，刺猬拮抗剂能够抑制表达本文中所描述的任何突变smo蛋白的细胞中的刺猬信号传导。在一些实施例中，刺猬途径抑制剂能够抑制表达平滑化多肽的细胞中的刺猬信号传导，包括在与seqidno:1的529相对应的一个或多个氨基酸处的突变(例如，与在野生型人smo中的对应位置)。在一些实施例中，刺猬途径抑制剂能够抑制表达包括g529s突变的平滑化多肽的细胞中的刺猬信号传导。

i.核酸类

本公开的核酸包括经分离的突变smo编码序列。在一些实施例中，核酸编码部分地或完全地耐受维莫德吉的突变smo蛋白。在一些实施例中，核酸编码在细胞中部分地或完全地耐受维莫德吉的突变smo蛋白，所述细胞具有在编码信号传导途径中蛋白的基因中的另外的突变。在一些实施例中，另外的突变是本文中所描述的任何补丁和/或sufu突变。

在一些实施例中，本公开提供一种编码突变smo蛋白的分离核酸分子，其中蛋白的所述氨基酸序列在与野生型smo蛋白氨基酸序列的位置529相对应的氨基酸位置处包括除甘氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，核酸包括与seqidno:3的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致，并且含有至少一个突变的序列，使得所述核苷酸对在与seqidno:1的氨基酸位置529相对应的氨基酸位置处包括除甘氨酸(g)外的氨基酸的smo多肽进行编码。在一些实施例中，核酸对在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处的丝氨酸(s)进行编码。在一些实施例中，核酸在与seqidno:3的核苷酸位置1585、1586和/或1587相对应的核苷酸位置处具有来自亲代野生型smo的至少一个突变。在一些实施例中，与seqidno:3的相同性百分比为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，条件是在与seqidno:3的位置1585、1586和/或1587相对应的核苷酸位置处存在至少一个突变。

在一些实施例中，本公开提供一种编码突变smo蛋白的分离核酸分子；其中所述蛋白的氨基酸序列在与野生型smo氨基酸序列的位置529相对应的氨基酸位置处包括除甘氨酸外的氨基酸，并且其中所述氨基酸序列还在与野生型smo氨基酸序列的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任何一个或多个氨基酸位置处包括至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，核酸分子包括与seqidno:3的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致，并且含有至少一个突变的序列，使得所述核酸对在与seqidno:1的核苷酸位置529相对应的氨基酸位置处包括除甘氨酸(g)外的氨基酸的smo多肽进行编码，并且其中所述多肽还包括在与seqidno:1的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任何一个或多个氨基酸位置处具有至少一个突变的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸分子包括与seqidno:3的核酸序列至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的序列，核酸对在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处的丝氨酸(s)进行编码，所述核酸对具有任何一个或多个下列取代的多肽进行编码：t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e518a、s533n和/或w535l。本公开也预期在长度为至少20个核苷酸的片段中跨越上述突变的区域的这种核酸的片段。在一些实施例中，核苷酸片段具有25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸的长度。这些片段可具有跨越上述突变的区域直至编码核酸分子的全长突变smo的任意长度。经分离的smo和其片段可用于例如杂交，以形成用于本公开的预诊和诊断测定的引物和探针，并且用于在重组系统中的表达(例如，用以产生用作免疫原并用于本公开的测定的突变smo蛋白或其部分，如在本文中所描述)。

本公开提供可用于在本公开的方法中鉴定突变smo核酸分子的核酸探针。可利用用于突变smo的特异性探针，通过标准步骤(如在sambrook等人，《分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)》冷泉港实验室出版社，纽约，1989年)中所描述的)对来源于疑似具有突变smo的组织或来源于其中smo的状态是未知的组织的核酸样本进行筛选。可替代地，可以从组织中将编码smo的核酸进行扩增并且利用本公开的特异性探针进行探测，以确定突变smo的存在或不存在。pcr方法在本技术领域中是公知的(sambrook等人，同上；dseffenbach等人，《pcr引物：实验室手册(pcrprimer:alaboratorymanual)》，冷泉港实验室出版社，纽约，1995年)。

编码突变smo的核苷酸序列(或它们的补体)具有在分子生物学领域中具有各种应用，包括作为杂交探针，和用于反义rna和dna探针的产生。突变smo编码的核酸也将可用于利用本文中所描述的重组技术，来制备突变smo多肽，其中这些突变smo多肽可用于例如抗突变smo抗体的制备，如在本文中所描述。

全长突变smo核酸或其各部分可作用鉴定突变smo的杂交探针。

任选地，探针的长度将为约20至约50个碱基。杂交探针可从全长突变smo核苷酸序列的至少突变区中得到。

举例来说，筛选方法将包括利用已知的dna序列来分离突变smo的编码区，以便合成约40个碱基的所选择探针。杂交探针可利用多种标记来进行标记，包括放射性核苷酸(如³²p或³⁵s)，或者酶标记(如经由抗生物素蛋白/生物素偶联系统偶联到探针的碱性磷酸酶)。具有与本公开的突变smo基因的序列互补的序列的标记探针可用于筛选人cda、基因组dna或mrna的文库，用以确定探针与上述文库的哪个成员杂交。可在聚丙烯酰胺凝胶中对杂交产物进行拆分。另外，可利用在实例中所描述的方法平来确定smo突变。sambrook等人(同上)提供了杂交条件(包括中等严格性和高严格性)。

可将在上述文库筛选方法中鉴定的序列与smo和突变smo的已知序列进行比较和比对。在第七跨膜域处的序列一致性可利用在本领域中已知的方法确定。

smo编码核酸的其它有用片段包括反义或正义寡核苷酸，包括能够与靶突变smomrna(正义)或突变smodna(反义)序列结合的单链核酸序列(rna或者dna)。根据本公开，反义或正义寡核苷酸包括含有突变区的突变smodna的编码区的片段。这种片段通常包括至少约14个核苷酸，并且在一些实施例中包括约14至30个核苷酸。基于编码给定蛋白质的cdna序列而获得反义或正义寡核苷酸的能力描述于，例如stein和cohen(1988年)《癌症研究(cancerres.)》48:2659和vanderkrol等人(1988年)《生物技术(biotechniques)》6:958。

在一些实施例中，本公开提供能够抑制本文中所描述的任何smo核酸的表达的核酸。反义或正义寡核苷酸与靶核酸序列的结合导致双链体的形成，所述双链体利用若干方法之一(包括增强双链体的降解、转录或翻译的提前终止)或利用其它方法阻止靶序列的转录或翻译。本公开包括这些方法。因此，反义寡核苷酸可用于阻止突变smo蛋白的表达，其中这些突变smo蛋白可在哺乳动物的癌症对化疗药(如gdc-0449)的耐药性中发挥作用。反义或正义寡核苷酸还包括具有经修饰的糖磷酸二酯主链(或其它糖键，如在wo91/06629中所描述)，并且其中这种糖键对内源性核酸酶具有抗性的寡核苷酸。这种具有抗性糖键的寡核苷酸在体内是稳定的(即，能够阻止酶解)但保持序列特异性，从而能够与靶核苷酸序列结合。

可用于抑制突变smo蛋白的表达的反义化合物的具体例子包括含有经修饰主链或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有经修饰主链的寡核苷酸包括在主链中保持磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。为了本说明书的目的，并且有时在在本领域中所引用，在它们的核苷间主链中不具有磷原子的经修饰寡核苷酸也可以被认为是寡聚核苷酸。在一些实施例中，经修饰的寡核苷酸主链包括，例如硫代磷酸酯类、手性硫代磷酸酯类、二硫代磷酸酯类、磷酸三酯类、氨基烷基磷酸三酯类、膦酸甲基和其它烷基酯(包括3'-亚烷基膦酸酯类、5'-亚烷基膦酸酯类以及手性膦酸酯类)、次膦酸酯类、磷酰胺酯类(包括3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯类、硫代磷酰胺酯类、硫代烷基膦酸酯类、硫代烷基磷酸三酯类、具有正常的3'-5'键的硒代磷酸酯类和硼烷磷酸酯类、这些的2'-5'键合类似物以及其中一个或多个核苷酸间键是3'到3'、5'到5'或2'到2'键的具有反极性的那些。在一些实施例中，具有反极性的寡核苷酸包括3'-核苷酸间键处的单个3'到3'键，即，可以是无碱性的单个倒置核苷残基(所述核碱基是不存在的或在其位置处具有羟基)。也包括各种盐类、混合盐和游离酸形态。教示含磷键的形成的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050号，其各自通过引用并入本文。

在一些实施例中，核酸包括经修饰的核苷酸或经修饰的寡核苷酸主链。在一些实施例中，在其中不包括磷原子的经修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷酸间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间键而形成的主链。这些包括具有吗啉基键的主链(部分地由核苷糖部所形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；核糖乙酰基主链；含亚烷基的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及其它具有混合的n、o、s和ch2成分的主链。教示这种寡聚核苷酸的制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第5,034,506；5,166,315；5,185,444：5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；5,792,608；5,646,269和5,677,439号，其各自通过引用并入本文。

在反义寡核苷酸的一些实施例中，苷酸单元的糖和核苷酸间键两者(即主链)被新型基团所取代。这些碱基单元被保持用于与适当的核酸靶化合物进行杂交。已显示具有优异杂交特性的一个这种寡聚合化合物(寡核苷酸模拟物)被称为肽核酸(pna)。在pna化合物中，寡核苷酸的糖主链被含有酰胺的主链(具体地氨基乙基甘氨酸主链)所取代。核碱基被保持并且直接地或间直接地结合到主链的酰胺部的氮杂氮原子。教示pna化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第5,539,082；5,714,331；和5,719,262号，其各自通过引用并入本文。对pna化合物的进一步教示可以参见nielsen等人(1991年)《科学(science)》254:1497-1500。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含硫代磷酸酯主链和/或杂原子主链，具体地是在上面所提到美国专利第5,489,677中所描述的-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或mmi主链)、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-(其中将天然磷酸二酯主链表示为-o-p-o-ch2-)以及在上面所提到美国专利第5,602,240号的酰胺主链。在一些实施例中，反义寡核苷酸具有上面所提到美国专利第5,034,506号的吗啉基主链结构。

经修饰的寡核苷酸也可含有一个或多个取代糖部分。在一些实施例中，寡核苷酸在2'位置包括下列中的一个：oh；f；o-烷基、s-烷基或n-烷基；o-烯基、s-烯基或n-烯基；o-炔基、s-炔基或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。在一些实施例中，寡核苷酸是o[(ch2)no]mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2以及o(ch2)non[(ch2)nch3)]2，其中n和m为1至约10。在一些实施例中，反义寡核苷酸在2'位置包括下列中的一个：c1至c10的低级烷基、取代低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代甲硅烷基、rna裂解基、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改善寡核苷酸的药效学特性的基团以及具有类似性质的其它取代基。在一些实施例中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-o-ch2ch2och3，也被称为2'-o-(2-甲氧基乙基)或2'-moe)(martin等人(1995年)《瑞士化学学报(helv.chim.acta)》78:486-504)，即烷氧基烷氧基。在一些实施例中，修饰包括2'-二甲基氨基氧乙氧基，即o(ch2)2on(ch)2基，也被称为2'-dmaeoe，如下文中的实例中所描述，以及2'-二甲氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也被称为2'-o-二甲氨基乙氧基乙基或2'-dmaeoe)，即2'-o-ch2-o-ch2-n(ch2)。

在一些实施例中，修饰包括被锁核酸(lna)，其中2'-羟基连接到糖环的3'或4'碳原子，由此形成双环糖部分。在一些实施例中，键是桥接2'氧原子与4'碳原子的亚甲基(-ch2-)n基，其中n为1或2。lna和其制备描述于wo98/39352和wo99/14226中。

在一些实施例中，修饰包括2'-甲氧基(2'-o-ch3)、2'-氨基丙氧基(2'-och2ch2ch2nh2)、2'-烯丙基(2'-ch2-ch＝ch2)、2'-o-烯丙基(2'-o-ch2-ch＝ch2)以及2'-氟(2'-f)。2'-修饰可处在阿拉伯糖基(上)位置或核糖基(下)位置。在一些实施例中，2'-阿拉伯糖基修饰是2'-f。也可在寡核苷酸上的其它位置完成类似的修饰，尤其是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置，或者在2'-5'连接寡核苷酸中，以及5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸也可具有糖模拟物(如环丁基部分)代替戊呋喃糖基糖。教示这种经修饰糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；5,792,747；和5,700,920号，其各自通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，寡核苷酸也可包括核碱基(在本领域中常常简称为“碱基”)修饰或取代。本文中所使用的“未经修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。经修饰的核碱基包括其它合成和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-c＝c-ch3或-ch2-c＝ch)尿嘧啶和胞嘧啶及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代腺嘌呤类和鸟嘌呤类、5-卤代(尤其是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代尿嘧啶类和胞嘧啶类)、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶类如吩噁嗪胞苷(1h-嘧啶并[5,4-b][l,4]苯并噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3h)-酮)、g-夹钳如取代吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。经修饰的核碱基也可包括其中将嘌呤或嘧啶碱基用其它杂环(例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶以及2-吡啶酮)进行取代的核碱基。其它的核碱基包括在美国专利第3,687,808号中所公开的那些、在《聚合物科学与工程简明百科全书(theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering)》kroschwitz，j.i.编著，johnwiley&sons，1990年，858-859页中所公开的那些，以及在englisch等人，《应用化学(angewandtechemie)》，国际版，wiley-vch，德国，1991年，30:613中公开的那些。这些核碱基中的某些尤其可用于提高本公开的寡聚体化合物的结合亲和力。这些包括5-取代嘧啶类、6-氮杂嘧啶类及n-2、n-6和o-6取代嘌呤类，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代提高核酸双链体的稳定性达0.6至1.2℃(sanghvi等人，《反义研究和应用(antisenseresearchandapplications)》，crc出版社，伯克莱屯市，1993，276-278页)并且是可能的碱基取代，甚至更特别地当与2'-o-甲氧基乙基糖修饰结合时。教示经修饰核碱基的制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第3,687,808，以及美国专利4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,645,985；5,830,653；5,763,588；6,005,096；5,681,941和5,750,692号。其各自通过引用并入本文。

另一个反义寡核苷酸的修饰涉及化学地连接到寡核苷酸的一个或多个部分或偶联物，其增强寡核苷酸的活性、细胞内分布或细胞摄取。本公开的化合物可以包括共价结合到官能团的缀合基，如伯或仲羟基。本公开的缀合基包括嵌入剂、报道分子、多胺类、聚酰胺类、聚乙二醇类、聚醚类、增强寡聚体的药效学性质的基团以及增强寡聚体的药代动力学性质的基团。典型的缀合基包括胆固醇类、脂类、阳离子脂质、磷酸脂类、阳离子磷酸脂类、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素类、罗丹明、香豆素以及染料。在本公开的上下文中，增强药效学性质的基团包括改善寡聚体摄取、增强寡聚体对降解的抗性和/或加强与rna的序列特异性杂交的基团。在本公开的上下文中，增强药代动力学性质的基团包括改善寡聚体摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合部分包括但不限于：脂质部分，如胆固醇部分(letsinger等人(1989年)《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》86:6553-6556)、胆酸(manoharan等人(1994年)《生物有机化学与医药化学通讯(bioorg.medchem.lett.)》4:1053-1060)、硫醚，例如己基-s-三苯甲基硫(manoharan等人(1992年)《纽约科学院年刊(ann.n.y.acad.sci)》660:306-309；manoharan等人(1993年)《生物有机化学与医药化学通讯(bioorg.medchem.lett.)》3:2765-2770)、巯基胆固醇(oberhauser等人(1992年)《核酸研究(nucl.acidsres.)》20:533-538、脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(saison-behmoaras等人(1991年)《欧洲分子生物学学会杂志(emboj.)》10:1111-1118；kabanov等人(1990年)《欧洲生化学会联合会快报(febslett.)》259:327-330：svinarchuk等人(1993年)《生物化学(biochimie)》75:49-54)、磷酸脂质，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙铵、2-二-o-十六烷基-rac-甘油-3-h-膦酸酯(manoharan等人(1995年)《四面体通讯(tetrahedronlett.)》36:3651-3654；shea等人(1990年)《核酸研究(nucl.acidsres.)》18:3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(manoharan等人(1995年)《核苷与核苷酸(nucleosides&nucleotides)》14:969-973)或金刚烷乙酸(manoharan等人(1995年)《四面体通讯(tetrahedronlett.)》36:3651-3654)、棕榈基部分(mishra等人(1995年)《生物化学与生物物理学报(biochim.biophys.acta)》1264:229-237)或者十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。本公开的寡核苷酸也可与活性药物缀合，例如阿司匹林、华法令、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮基布洛芬、(s)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。寡核苷酸-药物缀合物和它们的制备描述于美国专利第4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591，584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,12,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,688,941和6,656,730号，其各自通过引用并入本文。

给定化合物中的所有位置不必均匀地修饰，实际上多于一个的前述修饰可并入单个化合物中或者甚至在在寡核苷酸内部的单个核苷中。本公开也包括是嵌合化合物的反义化合物。在本公开的上下文中，“嵌合”反义化合物或“嵌合体”是反义化合物，具体地为含有两个或更多个化学性质不同的区域的寡核苷酸，在寡核苷酸化合物的情况下，各自是由至少一个单体单元(即核苷酸)所组成。这些寡核苷酸通常含有至少一个区域，其中对寡核苷酸进行修饰从而赋予寡核苷酸对核酸酶降解的增强抗性、增强的细胞摄取和/或增强的与靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的另一个区域可用作能够裂解rna:dna或rna:rna杂交的酶类的底物。举例来说，核糖核酸酶h是裂解rna:dna双链体的rna链的胞内核酸酶。因此，核糖核酸酶h的活化导致rna靶的裂解，由此大幅地提高寡核苷酸抑制基因表达的效率。因此，与杂交到相同靶区的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸相比，当使用嵌合寡核苷酸时，可以经常获得与较短寡核苷酸类似的结果。本公开的嵌合反义化合物可形成为两个或更多个寡核苷酸、经修饰的寡核苷酸、寡聚核苷酸和/或寡核苷酸模拟物的复合结构，如上所述。在一些实施例中，嵌合反义寡核苷酸包含在3'末端处的至少一个2'修饰糖(例如，2'-o-(ch2)2-o-ch3)，以赋予核酸酶抗性，并且包含具有至少4个相邻的2'-h糖的区域，以赋予核糖核酸酶h活性。在本领域中这种化合物也被称为杂交或gapmer。在一些实施例中，gapmer具有在3'-末端的2'修饰糖(例如，2'-o-(ch2)2-o-ch3)的区域，并且在5'末端被至少一个具有至少4个相邻的2'-h糖类的区域隔开，并且在一些实施例中，包含硫代磷酸酯主链键。教示这种杂交结构的形成的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356；和5,700,922号，其各自通过引用整体并入本文。

根据本公开所使用的反义化合物可方便地且常规地利用固相合成的公知技术而制备。用于这种合成的设备是由数个供应商销售，包括例如appliedbiosystems(加尼福尼亚州福斯特城)。另外地或可替代地，可采用本领域已知的用于这种合成的任何其它方法。公知的是采用类似的技术来制备寡核苷酸，如硫代磷酸酯类和烷基化衍生物。也可将本公开的化合物与其它分子、分子结构或化合物的混合物进行掺合、包封、缔合或结合，例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部用或其它制剂，用以帮助摄取、分布和/或吸收。教示这种摄取、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性美国专利包括但不限于：美国专利第5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,97；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756号，其各自通过引用并入本文。

正义或反义寡核苷酸的其它例子包括共价地连接到有机部分(例如在wo90/10048中所描述)和增加寡核苷酸与靶核酸序列的亲和力的其它部分(如聚(l-赖氨酸))的寡核苷酸。另外，可将插入药剂(如玫瑰树碱)和烷化剂或金属络合物附接到正义或反义寡核苷酸，用以调节反义或正义寡核苷酸与靶核苷酸序列的结合特异性。

可利用任何基因转移方法将反义或正义寡核苷酸导入含有靶核酸序列的细胞中，包括例如capo4-介导的dna转染、电穿孔或者通过利用基因转移载体(如epstein-barr病毒)。在一个实施例中，将反义或正义寡核苷酸插入合适的反转录病毒载体中。在体内或者离体，使含有靶核酸序列的细胞与重组反转录病毒载体接触。合适的反转录病毒载体包括但不限于：来源于鼠反转录病毒m-mulv的载体、n2(来源于m-mulv的反转录病毒)或被命名为dct5a、dct5b以及dct5c的双拷贝载体(参见wo90/13641)。

也可通过与配体结合分子形成缀合物而将正义或反义寡核苷酸导入含有靶核苷酸序列的细胞，如在wo91/04753中所描述。合适的配体结合分子包括但不限于：细胞表面受体、生长因子、其它细胞因子或者与细胞表面受体结合的其它配体。在一些实施例中，配体结合分子的缀合并不显著地干扰配体结合分子结合到其对应的分子或受体的能力，或者阻止正义或反义寡核苷酸或其缀合形式进入细胞中。

可替代地，通过形成寡核苷酸-脂质络合物可将正义或反义寡核苷酸导入含有靶核酸序列的细胞中，如在wo90/10448中所描述。在一些实施例中，在细胞内部利用内源性脂肪酶使正义或反义寡核苷酸-脂质络合物解离。

反义或正义rna或dna分子通常具有至少约5个核苷酸的长度，可替代地具有至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165,170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990或1000个核苷酸的长度，其中在本上下文中，术语“约”表示所引用的核苷酸序列长度是参考长度的+或-10％。

编码突变smo的核苷酸序列也可用于制作杂交探针，杂交探针是用于映射编码所述smo的基因，并且用于具有遗传性疾病的个体的基因分析。可利用已知的技术(如原位杂交、针对已知染色体标志的连锁分析和使用文库的杂交筛选)，将本文中所提供的核苷酸序列映射到染色体和染色体的特定区域。

潜在的突变smo拮抗剂是利用反义技术所制备的反义rna或dna结构，其中例如反义rna或dna分子的作用是通过杂交到靶向mrna并阻止蛋白质翻译而直接地阻止rna的翻译。反义技术可以用于通过三股螺旋形成或者反义dna或rna而控制基因表达，这两种方法是基于多核苷酸与dna或rna的结合。例如，在本文中编码突变smo蛋白的核酸是用于设计长度为约10至40个碱基对的反义rna寡核苷酸。dna寡核苷酸被设计成与参与转录的基因的区(三股螺旋)是互补的。参见lee等人(1979年)《核酸研究(nucl.acidsres.)》6:3073；cooney等人(1988年)《科学(science)》241:456；dervan等人(1991年)《科学(science)》251:1360)，由此防止突变smo的转录和产生。反义rna寡核苷酸在体内杂交到mrna并且阻止mrna分子翻译到突变smo中(okano(1991年)《神经化学(neurochem.)》56:560)；《寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂(oligodeoxynucleotidesasantisenseinhibitorsofgeneexpression)》crc出版社，伯克莱屯市，佛罗里达州，1988年)。也可以将上述寡核苷酸传递至细胞，以便可体内表达反义rna或dna从而抑制突变smo的产生。在一些实施例中，当使用反义dna时，可使用来源于例如在靶基因核苷酸序列的约-10和+10位置之间的翻译起始位点的寡脱氧核糖核苷。

任何核酸可适用于表达突变smo蛋白和鉴定天然靶或用于所表达的突变平滑蛋白的结合配偶体(例如，相对于野生型平滑蛋白(如野生型人smo)具有g529s突变的平滑蛋白)。核酸也可用于研究突变平滑蛋白的生物活性，以便从各种细胞和组织中纯化突变平滑蛋白和其结合配偶体，并鉴定刺猬信号传导途径的其它成分。

ii.小分子

潜在的突变smo拮抗剂包括小分子，所述小分子结合到在野生型smo中被gdc-0449所占据的位点，由此阻断突变smo的生物活性；小分子的例子包括但不限于：小肽类或类似肽的分子，例如可溶性肽类以及合成非肽有机或无机化合物。

核糖酶是能够催化rna的特定裂解的酶rna分子。核糖酶通过序列特异性杂交到互补的靶rna，接着进行内切核苷酸裂解而发挥其作用。在潜在的rna靶中的特定的核糖酶裂解位点可通过已知的技术而确定。为获得进一步的细节，可参见例如rossi(1994年)《现代生物学(currentbiology)》4:469-471和pct公开第wo97/33551号(于1997年9月18日公布)。

在三股螺旋形成中用于抑制转录的核酸分子应当是单链的并且是由脱氧核苷酸构成。这些寡核苷酸的碱基组成被设计成使得它利用hoogsteen碱基配对法来促进三股螺旋形成，这通常要求在双链体的一个链上的嘌呤类或嘧啶类的相当大的延伸。为获得更多的细节内容，可参见例如pct公开第wo97/33551号，同上。

这些小分子可利用上文中所描述的筛选测定中的任何一个或多个和/或利用对于本领域技术人员所熟知的任何其它筛选技术而加以鉴定。

iii.蛋白质

本公开提供经分离的突变smo蛋白。在seqidno:1中示出了野生型人smo。在一些实施例中，突变smo蛋白部分地或完全地耐受维莫德吉。在一些实施例中，突变smo蛋白在细胞中部分地或完全地耐受维莫德吉，所述细胞具有在编码信号传导途径中蛋白的基因中的另外的突变。在一些实施例中，另外的突变是本文中所描述的任何补丁和/或sufu突变。

在一些实施例中，本公开提供一种包括氨基酸序列的分离突变smo蛋白，其中所述氨基酸序列在与野生型smo氨基酸序列的位置529相对应的氨基酸位置处包括除甘氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，smo蛋白包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置529处存在取代，在一些实施例中，smo蛋白包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处包括除甘氨酸(g)外的氨基酸。在一些实施例中，所述smo蛋白包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，条件是所述smo蛋白在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处包括丝氨酸(s)。

在一些实施例中，本公开提供一种包括氨基酸序列的分离突变smo蛋白，其中所述蛋白的氨基酸序列在与野生型smo蛋白氨基酸序列的位置529相对应的氨基酸位置处包括除甘氨酸外的氨基酸，并且其中氨基酸序列还在与野生型smo氨基酸序列的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任何一个或多个氨基酸位置处的至少一个氨基酸取代。在一些实施例中，smo蛋白包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置529处存在取代，并且其中所述蛋白还在与seqidno:1的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任何一个或多个氨基酸位置处包括至少一个另外的突变。在一些实施例中，smo蛋白包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处包括除甘氨酸(g)外的氨基酸，并且其中所述氨基酸序列还包括下列取代中的任意一个或多个：t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e518a、s533n和/或w535l。在一些实施例中，smo蛋白包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处包括丝氨酸(s)，并且其中所述氨基酸序列还包括下列取代中的任意一个或多个：t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e518a、s533n和/或w535l。在各具体实施例中，本公开提供包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的smo蛋白，条件是所述氨基酸序列包括除甘氨酸(g)外的氨基酸，例如在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处的丝氨酸(s)，并且其中所述氨基酸序列还在与seqidno:1的位置321相对应的氨基酸位置处包括除缬氨酸(v)外的氨基酸(例如甲硫氨酸(m))。

在一些实施例中，在seqidno:2中示出了突变人smo蛋白，其中将氨基酸529表示为“xaa”，其在本申请中代表除甘氨酸(g)外的任何氨基酸。在一些实施例中，xaa是丝氨酸(s)。

在一些实施例中，任何的突变smo蛋白缺乏与seqidno:1或2任一个的位置1相对应的n末端甲硫氨酸。

突变smo蛋白和其片段可使用在本文中所描述的突变smo核酸在重组系统中以本领域公知的方法而产生。可用本领域公知的方法将这种核酸合并入表达载体并且转染入宿主细胞中，基于所述蛋白的建议用途宿主细胞可以是原核或真核细胞。例如，可将突变smo蛋白的全长或片段(其中这些片段含有至少smo的第七跨膜域和人smo的位置529)用作免疫原来产生本公开的抗体或纯化本公开的抗体。

在一些实施例中，smo蛋白或其片段具有野生型smo多肽(例如，具有seqidno:1的氨基酸序列的smo蛋白)的的至少一个相同生物活性。在一些实施例中，突变smo蛋白(例如，在与seqidno:1的氨基酸529相对应的氨基酸位置处具有突变的smo蛋白)具有与野生型smo蛋白(例如，具有seqidno:1的氨基酸序列的smo蛋白)相比增强的基础生物活性。术语“生物活性(biologicalactivity)”、“生物活性(bioactivity)”或“功能性”表示smo蛋白或其片段执行与野生型smo蛋白相关的至少一个功能的能力，例如转导刺猬信号传导途径和/或诱导gli1表达。在某些实施例中，smo蛋白与马达驱动蛋白costal-2结合。在本文中，术语“生物活性biologicalactivity)”、“生物活性(bioactivity)”和“功能性”可互换地使用。

在一些实施例中，任何smo蛋白(例如，本文中所描述的任何突变smo蛋白)能够转导刺猬信号传导。术语“有能力”或“能够”表示所引述的蛋白在合适的条件(例如，生理条件或者标准实验室条件)下将执行所陈述的生物活性。在某些实施例中，术语“可以”可用于描述此能力(例如，“可以结合”或“结合”到给定的序列)。例如，如果smo蛋白(例如，本文中所描述的任何突变smo蛋白)有能力或者能够促成刺猬信号传导，则在正常生理条件下，所述smo蛋白能够促成在细胞中的刺猬信号传导。本领域普通技术人员将会理解测试多肽是否有能力或能够执行所列举的生物活性需要什么条件。

在一些实施例中，本文中所描述的smo蛋白和突变smo蛋白包括平滑化功能获得性突变。在一些实施例中，功能获得性平滑化突变导致具有组成性活性的平滑蛋白。在某些实施例中，平滑蛋白中的突变包括任何特定位置(如在与seqidno:1中的特定位置相对应的位置)处的突变，如上面关于筛选测定所陈述。参见例如wo2011/028950；wo2012047968和wo2015/120075，其各自通过引用并入本文。在某些实施例中，突变是在与seqidno:1的位置529相对应位置处的突变。在一些实施例中，平滑化突变具有使它耐受某些平滑化抑制剂的突变。

在一些实施例中，本文中所描述的任何smo蛋白(例如，本文中所描述的任何突变smo蛋白)融合到另一种药剂。在一些实施例中，smo蛋白融合到另一个多肽。

本文中所描述的任何突变smo蛋白适用于鉴定天然的靶或突变smo蛋白的结合配偶体(例如，单独地或者连同t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、1.518k、e518a、s533n和/或w535l中的任何一个或多个而具有g529s突变的平滑蛋白)。突变smo蛋白也可用于研究突变平滑化生物活性，从各种细胞和组织中纯化突变平滑蛋白和其结合配偶体，以及鉴定刺猬信号传导途径的其它成分。

iv.抗体

a.抗突变smo抗体

在一个方面，本公开提供与smo尤其是突变smo结合的抗体。在一些实施例中，本文中所公开的任何抗体特异性地与本文中所描述的任何突变smo多肽结合。例如，突变smo多肽包括特异性地被本公开的抗体结合的表位。在一些实施例中，抗体特异性地与包括和seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列的smo蛋白结合，条件是在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处存在突变。在一些实施例中，抗体并不与具有seqidno:1的氨基酸序列特异性地结合，或者与具有seqidno:1的氨基酸序列的smo蛋白相比优先地结合突变smo蛋白(例如，对于突变smo蛋白，结合是选择性的)。在一些实施例中，抗体并不与在与seqidno:1的位置529相对应的任一氨基酸位置处缺乏突变的smo蛋白相结合。

在一个实施例中，抗smo抗体是单克隆抗体。在一个实施例中，抗smo抗体是抗体片段，例如fab、fab'-sh、fv、scfv或(fab')2片段。在一个实施例中，抗突变smo蛋白抗体是嵌合的、人源化的或人抗体。在一个实施例中，抗smo蛋白抗体是经纯化的。在某些实施例中，组合物是用于癌症治疗的药物制剂。

1.抗体片段

本公开包括抗体片段。抗体片段可通过传统的方法(如酶消化)或者通过重组技术而产生。在某些情况情况下，使用抗体片段比使用整个抗体有利。较小尺寸的片段允许快速清除，并且可使对实体肿瘤接近得到改善。对于某些抗体片段的综述，参见hudson等人(2003年)《自然医学(nat.med)》9:129-134。

已开发出各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化而得到(参见例如morimoto等人，《生物化学和生物物理方法杂志(journalofbiochemicalandbiophysicalmethods)》24:107-117(1992)；和brennan等人《科学(science)》，229:81(1985))。然而，这些片段现在可以直接地由重组宿主细胞产生。fab、fv以及scfv抗体片段均可在大肠杆菌中被表达并且从大肠杆菌中分泌，因此能够容易地生产大量的这些片段。可将抗体片段从上述抗体噬菌体文库中分离。可替代地，fab'-sh片段可从大肠杆菌直接地回收并且进行化学偶联而形成f(ab')2片段(carter等人，《生物技术(bio/technology)》10:163-167(1992))。根据另一个方法，f(ab')2片段可直接地从重组宿主细胞培养物中分离。在美国专利第5,869,046号中描述了包括挽救受体结合表位残基的具有延长的体内半衰期的fab和f(ab')2片段。抗体片段的其它生产技术对于本领域技术人员将是显而易见的。在某些实施例中，抗体是单链fv片段(scfv)。参见wo93/16185；美国专利第5,571,894号；以及5,587,458。fv和scfv是唯一具有无恒定区的完整结合位点的物种；因此，它们可适用于在体内使用期间的降低的非特异性结合。可将scfv融合蛋白制作成在scfv的氨基或者羧基末端获得效应蛋白的融合。参见《抗体工程学(antibodyengineering)》borrebaeck编著，同上。例如，抗体片段也可以是“线性抗体”，例如在美国专利第5,641,870号中所描述。这种线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。

2.人源化抗体

本公开包括人源化抗体。用于使非人抗体人源化的各种方法在本技术领域中是已知。例如，人源化抗体可以具有从非人的来源导入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入”残基，所述残基通常取自“输入”可变域。人源化可大致按照winter和其同事的方法(jones等人(1986年)《自然(nature)》321:522-525；riechmann等人(1988年)《自然(nature)》332:323-327；verhoeyen等人(1988年)《科学(science)》239:1534-1536)，通过用高变区序列替换人抗体的对应序列来执行。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号)，其中大体上小于完整人可变域已被来自非人物种的相应的序列所替换。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高可变域残基和可能地一些fr残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基所取代。

对用于制作人源化抗体的轻和重的人可变域的选择对于降低抗原性是重要的。根据所谓的“最佳拟合”法，针对已知的人可变域序列的整个库，对啮齿动物抗体的可变域的序列进行筛选。然后，将最接近啮齿动物序列的人序列作为用人源化抗体的人骨架。参见例如sims等人(1993年)《免疫学杂志(j.immunol.)》15:2296；chothia等人(1987年)《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》196:901。另一种方法使用来源于特定亚组的轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特定骨架。相同的骨架可用于数个不同的人源化抗体。参见例如carter等人(1992年)《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》，89:4285；presta等人(1993年)《免疫学杂志(j.immunol.)》151:2623。

另外，通常理想的是在保持与抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质的情况下将抗体人源化。为了实现此目的，根据一个方法，通过对亲代序列进行分析的步骤和使用亲代和人源化序列的三维模型的各种概念性人源化产物，而制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是常用的并且对于本领域技术人员是熟悉的。可获得说明并显示所选择候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。对这些显示的检查允许对残基在候选免疫球蛋白序列运行中的可能作用进行分析，即对影响候选免疫球蛋白与其抗原结合能力的残基的分析。这样，可对fr残基进行选择并且从受体和输入序列中进行合并，以便获得期望的抗体特征(如增强的与靶抗原的亲和力)。一般而言，高可变域残基直接地且大多数大体上与影响抗原结合有关。

3.人抗体

本公开的人抗体可以通过使从人源性噬菌体展示文库中所选择的fv克隆可变域序列与如上所述的已知人恒定域序列进行结合而制作。可替代地，本公开的人单克隆抗体可利用杂交瘤法制作。用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已在例如kozbor《免疫学杂志(j.immunol.)》133:3001(1984)；brodeur等人，《单克隆抗体生产技术和应用(monoclonalantibodyproductiontechniqueandapplications)》，第51-63页(marceldekker公司，纽约，1987年)；以及boemer等人《免疫学杂志(j.immunol.)》147:86(1991)中所描述。

现在能够制作在免疫接种时能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的转基因动物(例如小鼠)库。例如，已经描述了在嵌合和胚系突变小鼠中抗体重链连接区(jh)基因的纯合性缺失导致对内源性抗体产生完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列转移到这种胚系突变小鼠中，将导致在抗原激发时产生人抗体。参见例如jakobovits等人，《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sciusa)》，90:2551(1993)；jakobovits等人，《自然(nature)》，362:255(1993)；bruggermann等人，《免疫学年鉴(yearinimmunol.)》，7:33(1993)。

基因重排也可以用于从非人(例如啮齿动物)抗体中得到人抗体，其中人抗体具有类似的针对起始非人抗体的亲和性和特异性。根据此方法，也被称为“表位印记”，将利用如本文中所描述的噬菌体展示技术所获得的非人抗体片段的重或轻链可变域用人v域基因的库进行替换，从而形成非人链/人链scfv或fab嵌合体的群体。用抗原进行选择导致非人链/人链嵌合scfv或fab的分离，其中人链恢复在初级噬菌体展示克隆中将对应的非人链去除时受到破坏的抗原结合位点，即表位决定(加印记)人链配偶体的选择。当重复所述过程以便替换剩余的非人链时，获得人抗体(参见于1993年4月1日公布的pctwo93/06213)。不同于传统的通过cdr移植的非人抗体的人源化，所述技术提供不具有非人来源的fr或cdr残基的完全人抗体。

4.双特异性抗体

双特异性抗体是具有针对至少两个不同抗原的结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，双特异性抗体是人或人源化抗体。在某些实施例中，结合特异性中的一个针对smo蛋白，而另一个针对任何其它抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可与smo的两个不同的表位结合。双特异性抗体也可用于将细胞毒性药剂定位到表达smo的细胞。这些抗体具有smo结合臂和与细胞毒性药剂(例如肥皂草素、抗干扰素-a、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白a链、氨甲蝶呤)或放射性同位素半抗原结合的臂。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如f(ab')2双特异性抗体)。

用于制作双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(milstein和cuello，《自然(nature)》，305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四价体瘤)产生10种不同抗体分子的可能混合物，其中仅一个分子具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化通常是通过亲和层析步骤来完成，相当复杂，并且产物的产生是缓慢的。在于1993年5月13日公布的wo93/08829和traunecker等人，《欧洲分子生物学学会会刊(emboj.)》，10:3655(1991)中公开了类似的步骤。

根据一个不同的方法，具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域融合到免疫球蛋白恒定区序列。所述融合，例如是与包括至少部分的铰链区、ch2、和ch3区的免疫球蛋白重链恒定区。在某些实施例中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(ch1)存在于至少一个融合中。将编码免疫球蛋白重链融合和(若需要)免疫球蛋白轻链的dna插入单独的表达载体，并且共转染入合适的宿主生物体中。在当在制作中所使用的不同比率的三个多肽链提供最佳生产的实施例中，这为调整三个多肽片段的相互比例提供较大的灵活性。然而，当采用相同比率的至少两个多肽链的表达导致高产生或当这些比率不具有特定意义时，能够将两个或全部三个多肽链的编码序列插入一个表达载体中。

在此方法的一个实施例中，双特异性抗体是由在一个臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和在另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)所构成。已经发现，此不对称结构便于期望的双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合物中分离，因为免疫球蛋白轻链仅存在于一半的双特异性分子中提供了容易的分离方式。此方法公开于wo94/04690中。为了获得产生双特异性抗体的更多的细节内容，可参见例如suresh等人《酶学方法(methodsinenzymology)》，121:210(1986)。

根据另一个方法，可对一对抗体分子之间的界面进行设计，以使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比最大化。所述界面包括抗体恒定域的至少部分ch3区。在此方法中，将来自第一抗体的界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)进行替换。通过用较小的侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)来替换大的氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上形成与大侧链具有相同或相似尺寸的补偿“腔”。这提供相对于其它不需要的终产物(如同源二聚体)提高异源二聚体的产率的机制。

双特异性抗体包括交联的或“非同性缀合”抗体。例如，非同性缀合抗体中的一个可偶联到抗生物素蛋白，另一个抗体偶联到生物素。这种抗体已经，例如被提出将免疫系统细胞靶向到不需要的细胞(美国专利第4,676,980号)、并且用于hiv感染的治疗(wo91/00360、wo92/00373以及ep03089)。非同性缀合抗体可利用任何方便的交联方法制作。合适的交联试剂在本技术领域中是公知的，并且连同一些交联技术公开于美国专利第4,676,980号。

由抗体片段产生双特异性抗体的技术也已经在文献中进行了描述。例如，可利用化学键制备双特异性抗体。brennan等人，《科学(science)》，229:81(1985)描述了其中对完整抗体进行酶解而产生f(ab')2片段的步骤。在二硫代络合剂亚砷酸钠存在下，将这些片段还原以使邻位的二硫醇还原稳定化并且防止分子间二硫键形成。然后将所产生的fab'片段转化成成硫代硝基苯甲酸酯(tnb)衍生物。然后，通过用巯基乙胺进行还原而将fab'-tnb衍生物中的一个再转化成fab'-硫醇并且与等摩尔量的另一fab'-tnb衍生物加以混合，从而形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作酶类的选择性固定化的试剂。

最近的进展已促进了从大肠杆菌中直接回收fab'-sh片段，可使所述片段化学偶联而形成双特异性抗体。shalaby等人，《实验医学杂志(j.exp.med)》，175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异性抗体f(ab')2分子的生产。各fab'片段是单独地从大肠杆菌中分泌并且在体外经历受引导的化学偶联而形成双特异性抗体。如此，所形成的双特异性抗体能够与过度表达her2受体的细胞和正常人t细胞结合，并且引发人细胞毒淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。

也已经描述了用于直接从重组细胞培养物中制作并分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体，kostelny等人，《免疫学杂志(j.immunol.)》，148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自fos蛋白和jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接到的两个不同抗体的fab'部。将抗体同源二聚体在铰链区还原而形成单体，然后再氧化而形成抗体异源二聚体。此方法也可以用于抗体同源二聚体的生产。由hollinger等人，《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.set.usa)》，90:6444-6448(1993)所描述的“双抗体”技术已提供用于制作双特异性抗体片段的替代机制。这些片段包括连接肽连接到轻链可变域(vl)的重链可变域(vh)，所述连接肽过短而不允许在相同链上的两个域之间进行配对。因此，使得一个片段的vh和vl域与一个片段的互补的vl和vh域配对，由此形成两个抗原结合位点。也已经描述了通过使用单链fv(sfv)二聚体制作双特异性抗体片段的另一个策略。参见gruber等人，《免疫学杂志(j.immunol.)》，152:5368(1994)。

具有大于两个的效价的抗体是可想到的。例如，可以制备三特异性抗体。tutt等人《免疫学杂志(j.immunol.)》147:60(1991)。

5.多价抗体

可利用表达抗体所结合的抗原的细胞，比二价抗体更快地使多价抗体内化(和/或异化)。本公开的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)(它们不属于igm类)，这些抗体可通过编码抗体的多肽链的核酸重组表达而容易地产生。多价抗体可以包括二聚化域及三个或更多个抗原结合位点。在某些实施例中，二聚化域包括(或者由其组成)fc区或铰链区。在这种情况下，抗体将包括fc区和氨基末端与fc区的三个或更多个抗原结合位点。在某些实施例中，多价抗体包括(或由其组成)三个至约八个抗原结合位点。在一个这种实施例中，多价抗体包括(或由其组成)四个抗原结合位点。多价抗体包括至少一个多肽链(例如，两条多肽链)，其中所述多肽链包括两个或更多的可变域。例如，多肽链可包括vd1-(x1)n-vd2-(x2)n-fc，其中vd1是第一可变域，vd2是第二可变域，fc是fc区的一个多肽链，x1和x2代表氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，多肽链可包括：vh-ch1-柔性连接肽-vh-ch1-fc区链；或者vh-ch1-vh-ch1-fc区链。本文中的多价抗体还可包括至少两个(例如，四个)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可，例如包括从约二个至约八个轻链可变域多肽。这里所预期的轻链可变域多肽包括轻链可变域，并且任选地还包括cl结构域。

6.单域抗体

在一些实施例中，本公开的抗体是单域抗体。单域抗体是包括抗体的所有或一部分的重链可变域或者所有或一部分的的轻链可变域的单多肽链。在某些实施例中，单域抗体是人单域抗体(domantis有限公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆市；参见例如美国专利第6,248,516b1号)。在一个实施例中，单域抗体是由抗体的全部或一部分的重链可变域所组成。

7.抗体变体

在一些实施例中，预期本文中所描述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，会期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特征。通过将适当的变化导入编码抗体的核苷酸序列或者通过肽合成，可制备抗体的氨基酸序列变体。这种修饰包括，例如抗体氨基酸序列内部的残基的缺失和/或插入和/或取代。可执行缺失、插入以及取代的任意组合从而获得最终结构，条件是所述最终结构具备期望的特征。在制作序列时，可将氨基酸改变导入受试对象抗体氨基酸序列中。

用于鉴定是突变的可能位置的抗体的某些残基或区的有用方法被称为“丙氨酸扫描突变法”，如由cunningham和wells(1989年)《科学(science)》，244:1081-1085中所描述。这里，对残基和靶残基组进行鉴定(例如，带电荷残基，如arg、asp、his、lys以及glu)并且用中性的或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)进行取代，从而影响氨基酸与抗原的相互作用。然后，通过在或向取代位点导入另外的或其它的变体，对显示了针对取代的功能性敏感性的这些氨基酸位置进行改进。因此，虽然对用于导入氨基酸序列变异的位点进行了预测，但无需对突变本身的性质进行预测。例如，为了分析在给定位点处的突变的性能，在靶密码子或区执行ala扫描或随机突变并且对所表达的免疫球蛋白进行筛选以便获得期望的活性。

氨基酸序列插入包括在长度范围为从一个残基到含有一百或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有n-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的n-或c-末端到酶(例如用于adept)或者增加抗体血清半衰期的多肽的融合。

在某些实施例中，改变本公开的抗体以提高或减小抗体糖基化的程度。多肽类的糖基化通常是n-连接或者o-连接。n-连接是指将糖部分附接到天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸外的任何氨基酸)是用于将糖类部分酶附接到天冬氨酸侧链的识别序列。因此，这些三肽序列在多肽中的存在形成潜在的糖基化位点。o-连接糖基化是指将将糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一个附接到羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。

抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列方便地实现，以便形成或去除上述三肽序列(用于n-连接糖基化位点)中的一个或多个。所述改变也可通过对初始抗体的序列(用于o-连接到糖基化位点)进行将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加、缺失或取代而完成。

如果抗体包括fc区，则可以改变附接到抗体的糖类。由哺乳动物细胞所产生的天然抗体通常包括通常通过n-键附接到fc区的ch2结构域的asn297的支链双触角寡糖。参见例如wright等人(1997年)tibtech15:26-32。所述寡糖可包括各种糖类，例如甘露糖、n-乙酰基葡糖胺(glcnac)、半乳糖和唾液酸以及附接到在双触角寡糖结构的“主干”中的glcnac的岩藻糖。在一些实施例中，可对本公开的抗体中的寡糖进行修饰，从而形成具有某些改善性质的抗体变体。

例如，提供具有糖类结构的抗体变体，所述糖类结构没有附接(直接地或间接地)到fc区的岩藻糖。这种变体可具有改善的adcc功能。参见例如美国专利公开第2003/0157108号(presta，l.)；美国2004/0093621(kyowahakkokogyo有限公司)。与“去岩藻糖”或“岩藻糖缺陷”抗体变体有关的专利公开的例子包括：us2003/0157108；wo2000/61739；wo2001/29246；us2003/0115614；us2002/0164328；us2004/0093621；us2004/0132140；us2004/0110704；us2004/0110282；us2004/0109865；wo2003/085119；wo2003/084570；wo2005/035586；wo2005/035778；wo2005/053742；wo2002/031140；okazaki等人《分子生物学杂志(j.molbiol.)》336:1239-1249(2004)；yamane-ohnuki等人《生物技术与生物工程(biotech.bioeng.)》87:614(2004)。能够产生去岩藻糖抗体的细胞系的例子包括缺乏蛋白岩藻糖化的lec13cho细胞(ripka等人《生物化学与生物物理学集刊(arch.biochem.biophys.)》249:533-545(1986)；美国专利申请第us2003/0157108al号，presta，l；和wo2004/056312al，adams等人，特别是在实施例11中)，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因fut8、敲除cho细胞(参见例如yamane-ohnuki等人《生物技术与生物工程(biotech.bioeng.)》87:614(2004)；kanda，y.等人《生物技术与生物工程(biotech.bioeng.)》，94(4):680-688(2006)；以及wo2003/085107)。

还提供了具有对分寡糖的抗体变体，例如其中附接到抗体的fc区的双触角寡糖被glcnac对分。这种抗体变体可具有减少的岩藻糖化和/或改善的adcc功能。这种抗体变体的例子描述于，例如wo2003/011878(jean-mairet等人)；us6,602,684(umana等人)；以及us2005/0123546(umana等人)。也提供具有在附接到fc区的寡糖中的至少一个半乳糖残基的抗体变体。这种抗体变体可具有改善的cdc功能。这种抗体变体描述于，例如wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju,s.)；和wo1999/22764(raju,s.)。

在某些实施例中，抗体变体包括具有进一步改善adcc的一个或多个氨基酸取代的fc区，例如在fc区(eu编号的残基)的位置298、333和/或334处的取代。这种取代可与任何上述变异一起发生。

在某些实施例中，本公开预期一种具备部分但不是全部的效应物功能的抗体变体，这使得它成为许多用途的理想候选，其中所述抗体在体内的半衰期对于某些效应物功能(如补体和adcc)是重要是不必要的或有害的。在某些实施例中，测量抗体的fc活性以确保仅维持期望的性质。可执行体外和/或体内细胞毒性测定以确认cdc和/或adcc活性的减小/缺失。例如，可以执行fc受体(fcr)结合测定，以确保所述抗体缺乏fcγr结合(因此有可能缺乏adcc活性)，但保留fcrn结合能力。用于介导adcc的主要细胞(nk细胞)仅表达fc(riii，而单核细胞表达fc(ri、fc(rii以及fc(riii。在造血细胞上的fcr表达总结于ravetch和kinet，《免疫学年鉴(annu.rev.immunol.)》9:457-92(1991年)第464页的表3中。评估感兴趣分子的adcc活性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利第5,500,362号(参见例如hellstrom,i.等人，《美国国家科学院学报(proc.natlacad.sci.usa)》83:7059-7063(1986))和hellstrom,i等人《美国国家科学院学报(proc.natlacad.sci.usa)》，82:1499-1502(1985)；第5,821,337号(参见bruggemann,m.等人《实验医学杂志(j.exp.med)》166:1351-1361(1987))。可替代地，可采用非放射线测定方法(参见例如用于流式细胞术的acti^tm非放射性细胞毒性测定(celltechnology有限公司，加州山景城)；和cytotox非放射性细胞毒性测定(promega，威斯康星州麦迪逊市)。用于这种测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。

可替代地或另外地，可在体内(例如在动物模型中)对感兴趣分子的adcc活性进行评估，例如在clynes等人，《美国国家科学院学报(proc.nat'lacad.sci.usa)》95:652-656(1998)中所公开。也可执行c1q结合测定，以确认抗体不能结合c1q，并因此缺乏cdc活性。为了评估补体活化，可执行cdc测定(参见例如gazzano-santoro等人，《免疫学方法杂志(j.immunial.methods)》202:163(1996)；cragg,m.s.等人，《血液(blood)》101:1045-1052(2003)；以及cragg,m.s.和m.j.giennie，《血液(blood)》13:2738-2743(2004))。也可利用在本技术领域中已知的方法(参见例如petkova,s.b.等人，《国际免疫学(int’l.immunol.)》18(12):1759-1769(2006))来执行fcrn结合和体内清除率/半衰期测定。

提供具有一个或多个氨基酸取代的其它抗体变体。用于取代突变的感兴趣的位点包括高变区，但fr改变也是可想到的。在表1中在“优选取代”的标题下示出了保守取代。在表1中提供了命名为“示例性取代”的更多的明显变化，或者如下面关于氨基酸类别所描述。可将氨基酸取代导入感兴趣抗体中和筛选的产物中，例如用于期望的活性，例如改进的抗原结合、降低的免疫原性、改善的adcc或cdc等。

表1

对抗体生物性质的修饰可通过选择影响(a)在取代区域中的多肽主链的结构(例如片层或螺旋构象)、(b)在靶位点的分子电荷或疏水性或(c)侧链大小的取代而完成。可根据它们的侧链性质的相似性对氨基酸进行分组(a.l.lehninger，《生物化学(biochemistry)》，第二版，73-75页，沃茨出版社，纽约(1975年)):

(1)非极性的：ala(a)、val(v)、leu(l)、be(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)

(2)非荷电极性的：gly(g)、ser(s)、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)

(3)酸性的：asp(d)、glu(e)

(4)碱性的：lys(k)、arg(r)、his(h)

可替代地，可基于常见的侧链性质将天然残基划分为以下各组：

(1)疏水的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；

(2)中性亲水性的：cys、ser、thr、asn、gln；

(3)酸性的：asp、glu；

(4)碱性的：his、lys、arg；

(5)影响链取向的残基：gly、pro；

(6)芳香族的：trp、tyr、phe。

非保守取代将势必将这些类别中的一个成员交换成另一个类别。也可将这种取代残基导入保守取代位点，或者剩余(非保守)位点。

一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，被选择用于进一步发展的所得变体将具有相对于从其中产生所述变体的亲本抗体的经修饰的(例如，改善的)生物性质。一个示例性的取代变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可利用噬菌体展示亲和力成熟技术而方便地形成。简单地说，使数个高变区位点(例如6至7个位点)发生突变以便在各位点处形成所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体展示为从丝状噬菌体颗粒到封装于各颗粒内部的至少部分的噬菌体外壳蛋白(例如，m13的基因iii产物)的融合。然后对噬菌体展示变体进行筛选以便获得它们的生物活性(例如，结合亲和力)。为了识别用于修饰的候选高变区位点，可以执行扫描突变(例如，丙氨酸扫描)以识别明显有助于与抗原结合的高变区残基。

可替代地或另外地，对抗原-抗体络合物的晶体结构进行分析以识别抗体与抗原之间的接触点是有利的。这种接触残基和相邻的残基是用于根据本领域已知的技术进行取代的候选，包括在本文中所详细说明的那些。一旦产生了这种变体，利用本领域已知的技术(包括在本文中所描述的那些)对所述组变体进行筛选，并且可对在一个或多个相关测定中具有优越性质的变体进行选择以便用于进一步的发展。

编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子是通过本领域已知的多种方法而制备。这些方法包括但不限于：从天然来源中分离(在天然的氨基酸序列变体的情况下)，或者通过寡核苷酸介导的(或位点指导)的突变、pcr突变、早期制备的变体或抗体的非变体形式的盒式突变而制备。

理想的是在本公开的抗体的fc区中导入一个或多个氨基酸修饰，由此形成fc区变体。fc区变体可包括人fc区序列(例如，人igg1、igg2、igg3或lgg4fc区)，所述序列包括一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸的氨基酸位置)处的氨基酸修饰(例如取代)。

根据本说明和本领域的教示，可以想到在一些实施例中，本公开的抗体与野生型对应物抗体相比可包括一个或多个改变，例如在fc区中。尽管如此，与它们的野生型对应物相比，这些抗体将会仍然保留治疗用途所必需的大致相同的特征。例如，据认为，可在fc区中执行某些改变，这将会导致改变的(即，改善的或者减小的)clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)，例如在wo99/51642中所描述。关于fc区变体的其它实例，也可参见duncan和winter，《自然(nature)》322:738-40(1988)；美国专利第5,648,260号；美国专利第5,624,821号；以及wo94/29351。wo00/42072(presta)和wo2004/056312(lowman)描述了具有改善的或减小的与fcr的结合的抗体变体。这些专利申请的内容具体地通过引用并入本文。也可参见shields等人，《生物化学杂志(j.biol.chem.)》9(2):6591-6604(2001)。具有增强的半衰期和改善的与新生儿fc受体(fcrn)的结合，所述新生儿fc受体负责将母体igg转移到胎儿(guyer等人《免疫学杂志(j.immunol.)》117:587(1976)和kim等人《免疫学杂志(j.immunol.)》24:249(1994))，描述于美国专利2005/0014934a1(hinton等人)。这些抗体包括在其中具有一个或多个取代的fc区，从而改善fc区与fcrn的结合。具有改变的fc区氨基酸序列和增强的或减小的c1q结合能力的多肽变体描述于美国专利第6,194,551b1号、wo99/51642。这些专利申请的内容是具体地通过引用并入本文。也可参见idusogie等人《免疫学杂志(j.immunol.)》164:4178-4184(2000)。

在另一个方面，本公开提供在包括fc区的fc多肽的界面中包括修饰的抗体，其中这些修饰有助于和/或促进异源二聚化。这些修饰包括将突起导入第一fc多肽并且将腔导入第二fc多肽，其中突起可位于所述腔中从而促进第一fc多肽与第二fc多肽的络合。产生具有这些修饰的抗体的方法在本技术领域是已知的，例如在美国专利第5,731,168号中所描述。

在又一个方面，期望形成半胱氨酸工程抗体，例如“硫代mabs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在各具体实施例中，取代的残基出现在抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代这些残基，由此反应性的巯基被定位在抗体的可及位点，并且可用于将抗体缀合到其它部分，如药物部分或接头药物部分，如在本文中进一步的描述。在某些实施例中，下列残基中的任何一个或多个可用半胱氨酸取代：轻链的v205(kabat编号)；重链的a118(eu编号)；以及重链fc区的s400(eu编号)。

8.抗体衍生物

可以对本公开的抗体进行进一步修饰，从而含有本领域已知并且可容易获得的其它非蛋白质部分。在一些实施例中，适用于抗体衍生化的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例包括但不限于：聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧六环、乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物、聚氨基酸类(均聚物或无规共聚物)以及右旋糖酐或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在生产中具有优点。聚合物可具有任意的分子量，并且可以是支链或非支链的。附接到抗体的聚合物的数量可变化，并且如果多于一个的聚合物附接，则它们可以是相同的或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可基于以下考虑因素来确定，包括但不限于：要被改进的抗体的具体性质或功能、抗体衍生物是否将用于规定条件下的治疗等。

在另一个实施例中，提供可通过暴露于辐射而被选择性加热的抗体与非蛋白质部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质部分是碳纳米管(kam等人《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》102:11600-11605(2005))。辐射可具有任意波长，并且包括但不限于，不伤害正常细胞的波长，但所述波长的辐射将非蛋白质部分加热到接近抗体-非蛋白质部分的细胞被杀死的温度。

b.某些抗体的制作方法

1.某些基于杂交瘤的方法

本公开的单克隆抗体可利用杂交瘤方法而制作，所述方法首先是由kohler等人《自然(nature)》256:495(1975)所描述，并且还描述于例如hongo等人《杂交瘤(hybridoma)》14(3):253-260(1995)，harlow等人《抗体：实验室手册》(冷泉实验室出版社，第二版，1988年)；hammerling等人《单克隆抗体和t-细胞杂交瘤(monoclonalantibodiesandt-cellhybridomas)》563-681(elsevier，纽约州，1981年)，以及关于人-人杂交瘤的ni，《现代免疫学(xiandaimianyixue)》26(4):265268(2006)。

另外的方法包括，例如在美国专利第7,189,826号中所描述的关于从杂交瘤细胞系生产单克隆人天然igm抗体的方法。人杂交瘤技术(三源杂交瘤技术)描述于vollmers和brandlein，《组织学与组织病理学(histologyandhistopathology)》20(3):927-937(2005)以及vollmers和brandlein，《实验与临床药理学中的方法和发现(methodsandfindingsinexperimentalandclinicalpharmacology)》27(3):185-91(2005)。

关于各种其它杂交瘤技术，可参见例如us2006/258841；us2006/183887(完全地人抗体)、us2006/059575；us2005/287149；us2005/100546；us2005/026229；和美国专利第7,078,492和7,153,507号。下面对利用杂交瘤方法生产单克隆抗体的示例性方案进行描述。在一个实施例中，对小鼠或其它适当的宿主动物(如仓鼠)实施免疫接种，以诱发淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能够产生将与用于免疫接种的蛋白质特异性地结合的抗体。通过多次皮下(sc)或腹腔内(ip)注射包括突变smo或其片段和佐剂(如单磷酰脂质a(mpl)/海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedicrynomycolate，tdm)(ribiimunochem.research有限公司，蒙大拿州汉密尔顿)。包括突变smo或其片段的多肽可利用本领域公知的方法(如重组方法)而制备，在本文中对部分方法做进一步描述。对于抗突变smo抗体，测定来自免疫接种动物的血清并且任选地施用强化免疫接种。对来自产生抗突变smo抗体的动物的淋巴细胞进行分离。可替代地，可在体外将淋巴细胞进行免疫接种。

然后利用合适的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。参见例如goding，《单克隆抗体：原理和实践(monoclonalantibodies:principlesandpractice)》59-103页(学术出版社，1986)。可以使用高效地融合，支持利用所选择的抗体产生细胞稳定且高水平地生产抗体，并且对培养基(如hat培养基)敏感的骨髓瘤细胞。示例性的骨髓瘤细胞包括但不限于：鼠骨髓瘤细胞系，例如来源于从美国加尼福尼亚州圣迭戈市salkinstitutecelldistributioncenter获得的mopc-21和mpc-11小鼠肿瘤，和从美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection)获得的sp-2或x63-ag8-653细胞，美国马里兰州罗克维尔市。也对用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系进行了描述(kozbor《免疫学杂志(j.immunol.)》，133:3001(1984)；brodeur等人《单克隆抗体生产技术和应用》51-63页(marceldekker有限公司，纽约，1987年))。

将如此制备的杂交瘤细胞播种于合适的培养基(例如含有抑制未融合亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质的培养基)中并且生长。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hgprt或hprt)，那么用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤以及胸苷(hat培养基)，这些物质阻止hgprt缺陷型细胞的生长。在一些实施例中，将无血清杂交瘤细胞培养方法用于减少动物来源血清(如胎牛血清)的使用，例如在even等人《生物技术趋势(trendsinbiotechnology)》，24(3),105-108(2006)中所描述。

作为用于提高杂交瘤细胞培养生产率的工具的寡肽类描述于franek的《单克隆抗体的研究趋势》111-122(2005)中。具体地，使标准培养基富含某些氨基酸(丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、脯氨酸)，或者蛋白质水解产物组分，并且可利用由三至六个氨基酸残基所组成的合成寡肽类显著地抑制细胞凋亡。这些肽类是以毫摩尔或更高的浓度而存在。

可对其中生长有杂交瘤细胞的培养基进行测定，以便生产与突变smo结合的单克隆抗体。可利用免疫沉淀或通过体外结合测定(如放射性免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa))来确定由杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性。可确定单克隆抗体的结合亲和力，例如通过斯卡查德分析。参见例如munson等人《分析生物化学(anal.biochem.)》，107:220(1980)。

在鉴定出产生具有期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体杂交瘤细胞之后，可通过限制性稀释步骤对克隆进行亚克隆，并且利用标准方法使其生长。参见例如goding，同上。用于此目的合适培养基包括，例如d-mem或rpmi-1640培养基。另外，可使杂交瘤细胞以腹水肿瘤的形式在动物体内生长。通过常规的免疫球蛋白纯化步骤(例如蛋白α-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)适当地将由亚克隆所分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中分离。用于从杂交瘤细胞中分离蛋白质的一个方法描述于us2005/176122和美国专利第6,919,436号中。所述方法包括在结合过程中使用低盐(如感胶离子盐)，并且在一些实施例中，在洗脱过程中也使用少量的有机溶剂。

2.某些文库筛选方法

可以通过使用组合文库来制作本公开的抗体，以便筛选具有期望的一个活性或多个活性的抗体。例如，在本领域中已知有多种方法可用于形成噬菌体展示文库并且筛选具有期望结合特征的用于抗体的这种文库。这种方法一般性的描述于hoogenboom等人《分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)》178:1-37(o'brien等人编著，human出版社，新泽西州托托瓦市，2001年)中。例如，一种形成感兴趣抗体的方法是通过使用噬菌体抗体文库，如在lee等人《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》(2004),340(5):1073-93中所描述。

原则上，通过筛选含有显示融合到噬菌体外壳蛋白的抗体可变区(fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库，对合成抗体克隆进行选择。利用针对所需抗原的亲和层析，对这种噬菌体文库进行淘选。表达能够与期望抗原结合的fv片段的克隆被吸附到抗原，因此从文库中的非结合克隆中分离。

然后将结合克隆从抗原中洗提，并且可以利用抗原吸附/洗脱的额外循环而进一步富集。本公开的任何抗体可以通过如下方法而获得：设计合适的抗原筛选步骤以便选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的fv序列和合适的恒定区(fc)序列(描述于kabat等人《具有免疫学意义的蛋白质的序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》，第五版，美国国立卫生研究院(nih)出版91-3242，马里兰州贝塞斯达(1991年)，第1-3卷)制作全长抗体克隆。

在某些实施例中，抗体的抗原结合区是由约110个氨基酸的两个可变(v)区(各自是来自轻(vl)链和重(vh)链)所组成，这两个链都者存在三个高可变环(hvr)或互补性决定区(cdr)。可变域可以单链fv(scfv)片段的形式(其中vh与vl经由短的柔性肽而共价连接)或者以fab片段的形式(其中它们各自融合到恒定域且非共价地相互作用)在噬菌体上功能性地显示，如在winter等人《免疫学年鉴(ann.rev.immunol.)》，12:433-455(1994)中所描述。本文中所使用的编码噬菌体克隆的scfv和编码噬菌体克隆的fab被统称“fv噬菌体克隆”或“fv克隆”。

可以利用聚合酶链式反应(pgr)对vh和vl基因的库单独地进行克隆，并且随机地在噬菌体文库中进行重组，然后可以在其中搜索抗原-结合克隆，如在winter等人《免疫学年鉴(ann.rev.immunol.)》12:433-455(1994)中所描述。来自免疫接种源的文库提供与免疫原的高亲和力抗体，而不需要制作杂交瘤。可替代地，可以对天然库进行克隆，以便在没有任何免疫接种的情况下将单个人抗体源提供给大范围的的非自体和自体抗原，如由griffiths等人，《欧洲分子生物学组织杂志(emboj)》，12:725-734(1993)所描述。最后，天然文库也可以通过以下合成：从干细胞中克隆未重排的v-基因区段，利用含有随机序列的pgr引物来编码高度可变的cdr3区并且完成体外重排，如由hoogenboom和winter，《分子生物学杂志(j.molbiol.)》，227:381-388(1992)所描述。

在某些实施例中，利用丝状噬菌体通过融合到次要外壳蛋白piii而展示抗体片段。抗体片段可以单链fv片段的形式展示，其中利用柔性多肽间隔区将vh和vl域连接到相同的多肽链上，例如由marks等人《分子生物学杂志(j.molbiol.)》222:581-597(1991)中所描述，或者以fab片段的形式展示，其中一个链融合到piii而另一个则被分泌入细菌宿主细胞周质，其中fab外壳蛋白结构的组装通过替换部分的野生型外壳蛋白质而变得展示于噬菌体表面上，例如在hoogenboom等人《核酸研究(νulic.acidsres.)》19:4133-4137(1991)中所描述。

一般而言，编码抗体基因片段的核酸是从收集自人或动物的免疫细胞中所获得。如果需要有利于抗突变smo克隆的文库，则用突变smo对受试对象进行免疫接种以产生抗体反应，并且将脾细胞和/或循环的b细胞(其它外周血淋巴细胞(pbl))回收用于文库构建。在一个实施例中，有利于抗突变smo克隆的人抗体基因片段文库通过如下方式获得：在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列(并且缺乏功能性内源性抗体生产系统)的转基因小鼠中产生抗突变smo抗体反应，使得突变smo蛋白免疫接种产生b细胞，从而产生针对突变smo的人抗体。下面对人抗体产生转基因小鼠的形成进行描述。

对抗突变smo反应性细胞群体的额外富集可以通过以下步骤获得：利用合适的筛选步骤来分离表达突变smo特异性膜结合抗体的b细胞，例如通过利用突变smo亲和层析或将细胞吸附到荧色物标记的突变smo，接着进行流式激活细胞分选(facs)。

可替代地，对来自未免疫接种供体的脾细胞和/或b细胞或其它pbl的使用提供可能的抗体库的更好表现，并且允许利用其中突变smo不具有抗原性的任何动物(人或非人)物种来构建抗体文库。就包括体外抗基因构建的文库而言，从受试对象中采集干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。感兴趣的免疫细胞可从下列多种动物物种中获得，例如人、小鼠、大鼠、兔、狼、犬科动物、猫科动物、猪、牛、马属动物以及鸟物种等。

从感兴趣细胞中回收编码抗体可变基因区段(包括vh和vl区段)的核酸，并且扩增。在重排的vh和vl基因文库的情况下，所需的dna可以通过从淋巴细胞中分离基因组dna或mrna，接着利用与重排vh和vl基因的5'和3'端匹配的引物进行聚合酶链式反应(pcr)而获得，如在orlandi等人《美国国家科学院学报(proc.natlacad.sci.(usa).)》86:3833-3837(1989)中所描述，由此制作用于表达的不同的v基因库。可以从cdna和基因组dna中扩增v基因，其中在外显子的5'端的反向引物编码成熟v-结构域并且正向引物碱基是在j-区段中，如在orlandi等人(1989年)和ward等人《自然(nature)》341:544-546(1989)中所描述。然而，就来自cdna的扩增而言，反向引物也可以是基于前导外显子，如在jones等人《生物技术(biotechnol.)》9:88-89(1991)中所描述，并且正向引物是在恒定区内，如在sastry等人《美国国家科学院学报(pronatl.acad.sci.(usa))》86:5728-5732(1989)中所描述。为了使互补性最大化，可将简并性并入引物中，如在orlandi等人(1989年)或sastry等人(1989年)中所描述。在某些实施例中，通过使用靶向到各v-基因家族的pcr引物使文库多样性最大化，从而扩增存在于免疫细胞核酸样本中的所有可利用的vh和vl排列，例如在marks等人的方法中所描述，《分子生物学杂志(j.mol.biol)》，222:581-597(1991)，或者如在orum等人的方法中所描述，《核酸研究(nucleicacidsres.)》21:449-4498(1993)。为了将扩增的dna克隆进入表达载体，可以将稀有限制位点导入pcr引物内部作为在一端的标签，如在orlandi等人(1989年)中所描述，或者通过用加标签的引物进一步pcr扩增，如在clackson等人《自然(nature)》352:624-628(1991)中所描述。

可在体外从v基因区段中得到合成重排的v基因的库。大多数的人vh基因区段已被克隆和测序(在tomlinson等人《分子生物学杂志(j.mol.bio.)》227:776-798(1992)中有报道)，并且被映射(在matsuda等人《自然遗传学(naturegenet.)》3:88-94(1993)中有报道；这些克隆的区段(包括h1和h2环的所有主要构象)可以用于通过pcr引物而产生不同的vh基因库，所述pcr引物编码不同序列和长度的h3环，如在hoogenboom和winter《分子生物学(j.mol.biol.)，227:381-388(1992)中所描述。也可使用所有的序列多样性集中于单一长度的长h3环制作vh库，如在barbas等人《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》89:4457-4461(1992)中所描述。人vκ和vλ区段已被克隆和测序(在williams和winter，《欧洲免疫学杂志(eur.j.immunol.)》23:1456-1461(1993)中有报道)并且可以用于制作合成轻链库。合成v基因库，基于一系列的vh和cl折叠，以及l3和h3长度，将编码具有相当大结构多样性的抗体。在编码dna的v-基因的扩增之后，可以根据hoogenboom和winter《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》227:381-388(1992)的方法，对种系v-基因区段进行体外重排。

可以通过数种方法将vh和vl基因库合并到一起而制作抗体片段的库。各库可在不同的载体中形成，并且将载体进行体外重组，例如在hogrefe等人《基因(gene)》128:119-126(1993)中所描述，或者通过体内组合感染，例如在waterhouse等人《核酸研究(nucl.acidsres.)》21:2265-2266(1993)中所描述的loxp系统。体内重组方法利用的fab片段的双链性质来克服大肠杆菌转化效率所造成的对文库大小的限制。单独地对天然vh和vl库进行克隆，一个被克隆进入噬菌粒而另一个被克隆进入噬菌体载体。然后，通含噬菌粒细菌的噬菌体感染将这两个文库合并，使得各细胞含有不同的组合并且文库大小仅由所存在细胞的数量所限制(约10¹²克隆)。两种载体均含有体内重组信号，以便将vh和vl基因重组到单个复制子上并且共包装入噬菌体病毒粒子中。这些巨大的文库提供大量的具有良好亲和力的多种抗体(kd^-1约为10^-8m)。

可替代地，可将库按顺序克隆到相同的载体中，例如在barbas等人《美国国家科学院学报(proc.natlacad.sci.usa)》88:7978-7982(1991)中所描述，或者利用pcr组装到一起然后然后克隆，例如在clackson等人《自然(nature)》352:624-628(1991)中所描述。pcr组装也可以用于将vh和vldnas与编码柔性肽间隔区的dna连接从而形成单链fv(scfv)库。在又一项技术中，利用“细胞中pcr组装”通过pcr将vh和vl基因合并在淋巴细胞内部，然后克隆连接基因的库，如在embleton等人《核酸研究(nuclacidsres.)》20:3831-3837(1992)中所描述。

利用天然文库(天然的或者合成的)所产生的抗体可以具有适度的亲和力(kd^-1约为10⁶至10⁷m^-1)，但也可以通过构建并从第二文库中重新选择来体外模拟亲和力成熟，如在winter等人(1994)(同上)中所描述。例如，利用hawkins等人的方法《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》226:889-896(1992)或者gram等人的方法《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sciusa)》89:3576-3580(1992)，通过使用易错聚合酶(在leung等人《技术(technique)》1:11-15(1989)中有报告)可以随机地在体外将突变导入。另外，通过随机地使一个或多个cdr发生突变而执行亲和力成熟，例如携带跨越感兴趣cdr的随机序列的pcr，在所选择的单独fv克隆中执行并且筛选较高亲和力克隆。wo9607754(于1996年3月14日公布)描述了一种用于在免疫球蛋白轻链的互补性确定区中诱导突变以形成轻链基因的文库的方法。另一个有效方法是将通过噬菌体显示选择的vk或vl域与从未免疫接种供体中所获得的天然v结构域变体的库进行重组，并且在数轮链重组中筛选较高亲和力，如在marks等人《生物技术(bioiechnol.)》10:779-783(1992)中所描述。所述技术允许生产具有约10^-9m或以下亲和力的抗体和抗体片段。

可以通过本领域已知的各种技术完成文库的筛选。例如，突变smo可以用于包覆吸附板的孔，在附接到吸附板的宿主细胞上表达或者用于细胞分选、或与生物素缀合以便用链霉亲和素包覆珠进行捕捉，或者用于任何其它方法用以淘选噬菌体展示文库。

在适合于使至少一部分噬菌体颗粒与吸附剂结合的条件下，使噬菌体文库样本与固定化突变smo接触。通常，对条件(包括ph值、离子强度、温度等)进行选择以模拟生理条件。对结合到固相的噬菌体进行清洗，然后用酸进行洗脱，例如在barbas等人《美国国家科学院学报(proc.natlacadsciusa)》88:7978-7982(1991)中所描述，或者用碱，例如在marks等人《分子生物学杂志(j.molbiol.)》222:581-597(1991)中所描述，或者通过突变smo抗原竞争，例如在类似于clackson等人的抗原竞争法的步骤中《自然(nature)》352:624-628(1991)。可在单轮选择中将噬菌体富集20至1,000倍。此外，经富集的噬菌体可以在细菌培养物中生长并且经过再一轮的选择。

选择的效率取决于许多因素，包括在清洗期间解离的动力学和在单个噬菌体上的多个抗体片段是否可以同时与抗原接合。通过使用短时间清洗、多价噬菌体展示和在固相中抗原的高包覆密度，可以保留具有快速解离动力学(和弱结合亲和力)的抗体。高密度不仅利用多价相互作用使噬菌体稳定，而且有助于已解离噬菌体的再结合。通过采用使用长时间清洗和单价噬菌体展示(如在bass等人《蛋白质(proteins)》8:309-314(1990)和wo92/09690中所描述)，以及抗原的低包覆密度(如在marks等人《生物技术(biotechnol.)》10:779-783(1992))中所描述，可以促进对具有慢速解离动力学(和良好结合亲和力)的抗体的选择。

对于突变smo，能够在具有不同亲和力甚至具有稍微不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择。然而，所选择抗体的随机突变(例如，在一些亲和力成熟技术中所执行)有可能产生许多突变体，大多数与抗原结合，并且少数具有较高的亲和力。通过限制突变smo，可以将稀有的高亲和力噬菌体竞争出局。为了保留所有较高亲和力突变体，可以使用过量的生物素化突变smo，但生物素化突变smo的摩尔浓度低于突变smo蛋白的靶摩尔亲和力常数，从而对噬菌体进行温育。然后可以利用链霉亲和素蛋白包覆的顺磁性珠来捕捉高亲和力结合噬菌体。这种“平衡捕捉”允许根据它们的结合亲和力对抗体进行选择，并且具有允许从大量的具有较低亲和力的噬菌体中分离亲和力低至两倍的突变克隆的敏感性。可以对用于清洗结合到固相的噬菌体的条件进行控制，以便基于解离动力学加以区别。

可以基于活性对抗突变smo克隆进行选择。在某些实施例中，本公开提供与自然地表达突变smo的活细胞(如耐受gdc-0449的肿瘤细胞)结合的抗突变smo抗体。在一个实施例中，本公开提供抗突变smo抗体，这些抗体结合到一个区，所述区与野生型smo中的gdc-0449的结合区相同。与这种抗突变smo抗体相对应的fv克隆可通过如下方式进行选择：(1)从上述的噬菌体文库中分离抗突变smo克隆，并且任选地通过在合适的细菌宿主中生长而扩增经分离的噬菌体克隆群；(2)分别针对阻断性和非阻断性活性来选择突变smo和第二蛋白；(3)将抗突变smo噬菌体克隆吸附到固定化突变smo；(4)用过量的第二蛋白来洗脱任何不希望的识别突变smo结合决定簇的克隆，所述突变smo结合决定簇与第二蛋白的结合决定簇重叠或与之共用；以及(5)对在步骤(4)后仍然被吸附的克隆进行洗脱。任选地，可以通过重复一次或多次本文中所描述的选择步骤，而使具有所需阻断性/非阻断性质的克隆进一步富集。

本公开的编码杂交瘤来源的单克隆抗体或噬菌体展示fv克隆的dna可利用常规步骤(例如通过使用寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物被设计用于特异性地从杂交瘤或噬菌体dna模板扩增感兴趣的重链和轻链编码区)而容易地进行分离和测序。一旦被分离，可以将dna置入表达载体中，然后将其转染入不产生免疫球蛋白的宿主细胞(如大肠杆菌细胞)、猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞中，从而在重组宿主细胞中实现所需的单克隆抗体的合成。关于在抗体编码dna在细菌中的重组表达的综述文章包括skerra等人《免疫学新见(curr.opinioninimmunol)》5:256(1993)和pluckthun《免疫学综述(immunol.revs)》130:151(1992)。

可将本公开的编码fv克隆的dna与编码重链和/或轻链恒定区的已知dna序列(例如，适当的dna序列可以从kabat等人获得，同上)加以合并，从而形成编码全部或部分长度重链和/或轻链的克隆。应当理解的是，任何同种型的恒定区可以用于此目的，包括igg、igm、iga、igd以及ige恒定区，并且这种恒定区可以从任何人或动物物种获得。衍生自一个动物(如人)物种的可变域dna，并且然后融合到的另一个动物物种的恒定区dna以形成用于“杂交”的编码序列的fv克隆、全长重链和/或轻链包括在本文中使用的“嵌合”和“杂交”抗体的定义中。在某些实施例中，使来源于人可变dna的fv克隆融合到人恒定区dna，以形成用于全部或部分长度人重链和/或轻链的编码序列。

也可对本公开的编码来源于杂交瘤的抗突变smo抗体的dna进行修饰，例如通过替换用于人重链和轻链恒定区的编码序列以代替来源于杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如，在morrison等人的方法中，《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》81:6851-6855(1984))。通过共价地连接到所有或部分的用于非免疫球蛋白多肽的编码序列，可以对编码杂交瘤或fv克隆来源的抗体或片段的dna做进一步的修饰。以这种方式，制备“对本公开的fv克隆或杂交瘤克隆来源抗体具有结合特异性的嵌合”或“杂交”抗体。

3.载体、宿主细胞以及重组方法

也可利用重组方法生产抗体。就抗突变smo抗体的重组生产而言，将编码抗体的核酸分离并且插入可复制载体中以进一步克隆(dna的扩增)或表达。利用用常规的步骤(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)可容易地对编码抗体的dna进行分离和测序。许多载体是可利用的。载体成分通常包括但不限于下列中的一个或多个：信号序列、复制的起源、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子以及转录终止序列。

a)信号序列成分

本公开的抗体不仅可直接地重组地产生，而且还可以作为与异源多肽的融合多肽而产生，这在一些实施例中是在成熟蛋白或多肽的n-末端具有特定裂解位点的信号序列或其它多肽。在一些实施例中，所选择的异源信号序列是被宿主细胞所识别并处理(即，被信号肽酶裂解)的序列。就不识别和处理天然抗体信号序列的原核宿主细胞而言，信号序列被原核信号序列所取代，所述原核信号序列选自，例如，由以下组成的群组：碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定的肠毒素ii前导。就酵母菌分泌而言，天然信号序列可被例如酵母菌转化酶前导，α-因子前导(包括酵母菌和克鲁维酵母菌因素前导)或酸性磷酸酶前导、白色念珠菌葡糖淀粉酶前导或在wo90/13646中所描述的信号取代。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌的前导(例如单纯疱疹gd信号)是可利用的。

b)复制的起源

表达载体和克隆载体两者均含有使载体能够在一个或多个所选择宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列是使载体能够独立地复制宿主染色体dna的序列，并且包括复制的起源或自主复制序列。对于多种细菌、酵母菌和病毒而言，这种序列是公知的。自质粒pbr322的复制起源对于大多数革兰氏阴性细菌而言是合适的，2μ质粒源适合于酵母菌，并且各种病毒源(sv40、多瘤、腺病毒、vsv或bpv)可用于在哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，复制成分的起源对于哺乳动物表达载体(通常可仅使用sv40来源，因为它含有早期启动子)而言是不需要的。

c)选择基因成分

表达载体和克隆载体可含有选择基因(也被称为可选择标志)。典型的选择基因编码如下的蛋白：其(a)赋予针对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲蝶呤、或四环素)的耐药性；(b)营养缺陷型补体，或者(c)提供不能从复合培养基中获得的关键营养素，例如编码杆菌的d-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个例子是用药物来阻止一个宿主细胞的生长。使用同源基因成功转化的细胞产生赋予耐药性的蛋白质，因此在选择方案中幸存。这种显性选择的例子的使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

用于哺乳动物细胞的合适可选择标志的另一个例子是能够鉴定细胞从而占据抗体编码核酸的那些，如dhfr、谷氨酰胺合成酶(gs)、胸苷激酶、金属硫蛋白-i和ii(例如灵长目动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，通过将转化体在含有氨甲蝶呤(mtx)(dhhr的竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养，鉴定用dhfr基因转化的细胞。在这些条件下，将dhfr基因与任何其它共转化核酸一起进行扩增。可使用在内源性dhfr活性中有缺陷的中国仓鼠卵巢(cho)细胞系(例如，atcccrl-9096)。

可替代地，通过将转化体在含有l-甲硫氨酸亚砜亚胺(msx)(gs的抑制剂)的培养基中进行培养，鉴定用gs基因转化的细胞。在这些条件下，将gs基因与任何其它共转化的核酸一起进行扩增。gs选择/扩增系统可与上述dhfr选择/扩增系统一起使用。

可替代地，通过在含有用于可选择标志的选择剂如氨基糖甙类抗生素(例如卡那霉素、新霉素或g418)的培养基中的细胞生长，可以对使用编码感兴趣抗体的dna序列、野生型dhfr基因以及另一可选择标志如氨基糖甙3'-磷酸转移酶(aph)进行转化或共转化的宿主细胞(尤其是含有内源性dhfr的野生型宿主)进行选择。参见美国专利第4,965,199号。

用于酵母菌的合适的选择基因是存在于酵母菌质粒yrp7中的trp1基因(stinchcomb等人《自然(nature)》282:39(1979))。trp1基因向缺乏在色氨酸中生长能力的酵母菌的突变株提供提供选择标志(例如atccno.44076或pep4-1)。jones《遗传学(genetics)》85:12(1977)。然后，在酵母菌宿主细胞基因组中存在的trp1受损提供有效环境，用于通过不存在色氨酸情况下的生长检测转化。类似地，利用具有leu2基因的已知质粒来完善leu2缺陷型酵母菌株(atcc20,622或38,626)。

另外，来源于1.6μm环状质粒pkd1的载体可以用于克鲁维酵母菌的转化。可替代地，有报道用于重组犊牛凝乳酶大规模生产的表达系统可用于乳酸克鲁维酵母菌。vandenberg《生物技术(bio/technology)》8:135(1990)。用于由克鲁维酵母菌的工业菌株分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体也已被公开。fleer等人《生物技术(bio/technology)》9:968-975(1991)。

d)启动子成分

表达和克隆载体通常含有由宿主微生物所识别并且可操作地连接到编码抗体的核酸的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoa启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统以及杂交启动子(如tac启动子)。然而，其它的已知细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子也将含有可操作地连接到编码抗体的dna的夏因-达尔加诺(s.d.)序列。

真核细胞的启动子序列是已知的。实际上，所有真核基因具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的at富集区。许多基因的转录起始上游70至80个碱基处发现的另一个序列是其中n可以是任意核苷酸的cncaat区。在大多数真核基因的3'末端的是aataaa序列，所述序列可以是用于将多聚a尾添加到编码序列3'末端的信号。全部的这些序列合适地插入真核表达载体中。

用于酵母菌宿主的合适启动子序列的例子包括用于下列酶的启动子：3-磷酸甘油酸酯激酶或其它糖分解酶，如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸甘油醛异构酶、磷酸葡萄糖异构酶以及葡萄糖激酶。

具有受生长条件控制的转录的额外优点的可诱导启动子的其它酵母菌启动子是用于下列物质的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素c、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶类、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖应用的酶类。用于酵母菌表达的合适的载体和启动子进一步描述于ep73,657。酵母菌增强子也可有利地与酵母菌启动子一起使用。

可以对来自哺乳动物宿主细胞中载体的抗体转录进行控制，例如利用从病毒基因组中，如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(sv40)，或者从同源哺乳动物启动子中获得的启动子，例如肌动蛋白启动子，或者从热激启动子中获得的免疫球蛋白启动子，条件是这种启动子与宿主细胞系统是相容的。

sv40病毒的早期和晚期启动子可方便地以sv40限制片段的形式而获得，所述sv40限制片段也含有sv40病毒复制起点。人巨细胞病毒的立即早期启动子可方便地以hindiiie限制片段的形式而获得。美国专利第4,419,446号中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体的用于在哺乳动物宿主中表达dna的系统。对此系统的修改描述于美国专利第4,601,978号。也可参见reyes等人《自然(nature)》297:598-601(1982)，关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下，小鼠细胞中人β-干扰素cdna的表达。可替代地，可以使用劳斯肉瘤病毒长末端重复区作为作启动子。

e)增强子元件成分

利用高级真核对编码本公开抗体的dna的转录常常是通过将增强子序列插入载体中而增强。许多增强子序列现在已知是来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白以及胰岛素)。通常，然而将使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括在复制起点(bp100-270)的后侧上的sv40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的后侧上的多瘤增强子以及腺病毒增强子。也可参见yaniv《自然(nature)》297:17-18(1982)，关于用于真核启动子的激活的增强元件。所述增强子可剪接到抗体编码序列的位置5'或3'，但在一些实施例中则位于启动子的位点5'。

f)转录终止成分

在真核宿主细胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)中所使用的表达载体，视需要也将含有用于转录终止和使mrna稳定化的序列。这种序列通常是从真核或病毒dna或cdna的未翻译区的5'(偶尔3')中获得。这些区含有在编码抗体的mrna的未翻译部分中转录为多腺苷化片段的核苷酸区段。一个有用的转录中止成分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见wo94/11026和其中所公开的表达载体。

g)宿主细胞的选择和转化

用于克隆或表达本文中的载体的dna的合适宿主细胞是原核生物、酵母菌或上述的高级真核细胞。用于此目的合适原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性微生物，例如肠杆菌科，如埃希氏菌属、大肠杆菌、肠杆菌属、欧文氏菌属、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌属(例如粘质沙雷氏菌)、和志贺菌、以及杆菌(如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)(例如在1989年4月12日公布的dd266,710中公开的地衣芽孢杆菌41p)、假单胞菌(如绿脓杆菌)、和链霉菌属。一个可能的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(atcc31,446)，尽管其它菌株(如大肠杆菌b、大肠杆菌x1776(atcc31,537)以及大肠杆菌w3110(atcc27,325))也是合适的。这些例子是说明性的而非限制性的。

全长抗体、抗体融合蛋白质以及抗体片段可以在细菌中产生，尤其当不需要糖基化和fc效应物功能时，例如当治疗抗体与细胞毒剂(例如，毒素)缀合时，所述细胞毒素自身显示出在肿瘤细胞破坏中的有效性。全长抗体具有在循环中更长的半衰期。在大肠杆菌中的生产是更快的且更具有成本效益的。就在细菌中的抗体片段和多肽类的表达而言，可参见例如us5,648,237(carter等人)、us5,789,199(joly等人)、us5,840,523(simmons等人)，这些专利描述了翻译起始区(tir)和用于优化表达和分泌的信号序列。也可参见charlton《分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)》248卷(b.k.c.lo编著，humana出版社，新泽西州托托瓦市，2003年)，245-254页，其中描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达。在表达后，可将抗体从可溶性部分中的大肠杆菌细胞浆中分离出，并且可基于同种型经过例如蛋白a或g柱进行纯化。可以类似于用于纯化例如在cho细胞中所表达抗体的过程来执行最后的纯化。

除了原核生物外，真核微生物(如丝状真菌或酵母菌)是用于抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母菌或普通面包酵母菌，是在低级真核宿主微生物中最常用的。然而，若干其它属、物种和菌株通常也是可利用的并且可用于本文，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母菌宿主(例如乳酸克鲁维酵母菌、脆壁克鲁维酵母菌(atcc12,424)、保加利亚克鲁维酵母(atcc16,045)、威克克鲁维酵母菌(atcc24,178)、克鲁雄酵母菌(atcc56,500)、果蝇克鲁维酵母(atcc36,906)、耐热克鲁维酵母菌以及马克斯克鲁维酵母菌；耶氏酵母菌(ep402,226)；毕氏酵母菌(ep183,070)；念珠菌；瑞氏木霉菌(ep244,234)；粗糙脉孢菌；许旺酵母菌(如西方许旺酵母菌)；以及丝状真菌，例如脉孢菌属、青霉属、弯颈霉属以及曲霉属宿主如构巢曲霉和黑曲霉。关于描述酵母菌和丝状真菌在药用蛋白生产中使用的综述，可参见例如gemgross《天然生物技术(nat.biotech.)》22:1409-1414(2004)。

可以对其中糖基化途径已被“人源化”从而导致部分或完全人糖基化抗体的产生的某些真菌和酵母菌株进行选择。参见例如li等人《天然生物技术(nat.biotech.)》24:210-215(2006)(描述在毕氏酵母菌中糖基化途径的人源化)；和gemgross等人，同上。

用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也来源于多细胞微生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。许多杆状病毒株和变体及来自宿主如草地贪夜蛾(caterpillar)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)以及家蚕的容许的对应昆虫宿主细胞已被确认。用于转染的多种病毒株可公开地获得，例如，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的l-1变体和家蚕核型多角体病毒的bm-5菌株，并且根据本公开这种病毒可用作本文中的病毒，具体地用于草地贪夜蛾细胞的转染。

也可以将棉花、玉米、马铃薯、大豆、牵牛花、西红柿、浮萍(浮萍科)、苜蓿(蒺藜苜蓿)以及烟草植物的细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利第5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429号(描述了用于在转基因植物中生产抗体的plantibodies^tm技术)。

也可将脊椎动物细胞用作宿主，并且脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已变为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是利用sv40(cos-7，atcccrl1651)转化的猴肾cv1细胞系；人胚胎肾细胞系(用于在悬浮培养中生长的经亚克隆的293或293细胞，graham等人《普通病毒学杂志(j.genvirol.)》36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(bhk，atccccl10)；小鼠睾丸支持细胞(tm4，mather，《生殖生物学(biol.reprod.)》23:243-251(1980))；猴肾细胞(cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(hela，atccccl2)；犬肾细胞(mdck，atccccl34)；布法罗大鼠肝细胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺细胞(w138，atccccl75)；人肝细胞(hepg2，hb8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562，atccccl51)；tri细胞(mather等人《纽约科学院年报(annalsn.y.acad.sci.)》383:44-68(1982))；mrc5细胞；fs4细胞；以及人肝癌细胞系(hepg2)。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr^-cho细胞(urlaub等人《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，如ns0和sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，可参见例如yazaki和wu，《分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)》第248卷(b.k.c.lo编著，胡玛纳出版社，新泽西州托托瓦市，2003年)，255-268页。

用上述表达或克隆载体对宿主细胞进行转化用于抗体产生，并且在常规营养剂培养基(适当情况下可修改)中培养，以便诱导启动子、选择转化体或扩增编码期望序列的基因。

h)培养宿主细胞

可将用于生产本公开抗体的宿主细胞在多种培养基中进行培养。市售的培养基如ham'sf10(sigma)、最低要素培养基((mem)(sigma)、rpmi-1640(sigma)以及杜尔贝科改良伊格尔培养基((dmem)，sigma)适合于宿主细胞的培养。另外，可将ham等人《酶学方法(meth.enz.)》58:44(1979)，barnes等人《分析生物化学(anal.biochem.)》(1980)，美国专利第4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469号；wo90/03430；wo87/00195；或美国专利re.30,985中所描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。视需要，可用激素和/或其它生长因子(如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如hepes)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素^tm药物)、微量元素(被定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度而存在的无机化合物)以及葡萄糖或等效能量源物对任何这些培养基进行补充。也包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需的补充物。培养条件(如温度、ph值等)是先前用于表达的所选择宿主细胞的条件，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

i)抗体的纯化

当采用重组技术时，抗体可在细胞内、在周质空间中产生，或者直接地分泌入培养基中。如果抗体是在细胞内产生，那么作为第一步骤，可将宿主细胞或者溶解片段的颗粒碎屑去除，例如通过离心或超滤。carter等人《生物技术(bio/technology)》10:163-167(1992)中描述了用于分离被分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的步骤。简单地说，在醋酸钠(ph3.5)、edta以及苯甲基磺酰氟(pmsf)存在下在约30分钟内将细胞浆解冻。可通过离心除去细胞碎片。其中抗体被分泌入培养基中，通常首先利用市场上可购得的蛋白浓度过滤器(例如amicon或milliporepellicon超滤装置)对来自这种表达系统的上清液进行浓缩。可将蛋白酶抑制剂(如pmsf)包含在任何的前述步骤中用以抑制蛋白酶解，并且可包含抗生素用以防止外来污染物的生长。

可利用例如羟基磷灰石层析、疏水相互作用层析、凝胶电泳、透析以及亲和层析，对由细胞制备的抗体组合物进行纯化。蛋白a作为亲和配体的适合性，取决于存在于抗体中的任何免疫球蛋白fc域的物种和同种型。蛋白a可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(lindmark等人《免疫学方法杂志(j.immunol.meth.)》62:1-13(1983))。蛋白g被推荐用于所有小鼠同种型并且用于人γ3(guss等人(1986年)《欧洲分子生物学组织杂志(emboj.)》5:1567-1575)。亲和力配体所附接的基质在大多数情况下是琼脂糖，但其它基质也是可利用的。与使用琼脂糖相比，机械稳定的基质例如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许更快的流率和更短的处理时间。如果抗体包括ch3结构域，那么bakerbondabx^tm树脂(j.t.baker，新泽西州菲利普斯堡)可用于纯化。基于被回收的抗体，也可采用用于蛋白质纯化的其它技术，如在离子交换柱上的分离、乙醇沉淀、反相hplc、硅胶层析、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的肝素琼脂糖凝胶层析、色谱聚焦、sds-page以及硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可使用ph值在约2.5至4.5之间的洗脱缓冲剂，对包括感兴趣抗体和污染物的混合物实施低ph值疏水相互作用层析，在一些实施例中是以低盐浓度(例如，约0至0.25m的盐)而实施。

一般而言，制备用于研究、测试和临床的抗体的各种方法在本领域中是得到确认的，与上述方法一致和/或被本领域技术人员认为合适于感兴趣的特定抗体。

c.免疫缀合物

本公开也提供免疫缀合物(可互换地被称为“抗体-药物缀合物”或“adc”)，所述免疫缀合物包括与一个或多个细胞毒性药剂结合的抗体，如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白毒素、细菌、真菌、植物、或动物来源或其片段的酶活性毒素)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。

在癌症的治疗中，已将免疫缀合物用于细胞毒性药剂(即，杀死或抑制细胞生长或增殖的药物)的局部给药(lambert，j.(2005年)《药理学新见(curr.opinioninpharmacology)》5:543-549；wu等人(2005年)《自然生物技术(naturebiotechnology)》23(9):1137-1146；payne,g.(2003年)i3:207-212；syngos和epenetos(1999年)《抗癌研究(anticancerreserach)》19:605-614；nicuiescu-duvaz和springer(1997年)《先进药物输送评论(adv.drugdeliv.rev.)》26:151-172；美国专利第4,975,278号)。免疫缀合物允许药物部分对肿瘤的靶向传递和在其中的细胞内蓄积，其中未缀合药物的全身性给药可导致对正常细胞的毒性达到不可接受水平并消除肿瘤细胞(baldwin等人《柳叶刀(lancet)》1986年3月15日)，603-05页；thorpe(1985年)《治疗中细胞毒性药剂的抗体载体：综述(antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview)》《单克隆抗体'84：生物和临床应用》(a.pinchera等人编著)，475-506页中。多克隆抗体和单克隆抗体两者都已被报道可用于这些策略(rowland等人(1986年)《癌症免疫学与免疫治疗(cancerimmunol.immunother.)》21:183-87)。在这些方法中所使用的药物包括柔红霉素、阿霉素、氨甲蝶呤以及长春地辛(rowland等人(1986年)同上)。在抗体-毒素缀合物中所使用的毒素包括细菌毒素，如白喉毒素、植物毒素(如蓖麻毒素)、小分子毒素(如格尔德霉素)(mandler等人(2000年)《国家癌症学会杂志(j.nat.cancerinst)》92(19):1573-1581；mandler等人(2000年)《生物有机化学与医药化学通讯(bioorganic&medchem.letters)》10:1025-1028；mandler等人(2002年)《生物共轭化学(bioconjugatechem.)》13:786-791)、美登素类化合物(ep1391213；liu等人(1996年)《美国国家科学院学报(pronatl.acad.sci.usa)》93:8618-8623)以及卡奇霉素(lode等人(1998年)《癌症研究(cancerres.)》58:2928；hinman等人(1993年)《癌症研究(cancerres.)》53:3336-3342)。这些毒素可通过机制(包括微管蛋白结合、dna结合或拓扑异构酶抑制)发挥它们的细胞毒性作用。当与大的抗体或蛋白受体配体缀合时，一些细胞毒性药物倾向于无活性或活性降低。

(替伊莫单抗，biogen/idec)是抗体-放射性同位素缀合物，所述缀合物是由通过硫脲接头螯合剂而结合的针对cd20抗原的鼠igg1κ单克隆抗体和111in或90y放射性同位素所构成，所述cd20抗原发现于正常和恶性b淋巴细胞的表(wiseman等人(2000年)《欧洲核医学杂志(eur.jour.nucl.med.)》27(7):766-77；wiseman等人(2002年)《血液(blood)》99(12):4336-42；witzig等人(2002年)《临床肿瘤学(j.clin.oncol.)》20(10):2453-63；witzig等人(2002年)《临床肿瘤学(j.clin.oncol.)》20(15):3262-69)。尽管zevalin具有针对b细胞非何杰金淋巴瘤(nhl)的活性，但给药在大多数患者中导致严重且延长的血细胞减少。mylotarg^tm(吉妥珠单抗，wyethpharmaceuticals)，由连接到卡奇霉素的hucd33抗体所构成的抗体-药物缀合物，于2000年被批准用于通过注射对急性髓系白血病进行治疗(《未来药物(drugsofthefuture)》(2000)25(7):686；美国专利第4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001号)。莫坎妥珠单抗(immunogen有限公司)，由经由二硫接头spp连接到美登醇药物部分dm1的huc242抗体所构成的抗体-药物缀合物正进入用于表达canag的癌症(如结肠癌、胰腺癌、胃癌以及其它癌症)的治疗ii期试验。mln-2704(millenniumpharm.，bzlbiologies，immunogen有限公司)，由连接到美登醇药物部分dm1的抗前列腺特异性膜抗原(psma)单克隆抗体所构成的抗体-药物缀合物，正处于用于前列腺肿瘤的潜在治疗的开发阶段。澳瑞他汀肽类、澳瑞他汀e(ae)以及一甲基澳瑞他汀(mmae)，尾海兔素的合成类似物，被缀合到嵌合单克隆抗体cbr96(对恶性肿瘤上的lewisy抗原具有特异性)和cac10(对血液恶性肿瘤上的cd30具有特异性)(doronina等人(2003年)《自然生物技术(naturebiotechnol.)》21(7):778-784)，并且正处于治疗开发阶段。

在某些实施例中，免疫缀合物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文中描述了可用于免疫缀合物的形成的化疗剂(例如，上述)。可以使用的酶活性毒素和其片段包括：白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自绿脓杆菌)、蓖麻毒素a链、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝裂素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素以及单端孢霉烯。参见例如于1993年10月28日公布的wo93/21232。多种放射性核素可用于放射性结合抗体的产生。例子包括²¹²bi、¹³¹i、¹³¹in、⁹⁰y以及¹⁸⁶re。抗体与细胞毒性药剂的缀合物是用多种双官能团蛋白质-偶联药剂而制作，如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、亚氨基硫烷(it)、亚胺酸酯的双官能团衍生物(如己二亚胺二甲酯hcl)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮盐衍生物(如双(对重氮盐苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯类(如2,6-甲苯二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以制备蓖麻毒素免疫毒素，如在vitetta等人《科学(science)》238:1098(1987)中所描述。碳14标记的1-异硫氰基苯基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸()mx-dtpa)是用于使放射性核苷酸缀合到抗体的示例性螯合剂。参见wo94/11026。

抗体与一个或多个小分子毒素(如卡奇霉素、美登醇类、尾海兔素类、澳瑞他汀类、单端孢霉烯和cc1065，以及具有毒素活性的这些毒素的衍生物)的缀合物也包括在本文中。

1.美登素和美登醇类

在一些实施例中，免疫缀合物包括与一个或多个美登醇分子结合的抗体(全长或片段)。

美登醇类是通过抑制微管蛋白聚合而发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素首先是从东非锯齿马尾松中分离(美国专利第3,896,111号)。随后，发现某些微生物也产生美登素类化合物，如美登醇和c-3美登醇酯类(美国专利第4,151,042号)。合成美登醇及其衍生物和类似物公开于例如美国专利第4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331，598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；和4,371,533号。

美登醇药物部分是在抗体药物缀合物中有吸引力的药物部分，因为它们是：(i)可通过发酵或化学修饰、发酵产物的衍生化而相对容易制备；(i)适合于用适于经由非二硫接头接合到抗体的官能团而衍生化；(iii)在血浆中是稳定的；以及(iv)对多种肿瘤细胞系有效。

含有美登醇类的免疫缀合物、其制作方法以及它们的治疗应用公开于例如美国专利第5,208,020号、第5,416,064号和欧洲专利ep0425235b1，这些专利的公开内容通过引用明确地并入本文。liu等人《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》93:8618-8623(1996)描述了包含连接到针对人结直肠癌的单克隆抗体c242的被命名为dm1的美登醇的免疫缀合物。发现所述缀合物对于培养的结肠癌细胞具有高度细胞毒性，并且在体内肿瘤生长试验中显示出抗肿瘤活性。chari等人《癌症研究(cancerresearch)》52:127-131(1992)描述了免疫缀合物，其中美登醇经由二硫化物接头缀合到鼠抗体a7(结合到人结肠癌细胞系上的抗原)，或缀合到与her-2/neu致癌基因结合的另一个鼠单克隆抗体ta.1。ta.1-美登醇缀合物的细胞毒性在体外在人乳腺癌细胞系sk-br-3上测定，所述人乳腺癌细胞系sk-br-3每个细胞表达3×10⁵her-2表面抗原。所述药物缀合物获得与无美登醇药物程度类似的细胞毒性，这可以通过增加每抗体分子中美登醇分子的数量而增强。a7-美登醇缀合物在小鼠中显示低全身性细胞毒性。

抗体-美登醇缀合物是通过将抗体化学连接到美登醇分子而制备，而不明显地降低抗体或者美登醇分子的生物活性。参见例如美国专利第5,208,020号(其公开内容通过引用并入本文)。平均每个抗体缀合有3至4个美登醇分子物已经显示出增强靶细胞的细胞毒性而不对抗体的功能或溶解性造成负面影响的效果，尽管甚至一个分子的毒素/抗体预期会增强细胞毒性(相对于使用裸抗体)。美登素类化合物在本领域是公知的，并且是通过已知的技术而合成或者从天然来源中分离。合适的美登醇类公开于例如美国专利第5,208,020号及上文中所提到的其它专利和非专利出版物。在一些实施例中，美登醇类是美登醇和在美登醇分子的芳香环或其它位置经修饰的美登醇类似物(如各种美登醇酯类)。

本领域已知许多用于制作抗体-美登醇缀合物的连接基，包括例如在美国专利第5,208,020号或欧洲专利0425235b1、chars等人的《癌症研究(cancerreserach)》52:127-131(1992)以及于2004年10月8日提交的美国专利申请第10/960,602号中所公开的那些，其公开内容通过引用明确并入本文。包含接头成分smcc的抗体-美登醇缀合物可以以如在2004年10月8日提交美国专利申请第10/960,602号中所公开的方法而制备。连接基团包括：二硫基、硫醚基、酸不稳定基、光不稳定基、肽酶不稳定基或酯酶不稳定基，如在上述专利中所公开；在一些实施例中可使用二硫基和硫醚基。在本文中描述并例示了另外的连接基。

可通过使用多种双官能蛋白偶联剂来制作抗体与美登醇的缀合物，如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-二硫代吡啶基)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)己烷-1-甲酸酯(smcc)、亚氨基硫烷(it)、亚胺酸酯双官能团衍生物(如盐酸己二亚氨二甲酯)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮盐衍生物(如双(对重氮盐苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯类(如2,6-甲苯二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些实施例中，偶联剂包括n-琥珀酰亚胺基-3-(2-二硫代吡啶基)丙酸酯(spdp)(carlsson等人《生物化学杂志(biochem.j.)173:723-737(1978))和n-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(spp)以提供二硫键。

基于连接的类型，接头可在各种位置附接到美登醇分子。例如，可利用常规的偶联技术通过与羟基反应而形成酯键。所述反应可在具有羟基的c-3位置、用羟甲基修饰的c-14位置、用羟基修饰的c-15位置以及具有羟基的c-20位置发生。在一个实施例中，所述键在美登醇或美登醇类似物的c-3位置形成。

2.澳瑞他汀和尾海兔素

在一些实施例中，免疫缀合物包含与尾海兔素或尾海兔素肽类似物和衍生物结合的抗体、澳瑞他汀(美国专利第5635483；5780588号)。尾海兔素和澳瑞他汀尚未显示干扰微管动力学、gtp水解以及核分裂和细胞分裂(woyke等人(2001年)《抗微生物制剂和化学疗法(antimicrob.agentsandchemother.)》45(12):3580-3584)，并且具有抗癌(美国5663149)和抗真菌活性(pettit等人(1998年)《抗微生物制剂和化学疗法(antimicrob.agentsandchemother.)》42:2961-2965)。尾海兔素或澳瑞他汀药物部分可经由肽药物部分的n(氨基)末端或c(羧基)末端附接到抗体(wo02/088172)。

示例性的澳瑞他汀实施例包括n-末端连接的一甲基澳瑞他汀药物部分de和df，公开于2004年11月5日提交的美国专利序列号10/983,340《能够与配体缀合的一甲基缬氨酸化合物(monomethylvalinecompoundscapableofconjugationtoligands)》，其全部内容通过引用整体明确并入本文。

通常，基于肽的药物部分可通过在两个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备。这种肽键可以例如根据在肽化学领域公知的液相合成方法而制备(参见e.和k.lübke，《肽(thepeptides)》，第1卷，76-136页，1965年，学术出版社)。澳瑞他汀/尾海兔素药物部分可根据以下方法制备：us5635483；us5780588；pettit等人(1989年)《美国化学学会杂志(j.amchem.soc)》111:5463-5465；pettit等人(1998年)《抗癌药物设计(anti-cancerdrugdesign)》13:243-277；pettit，g.r.等人《合成(synthesis)》1996年，719-725；和pettit等人(1996年)《j.cherm.soc.perkintrans.》15:859-863。也可参见doronina(2003年)《自然生物技术(natbiotechnol)》21(7):778-784；《能够与配体缀合的一甲基缬氨酸化合物》，于2004年11月5日提交的美国专利序列号10/983,340，其全部内容通过引用整体并入本文(公开了例如，接头和制备缀合到接头的一甲基缬氨酸化合物(如mmae和mmaf)的方法)。

3.卡奇霉素

在其它实施例中，免疫缀合物包括与一个或多个卡奇霉素分子缀合的抗体。卡奇霉素族的抗生素能够在亚皮摩尔浓度下产生双链dna断裂。关于卡奇霉素族缀合物的制备，可参见美国专利第5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296号(均授予美国氰氨公司)。可被使用的卡奇霉素的结构类似物包括但不限于：γ1i、α2ι、α3ι、n-乙酰基-γ1ι、psag以及θι1(hinman等人《癌症研究(cancerresearch)》53:3336-3342(1993年)，lode等人《癌症研究(cancerresearch)》58:2925-2928(1998年)以及前述授予美国氰氨公司的美国专利)。抗体可缀合的另一个抗肿瘤药物是qfa，所述药物是抗叶酸剂。卡奇霉素和qfa两者均具有细胞内的作用位点并且不能容易跨过细胞质膜。因此，经由抗体介导的内化的这些药剂的细胞摄取大幅地增强它们的细胞毒性效果。

4.其它细胞毒性药剂

可以与抗体缀合的其它抗肿瘤药物包括bcnu、链佐星、长春新碱以及5-氟尿嘧啶(所述族的药剂被统称为在美国专利5,053,394、5,770,710中所描述的ll-e33288复合物)以及埃斯培拉霉素(美国专利5,877,296)。

可以使用的酶活性毒素和其片段包括：白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自绿脓杆菌)、蓖麻毒素a链、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-帚曲毒蛋白、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(papi、papii、和pap-s)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制剂、白树毒素、丝裂素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素以及单端孢霉烯。参见例如于1993年10月28公布的wo93/21232。

本公开还预期在抗体与具有溶核活性的化合物(例如，核糖核酸酶或dna内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；脱氧核糖核酸酶)之间所形成的免疫缀合物。

就肿瘤的选择性破坏而言，抗体可包含高放射活性原子。多种放射性同位素可用于放射性缀合抗体的产生。例子包括at²¹¹、i¹³¹、i¹²⁵、y⁹⁰、re¹⁸⁶、re¹⁸⁸、sm¹⁵³、bi²¹²、p³²、pb²¹²以及lu的放射性同位素。当缀合物用于检测时，它可包括用于闪烁显像研究的放射性原子，例如tc99m或i123、或者用于核磁共振(nmr)成像(也被称为磁共振成像，mri)的自旋标记，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可利用已知方法将放射性或其它标记并入缀合物。例如，肽可生物合成，或者可通过化学氨基酸合成使用合适的氨基酸前体而合成，所述前体包括例如氟-19来代替氢。标记如tc^99m或i¹²³、re¹⁸⁶、re¹⁸⁸以及in¹¹¹可经由肽中的半胱氨酸残基而附接。钇-90可经由赖氨酸残基而附接。可以利用iodogen法(fraker等人(1978年)《生物化学与生物物理学研究通讯(biochem.biophys.res.commun.)》80:49-57)来并入碘-123。《免疫显像中的单克隆抗体(monoclonalantibodiesinimmunoscintigraphy)》(chatal，crc出版社，1989年)详细描述了其它方法。

抗体与细胞毒性药剂的缀合物可利用多种双官能团蛋白质偶联剂而制作，如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺基甲基)己烷-l-甲酸酯(smcc)、亚氨基硫烷(it)、亚胺酸酯双官能团衍生物(如二甲基己二亚氨hcl)、活性酯类(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、二重氮盐衍生物(如双(对重氮盐苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯类(如2,6-甲苯二异氰酸酯)以及双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可以以如在vitetta等人《科学(science)》238:1098(1987)中所描述的方法而制备。碳-14标记的1-异硫氰基苯基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将放射性核苷酸缀合到抗体的示例性螯合剂。参见wo94/11026。接头可以是有助于细胞毒性药剂在细胞中释放的“可裂解接头”，例如可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫的接头(chari等人《癌症研究(cancerreaserch)》52:127-131(1992)；美国专利第5,208,020号)。

这些化合物包括但不限于使用下列交联剂制备的adc：bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb，以及svsb(琥珀酰亚胺基(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，这些是可从市场上购得的(例如从pierce生物技术公司，美国伊利诺伊州罗克福德市)。参见467-498页，2003-2004《应用手册和目录(applicationshandbookandcatalog)》。

5.抗体-药物缀合物的制备

在抗体药物缀合物(adc)中，抗体(ab)经由接头(l)缀合到一个或多个药物部分(d)，例如约1至约20个药物部分每抗体(p＝1至约20)。下面所示化学式的adc可采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件、和试剂通过数个途径制备，包括：(1)使抗体的亲核基与二价接头剂反应，从而利用共价键形成ab-l，接着与药物部分d反应；和(2)药物部分的亲核基与二价接头剂反应，利用共价键形成d-l，接着是与抗体的亲核基反应。本文中描述了用于制备adc的其它方法。

ab-(l-d)p

接头可由一个或多个接头成分构成。示例性的接头成分包括：6-马来酰亚胺基己酰基(“mc”)、马来酰亚胺基丙酰基(“mp”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”)、丙氨酸-苯基丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“pab”)、n-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“spp”)、n-琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺甲基)己烷-1-甲酸酯(“smcc”)以及n-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“stab”)。另外的接头成分在本领域中是已知的并且在本文中对一些进行了描述。也可参见《能够与配体接合的一甲基缬氨酸化合物(monomethylvalinecompoundscapableofconjugationtoligands)》，于2004年11月5日提交的美国专利序列号10/983,340，其全部内容通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，接头可包括氨基酸残基。示例性的氨基酸接头成分包括二肽、三肽、四肽或五肽。示例性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯基丙氨酸(af或ala-phe)。示例性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。包括氨基酸接头成分的氨基酸残基包括天然的以及小氨基酸和非天然氨基酸类似物，如瓜氨酸。可基于特定酶(例如肿瘤联接蛋白酶、组织蛋白酶b、c和d或纤溶酶)对氨基酸接头成分的酶裂解的选择性进行设计和优化。

抗体上的亲核基包括但不限于：(i)n-末端胺基；(ii)侧链胺基，例如赖氨酸；(iii)侧链巯基，例如半胱氨酸；以及(iv)其中使抗体是糖基化的糖羟基或氨基。胺基、巯基和羟基是亲核的，并且能够与接头部分和接头剂上的亲电基发生反应而形成共价键，接头剂包括：(i)活性酯类，如nhs酯、hobt酯、卤甲酸酯和酰卤；(ii)卤代烷基和卤代苯基，如卤代乙酰胺；以及(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可以通过用还原剂如dtt(二硫苏糖醇)进行处理而使抗体对与接头剂的缀合有反应性。因此，各半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫代亲核体。通过赖氨酸与2-亚氨基硫烷(特劳特试剂)反应从而导致胺基转变成巯基，可将另外的亲核基导入抗体中。通过导入一个、二个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基，可将反应性巯基导入抗体(或其片段)(例如，制备包括一个或多个非天然半胱酸氨基酸残基的突变抗体)。

抗体-药物缀合物也可通过对抗体进行修饰成以便导入亲电部分而形成，所述亲电部分可以与在接头试剂或药物上的亲核取代基反应。可例如用高碘酸盐氧化试剂将糖基化抗体的糖氧化，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基发生反应的醛基或酮基。所形成亚胺席夫碱基可形成稳定的键，或者可被还原(例如用硼氢化物试剂)而形成稳定的胺键。在一个实施例中，糖基化抗体上的糖部与乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中产生羰基(醛基和酮基)，所述基团可以与药物上的适当基团发生反应(hermanson《生物缀合技术(bioconjugatetechniques)》)。在另一个实施例中，含有n-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可以与偏高碘酸钠发生反应，从而形成醛以代替第一氨基酸(geoghegan和stroh(1992年)《生物缀共轭化学(bioconjugatechem.)》3:138-146；us5362852)。这种醛可与药物部分或接头亲核试剂发生反应。

同样地，在药物部分上的亲核基包括但不限于：胺基、巯基、羟基、酰肼基、肟基、肼基、缩氨基硫脲基、肼甲酸酯基以及芳基酰肼基，这些基团能够反应而与接头部分上和接头试剂的亲电基形成共价键，包括：(i)活性酯类，如nhs酯类、hobt酯类、卤代甲酸酯类和酰卤化物；(ii)卤代烷基和卤代苯基，如卤代乙酰胺类；以及(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基。

可替代地，包括抗体和细胞毒性药剂的融合蛋白可例如利用重组技术或肽合成而制作。所述长度的dna可包括编码缀合物的两个部分的各自区域，所述两个部分彼此相邻或者被编码不破坏缀合物的期望性质的连接肽的区域所隔离。

在又一个实施例中，抗体可与”受体”(例如链霉亲和素蛋白)缀合，以便于用于肿瘤预靶向，其中将施用于抗体-受体缀合物向患者，接着利用清除剂从循环中去除未结合的缀合物，然后施用“配体”(例如，抗生物素蛋白)，所述配体缀合到细胞毒性药剂(例如，放射性核苷酸)。多种放射性核素可用于放射性缀合抗体的产生。例子包括²¹²bi、¹³¹i、¹³¹in、⁹⁰y和¹⁸⁶re。

v.方法

a.利用抗体对突变smo的诊断方法和检测方法

在一个方面，本公开的抗体可用于检测在生物样本中突变smo的存在。本文中所使用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施例中，生物样本包括细胞或组织(如肿瘤组织)。

在一个方面，本公开提供一种检测在生物样本中突变smo的存在的方法。在某些实施例中，所述方法包括在容许抗突变smo抗体结合到突变smo的条件下使生物样本与抗突变smo抗体接触，并且检测在抗突变smo抗体与突变smo之间是否形成复合物。

在一个方面，本公开提供一种对与突变smo的表达相关的疾病或者状况(如耐药性)进行诊断方法。在某些实施例中，所述方法包括：使测试细胞与抗突变smo抗体接触；通过检测抗突变smo抗体与突变smo的结合，确定突变smo的表达水平(定量或者定性)；以及对测试细胞的突变smo的表达水平与对照细胞的突变smo的表达水平(例如，与测试细胞或以类似于这种正常细胞的水平表达野生型smo蛋白的细胞相同组织来源的正常细胞)进行比较，其中与对照细胞相比测试细胞的更高水平的突变smo表达表示存在与增强的突变smo表达相关的病症。在某些实施例中，测试细胞是从疑似患有与增强的突变smo表达相关的病症的个体中获得。在某些实施例中，病症是细胞增殖性病症，如癌症或肿瘤。应理解的是，在例如肿瘤样本中，在smo蛋白表达中可存在不均一性。因此，应理解的是，在一个样本中，在所述样本中仅一个亚组的细胞可表达突变smo，并且这种表达足以例如与耐药性相关。因此，对表达的评估包括：对在样本中的表达进行评估，并且对在样本中一个亚组的细胞中的突变smo进行检测。

可被诊断或其中可利用本公开抗体对耐药性进行评估的示例性病症包括但不限于：髓母细胞瘤、胰腺癌、基底细胞癌。

某些其它方法可用于对抗体与突变smo的结合进行检测。这种方法包括但不限于：本领域公知的抗原-结合测定，如蛋白印迹法、放射免疫测定、elisa(酶联免疫吸附测定)、”夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白a免疫测定以及免疫组织化学(ihc)。

在某些实施例中，给抗体加标记。标记包括但不限于：被直接地检测的标记或部分(如荧光的、发色的、电子致密的、化学发光的和放射性的标记)以及被间接地检测(例如利用酶反应或分子相互作用)的部分(如酶类或配体)。示例性的标记包括但不限于：放射性同位素³²p、¹⁴c、¹²⁵i、³h和¹³²i、荧光团(如稀土螯合物或者荧光素和其衍生物)、罗丹明和其衍生物、丹酰、伞形酮、荧光素酶类，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利第4,737,456号)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮类、辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶类如尿酸氧化酶和黄嘌呤氧化酶、利用过氧化氢来氧化染料前体与酶偶联的，例如hrp、乳过氧化物酶、或微过氧化物酶、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、噬菌体标记、稳定的自由基，等。

在某些实施例中，将抗体固定化于可溶性基质上。固定化会涉及到将抗突变smo抗体从在溶液中处于游离状态的任何突变smo中分离。这通常是通过如下方式而完成：在测定步骤前使抗突变smo抗体不溶解，如被吸附到水不溶性基质或表面(bennich等人，u.s3,720,760)；或者共价偶联(例如，利用戊二醛交联)；或者通过在抗突变smo抗体与突变smo之间形成复合物之后使抗突变smo抗体不溶解(例如通过免疫沉淀)。

当然，代替或除抗突变smo抗体外，可利用本公开的免疫缀合物来执行诊断或检测的任何上述实施例。

b.用核酸探针对突变smo进行检测的方法。

在一个方面，本文中所描述的核酸探针可用于在生物样本中检测突变smo核酸的存在。本文中所使用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施例中，生物样本包括细胞或组织，如肿瘤组织。

在一个方面，本公开提供一种在生物样本中检测突变smo编码核酸的存在的方法。在某些实施例中，所述方法包括使取自生物样本的核酸与本文中所描述的探针接触；在严格条件下，在允许杂交的的情况下，将探针杂交到核酸；以及检测在探针与核酸样本之间是否形成复合物。

突变smo编码核酸可利用本领域已知的任何方法进行检测，包括但不限于：使用本文中所描述的探针，或者利用pcr扩增、rtpcr测序、单链构象多态性(sscp)、dna的差异性限制性消化、杂交，或者本领域已知的任何其它方法。

在这些方法中，在细胞中检测如本文中所描述的突变smo表明与增强的突变smo表达相关病症的存在(即，对使用smo抑制剂(如gdc-0449)的治疗具有耐受性)。在某些实施例中，测试细胞是从疑似患有与突变smo表达有关的耐药性肿瘤的个体中获得。如上面的详述，应理解的是，突变可以是在取自样本的一个亚组的细胞中，如取自肿瘤样本的一个亚组的细胞。

可利用本公开的抗体进行诊断的示例性病症包括但不限于：髓母细胞瘤、胰腺癌、基底细胞癌。

c.在基于细胞的测定中检测突变smo的方法

可在本领域已知的基于细胞的测定中对突变smo进行检测，包括但不限于使突变smo蛋白检测抗体结合到细胞样本(例如肿瘤样本)表面、进行体外肿瘤样本或疑似含有突变smo的组织的组织学制品的免疫组织化染色。功能性测定，其中使组织样本与gdc-0449和刺猬接触，以确定是否发生hh信号传导(例如，通过测量途径成员的活化、gli的表达等)。使用hh信号传导途径(可以利用gdc-0449中断)的任何功能测定可用于本公开的方法，以确定突变smo的存在和活性。

d.筛选与突变smo结合的化合物的方法

在一些实施例中，本公开提供一种筛选能够抑制细胞中的刺猬信号传导的刺猬途径抑制剂的方法，所述细胞表达本文中公开的任何突变smo蛋白。在一些实施例中，筛选是单个药剂的或离散数量药剂的。在一些实施例中，筛选是药剂库的。在一些实施例中，筛选是高通量筛选。在一些实施例中，筛选是化合物文库的(例如，小分子的文库、反义寡核苷酸的文库，或者抗体或肽类的文库)。在一些实施例中，筛选可包括单独的一级测定，或者一级测定和一个或多个二级测定。在一些实施例中，可在测定中对药剂进行评估(例如，刺猬信号传导测定(例如，通过使用本文中所描述的任何gli1表达测定，或者本领域中已知的用于检查对药剂产生反应的glil核酸或蛋白质表达)；突变smo结合测定(例如，通过利用本文中所描述的任何突变smo结合测定)、细胞增殖测定(例如，通过采用本文中所描述的或本领域中已知的细胞增殖测定)。在筛选测定中的应用是本公开的突变smo蛋白和核酸的示例性应用(例如，突变smo蛋白可用于无细胞或基于细胞的测定；可以将突变smo核酸提供于载体中并且用于在适用于筛选测定的宿主细胞或宿主生物中表达突变smo蛋白。

本公开提供一种用于筛选与突变smo结合的化合物的方法。在不局限于任何具体运行模式的情况下，预计gdc-0449与野生型smo蛋白结合而不与突变smo结合；用作突变smo的抑制剂的化合物将会与突变smo结合。因此，可表达突变smo蛋白或其片段，如包括全部或一部分的跨膜域6(tm6)的片段，并且使用化合物的文库并通过本领域中已知的任何方法执行结合测定。另外，也可利用基于gdc-0449的潜接触点的模型化方法而使用由gdc-0449的变异所代表的化合物的较小文库，然后将突变smo和gdc-0449的变异的类似接触点模型化。这种模型化程序和算法可以是本领域中已知的任何程序和算法。可确认与突变smo和野生型smo蛋白结合的化合物是野生型和突变smo两者的抑制剂。可替代地，可发现与突变smo结合的化合物，但这些化合物不与野生型smo蛋白结合，因此是仅用于突变smo的抑制剂。在某些实施例中，对结合和/或一些其它读出(例如，刺猬信号传导)进行评估，并且与用于野生型smo蛋白或合适对照物(例如，空载体)进行比较。

在一个实施例中，被筛选的化合物是小分子化合物，如gdc-0449的变体。在其它实施例中，与突变smo结合的化合物是特异性地识别表位的抗体，所述表位与野生型smo蛋白和gdc-0449的结合位点在相同的区域中。在一个实施例中，抗体与在突变smo的tm7的氨基末端部的区结合，并且抑制突变smo活性。

可替代地或另外地，可对各化合物抑制突变smo活性的能力进行筛选。在这些实施例中，可以对这些化合物在表达突变smo的细胞中抑制刺猬信号传导的能力进行评估。可在细胞中执行这些测定，所述细胞具有完整的刺猬信号传到途径，但是表达带有突变的重组smo蛋白(代替或除野生型smo外)。在这些测定中，确定在候选抑制剂的存在或不存在下用刺猬进行温育时所述细胞具有活性刺猬信号传导的能力。如果在候选化合物的存在下刺猬信号传导被抑制，那么这种化合物是刺猬抑制剂。在一些实施例中，细胞表达野生型smo和突变smo两者，并且使用gdc-0449和候选抑制剂进行温育。在其它实施例中，细胞仅表达突变smo，并且可单独使用hh和候选抑制剂(即，在gdc-0449)进行温育。如果在这种细胞中hh信号传导被减小或抑制，那么所述化合物是突变smo的抑制剂。

在一些实施例中，本公开提供一种鉴定刺猬途径抑制剂的方法，其中所述方法包括：(a)使细胞与一定量的试验药剂接触，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者具有增强的刺猬信号传导和/或刺猬信号传导途径的激活，并且其中所述细胞表达本文中所描述的任何突变smo蛋白；和(b)确定与对照物相比所述试验药剂是否抑制细胞中的刺猬信号传导，其中如果相对于对照物所述试验药剂抑制细胞中的刺猬信号传导，则将所述试验药剂鉴定为刺猬途径抑制剂。在一些实施例中，对照物(或用于比较的基准物)是表达野生型smo蛋白(例如，具有seqidno:1的氨基酸序列的smo蛋白)的细胞。在一些实施例中，对照物是表达和与试验药剂接触的细胞相同的突变smo蛋白的细胞，其中对照物是未处理的，或使用突变smo蛋白部分或完全地耐受的对照物进行处理的。在一些实施例中，对照物是维莫德吉、ly2940680、lde225和/或化合物5。在一些实施例中，试验药剂与突变smo蛋白结合但不与野生型smo蛋白结合。在一些实施例中，试验药剂与突变smo蛋白和野生型smo蛋白两者结合。在一些实施例中，与在表达野生型smo蛋白的细胞中相比，试验药剂可更有效地抑制表达突变smo蛋白的细胞中的刺猬信号传导。

在一些实施例中，本公开提供一种鉴定刺猬途径抑制剂的方法；其中所述方法包括：(a)使细胞与一定量的药剂接触，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者具有增强的刺猬信号传导和/或刺猬信号传导途径的激活，并且其中所述细胞表达本文中所描述的任何突变smo蛋白；和(b)确定与对照物相比所述药剂是否抑制细胞的生长和/或增殖，其中如果相对于对照物所述药剂抑制细胞的生长和/或增殖，则将所述药剂鉴定为刺猬途径抑制剂。在一些实施例中，对照物是表达野生型smo蛋白(例如，具有seqidno:1的氨基酸序列的smo蛋白)的细胞。在一些实施例中，对照物是和与试验药剂接触的细胞相同的突变smo的细胞，其中所述对照物未处理，或使用突变smo部分或完全地耐受的对照物进行处理或处理。在一些实施例中，对照物是维莫德吉、ly294068q、lde225和/或化合物5。在一些实施例中，试验药剂与突变smo结合但不与野生型smo蛋白结合。在一些实施例中，试验药剂与突变smo和野生型smo蛋白两者结合。在一些实施例中，与在表达野生型smo蛋白的细胞中相比，试验药剂可更有效地抑制表达突变smo的细胞的生长和/或增殖。

在一些实施例中，在本文中所描述的筛选方法中使用的细胞是在培养物中。在一些实施例中，与培养物中的细胞接触的药剂足以，部分和全部地，抑制细胞培养物种至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％细胞中的刺猬信号传导。在一些实施例中，在培养物中与细胞接触的药剂足以降低细胞培养物中至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％细胞中的细胞增殖速率和/或存活率，其中这些细胞或过度表达猬或者具有活性刺猬信号传导。

在其它实施例中，所述细胞是在动物中。在一些实施例中，动物是哺乳动物或其它脊椎动物。在一些实施例中，动物是产后动物。在一些实施例中，动物是儿童。在一些实施例中，动物是成人。当提到体外的细胞时，这些细胞可属于任何脊椎动物物种，例如哺乳动物，如啮齿动物、仓鼠或人。体外或体内，细胞可以是癌细胞，如原发性癌细胞、转移癌细胞或癌细胞系。在一些实施例中，细胞是髓母细胞瘤细胞。在一些实施例中，细胞是基底细胞癌细胞。在一些实施例中，细胞是痣样基底细胞癌细胞。在一些实施例中，细胞是gorlin综合征细胞。

在一些实施例中，细胞包括在刺猬信号传导途径基因中的一个或多个突变。在一些实施例中，一个或多个突变是打补丁的。在一些实施例中，补丁突变是功能丢失突变。在一些实施例中，一个或多个突变是在平滑蛋白中。在一些实施例中，平滑化突变是平滑化功能获得性突变。在一些实施例中，功能获得性平滑化突变形成构成性活性的平滑蛋白。在一些实施例中，一个或多个突变是在融合抑制剂，并且细胞具有融合抑制剂(sufu)功能丢失。在一些实施例中，sufu突变导致sufu活性的部分功能丢失。在一些实施例中，sufu突变导致sufu活性中的全部功能丢失。在一些实施例中，sufu突变赋予对维莫德吉的耐药性。

在一些实施例中，在本文中所描述的任何筛选方法中测试的药剂是小分子。在其它实施例中，所述药剂是多肽。在其它实施例中，所述药剂是sirna拮抗剂。

在本文中所描述任何筛选方法的一些实施例中，在细胞中外源性地表达突变smodna。在一些实施例中，在细胞中稳定地表达突变smodna。在一些实施例中，在细胞中短暂地表达突变smodna。

可以通过本领域中已知的方法对可用于本公开的各种刺猬途径抑制剂的生长抑制效果进行评估，例如使用外源性地表达突变smo多肽或者使用各自突变smo基因转染后的细胞。例如，可用本公开的刺猬途径抑制剂，将适当的用突变smo编码dna转染的肿瘤细胞系和细胞在各种浓度下处理达数天(例如，2至7天)并且用结晶紫、mmt染色，或者通过一些其它比色或基于萤光素酶的(例如celltiterglo)测定进行分析。另一个测量增殖的方法将会是通过比较这种刺猬途径抑制剂存在或不存在下处理的细胞对³h-胸苷的摄取。在处理后，采集细胞并且将所述量的放射活性并入在闪烁计数器中定量的dna。合适的阳性对照物包括用生长抑制性抗体或已知抑制所述细胞系生长的小分子对所选择的细胞系进行处理。可以本领域中已知的各种方式，对肿瘤细胞的体内生长抑制进行测定。在一些实施例中，肿瘤细胞是具有在刺猬途径信号传导基因中的一个或多个突变的肿瘤细胞。在一些实施例中，与未处理的肿瘤细胞相比，这种刺猬途径抑制剂将在体外或体内抑制刺猬表达肿瘤细胞的细胞增殖达约10至25％、约25至100％、约30至100％、约50至100％或约或70至100％。可以在在细胞培养物中约0.5至30μg/ml、约0.5μm至200μm、约200nm至1μμ、约1μμ至5μμ或约5μμ至10μμ的刺猬途径抑制剂浓度下对生长抑制进行测量，其中在使肿瘤细胞暴露于拮抗剂1至10天后对生长抑制进行测定。如果以约1μg/kg至约100mg/kg体重施用拮抗剂和/或激动剂导致从抗体或小分子拮抗剂的第一次施用后约5天至3个月内(在一些实施例中，约5至30天内)肿瘤大小减小或肿瘤细胞增殖减少，那么所述拮抗剂在体内是生长抑制的。

在一些实施例中，为了选择诱导细胞死亡的刺猬途径抑制剂，可相对于对照物，对例如碘化丙啶(pi)、台盼蓝或7aad摄取所指示的膜完整性的丢失进行评估。可在补体和免疫效应细胞不存在下，执行pi摄取测定。在一些实施例中，将突变smo蛋白表达肿瘤细用培养基单独进行温育，或者在含有合适的刺猬途径抑制剂的培养基中进行温育。将细胞温育3天。在各处理后，将细胞清洗并等分入用35mm容器加盖的12×75管中(1ml每管，每处理组3管)，用以除细胞团块。各管然后接受pi(10μg/m1)。可利用流式细胞仪和cellquest软件(bectondickinson)或任何本领域技术员用于分析的其它装置，对各样本进行分析。然后，可选择诱导具有统计学意义水平的细胞死亡(如通过pi摄取所确定)的刺猬途径抑制剂。

在一些实施例中，为了筛选结合到突变smo多肽上的表位的刺猬途径抑制剂，可以执行常规的交叉阻断测定，如在《抗体：实验室手册(antibodies:alaboratorymanual)》冷泉港实验室，edharlow和davidlane编著(1988年)中所描述。所述测定可用于判定测试抗体、多肽、寡肽或其它有机分子是否与和已知的刺猬途径抑制剂相同的位点或表位相结合。可替代地或另外地，可利用本领域中已知的方法执行表位映射。例如，可对突变smo序列进行诱变处理，例如通过丙氨酸扫描或者通过用免疫学不同的gpcr蛋白制作嵌合体，以鉴定接触残基。最初对与多克隆抗体结合的突变抗原进行测试，以确保适当的折叠。在不同的方法中，与突变smo蛋白的不同区域相对应的肽类可以与测试抗体或与具有特征化和已知表位的测试抗体和抗体一起用于竞争测定。

在一些实施例中，通过共价或非共价接合，将突变smo蛋白或候选刺猬途径抑制剂固定化于固相上，例如在微升板上。非共价接合通常是通过用突变smo蛋白或候选刺猬信号传导药剂的溶液来涂覆固体表面，并且干燥而完成。可替代地，对被固定化的突变smo的靶部具有特异性的固定化抗体(例如单克隆抗体)可用于将其固定到固体表面。测定可通过将利用可检测标记加标记的非固定化成分添加到固定化成分(例如含有被固定成分的涂覆表面)而执行。当反应完成时，可将未反应的成分去除(例如通过清洗)，并且对被固定于固体表面上的复合物进行检测。当最初非固定化成分携带可检测标记时，对被固定化于表面上的标记的检测表明发生复合过程。如果最初非固定化成分不携带标记，可以对复合过程进行检测，例如通过使用特异性地结合到固定化复合物的标记抗体。

如果候选刺猬途径抑制剂与本文中定义的刺猬信号传导多肽相互作用但不直接地与刺猬信号传导多肽结合，那么可以利用公知的用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法对其与多肽的相互作用进行测定。这种检测包括传统的方法，例如交联、共免疫沉淀和经过梯度或层析柱的共纯化。另外，可通过使用酵母基遗传体系对蛋白质-蛋白质相互作用进行监测，描述于fields和同事(fields和song，《自然(nature)》(伦敦)340:245-246(1989)；chien等人《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa，88:9578-9582(1991))如由chevray和nathans，《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa.)》89:5789-5793(1991)所公开。许多转录激活因子(如酵母菌gal4)是由两个物理离散的模块化区所组成，一个用作dna结合域，另一个用作转录-活化结构域。在前述申请中所描述的酵母菌表达系统(通常被称为“二杂交系统”)利用了此性质，并且使用两个杂交蛋白，在一个中靶蛋白融合到gal4的dnα结合域，而在另一个中候选激活蛋白融合到活化域。在gal4激活启动子控制下，gali-lacz报告基因的表达取决于经由蛋白质-蛋白质相互作用对gal4活性的重建。利用β-半乳糖苷酶的发色底物，对含有相互作用多肽的群体进行检测。利用二杂交技术鉴定在两个具体蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用的完整试剂盒(matchmaker^tm)可从clontech购得。所述系统也可以扩展至对参与特定蛋白质相互作用的蛋白结构域进行映射，以及查明对于这些相互作用是关键性的氨基酸残基。

可以多种方式执行测定，包括蛋白质-蛋白质结合测定、生物化学筛选测定、免疫测定以及基于细胞的测定，这些方式在本领域中具有显著特征。

可以利用本领域技术人员公知的方法，对干扰刺猬信号传导多肽与其它细胞内或细胞外成分(例如，costal-2)相互作用的药剂进行测定。在一些实施例中，含有突变smo多肽及细胞内和细胞外成分的反应混合物，是在允许两个产物的相互作用和结合的条件和时间下而制备。在一些实施例中，为了测试候选化合物抑制结合的能力，反应是在试验化合物不存在和存在的情况下完成。另外，可将安慰剂添加到第三反应混合物中，用作阳性对照物。对在试验化合物与存在于混合物中的细胞内或细胞外成分之间的结合(复合物形成)进行监测，如在上本文中所描述。复合物在对照物反应中而不是在含有试验药剂反应混合物中形，表明试验药剂干扰了试验化合物与其反应配偶体的相互作用。

本公开预期用于利用前述测定步骤中的任何一个或组合来鉴定刺猬途径抑制剂的方法。换句话说，可以将各种筛选测定加以组合以便鉴定具有例如特定活性的拮抗剂，或者确认在一个测定中拮抗突变smo的药剂中在单独的测定中也抑制刺猬信号传导。对于任何测定或鉴定的方法，可将结果与一个或多个合适的对照物(包括阳性和/或阴性对照物)进行比较。

就用于筛选和/或鉴定刺猬途径抑制剂的任何前述测定方法而言，可单独地或集中地对各药剂进行筛选。可从药剂的文库或一组候选药剂中筛选药剂。可被筛选的合适药剂包括但不限于：抗体、抗体片段、肽类、反义寡核苷酸、rnai以及小分子(例如，布罗莫结构域抑制剂)。

在一些实施例中，本文中所公开的任何筛选方法中所使用的细胞包括在导致刺猬信号传导的激活或增加的基因中的一个或多个突变。在一些实施例中，在补丁基因中的一个或多个突变导致补丁的功能丢失。在一些实施例中，在补丁基因中的一个或多个突变形成突变基因，所述突变基因编码具有下列突变中的一个或多个的补丁蛋白：s616g、fs251、e380*、q853*、w926*、p1387s、sp2667、q501h、fs1017、fs108或a1380v。

在一些实施例中，在导致激活或增加的刺猬信号传导的基因中的一个或多个突变是在平滑化状态中，并且所述细胞具有平滑化突变。在一些实施例中，平滑化突变是平滑化功能获得性突变。在一些实施例中，功能获得性平滑化突变形成构成性活性平滑蛋白。参见例如wo2011/028950；wo2012047968和wo2015/120075，其内容通过引用并入本文中。

在一些实施例中，平滑蛋白在与seqidno:1的位置529相对应的位置处包括突变。在一些实施例中，突变是在位置529或者在seqidno:1中的所述对应位置处的g529s。在一些实施例中，平滑蛋白在与seqidno:1的位置529相对应的位置包括突变和至少一个另外的突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置241相对应位置处的突变，例如在位置241或与seqidno:1的所述位置相对应位置处的t241m突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置281相对应位置处的突变，例如在位置281或者在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的w281c突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置321相对应位置处的突变，如在位置321或在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的v321m突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置408相对应位置(如位置408)处的突变，例如在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的i408v突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置412相对应位置处的突变，如在位置412或在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的l412f突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置459相对应位置处的突变，如在位置459或者在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的a459v突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置469相对应位置处的突变，如在位置469或在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的c469y突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置473相对应位置处的突变，如在位置473或在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的d473h突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置518相对应位置处的突变，如在位置518或在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的e518k或e518a突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置533相对应位置处的突变，如在位置533或在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的s533n突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置535相对应位置处的突变，如在位置535或者在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的w535l突变。在一些实施例中，另外的平滑化突变是在与seqidno:1的位置562相对应位置处的突变，如在位置562或在与seqidno:1的所述位置相对应位置处的r562q突变。在一些实施例中，平滑化突变具有致使它对某些平滑化抑制剂产生耐药性的替代突变。

在一些实施例中，一个或多个突变是在刺猬基因中，并且导致刺猬蛋白的过度表达。在一些实施例中，过度表达的刺猬蛋白是索尼克刺猬蛋白。在一些实施例中，过度表达的刺猬蛋白是印第安刺猬蛋白。在一些实施例中，过度表达的刺猬蛋白是沙漠刺猬蛋白。

在一些实施例中，一个或多个突变是在融合阻抑蛋白中，并且细胞具有融合阻抑基因(sufu或sufu)功能丢失。在一些实施例中，导致sufu活性中的功能丢失。在一些实施例中，sufu突变是在髓母细胞瘤、脑膜瘤、腺样囊性癌、基底细胞癌以及横纹肌肉瘤癌细胞中。在一些实施例中，sufu突变是在brugieres等人，2012,jco,30(17):2087-2093中所描述的任何突变，其整体并入本文。在一些实施例中，sufu突变是在表1或表2中所描述的任何突变或者在brugieres等人，2012,jco,30(17):2087-2093中所描述的任何突变，其整体并入本文。

表2：种系sufu突变

缩写：mb，髓母细胞瘤；mben具有广泛结节性的髓母细胞瘤；na，难得到；nos，未另行规定

表3.种系致病性sufu突变

缩写：uv，未知的变体。

在一些实施例中，sufu突变包括在与在seqidno:4位置15、184、123、295、187中的下列氨基酸位置的任意位置相对应位置的突变。在某些实施例中，sufu突变包括下列中的任意一个或多个：p15l、q184x、r123c、l295fs、或p187l，其中所述突变是在所述位置或者在与在seqidno:4中所陈述位置相对应的位置。在一些实施例中，sufu突变是与seqidno:5的c.1022+1g>a(ivs8-1g>t)、c.72delc、c.72insc、143msa、c.846inc、或ivs1-1α->t相对应的任何突变。在一些实施例中，sufu突变是在taylor等人(2002年)《natgenet》31:306-310中所描述的任意突变(例如，1vs8-1g>t(＝c.1022+1g>a)，1129del、p15l和ng的两个(全部+loh))；slade等人(2011年)《famcaner》10:337-342,2011(例如，c.1022+1g>a；c.848insc)；pastorino等人(2009年)《美国医学遗传学杂志a辑(amjmedgeneta)》149a:1539-1543(例如，c.1022+1g>a)；ng等人(2005年)《美国医学遗传学杂志a辑(amjmedgeneta)》134:399-403(例如，143insa；ivs1-1a>t)；kijima等人(2012年)《famccancer1》1:565-70(例如，c.550c>t(q184x))；aavikko等人(2012年)《国人类遗传学杂志(amjhumgenet)》91:520-526(例如，c.367c>t(r123c))；stephens等人(2013年)《临床研究杂志(jclininvest)》123:2965-2968(例如，x881_882insg(l295fs))；或者reifenberger等人(2005年)《英国皮肤病学杂志(britjdermatology)》152:43-51。

在一些实施例中，细胞是人细胞并且具有染色体10重复和/或一部分的10q的缺失，其中所述部分含有sufu和pten。在一些实施例中，所述细胞包括fs1017sufu突变。

在一些实施例中，本文中所描述任何筛选方法中所使用的细胞是其中刺猬信号传导途径是活性的细胞。在一些实施例中，细胞是其中刺猬信号传导途径是构成性活性的细胞。在一些实施例中，细胞是已用刺猬蛋白或刺猬激动剂进行刺激的细胞。在一些实施例中，在细胞中刺猬途径的活性是通过在gil-萤光素酶报告基因测定中监测gil1水平或活性而确定。

在一些实施例中，本文中所描述的任何筛选方法中所使用的细胞是在培养物中的细胞。在一些实施例中，本公开提供一种包括与包括多个细胞的培养物接触的方法。在一些实施例中，细胞是在脊椎动物中。在一些实施例中，细胞是在哺乳动物中，并且使细胞接触包括将刺猬信号传导抑制剂施用于哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物是人受试对象。在一些实施例中，细胞是癌细胞并且/或者哺乳动物是诊断患有癌症的哺乳动物。在一些实施例中，癌细胞是选自由以下组成的组群的癌细胞：结肠、肺、前列腺、皮肤、血癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、膀胱、骨癌、脑癌、髓母细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胃癌、卵巢、食管癌、胰腺癌或睪丸癌细胞。在一些实施例中，癌细胞是髓母细胞瘤细胞、基底细胞癌细胞或痣样基底细胞细胞癌细胞(gorlin综合征细胞)。

在某些实施例中，一旦药剂被鉴定为刺猬途径抑制剂，那么可以对所述药剂进行配制并且在基于细胞或动物的测定中进行进一步的评估。例如，可在基于细胞或动物的癌症模型中对所述药剂进行测试，以便评估其作为抗癌药剂的疗效。

vi.治疗的方法

在一些实施例中，本公开涉及对具有本文中所描述的任何平滑化突变的表达smo蛋白的细胞的分化状态、存活和/或增殖进行调节的方法。在一些实施例中，细胞是在受试对象中(例如，人患者)。在一些实施例中，细胞是在培养物中，并且方法包括体外方法。在某些实施例中，细胞是癌细胞。在某些实施例中，细胞特征为不需要的或异常的细胞增殖。在一些实施例中，细胞包括或已被预测表达包括本文中所描述任何平滑化突变。在某些实施例中，细胞已被预测表达包括相对于野生型人smo的突变的平滑化多肽，在与seqidno:1的529相对应的氨基酸处的突变。在一些实施例中，细胞已被预测表达包括至少两个突变的平滑化多肽，其中至少一个的突变是在与seqidno:1的氨基酸位置529相对应的氨基酸处，并且其中多肽还包括在与seqidno:1的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任何一个或多个氨基酸位置处的突变。在一些实施例中，细胞表达包括seqidno:1的g529s突变和任选地任何下列取代：t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e5i8as533n和/或w535l的平滑化多肽。

在一些实施例中，本公开提供一种减少细胞中的刺猬信号传导的方法，其中所述细胞表达具有本文中所描述的任何平滑化突变的平滑化蛋白，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者包括在刺猬信号传导途径基因中的一个或多个突变(例如，刺猬信号传导途径的成分)，其中在配体不存在的情况下一个或多个突变导致增强的刺猬信号传导和/或刺猬信号传导途径的激活；其中所述方法包括使细胞与有效量的药剂接触的步骤，其中药剂是猬途径抑制剂。在一些实施例中，药剂是选择性地结合并抑制突变平滑化蛋白的化合物。在一些实施例中，药剂抑制在细胞中突变平滑化蛋白的下游位置发挥作用的刺猬信号传导途径的成分。在其它实施例中，药剂是布罗莫结构域抑制剂。

在一些实施例中，本公开提供一种用抗癌治疗剂对患有癌症的受试对象进行治疗的方法；其中所述受试对象包括和/或已确定表达突变smo蛋白，其中所述突变smo蛋白具有在与seqidno:1的位置529的位置相对应位置处的除甘氨酸外的氨基酸。在一些实施例中，本公开提供一种抑制细胞中的刺猬信号传导的方法，其中所述细胞表达具有在与seqidno:1的位置529相对应位置处的除甘氨酸外的氨基酸突变smo蛋白。在一些实施例中，本公开提供一种对患有癌症的受试对象进行诊断的方法；所述方法包括下列步骤：(a)从受试对象中获得样本；(b)对所述样本进行测试，以判定编码具有在与seqidno:1的位置529相对应位置处的除甘氨酸外的氨基酸的突变smo的核酸的存在，其中如果所述样本包含所述突变smo蛋白，那么所述受试对象患有癌症。在一些实施例中，癌症是基底细胞癌。在一些实施例中，突变smo蛋白具有在与seqidno:i的氨基酸位置529相对应的氨基酸位置处的丝氨酸。在一些实施例中，癌症包括具有在至少一个氨基酸位置处的另外突变的平滑化蛋白，所述氨基酸位置选自由以下组成的群组：与seqidno:1的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的氨基酸位置。

在一些实施例中，本公开提供一种抑制不需要的细胞生长、增殖或存活的方法，其中所述细胞表达具有本文中所描述的任何平滑化突变的平滑化蛋白，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者包括在刺猬信号传到途径基因中的一个或多个突变，其中一个或多个突变在配体不存在的情况下导致增强的刺猬信号传导和/或刺猬信号传导途径的激活；其中所述方法包括使细胞与有效量的药剂接触的步骤，其中所述药剂是刺猬途径抑制剂。在一些实施例中，药剂是选择性地结合并抑制突变平滑化蛋白的药剂。在一些实施例中，药剂抑制在细胞中突变平滑化蛋白的下游位置发挥作用的刺猬信号传导途径的成分。在一些实施例中，药剂是布罗莫结构域抑制剂。

在一些实施例中，本公开提供一种抑制肿瘤细胞的生长、增殖或存活的方法，其中所述肿瘤细胞表达具有本文中所描述的任何平滑化突变的平滑化蛋白，其中所述细胞对刺猬蛋白有反应或者包括在刺猬信号传导途径基因中的一个或多个突变，其中一个或多个突变导致在配体不存在下增强的刺猬信号传导和/或对刺猬信号传导途径的激活；其中所述方法包括使细胞与有效量的药剂接触的步骤，其中药剂是刺猬途径抑制剂。在一些实施例中，药剂是选择性地结合并抑制突变平滑化蛋白的药剂。在一些实施例中，药剂抑制在细胞中突变平滑化蛋白的下游位置发挥作用的刺猬信号传导途径的成分。在其它实施例中，药剂是布罗莫结构域抑制剂，在一些实施例中，所述方法包括将药剂施用于需要的患者。

在一些实施例中，用本文中所公开的任何方法处理的细胞包括导致刺猬信号传导的激活或增强的基因中的一个或多个突变。在一些实施例中，一个或多个突变是在导致打补丁的功能丢失的补丁基因中。在一些实施例中，在补丁基因中的一个或多个突变形成突变基因，所述突变基因对具有一个或多个下列突变的补丁蛋白进行编码：s616g、fs251、e380*、q853*、w926*、p1387s、sp2667、q501h、fs1017、fs108或a1380v。

在一些实施例中，在导致刺猬信号传导激活或增强的基因中的一个或多个突变是处于平滑化的状态，并且所述细胞具有平滑化突变。在一些实施例中，平滑化突变是平滑化功能获得性突变。在一些实施例中，功能获得性平滑化突变导致构成性活性的平滑化蛋白。参见例如wo2011/028950、wo2012047968和wo2015/120075，其通过引用并入本文。在一些实施例中，平滑化突变是在与seqidno:1的位置529相对应的氨基酸位置处的突变，如在位置529或seqidno:1的对应位置处的g529s突变。在一些实施例中，smo蛋白包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，条件是在氨基酸位置529处存在取代，并且其中蛋白质还包括在与seqidno:1的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任何一个或多个氨基酸位置处的至少一个另外的突变。在一些实施例中，smo蛋白包括与seqidno:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列包括在与seqidno:1的位置529相对应氨基酸位置处的除甘氨酸(g)外的氨基酸，并且其中氨基酸序列还包括下列取代中的任意一个或多个：t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e518a、s533n和/或w535l。

在一些实施例中，一个或多个突变是在刺猬基因中并且导致过度表达的刺猬蛋白。在一些实施例中，过度表达的刺猬蛋白是索尼克刺猬蛋白。在一些实施例中，过度表达的刺猬蛋白是印第安刺猬蛋白。在一些实施例中，过度表达的刺猬蛋白是沙漠刺猬蛋白。

在一些实施例中，一个或多个突变是在融合阻抑蛋白中，并且所述细胞具有融合阻抑蛋白(sufu或sufu)功能丢失。在一些实施例中，导致在sufu活性中的功能丢失。在一些实施例中，sufu突变是在髓母细胞瘤、脑膜瘤、腺样囊性癌、基底细胞癌以及横纹肌肉瘤癌细胞中。在一些实施例中，sufu突变是在brugieres等人，2012年，ico，30(17):2087-2093中所描述的任何突变，其整体并入本文。在一些实施例中，sufu突变是在表2或表3中所描述的任何突变或者在brugieres等人，2012年，jco，30(17):2087-2093中所描述的任何突变，其整体并入本文。

表2：种系sufu突变

缩写：mb，髓母细胞瘤；mben具有广泛结节性的髓母细胞瘤；na，不可用；nos，未另行规定

表3.种系致病性sufu突变

缩写：uv，未知的变体。

在一些实施例中，sufu突变包括在与在seqidno:4:位置15、184、123、295、187中的任何下列氨基酸位置相对应位置处的突变。在某些实施例中，sufu突变包括p15l、q184x、r123c、l295fs或p187l中的任意一个或多个，其中突变是在所述位置或者在与seqidno:4中所陈述位置相对应的位置。在一些实施例中，sufu突变是与seqidno:5的c.1022+1g>a(ivs8-1g>t)、c.72delc、c.72insc、143insa、c.846insc或ivs1-1α->t相对应的任何突变。在一些实施例中，sufu突变是taylor等人(2002年)《自然遗传学(natgenet)》31:306-310中所描述的任何突变(例如，ivs8-1g>t(＝c.1022+1g>a)，1129del、p15l和ng的两个(所有+loh))；slade等人(2011年)《家族性癌症(famcancer)》10:337-342,2011(例如，c.1022+1g>a；c.848msc)；pastorino等人(2009年)《amjmedgeneta》149a:1539-1543(例如，c.1022+1g>a)；ng等人(2005年)《amjmedgeneta》134:399-403(例如，143insa；ivsma>t)；kijima等人(2012年)《家族性癌症(famcancer)》11:565-70(例如，c.550c>t(q184x))；aavikko等人(2012年)《美国人类遗传学杂志(amjhumgenet)》91:520-526(例如，c.367c>t(r123c))；stephens等人(2013年)《jclininves》123:2965-2968(例如，x881_882insg(l295fs))；或reifenberger等人(2005年)《英国皮肤病学(britjdermatology)》152:43-51(例如，c560c>t(p187l))。

在一些实施例中，细胞是人细胞并且具有染色体10重复和/或一部分的10q的缺失，其中所述部分含有sufu和pten。在一些实施例中，细胞包括fs1017sufu突变。

在一些实施例中，用本文中所描述的任何方法处理的细胞是其中述刺猬信号转动途径是活性的细胞。在一些实施例中，细胞是其中刺猬信号传导途径是构成性活性的细胞。在一些实施例中，细胞是已用刺猬蛋白或刺猬激动剂进行刺激的细胞。在一些实施例中，在细胞中的刺猬途径的活性是通过在gli-萤光素酶报告基因测定中检测glil水平或活性而确定。

在一些实施例中，利用本文中所描述的任何方法进行处理的细胞是在培养物中的细胞。在一些实施例中，本公开提供一种包括使包括多个细胞的培养物接触的方法。在一些实施例中，细胞是在脊椎动物中。在一些实施例中，细胞是在哺乳动物中，并且与细胞接触包括将刺猬信号传导抑制剂施用于哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物是人受试对象。在一些实施例中，细胞是癌细胞并且/或者哺乳动物是诊断患有癌症的哺乳动物。在一些实施例中，癌细胞是选自由以下组成的组群的癌细胞：结肠癌、肺癌、前列腺癌、皮肤癌、血癌、肝癌、肾癌、乳腺癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、髓母细胞瘤、肉瘤、基底细胞癌、胃癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌或睪丸癌细胞。在一些实施例中，癌细胞是髓母细胞瘤细胞、基底细胞癌细胞或痣样基底细胞细胞癌细胞(gorlin综合征细胞)。

在一些实施例中，本文中公开的任何方法中所使用的刺猬途径抑制剂是抑制本文中所描述的任何突变平滑蛋白的表达的多核苷酸分子。在一些实施例中，多核苷酸分子是特异性地杂交到编码本文中所公开的任何突变平滑蛋白的核酸的反义寡核苷酸。在一些实施例中，反义分子不杂交到编码野生型平滑蛋白的核酸(例如，编码具有seqidno:1的序列的蛋白质的核酸)。在一些实施例中，刺猬途径抑制剂是将编码任何本文中所公开突变平滑化多肽类的mrna转录物作为靶的rnai拮抗剂。在一些实施例中，rnai拮抗剂是sirna。在一些实施例中，sirna具有19至23个核苷酸的长度。在一些实施例中，sirna是双链的，并且包括在一端或两端的短单链突出端。在一些实施例中，sirna将编码任何本文中所公开的突变平滑化多肽类的mrna转录物作为靶。在一些实施例中，rnai或sirna不将编码野生型平滑蛋白的mrna转录物(例如，编码具有seqidno:1的序列的蛋白质的核酸)作为靶。在一些实施例中，rnai包括shrna。

在一些实施例中，本文中公开的任何方法中所使用的刺猬途径抑制剂是与本文中所描述的任何突变平滑化多肽特异性地结合的小分子。在一些实施例中，小分子与在刺猬信号传导途径中在平滑化蛋白下游位置发挥作用的多肽结合。在一些实施例中，小分子在不同于刺猬信号传导途径的途径中与多肽结合。在一些实施例中，小分子是布罗莫结构域抑制剂。在一些实施例中，布罗莫结构域抑制剂是brd4抑制剂。在一些实施例中，布罗莫结构域抑制剂是在ciceri等人，2014年《自然化学生物学(naturechemicalbiology)》10:305-312；muller等人，2014年《药物化学通讯(medchemcommun)》5:288-296；gamier等人，2014,24(2):185-199中所描述的任何布罗莫结构域抑制剂，其整体并入本文。在一些实施例中，布罗莫结构域抑制剂是i-bet762、jq1、jq2、经bi-2536的brd4以及tg-101348。

在一些实施例中，本文中所公开任何方法中使用的刺猬途径抑制剂是与本文中所描述的任何突变平滑化多肽类特异性地结合的抗体。在一些实施例中，抗体与在刺猬信号传导途径中在平滑蛋白的下游位置发挥作用的多肽结合。在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。

在一些实施例中，根据本文中所描述的任何方法与药剂接触的细胞也与另一个刺猬信号传导途径的抑制剂(例如，hpi)接触。在一些实施例中，另外的刺猬信号传导途径抑制剂是藜芦型甾体生物碱。在一些实施例中，藜芦型甾体生物碱是环巴胺或kaad-环巴胺或者其任何功能性衍生物(例如，ipi-269609或iρι-926)。在一些实施例中，藜芦型甾体生物碱是蒜藜芦碱或者其任何功能衍生物。在一些实施例中，另外的抑制剂是维莫德吉、索尼德吉、bms-833923、pf-04449913或ly2940680或者其任何功能衍生物。在一些实施例中，另外的抑制剂是在化学上与藜芦生物碱无关的平滑化抑制剂或维莫德吉，包括但不限于：索尼德吉、bms-833923、pf-04449913、ly2940680、维莫德吉、bms-833923(xl319)、lde225(erismodegib)、pf-04449913、nvp-lde225、nvp-leq506、tak-441、xl-319、ly-2940680、sen450、伊曲康唑、mrt-10、mrt-83或pf-04449913)。在一些实施例中，另外的抑制剂是在amakye等人《自然医学(naturemedicine)》19(11):1410-1422中所公开的任何化合物(其整体并入本文)。在一些实施例中，另外的刺猬信号传导途径抑制剂是抗体。在一些实施例中，抗体是与刺猬蛋白结合例如特异性地结合的抗体。在一些实施例中，刺猬信号传导途径的另外的抑制剂是rnai拮抗剂。

需要进行治疗或诊断的受试对象包括已具有异常刺猬信号传导以及容易具有或其中常刺猬信号传导被阻止的受试对象。例如，如果根据本公开的方法，在接受刺猬途径抑制剂之后，患者显示下列中的一个或多个可观察和/或可测量的减小或不存在：肿瘤细胞数量的减少或这种细胞的不存在；肿瘤大小的减小；抑制(即，低于某种程度，并且在一些实施例中，停止)肿瘤细胞浸润入外周器官，包括癌扩散入软组织和骨；抑制(即，减慢至某种程度，并且在一些实施例中，停止)肿瘤的转移；抑制(至某种程度)肿瘤生长；和/或缓解(至某种程度)与特定的癌症相关的一个或多个症状；降低的发病率和死亡率及生活质量的改善，那么对异常刺猬信号传导的受试对象或哺乳动物成功地进行了“治疗”。为了使这种刺猬途径抑制剂可阻止存在的癌细胞的生长和/或杀死癌细胞，它可以是抑制细胞的和/或细胞毒性的。这些体征或症状的缓解也可被患者感觉到。另外，利用在皮肤取样活检中或毛囊中的gli1表达(如为维莫德吉所执行的)对是否成功地暴露于刺猬途径抑制剂(尤其是在其中没有肿瘤反应是可测量的情况下)进行监测。

在某些实施例中，用本文中所公开的任何刺猬途径抑制剂治疗的受试对象表达耐受维莫德吉的突变平滑蛋白。在一些实施例中，受试对象表达包括本文中所描述的任何平滑化突变的平滑蛋白。在某些实施例中，受试对象表达包括在与seqidno:1的529相对应氨基酸处的突变的平滑化多肽。在一些实施例中，受试对象表达包括在与seqidno:1的529s相对应的氨基酸处的突变平滑化多肽。在一些实施例中，受试对象表达包括在与seqidno:1的529相对应的氨基酸处的突变，其中多肽还包括在与seqidno:1的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任何一个或多个氨基酸位置处的至少一个另外的突变。在一些实施例中，受试对象表达包括seqidno:1的g529s突变的平滑化多肽，并且其中多肽还包括下列取代中的任意一个或多个：t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e518a、s533n和/或w535l。在一些实施例中，在用本文中所描述的任何治疗方法进行治疗之前，受试对象已被确定表达包括本文中所描述的任何平滑化突变的平滑蛋白。在某些实施例中，在用本文中所描述的任何治疗方法进行治疗之前，受试对象已被确定表达包括在与于seqidno:1的529相对应的氨基酸处的突变的平滑化多肽。在一些实施例中，在用本文中所描述的任何治疗方法进行治疗之前，受试对象已被确定表达包括在与seqidno:1的g529s相对应的氨基酸处的突变的平滑化多肽。在一些实施例中，在用本文中所描述的任何治疗方法进行治疗之前，受试对象已被确定表达包括在与seqidno:1的529相当应的氨基酸处的突变的平滑化多肽，其中多肽还包括在与seqidno:1的241、281、321、408、412、459、469、473、518、533和/或535相对应的任意一个或多个氨基酸位置处的至少一个另外的突变。在一些实施例中，在用本文中所描述的任何治疗方法进行治疗之前，受试对象已被确定表达包括seqidno:1的g529s突变的平滑化多肽，其中多肽还包括下列取代中的任意一个或多个：t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e518a、s33n和/或w35l。

用于评估成功治疗和疾病改善的上述参数可容易地利用医生所熟悉的常规步骤进行测量。就癌症治疗而言，可对疗效进行测量，例如通过评估到疾病进展的时间(ttp)和/或确定反应率(r)。转移可通过分级测试和用于钙水平和其它酶类的测试而确定，以便确定转移的程度。也可进行ct扫描，以观察向肿瘤或癌症外部的区域的扩散。与预测、诊断和/或治疗的过程有关的本文中所描述的公开内容包括例如glil表达的确定和评估。

用于治疗、疾病症状的缓解或诊断目的(例如，癌症)的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜、动物园动物、体育动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、雪貂等。在一些实施例中，所述哺乳动物是人。在一些实施例中，哺乳动物是产后的哺乳动物。在一些实施例中，所述哺乳动物是儿童。在一些实施例中，哺乳动物是成人。

“连同”一个或多个治疗剂的给药包括同时(并行)和按任意顺序的连续给药。

在某些实施例中，刺猬途径抑制剂是用于治疗癌症，所述癌症选自本文中所描述的任何癌症或者其中肿瘤的一个或多个细胞包括在刺猬途径成员中的突变(如本文中所描述的任何突变)的癌症。通常应理解的是并且在本文中特别指出的是，肿瘤包括可具有一定水平的异质性的细胞。因此，并非肿瘤中的所有细胞必定包括特定的有害突变。因此，本公开预期如下的方法，其中正在进行治疗的癌症或肿瘤包括具有在刺猬途径的成分的中的突变(如本文中所描述的任何突变)的细胞，即使这种突变不存在于肿瘤的每个细胞中。

还可预期的是，刺猬途径抑制剂的使用可特异性地将其中受影响的组织和/或细胞展示出高刺猬途径激活的病症作为靶。被刺猬信号传导途径激活的gli基因(包括glil和gli2)的表达始终与大范的刺猬信号传导或组织和病症相关，而gli3则稍微减少。gli基因对激活诱发刺猬信号传导的全部作用所需的许多基因的表达的转录因子进行编码。然而，gli3转录因子也可以用作刺猬效应物基因的阻抑物，因此gli3的表达可以导致刺猬信号传导途径的效果降低。gli3是用作转录激活因子还是阻抑物取决于翻译后事件，因此预测用于检测gli3蛋白质的激活形式(相对于阻抑形式)的方法(如蛋白质免疫印迹)也将会是刺猬途径激活的可靠测量。glil基因在大范围的癌症、增生和不成熟肺中被强烈表达，并且用作刺猬途径的相对激活的标志。另外，具有高gli基因表达的组织(如未成熟肺)受到刺猬抑制剂的强烈影响。因此，可以预期的是，gli基因表达的检测可用作鉴定将尤其得益于使用刺猬拮抗剂的治疗的组织和病症的强大预测工具。在一些实施例中，通过对转录物的直接检测或通过对蛋白质水平或活性的检测，而对glil表达水平进行检测。可利用大范围的技术中任一个对转录物进行检测，这主要取决于针对gli1转录物或由其合成的cdna的杂交或探针。公知的技术包括rna印迹法、反转录酶pgr及转录物水平的微阵列分析。用于检测gli蛋白质水平的方法包括蛋白质印迹法、免疫沉淀、二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2dsds-page)，在一些实施例中，与其中gli蛋白质的位置已被确定的标准品相比)；以及质谱法。质谱法可以是与一序列的纯化步骤联接从而允许对在特定样本中的许多不同的蛋白质水平进行高通量鉴定。质谱法和2dsds-page也可以用于对蛋白质的转录后修饰进行鉴定，包括蛋白质裂解事件、泛素化、磷酸化、脂质修饰等。也可通过分析与底物dna的结合或靶启动子体外转录活化，对gli活性进行评估。凝胶迁移率变动测定、dna足迹测定和dnα-蛋白质交联测定都是可用于评估能够与dna上的gu结合位点结合的蛋白质的存在的方法。《分子医学杂志(j.mol.med)》77(6):459-68(1999)；《细胞(cell)》100(4):423-34(2000)；《开发(develpmemt)》127(19):4923-4301(2000)。

因为gli1在刺猬激活期间到处被表达，所以任何程度的glil过度表达在确定刺猬途径抑制剂将是有效的治疗中应该是有用的。在一些实施例中，glil应在正常对照物细胞/组织/受试对象中的至少两倍高的水平下被表达。在一些实施例中，glil表达比在正常细胞/组织/受试对象中的高四、六、八或十倍。

在某些实施例中，对gli1转录物水平进行测量，并且用刺猬途径抑制剂化学治疗对显示不正常高glil水平的患病或病变组织进行处理。在其它实施例中，正在治疗的疾病已知与刺猬途径的异常激活具有显著相关性，即使不在正在处理的组织中进行对gli1表达水平的测量。成熟前肺组织、肺癌(例如，腺癌、支气管肺泡腺癌、小细胞癌)、乳腺癌(例如，下导管癌、下小叶癌、小管癌)、前列腺癌(例如，腺癌)邮件良性前列腺增生在某些情况下都显示强烈升高的glil表达水平。因此，glil表达水平是用以确定这些组织中的哪个组织应当用刺猬途径抑制剂进行治疗的强大诊断工具。另外，大量的证据表明尿路上皮细胞的癌症(例如，膀胱癌、其它泌尿生殖器癌)在某些情况情况下也将具有升高的gli-1水平。例如，已知在染色体9q22上杂合性的丢失在膀胱癌中是常见。ptchl基因是位于此位置并且ptchl功能丢失有可能是高增殖的部分原因，如在许多其它癌症类型中。因此，这种癌症也将会显示高glil表达并且将会尤其适合于使用刺猬拮抗剂的治疗。

在某些实施例中，本文中所描述的任何刺猬途径抑制剂是用于对患有具有ptch-1和/或ptch-2突变(例如修补的-1或修补的-2功能丢失突变)的肿瘤的受试对象进行治疗。ptch-1和ptch-2的表达也被刺猬信号传导途径激活，但通常不被激活到与gli基因相同的程度，因此与作为刺猬途径激活的标志的gli基因相比较差。在某些组织中，仅ptch-1或ptch-2中的一个被表达，尽管刺猬途径是高度活性的。例如，在睪丸发育中，沙漠刺猬发挥重要的作用并且刺猬途径被激活，但仅ptc-2被表达。因此，作为刺猬途径激活的标志，这些基因在单独使用时是不可靠的，尽管对这两个基因的同时测量被预期为对于用刺猬拮抗剂进行治疗的组织是更有用的指示物。

鉴于刺猬信号传导广泛地涉及脊椎动物中不同组织的有序空间布置，本公开的刺猬途径抑制剂可以用于在体外和体内产生和/或维持一系列不同脊椎动物组织的过程。视情况，刺猬途径抑制剂可以是任何的上述制剂。

在一些实施例中，刺猬途径抑制剂可用作恶性髓母细胞瘤和其它主要中枢神经系统恶性神经外胚瘤的治疗方案的一部分。髓母细胞瘤(一种主要的脑肿瘤)是儿童中最常见的脑部肿瘤。髓母细胞瘤是发生于后窝中的原始神经外胚层(pnet)肿瘤。它们占到全部儿科脑肿瘤的大约25％。在组织学上，它们是通常分布于真玫瑰花结中的小圆细胞肿瘤，但会显示一些向星形胶质细胞、室管膜细胞或神经元的分化。pnet可发生在脑的其它区域，包括松果腺(成松果体细胞瘤)和大脑。发生于幕上区的肿瘤通常具有恶化的预后。

已知髓母细胞瘤/pnet在切除后会在中枢神经系统中的任何部位复发，并且甚至会转移到骨。因此，治疗前评估应包括对脊髓的检查以排除“向下转移”的可能性。钆增强的mri已很大程度上代替脊髓造影用于此目的，并且在手术后作为常规步骤获得脑脊液细胞学检查结果。

在一些实施例中，刺猬途径抑制剂被用作室管膜瘤的治疗程序的一部分。在儿童中，室管膜瘤占到的儿科脑肿瘤的大约10％。总的来说，它们是发生于脑室的室管膜内层的肿瘤，并且在显微镜观察下形成玫瑰花结、管和血管周的玫瑰花结。在chop系列的报告患有室管膜瘤的51名儿童中，3/4是组织学良性的，大约2/3发生在第4脑室的区域，三分之一出现在幕上区。年龄在出生与4岁之间存在峰值。平均年龄为约5岁。因为患有此疾病的许多儿童是幼儿，所以他们经常需要多种方式治疗。

在一些实施例中，鉴于刺猬信号传导涉及到各种肿瘤，或者在开发期间刺猬或其受体在这种组织中的表达，本公开的刺猬途径抑制剂可以用于抑制具有失调的刺猬活性的肿瘤的生长。这种肿瘤包括但不限于：与gorlin综合征有关的肿瘤(例如，髓母细胞瘤、脑膜瘤等)、与ptch突变相关的肿瘤(例如，血管瘤、横纹肌肉瘤等)、由于glil扩增所导致的肿瘤(例如，胶质母细胞瘤、肉瘤等)、由于smo功能失调所导致的肿瘤(例如，基底细胞癌等)、与trc8相关的肿瘤、ptc同系物(例如，肾癌、甲状腺癌等)、ext-1相关性肿瘤(例如，骨癌等)、sft/x诱导的肿瘤(例如，肺癌、软骨肉瘤等)、过度表达刺猬蛋白的肿瘤以及其它肿瘤(例如，乳腺癌、泌尿生殖器癌(例如，肾癌、膀胱癌、输尿管癌、前列腺癌等)、肾上腺癌、胃肠癌(例如，胃癌、肠癌等)。

在一些实施例中，本公开的刺猬途径抑制剂也可用于治疗数种形式的癌症。这些癌症包括但不限于：前列腺癌、膀胱癌、肺癌(包括小细胞和非小细胞)、结肠癌、肾癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌或其它子宫癌、卵巢癌、睪丸癌、阴茎癌、阴道癌、尿道癌、胆囊癌、食管癌或胰腺癌。

另外的癌类型包括：骨骼或平滑肌的癌症、胃癌、小肠癌、唾液腺的癌症、肛门癌、直肠癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、垂体腺癌和鼻咽癌。可使用本公开的刺猬拮抗剂进行治疗的癌症的其它示例性形式包括包含刺猬表达细胞的癌症。可以用本公开的刺猬拮抗剂进行治疗的其它示例性形式的癌症包括包含gli表达细胞的癌症。在一个实施例中，癌症不是补丁蛋白-1中的突变为特征。在一些实施例中，癌症是以平滑化和/或sufu突变为特征。

在某些实施例中，刺猬途径抑制剂可用于对患有基底细胞癌的受试对象进行治疗。在特定实施例中，基底细胞癌是痣样基底细胞癌。在特定实施例中，所述受试对象具有gorlin综合征。

前述内容仅仅是本公开的刺猬途径抑制剂的示例性的体外和体内应用。刺猬途径抑制剂也适用于鉴别突变smo的天然靶或结合配偶体(例如，具有g529s突变的平滑蛋白，单独地或连同t241m、w281c、v321m、i408v、a459v、c469y、d473h、e518k、e518as533n、和/或w535l突变中的任意一个或多个)、研究突变平滑化生物活性、从各种细胞和组织中纯化突变平滑化和其结合配偶体以及对刺猬信号传导途径的其它成分进行鉴定。

在某些实施例中，刺猬途径抑制剂是任何公开的抗体。本公开的抗体可用于例如体外、离体、和体内治疗方法。在一个方面，本公开提供用于治疗癌症、抑制不需要的细胞增殖、抑制癌症的转移及在体内或者体外诱导肿瘤细胞的细胞凋亡的方法；所述方法包括在容许抗体与突变smo结合的条件下使细胞暴露于本公开的抗体。在某些实施例中，细胞是髓细胞性白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肾细胞癌细胞和胶质母细胞瘤细胞。在一个实施例中，本公开的抗体可用于抑制突变smo的活性，所述方法包括使突变smo暴露于本公开的抗体从而抑制突变smo的活性。

在一个方面，本公开提供用于治疗癌症的方法；所述方法包括将有效量的本公开抗体施用于个体。在某些实施例中，用于治疗癌症的方法包括将有效量的包括本公开抗体和任选地至少一个另外的治疗剂(如下面所提供的治疗剂)的药物制剂施用于个体。

在治疗中，本公开的抗体可单独地使用或连同其它组合物而使用。例如，本公开的抗体可与至少一个另外的治疗剂和/或佐剂共同给药。在某些实施例中，另外的治疗剂是抗vegf抗体。

上述的这种联合治疗包括联合给药(其中将两个或更多的治疗剂包括在相同或不同的制剂中)和单独给药，在后者的情况下，本公开抗体的给药可以在另外的治疗剂和/或佐剂的给药之前、同时和/或之后进行。本公开的抗体也可与辐射治疗一同使用。

在一个实施例中，本公开的抗体用于在患有与增强的突变smo表达和/或活性相关病症的个体中结合突变smo的方法；所述方法包括将抗体施用于个体，使得个体中的突变smo被结合。在一个实施例中，突变smo是人突变smo，并且个体是人。

本公开的抗体(和任何另外的治疗剂或佐剂)可通过任何合适的方式施用，包括胃肠外、皮下、腹腔内、肺内和鼻内，以及病灶内给药(若需要用于局部治疗)。胃肠外输注包括肌内、静脉、动脉内、腹腔内或皮下给药。另外，在合适的情况下，抗体可通过脉冲输注施用，尤其是采用抗体的递减剂量。给药可通过任何合适的途径，例如通过注射，如静脉或皮下注射，这部分地是基于给药是短暂的还是长期的。

在抗体的制备和给药中，可对本公开抗体的结合靶的位置加以考虑。当结合靶是细胞内分子时，本公开的某些实施例提供用于被导入结合靶所位于的细胞内的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，本公开的抗体可作为胞内抗体的形式在细胞内被表达。本文中所使用的术语“胞内抗体”是指在细胞内被表达并且能够选择性地结合到靶分子的抗体或其抗原结合部，例如在marasco《基因治疗(genetherapy)》4:11-15(1997)；kontermann《方法(methods)》34:163-170(2004)；美国专利第6,004,940和6,329,173号；美国专利申请公开号2003/0104402以及pct公开wo2003/077945中所描述。也可参见例如于1996年3月14日公布的wo96/07321关于基因治疗产生细胞内抗体的应用。

胞内抗体的细胞内表达可通过将编码期望的抗体或其抗原结合部(缺乏野生型前导序列和与编码所述抗体或抗原结合片段的基因联接的分泌信号)的核酸导入靶细胞中而实现。可将编码全部或一部分的本公开抗体的一个或多个核酸传输至靶细胞，使得能够与细胞内的靶多肽结合并调节靶多肽活性的一个或多个胞内抗体被表达。可采用将核酸导入细胞内的任何标准方法，包括但不限于：微量注射、弹道注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体以及用反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、将核酸带入细胞的痘苗载体进行转染。

在某些实施例中，可利用体内和离体方法将核酸(任选地包含于载体中)导入患者的细胞中。在体内传递的一个例子中，将核酸直接地注射入患者中，例如在其中需要治疗干预的部位。在体内传递的另一个例子中，利用使用病毒载体(如腺病毒、单纯疱疹i型病毒或腺相关病毒)和基于脂质的系统(用于基因的脂质介导转移的脂质是例如dotma、dope和dc-chol)的转染，将核酸导入细胞中。关于某些基因制作和基因治疗方案的综述，可参见hanerson等人《科学(science)》256:808-813(1992)和wo93/25673以及其中所引用的文献。在离体治疗的一个实例中，将患者的细胞取出，将核酸导入这些分离的细胞中，将经修饰的细胞直接地或者例如包封于被植入患者的多孔膜中而施用于患者(参见例如美国专利第4,892,538和5,283,187号)。用于核酸离体传递的常用载体是反转录病毒载体。

在另一个实施例中，提供内化的抗体。抗体可以具备增强抗体到细胞的传递的某些特征，或者可进行修饰而具备这种特征。用于实现此目的技术在本领域中是已知的。例如，已知抗体的阳离子化可促进其被摄取入细胞(参见例如美国专利第6,703,019号)。脂质转染或脂质体也可以用于将抗体传递入细胞中。如果使用抗体片段，特异性地与靶蛋白质结合的最小抑制性片段会是有利的。例如，基于抗体的可变域序列，可以将肽分子设计成保留与靶蛋白质序列结合的能力。这种肽类可以化学合成和/或利用重组dna技术而产生。参见例如marasco等人《美国国家科学院学报(proc.natlacad.sci.usa)》90:7889-7893(1993)。

抗体进入靶细胞可利用本领域中已知的其它方法而增强。例如，某些序列(例如来源于hivtat或控制触角基因同源域蛋白的那些)能够指导同源蛋白跨细胞膜的高效摄取。参见例如chen等人《美国国家科学院学报(proc.natlacad.sci.usa)》(1999)96:4325-4329。

当抗体的结合靶位于脑中时，本公开的某些实施例提供穿过血脑屏障的抗体。用于将分子转运跨过血脑屏障的数个本领域已知的方法包括但不限于：物理方法、基于脂质的方法、基于干细胞的方法以及基于受体和通道的方法。

将抗体转运跨过血脑屏障的物理方法包括但不限于：完全地避开血脑屏障或者通过在血脑屏障中形成开口。避开方法包括但不限于：直接注射入脑中(参见例如，papanastassiou等人《基因治疗(genetherapy)》9:398-406(2002))；间隙输注/对流增强传递(参见例如bobo等人《美国国家科学院学报(proc.natl.acad.sci.usa)》91:2076-2080(1994))；以及将传递装置植入脑中(参见例如gill等人《自然医学(naturemed)》9:589-595(2003)；和gliadelwafers^tm，guildfordpharmaceutical)。在血脑屏障中形成开口的方法包括但不限于：超声波(参见例如美国专利公开第2002/0038086号)；渗透压(例如，通过高渗甘露糖醇的施用(neuwelt,e.a.，《血脑屏障的意义及其操作(implicationoftheblood-brainbarrieranditsmanipulation)》，第1和第2卷，普莱南出版社，纽约州(1989年))；利用例如缓激肽或渗透剂α-7增加渗透性(参见例如美国专利第5,112,596、5,268,164、5,506,206、和5,686,416号)；以及利用含有编码抗体的基因的载体对跨越血脑屏障神经元的转染(参见例如美国专利公开第2003/0083299号)。

将抗体转运跨过血脑屏障的基于脂质的方法包括但不限于：将抗体包封于偶联到与血脑屏障血管内皮上的受体相结合的抗体结合片段的脂质体中(参见例如美国专利申请公开号20020025313)；和将抗体包覆于低密度脂蛋白颗粒中(参见例如美国专利申请公开号20040204354)或载脂蛋白e中(参见例如美国专利申请公开号20040131692)。

将抗体转运跨过血脑屏障的基于干细胞的方法势必需要对神经祖细胞或细胞(npc)实施基因工程以便表达感兴趣的抗体然后将干细胞植入被治疗个体的脑中。参见behrstock等人(2005年)《基因治疗(genether.)》2005年12月15日，提前在线出版(报告有对npc实施基因工程以表达神经生长因子gdnf，从而当被移植入啮齿动物和灵长目动物模型的脑中时减轻帕金森病的症状)。

将抗体转运跨过血脑屏障的基于受体和通道方法包括但不限于：利用糖皮质激素抑制剂增加对血脑屏障的渗透性(参见例如美国专利申请公开号2002/0065259、2003/0162695、和2005/0124533)；激活钾通道(参见例如美国专利申请公开号2005/0089473)；抑制abc药物转运体(参见例如美国专利申请公开号2003/0073713)；用运铁蛋白包覆抗体并且调节一个或多个运铁蛋白受体的活性(参见例如美国专利申请公开号2003/0129186)；以及使抗体阳离子化(参见例如美国专利第5,004,697号)。

本公开的抗体将会以符合良好医疗实践的方式进行配制、给药以及施用。在本上下文中考虑的因素包括：正在治疗的具体病症、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床条件、病症的原因、药物递送的部位、给药的方法、给药的时间安排以及其它医生已知的因素。抗体无需，但任选地与目前用于预防或治疗病症的一个或多个药物一起进行配制。这种其它药物的有效量取决于存在于所述制剂中的抗体的量、病症或治疗的类型以及上述其它因素。这些是通常是以与如本文中所描述的相同的剂量和给药途径，或者本文中所描述的约1至99％的剂量，或者以凭经验/临床判定为合适的任何剂量并通过任何途径而使用。

就疾病的预防或治疗而言，当单独地使用或连同一个或多个其它的另外治疗剂使用时，本公开抗体的合适剂量将取决于被治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和过程、施用抗体是为预防还是治疗、以前的治疗、患者的临床治疗史和对抗体的反应以及主治医师的判断。合适地，将抗体一次或在一系列的治疗中施用于患者。基于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可以是向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一个或多个单独给药或者通过连续输注。基于上述因素，一个典型的每日剂量可能会在从约1μg/kg至100mg/kg或以上的范围内。对于数天或更长时间中的重复给药而言，基于病情，治疗将会通常持续进行直到期望的疾病症状抑制出现。抗体的一个示例性剂量将会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可将约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量施用于患者。这种剂量可间断地施用，例如每周或每三周(例如使患者接受约二至约二十、或例如约六剂量的抗体)。最初是较高负荷始剂量，接着可施用一个或多个较低剂量。示例性的给药方案包括施用约4mg/kg的初始负荷剂量，接着是约2mg/kg的抗体的每周维持剂量。然而，其它给药方案也会是有用的。可利用常规的技术和测定，容易地对治疗的进展进行监测。

应当理解的是，代替或除抗突变smo抗体外，可使用本公开的免疫缀合物实施任何上述治疗方法。

vii.药物制剂

在一些实施例中，可将本文中所描述的任何刺猬途径抑制剂或者根据本公开的刺猬途径抑制剂配制于药物组合物中。

可制备根据本公开所使用的刺猬途径抑制剂的药物组合物以便于贮存，通过将具有期望程度纯度的药物与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂加以混合《雷明顿：药学的科学与实践(remington:thescienceofpracticeofpharmacy)》第20版，gennaro，a.等人编著，费城药学与科学学院，(2000年))，并采用冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对于受者是无毒的，并且包括：缓冲剂，如醋酸盐、三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐、柠檬酸盐以及其它有机酸类；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基醇或苯甲醇；烷基羟基苯甲酯，如羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽类；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸类，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖类、二糖类和其它糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；渗透压调节剂，如海藻糖和氯化钠；糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯；形成盐的反离子，如钠；金属复合物(例如，zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如或聚乙二醇(peg)。

在一些实施例中，根据本公开和/或本文中所描述的任何刺猬途径抑制剂的制剂也可视需要含有用于正在治疗的具体适应症多于一个的活性化合物，在一些实施例中，这些活性化合物具有互补活性并且不相互造成负面影响。应当认识到的是，在某些实施例中，将猬途径抑制剂与第二活性剂配制在一起(例如，含有这两种药物的制剂或组合物)。在其它实施例中，将两个(或更多个)活性剂单独地配制，以便可以将单独制剂共同地或单独地上市、销售、储存和使用。当单独地配制时，本公开预期可以将它们在相同或不同的时间施用，并且在某些实施例中可将它们组合并且同时地施用。

例如，除了前面的治疗剂外，理想的是将另外的抗体(例如第二治疗剂)或针对一些其它靶的抗体(例如，影响肿瘤生长的生长因子)包括在所述制剂中。在一些实施例中，理想的是在制剂中包括刺猬抑制剂(例如，robotkinin)。可替代地或另外地，组合物还可包括化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素药物和/或保心药。这种分子合适地以对于预定目的为有效的量存在于组合中。在一些实施例中，另外的活性化合物是甾体生物碱。在一些实施例中，甾体生物碱是环巴胺或者kaad-环巴胺或蒜藜芦碱或其任何功能性衍生物(例如，ipi-269609或ipi-926)。在一些实施例中，另外的活性化合物是维莫德吉、索尼德吉、bms-833923、pf-04449913、或ly2940680或其任何衍生物。在一些实施例中，另外的活性化合物是在amakye等人《自然医学(naturemedicine)》19(11):1410-1422(其整体并入本文)中所公开的任何化合物。在一些实施例中，另外的活性化合物是在化学上与藜芦生物碱无关的另一个平滑化抑制剂或维莫德吉，包括但不限于：维莫德吉、bms-833923(xls19)、lde225(erismodegib)、pf-04449913、nvp-lde225、nvp-leq506、tak-441、xl-319、ly-2940680、sen450、伊曲康唑、mrt-10、mrt-83或pf-04449913)。如上所述，本公开预期其中将第二活性剂与刺猬途径抑制剂共同配制(例如，作为包括两个活性剂的单个制剂)的制剂，以及其中两种活性剂存在于两个单独制剂或组合物中的实施例。

在一些实施例中，也可将本公开的任何刺猬途径抑制剂(如本文中所描述的)包埋于微囊制剂(例如通过凝聚技术或通过界面聚合；例如分别是羟甲基纤维素或明胶微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊剂)、在胶体药物递送系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或者粗乳剂中。这种技术公开于《雷明顿：药学的科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)》同上。

在一些实施例中，将本公开的任何刺猬途径抑制剂配制在缓释制剂中。缓释制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质采用成型物品的形式，例如膜剂或微囊剂。缓释基质的例子包括：聚酯类、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸类(美国专利第3,773,919号)、l-谷氨酸与γ-乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、非可降解的乙烯-醋酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如luprondepo^tm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林所组成的可注射微球)以及聚-d(-)-3-羟基丁酸。

用于本公开方法的本公开组合物的量可利用标准临床技术而确定，并且可基于具体的适应症或用途而变化。可从体外或动物模型测试系统中所得到的剂量反应曲线中推算出有效剂量。

在某些实施例中，本公开的组合物(包括药物制剂)是无热原的。换句话说，在某些实施例中，组合物大体上是非致热的。在一个实施例中，本公开的制剂是大体上无内毒素和/或相关热原物质的无热原制剂。内毒素包括局限于微生物内部并且仅当微生物破裂或死亡时被释放的毒素。热原物质也包括来自细菌和其它微生物的外膜的、引起发热的热稳定物质(糖蛋白)。这两种物质如果给人施用均会导致发热、低血压和休克。由于潜在的有害作用，即使少量的内毒素也必须从静脉给药的药物溶液中去除。美国食品与药品药品管理局(“fda”)已设定了在静脉药物给药的一小时时间段内5内毒素单位(eu)每剂量每千克体重的上限(美国药典委员会，药典论坛26(1):223(2000))。当药用蛋白质是以相对较大的剂量和/或在延长的时间段(例如，患者的一生)施用时，即使少量的有害和危险的内毒素都会是危险的。在某些具体实施例中，在组合物中的内毒素和热原水平是小于10eu/mg，或小于5eu/mg，或小于1eu/mg，或小于0.1eu/mg，或小于0.01eu/rng，或小于0.001eu/mg的。

在一些实施例中，将刺猬途径抑制剂配制在无菌制剂中。这可通过经过无菌滤膜的过滤而容易地完成。

ix.制造的物品和试剂盒

在一些实施例中，将本公开的刺猬途径抑制剂(如本文中所公开的刺猬途径抑制剂)制备在制造物品中。类似地，可将本公开的多肽和核酸(如突变smo多肽)以制造物品的形式而制备。在一些实施例中，制造物品包括容器和在容器上或与容器粘接的标签或药品说明书(说明用于刺猬信号传导的全部或部分抑制，或者可替代地用于刺猬信号传导途径激活所导致病症或病况的治疗)。在其它实施例中，制造物品包括容器和在容器上或与容器粘接的标签或说明书(说明用于筛选测定)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。容器可由多种材料构成，如玻璃或塑料。在一些实施例中，容器容纳可有效地用于治疗癌症的组合物，并且可具有无菌制剂进入端口(例如，容器可以是具有用皮下注射用注射针可刺破的塞子的静脉溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一个活性剂是刺猬途径抑制剂。标记或药品说明书将还包括用于刺猬途径抑制剂的给药或者用于smo多肽或核酸或载体或宿主细胞的使用说明。另外，制造物品还可还包括第二容器，所述第二容器包括药学上可接受的缓冲剂，如用于注射的抑菌水(bwfi)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏液以及葡萄糖溶液。从商业和用户的观点来看，制造物品还可包括其它所需的材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针以及注射器。

在一些实施例中，提供可用于各种其它目的试剂盒，例如用于突变smo蛋白表达细胞的杀灭测定、用于从细胞中纯化或免疫沉淀刺猬信号传导多肽。对于突变smo蛋白的分离和纯化而言，所述试剂盒可以含有偶联到珠(例如，琼脂糖凝胶珠)的各个突变smo蛋白结合试剂。所提供的试剂盒可含有用于突变smo蛋白的体外检测和定量(例如在elisa或蛋白质免疫印迹中)的分子。在一些实施例中，如同制造物品，所述试剂盒包括容器和在容器上，或与容器粘接的标签或说明书。在一些实施例中，容器中容纳包括可用于本公开的至少一个上述刺猬途径抑制剂的组合物。在一些实施例中，可包括容纳例如稀释剂和缓冲剂、对照抗体的另外的容器。在一些实施例中，标签或药品说明书可提供组合物的说明以及对用于体外或诊断用途的描述。

实例

现在对本公开进行一般性描述，通过参考下面的实例将更容易地理解，这些实例仅仅是出于说明本公开的某些方面和实施例的目的，而并非意图限制本公开。

实例1：维莫德吉耐药基底细胞癌的突变分析。

由于赋予耐药性的基因改变的获得，针对靶向治疗(例如，癌症治疗)的临床反应可以是短暂的。对耐药性机制的鉴定将指导新型治疗策略。不适当的hh信号传导与若干癌症有关，包括基底细胞癌(bcc)。ptch中的功能丢去突变(约90％)和smo中的激活突变(约10％)是bcc的主要致病因素。通过用foundationone^tm下一代测序(ngs)平台评估维莫德吉敏感性和患者的bcc的突变状态，而鉴定针对维莫德吉(gdc-0449)耐药性的临床机制。图1列出了用维莫德吉治疗的mbcc(转移性基底细胞癌)患者的特征。

如在图2中所示，用于各肿瘤活检标本的中值外显子覆盖度是从460倍至921倍覆盖度。在bcc中的体细胞突变率是在3.99至63.89的范围内，这相对于在其它癌症中所观察到的(lawrence等人，2013)为较高。对体细胞突变谱的分析揭示了c到t核苷酸转换突变(指示紫外光诱导突变)的优势(miller，《分子生物学杂志(j.mol.bio.)》1985)。

如在图3中所示，在mycn(p44l/f、p60l、p237l)、lrp1b、ptch1、smo和tert(启动子)中的突变是所观察到的最通常被检测到的突变变体。未观察到sufu或gli1的突变等位基因。然而，已知在获得对维莫德吉的耐药性的亲本样本中所发现的数个基因(prkaca、gli2和gli3(shaipe等人，《癌细胞(cancercell)》2015)并不包含在foundationone^tm操作板中。

实例2：smo变体分析鉴定新型g529s突变

在7个所采集进展后标本(来自5位患者中的4位)中的5个中，观察到smo中的突变。在3/4的含有smo突变的样本中，观察到已被描述赋予对维莫德吉的耐药性的smo突变(v321m和t241m；sharpe等人，《癌细胞(cancercell)》2015)(图4)。

在进展后活检中鉴定出一个新型smo突变g529s。g529氨基酸是位于在smo的第七跨膜结构域(tm7)中的药物结合口袋(dbp)外部的高度保守残基，这表明所述残基是功能性相关的(图5)。基于计算模型化，g529在空间上与当突变时已知是致癌的或赋予针对维莫德吉的耐药性的残基相邻(图6)。不希望受到理论的约束，这些突变会破坏螺旋包装，从而导致smo的构象柔顺性的增加，并由此降低与拮抗剂的亲和力(sharpe等人《癌细胞(cancercell)》2015)。与这种假说相一致，体外实验表明smog529s突变体具有增强的基础活性和降低的对维莫德吉的敏感性(图7)。

患者002似乎获得在已知赋予针对维莫德吉的耐药性的残基中的smo的两个突变(t241m、v32lm；图4)。这些突变似乎已在疾病进展期间获得，因为在治疗前活检中并未检测到这些突变。这些观察结果确认smo突变是导致在患有转移性bcc的患者中的维莫德吉耐药性的最常见体细胞基因改变。

如上所述，取自患者002的进展活检样本含有以相似等位基因频率而存在的t241m和v321m突变，同时，取自患者011的进展活检含有不同等位基因频率的g529s和v321m中的突变(图4)。在其中在进展中同时收集两个单独活检(患者/样本id011-p-i、011-p-ii、005-p-i以及005-p-ii)的情况下，在smo突变的检测以及在时间匹配的配对样本中的各自等位基因频率中存在不一致性。例如，在患者011中，仅在配对活检中的其中一个检测到v321m突变，另外在同时采集的各进展标本之间v321m突变的等位基因频率有变化(11％和39％)。不希望受到理论的约束，这些观察结果与两个不同耐药性亚克隆的生长相一致，并且支持在耐药性中有遗传异质性的意见。

实例1和2的材料与方法

患者治疗史

008：患有转移性基底细胞癌(mbcc)的72岁女性患者。未报告bcc的先前手术。mbcc的系统治疗包括以下药剂：蒽环类化疗药。在筛选时转移的部位包括右半骨盆中的软组织。在紧邻右髂骨、紧邻右股骨和骶骨的腹侧面的皮肤/软组织上，鉴定出可测量的病损。在髂骨和骶骨中的骨破坏区上，鉴定出不可测量的病损。在研究第1天，患者接受她的第一剂量的150mg维莫德吉。患者接受总共20个周期并且在此时间期间处于sd。在研究的第673天，整体反应评价表明疾病进展，并且在研究的第763天，停止使用维莫德吉的研究治疗。基于所确认的研究药物的最后剂量，由于疾病进展，在研究的第763天结束施用维莫德吉。

001：患有转移性基底细胞癌(mbcc)的77岁男性患者。在bcc的手术之前包括6次皮肤肿瘤切除术。未报告有用于bcc的先前局部或系统治疗。在筛选时转移的部位包括头部的皮肤。在头部的皮肤上(淋巴结[在气管旁边和缘下])鉴定出可测量的病损。在研究第1天，患者接受他的第一剂量的150mg维莫德吉。在研究第397天，患者在靶病损上显示pr，并且处于pr直到第19周期。在研究第516天，整体反应评价表明疾病进展。基于所确认的研究药物的最后剂量，由于疾病的进展，在研究第532天停止施用维莫德吉。

002：患有转移性基底细胞癌(mbcc)的55岁女性患者。用于bcc的先前手术包括皮肤肿瘤切除术。未报告用于bcc的先前局部或系统治疗。在筛选时(2012年1月24日)转移的部位包括骨。在肺(s5右侧和s10左侧)、骶骨、脊椎第9肋骨、右股骨、枕骨和淋巴结(纵隔，腔静脉后)上鉴定出可测量的病损。在研究第1天，患者接受她的第一剂量的150mg维莫德吉。在研究的第172天，患者在第7周期中显示pr。患者继续处于pr直到第15周期。在研究第399天，整体反应评价表明疾病进展。基于所确认的研究药物的最后剂量，由于疾病进展，在研究第533天停止施用维莫德吉。

011：患有转移性基底细胞癌(mbcc)的52岁男性患者。未报告有用于bcc的先前手术。未报告有用于bcc的局部或系统治疗。在筛选时转移的部位包括骨和肺。在躯干的皮肤上鉴定出可测量的病损。在研究第1天，所述患者接受他的第一剂量的150mg维莫德吉。在他的治疗(第11周期)期间，在研究第282天，患者处于稳定疾病状态。在研究第310天的新评估中，整体反应评价表明疾病进展。由于疾病进展，维莫德吉持续地在此日期被停止，并且最后剂量是在与研究第310天的同一天施用。

005：患有转移性基底细胞癌(mbbc)的65岁女性患者。用于bcc的先前手术包括皮肤肿瘤切除术。先前的辐射是针对头部和颈部(总剂量：50gy)。未报告有用于bcc的先前局部或系统治疗。在筛选时转移的部位包括颈部、胸骨和左锁骨。在颈部(锁骨上区)、肺(区段10和3)上鉴定出可测量的病损。在胸锁乳突肌和骨(左锁骨和胸骨)上鉴定出不可测量的病损。在研究第1天，患者接受她的第一剂量的150mg维莫德吉。在治疗期间，患者处于sd直到第13周期。在研究的第336天，整体反应评价表明疾病进展并且在肺(s10和s3区)中具有新的病损，并且局部进展疾病的部位包括颈部的皮肤(胸骨和左锁骨)。基于所确认研究药物的最后剂量，在研究的第309天停止施用维莫德吉。

基因图谱

根据服务供应商协议(foundationmedicine，马萨诸塞州剑桥市)而实施foundationone^tm基因图谱研究。

gli-萤光素酶报告基因测定

以1.75×10e5细胞/孔，将c3h10t1/2细胞(atcc)播种入高葡萄糖培养基中的六孔板中，所述培养基含有4mm谷氨酰胺、10mmhepes(ph7.2)和10％fbs。16小时后，利用genejuice转染试剂(novagen)，用400ng的表达载体、400ng的9x-gli-bs和200ng的prl-tk，对细胞进行了转染。6小时后，使取自一个孔的细胞胰蛋白酶化，并重新分配到12孔板的四个孔上。16小时后，将培养基的fbs含量减小到0.5％以诱导原纤毛的形成，在指定浓度下添加小分子hh抑制剂。24小时后，利用dual-glo萤光素酶测定系统(promega)测定萤火虫萤光素酶活性，并且用wallacenvision盘式分析仪(perkinelmer)进行读取。将各值除以海肾萤光素酶活性，使转染效率归一化。单独的实验是以一式两份或一式三份的方式而执行，并重复至少一次。将剂量反应数据拟合到在绘制医学图表(graphpadprism)中的4-参数方程式：

其中“y”是归一化，gli-萤光素酶信号或归一化的胸苷并入，所述并入是作为不包括抑制剂的对照物分数而计算，“x”是抑制剂浓度。各样本的最高值被约束为相等。“h”是斜率。

引用的参考文献

●brinkhuizen,t.,reinders,m.g.,vangeel,m.,hendriksen,a.j.,paulussen,a.d.,winnepenninckx,v.j,keymeuien,k.b.,soetekouw,p.m.,vansteensel,m.a.,和mosterd,k.(2014)《在局部晚期基底细胞癌的治疗中由于平滑化突变而获得的对刺猬途径抑制剂维莫德吉的耐药性(acquiredresistancetothehedgehogpathwayinhibitorvismodegibduetosmoothenedmutationsintreatmentoflocallyadvancedbasalcellcarcinoma)》《美国皮肤病学会杂志(j.am.acad.dermatol.)》71,1005。

●horns,figla,rachakondaps,fischerc,suckera,gasta,kadels,molli,nagoree,hemminkik,schadendorfd,kumarr.(2013)《在家族性和散发性黑色素瘤中的tert启动子突变(tertpromotermutationsinfamilialandsporadicmelanoma)》《科学(science)》339,959。

●miller,j.h.(1985)《紫外光的致突变特异性(mutagenicspecificityofultravioletlight)》《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》182,45-65。

●pricl,s.,cortelazzi,b.,dalcol,v.,marson,d.,laurini,e.,fermeglia,m.,liciira,l.,pilotti,s.,bossi,p.,andperrone,f.(2014)《在基底细胞癌中平滑化(smo)受体突变决定对维莫德吉的耐药性(smoothened(smo)receptormutationsdictateresistancetovismodegibinbasalcellcarcinoma)》《分子肿瘤学(moloncol.)》9,389。

●sharpehj,paug,dijkgraafgj,basset-seguinn,modrusanz,januariot1,tsuiv,durhamab,dlugoszaa,hasrtypm,bourgonr,tangjy,sarinky,dirixl,fisherdc,rudincm,sofenh,migdenmr,yauchrl,desauvagefj.(2015)《在基底细胞癌中平滑抑制剂耐药性的基因组分析(genomicanalysisofsmoothenedinhibitorresistanceinbasalcellcarcinoma)》《癌细胞(cancercell)》27,327。

●vinagrej,almeidaa,populoh,batista.r,lyraj,pintov,coelhor,celestinor,prazeresh,limal,melom,darochaag,pretoa,castrop,castrol,pardalf,lopesjm,santosll,reisrm,cameselle-teijeiroj,sobrinho-simoesm,limaj,maximov,scaresp.(2013)《在人类癌症中tert启动子突变的频率(frequencyoftertpromotermutationsinhumancancers)》《自然通讯(natcommun.)》4,2185。

●wang,c,wu,h.,katritch,v.,han,g.w.,huang,x.p.,liu,w.,siu,f.y.,roth,b.l.,cherezov,v.,andstevens,r.c.(2013)《与抗肿瘤药剂结合的人平滑受体的结构(structureofthehumansmoothenedreceptorboundtoanantitumouragent)》《自然(nature)》497,338。

●amakye,d.,jagani,z.,anddorsch,m.(2013)《对刺猬途径在癌症中的治疗潜力的说明(unravelingthetherapeuticpotentialofthehedgehogpathwayincancer)》《自然医学(naturemedicine)》19,140-1422。

●atwood,s.x.,li,m.,lee,a.,tang,j.y.,andoro,a.e.(2013)《通过非典型蛋白激酶ciota/lambda对gli的活化调节生长的基底细胞癌(gliactivationbyatypicalproteinkinaseciota/lambdaregulatesthegrowthofbasalcellcarcinomas)》《自然(nature)》494,484-488。

●brastianos,p.k.,horowitz,p.m.,santagata,s.,jones,r.t.,mckenna,a.,getz,g.,ligon,k.l.,paiescandoio,e.,vanhummelen,p.,ducar,m.d.等人(2013)《脑膜瘤的基因组测序鉴定致癌smo蛋白和akti突变(genomicsequencingofmeningiomasidentifiesoncogenicsmoandakt1mutations)》《自然遗传学(naturegenetics)》45,285-289。

●brinkhuizen,t.,reinders,m.g.,vangeel,m.,hendriksen,a.j.,pauiussen,a.d.,wrinnepenninckx,v.j.,keymeulen,k.b.,soetekouw,p.m.,vansteensel,m.a.,和mosterd,k.(2014)《在局部晚期基底细胞癌的治疗中由于平滑化突变而获得的对刺猬途径抑制剂维莫德吉的耐药性(acquiredresistancetothehedgehogpathwayinhibitorvismodegibduetosmoothenedmutationsintreatmentoflocallyadvancedbasalcellcarcinoma)》《美国皮肤病学学科杂志(americanacadamyofdermatology)》。

●buonamici,s.,williams,j.,morrissey,m.,wang,a.,guo,r.,vattay,a.,hsiao,k.,yuan,j.,green,j.,ospina,b.等人(2010)《在髓母细胞瘤中通过抑制pi3k途径径而干扰对平滑化拮抗剂的耐药性(interferingwithresistancetosmoothenedantagonistsbyinhibitionofthepi3kpathwayinmedulloblastoma)》《科学转化医学期刊(sci.trans.med.)》2,51ra70。

●chang,a.l.和oro,a.e.(2012)《在晚期基底细胞癌中使用维莫德吉之后对肿瘤再生长的初始评价(initialassessmentoftumorregrowthaftervismodegibinadvancedbasalcellcarcinoma)》《皮肤病学文献集(archivesofdermatology)》148,1324-1325。

●clark,v.e.,erson-omay,e.z.,serin,a.,yin,j.,cotney,j.,ozduman,k.,avsar,t.,li,j.,murray,p.b.,henegariu,o.等人(2013)《非nf2脑膜瘤的基因组分析表明在traf7、klf4、akti和smo中的突变(genomicanalysisofnon-nf2meningiomasrevealsmutationsintraf7,klf4,akt1,andsmo)》《科学(science)》339,1077-1080。

●dasthakur,m.,andstuart,d.d.(2013)《黑色素瘤耐药性的进展表明治疗机会(theevolutionofmelanomaresistancerevealstherapeuticopportunities)》《癌症研究(cancerreasech)》73,6106-6110。

●dijkgraaf,g.j.,alicke,b.,weinmann,l.,januario,t.,west,k.,modrusan,z.,burdick,d.,goldsmith,r.,robarge,k,,sutherlin,d.等人(2011).gdc-0449《顽固性平滑化突变的小分子抑制和耐药性的下游机制(smallmoleculeinhibitionofgdc-0449refractorysmoothenedmutantsanddownstreammechanismsofdrugresistance)》《癌症研究(cancerreserch)》71,435-444。

●gether,u.,baliesteros,j.a.,seifert,r.,sanders-bush,e.,weinstein,h.,andkobilka,b.k.(1997)《构成性活性g蛋白质偶联受体的结构不稳定性(structuralinstabilityofaconstitutivelyactivegprotein-coupledreceptor)》《构象柔顺性导致的激动剂依赖性活化(agonist-independentactivationduetoconformationalflexibility)》《生物化学杂志(thejuurnalofbiologicalchemistry)》272,2587-2590。

●gonzalez-perez,a.,andlopez-bigas,n.(2011)《(improvingtheassessmentoftheoutcomeofnonsynonymoussnvswithaconsensusdeleteriousnessscore,condel)》改善具有一致性缺失评分的非同义snv结果的评价》，condel。《美国人类遗传学杂志(americanjournalofhumangenetics)》88,440-449。

●greenman,c.d.,bignell,g.,butler,a.,edkins,s.,hinton,j.,beare,d.,swamy,s.,santarius,t.,chen,l.,widaa,s.等人(2010)《picnic：用微阵列癌数据预测绝对等位基因拷贝数变异的算法(picnic:analgorithmtopredictabsolutealleliccopynumbervariationwithmicroarraycancerdata)》《生物统计学(biostatistics)》11,164-175。

●hahn,h.,wicking,c,zaphiropouious,p.g.,gaiiani,m.r.,shaniey,s.,chidambaram,a.,vorechovsky,i.,holmberg,e.,unden,a.b.,gillies,s等人(1996)《(在痣样基底细胞癌综合征中的补丁果蝇的人同系物的突变mutationsofthehumanhomologofdrosophilapatchedinthenevoidbasalcellcarcinomasyndrome)》《细胞(cell)》85,841-851。

●inukai,m.,toyooka,s.,ito,s.,asano,h.,ichihara,s.,soli,j.,suehisa,h.,ouchida,m.,aoe,k.,aoe,m.等人(2006)《在非小细胞肺癌中作为小克隆的表皮生长因子受体基因t790m突变的存在(presenceofepidermalgrowthfactorreceptorgenet790mmutationasaminorcloneinnon-smallcelllungcancer)》《癌症研究(cancerresearch)》66,7854-7858。

●jayaraman,s.s.,rayhan,d.j.,hazany,s.,和kolodney,m.s.(2014)《通过全外显子测序获得的基底细胞癌的突变特征(mutationallandscapeofbasalcellcarcinomasbywhole-exomesequencing)》《皮肤病学研究杂志(thejournalofinvestigativedermatology)》134,213-220。

●johnson,r.l.,rothman,a.l.,xie,j.,goodrich,l.v.,bare,j.w.,bonifas,j.m.,quinn,a.g.,myers,r.m.,cox,d.r.,epstein,e.h.,jr.和scott,m.p.(1996)《用于基底细胞神经综合征的补丁候选基因的人同系物(humanhomologofpatched,acandidategeneforthebasalcellnevussyndrome)》《科学(science)》272,1668-1671。

●kndoth,c,mclellan,m.d.,vandin,f.,ye,k.,niu,b.,lu,c,xie,m.,zhang,q.,mcmichael,j.f.,wyczalkowski,m.a.等人(2013)《在12种主要癌症类型中的突变特征和意义(mutationallandscapeandsignificanceacross12majorcancertypes)》《自然(nature)》502,333-339。

●katfitch,v.,cherezov,v.,和stevens,r.c.(2013)《g蛋白偶联受体超家族的结构功能(structure-functionofthegprotein-coupledreceptorsuperfamily)》《药理学和毒理学年度综述(annualreviewofpharmacoligyandtoxicology)》53,531-556。

●kijima,c.,miyashita,t.,suzuki,m.,oka,h.和fujii,k.(2012)《与ptch1或sufu种系突变所导致的脑膜瘤有关的痣样基底细胞癌综合征的两个病例(twocasesofnevoidbasalcellcarcinomasyndromeassociatedwithmeningiomacausedbyaptch1orsufugermlinemutation)》《家族性癌症(famcancer)》11,565-570。

●kool,m.,jones,d.t.,jager,n.,northcott,p.a.,pugh,tj.,hovestadt,v.,piro,r.m.,esparza,l.a.,markant,s.l.,remke,m.,等人(2014)。《shh髓母细胞瘤的基因组测序预测基因对平滑化抑制的基因型相关反应(genomesequencingofshhmedulloblastomapredictsgenotype-relatedresponsetosmoothenedinhibition)》《癌细胞(cancercell)》25,393-405。

●lackner,m.r.,wilson,t.r.和settleman,j.(2012)《针对靶向癌症治疗获得耐药性的机制(mechanismsofacquiredresistancetotargetedcancertherapies)》《未来肿瘤学(futureoncol)》8,999-114。

●lee,y.,kawagoe,r.,sasai,k.,li,y.,russell,h.r.,curran,t.,和mckinnon,p.j.(2007)《融合阻抑基因功能丢失促进肿瘤发生(lossofsuppressor-of-fusedfunctionpromotestumorigenesis)》《癌基因(oncogene)》26,6442-6447。

●long,j.,li,b.,rodriguez-bianco,j.,pastori,c,volmar,c.h.,wahlestedt,c,capobianco,a.,bai,f.,pei,x.h.,ayad,n.g.和robbins,d.j.(2014)《bet布罗莫结构域抑制剂i-bet151在平滑化蛋白的下游发挥作用以停止刺猬驱动癌症的生长(thebetbromodomaininhibitori-bet151actsdownstreamofsmoothenedtoabrogatethegrowthofhedgehogdrivencancers)》《生物化学杂志(thejournalofbiologicalchemistry)》。

●lorusso,p.m.,rudin,c.m.,reddy,j.c,tibes,r.,weiss,g,j,borad,m.j.,harm,c.l.,brahmer,j.r.,chang,i.,darbonne,w.c等人(2011)《在患有难治性局部晚期或转移性固体肿瘤的患者中刺猬途径抑制剂维莫德吉(gdc-0449)的i期试验(phaseitrialofhedgehogpathwayinhibitorvismodegib(gdc-0449)inpatientswithrefractory,locallyadvancedormetastaticsolidtumors)》《临床癌症研究：美癌症研究协会的官方杂志(clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch)》17,2502-2511。

●metcalfe,c,alicke,b.,crow,a.,lamoureux,m.,dijkgraaf,g.j.,peale,f.,gould,s.e,和desauvage,f.j.(2013)《pten丢失减小髓母细胞瘤对刺猬途径抑制反应(ptenlossmitigatestheresponseofmedulloblastomatohedgehogpathwayinhibition)》《癌症研究(cancerreseach)》73,7034-7042。

●miller,j.h.(1985)《紫外线的致诱变特异性(mutagenicspecificityofultravioletlight)》《分子生物学杂志(jmolbiol)》182,45-65。

●nedelcu,d.,liu,j.,xu,y.，jao,c,和salic,a.(2013)《在刺猬信号传导中氧化胆固醇结合到平滑蛋白的细胞外区(oxysterolbindingtotheextracellulardomainofsmoothenedinhedgehogsignaling)》《自然化学生物学(naturechemicalbiology)》9,557-564。

●negrini,s.,gorgoulis,v.g.,和halazonetis,t.d.(2010)《基因组不稳定性-癌症的演化标志(genomicinstability—anevolvinghallmarkofcancer)》《分子细胞生物学自然概述(naturereviewsmolecularcellbiology)》11,220-228。

●nik-zainal,s.,vanloo,p.,wedge,d.c,alexandrov,l.b.,greenman,c.d.,lau,k,w.,raine,k.,jones,d.,marshall,j.,ramakrishna,m等人(2012)《21例乳腺癌的生活史(thelifehistoryof21breastcancers)》《细胞(cell)》149,994-1007。

●oro,a.e.,higgins,k.m.,hu,z.,bonifas,j.m.,epstem,e.h.,jr.,和scott,m.p.(1997)《在小鼠过度表达的索尼克刺猬中的基底细胞癌(basalcellcarcinomasinmiceoverexpressingsonichedgehog)》《科学(science)》276,817-821。

●pastorino,l.,ghiorzo,p.,nasti,s.,battistuzzi,l.,cusano,r.,marzocchi,c,garre,m.l.,clementi,m.,和searra,g.b.(2009)《对患有gorlin综合征的家族中的sufu种系突变的鉴定(identificationofasufugermlinemutationinafamilywithgorlinsyndrome)》《美国医学遗传学杂志a辑(amjmedgeneta)》149a,1539-1543。

●pesz,k.a.,bieniek,a.,makowska,i,和sasiadek,m.m.(2013)《皮肤的基底细胞癌：通过重新比较基因组杂交的全基因组筛选(basalcellcarcinomaoftheskin:wholegenomescreeningbycomparativegenomehybridizationrevisited)》《皮肤病理学杂志(journalofcutaneouspathology)》40,25-29。

●pricl,s.,cortelazzi,b.,dalcol,v.,marson,d.,laurini,e.,fermegiia,m.,licitra,l.,pilotti,s.,bossi,p.,和perrone,f.(2014)《在基底细胞癌中平滑化(smo)受体突变决定对维莫德吉的耐药性(smoothened(smo)receptormutationsdictateresistancetovismodegibinbasalcellcarcinoma)》《分子肿瘤学(molecularoncology)》。

●reifenberger,j.,wolter,m.,knobbe,c.b.,kohler,b.,schonicke,a.,schanvacliter,c,kumar,k.,blaschke,b.,ruzicka,t.,和reifenberger,g.(2005)《在散发基底细胞癌中在ptch、smoh、sufuh和tp53基因中的体细胞突变(somaticmutationsintheptch,smoh,sufuhandtp53genesinsporadicbasalcellcarcinomas)》《英国皮肤病学杂志(brjdermatol)》152,43-51。

●reifenberger,j.,wolter,m.,weber,r.g.,megahed,m.ruzicka,t.,lichter,p.,andreifenberger,g.(1998)《在散发基底细胞癌皮肤中和中枢神经系统的原始神经外胚层肿瘤中的smoh的错义突变(missensemutationsinsmohinsporadicbasalcellcarcinomasoftheskinandprimitiveneuroectodermaltumorsofthecentralnervoussystem)》《癌症研究(cancerreserch)》58,1798-1803。

●sasai,k.,romer,j.t.,lee,y.,finkelstein,d.,fuller,c,mckinnon,p.j.,和curran,t.(2006)。《shh途径活性在经培养的髓母细胞瘤细胞中被下调：对临床前研究的意义(shhpathwayactivityisdown-regulatedinculturedmedulloblastomacells:implicationsforpreclinicalstudies)》《癌症研究(cancerresearch)》66,4215-4222。

●sekulic,a.,migden,m.r.,oro,a.e.,dirix,l.,lewis,k.d.,hainsworth,j.d.,solomon,j.a.,yoo,s.,arron,s.t.,friedlander,p.a.等人(2012)《维莫德吉在晚期基底细胞癌中的疗效和安全性(efficacyandsafetyofvismodegibinadvancedbasal-cellcarcinoma)》《新英格兰医学杂志(thenewenglandjournalofmedicine)》366,2171-2179。

●smith,m.j.,beetz,c,williams,s.g.,bhaskar,s.s.,o'sullivan,j.,anderson,b.,daly,s.b.,urquhart,j.e.,bholah,z.,oudit,d.等人(2014)《sufu中的种系突变导致与gorlin综合征相关的儿童髓母细胞瘤并且重新定义与ptch1突变相关的风险(germlinemutationsinsufucausegorlinsyndrome-associatedchildhoodmedulloblastomaandredefinetheriskassociatedwithptch1mutations)》《临床肿瘤学杂志：美国临床肿瘤学协会的官方杂志(journalofclinicaloncology:officialjournaloftheamericansocietyofclinicaloncology.)》。

●stjemqvist,s.,ryden,t.,和greenman,c.d.(2011)《用于癌症snp等位基因拷贝数数据的正常组织污染物的模型一体化估计(model-integratedestimationofnormaltissuecontaminationforcancersnpalleliccopynumberdata)》《癌症信息学(cancerinformatics)》10,159-173。

●stone,d,m.,murone,m.,luoh,s.,ye,wr.,armanini,m.p.,gurney,a.,phillips,h.,brush,j.,goddard,a.,desauvage,f.j.,和rosenthal,a.(1999)《锌指转录因子gli的负调节因子的融合人阻抑基因的表征(characterizationofthehumansuppressoroffused,anegativeregulatorofthezinc-fingertranscriptionfactorgli)》《细胞科学杂志(journalofcellscience)》112(23页),4437-4448。

●svard,j.,heby-henricson,k.,persson-lek,m.,rozell,b.,lauth,m.,bergstrom,a.,ericson,j.,toftgard,r.,和teglund,s(2006)《融合阻抑基因的基因消除表明在哺乳动物刺猬信号传导途径中的基本阻遏物功能(geneticeliminationofsuppressoroffusedrevealsanessentialrepressorfunctioninthemammalianhedgehogsignalingpathway)》《细胞发育学(developmentalcell)》10,187-197。

●sweeney,r.t.,mcclary,a.c,myers,b.r.,bicocho,j.,nahrmg,l.,kwei,k.a.,qu,k.,gong,x.,ng,t.,jones,c.d.,等人(2014)《对成釉细胞瘤中频发smo和braf突变的鉴定(identificationofrecurrentsmoandbrafmutationsinameloblastomas)》《自然遗传学(naturegenetics)》46,722-725。

●tang,y.,gholamin,s.,schubert,s.,wiliardson,m.i.,lee,a.,bandopadhayay,p.,bergthold,g.,masoud,s.,nguyen,b.,vue,n.等人(2014)《通过bet布罗莫结构域抑制对刺猬途径转录输出的表观遗传靶向(epigenetictargetingofhedgehogpathwaytranscriptionaloutputthroughbetbromodomaininhibition)》《自然医学(naturemedicine)》20,732-740。

●taylor,m.d.,liu,l.,raffel,c,hui,c.c,mainprize,t.g.,zhang,x.,agatep,r.,chiappa,s.,gao,l.,lowrance,a.等人(2002)《在易患髓母细胞瘤的sufu中的突变(mutationsinsufupredisposetomedulloblastoma)》《自然遗传学(naturegenetics)》31,306-310。

●wang,c,wu,h.,katritch,v.,han,g.w.,huang,x.p.,liu,w.,siu,f.y.,roth,b.l.,cherezov,v.,和stevens,r.c.(2013)《与抗肿瘤药物结合的人平滑化受体的结构(structureofthehumansmoothenedreceptorboundtoanantitumouragent)》《自然(nature)》497,338-343。

●wang,g.y.,so,p.l.,wang,l.,libove,e.,wang,j.,和epstein,e.h.,jr.(2011年)《鼠基底细胞癌同种异体移植物的建立：用于临床前药物测试和用于分子分析的潜在模型(establishmentofmurinebasalcellcarcinomaallografts:apotentialmodelforpreclinicaldrugtestingandformolecularanalysis)》《皮肤病学研究杂志(thejournalofinvestigativedermatology)》131,2298-2305。

●wechsler-reya,r.j.和scott,m.p.(1999)《利用索尼克刺猬对照物对小脑中神经元前体细胞增殖的控制(controlofneuronalprecursorproliferationinthecerebellumbysonichedgehog)》《神经元(neuron)》22,103-114。

●wong,h.,alicke,b.,west,k.a.,pacheco,p.,la,h.,januario,t.,yauch,r.l.,desauvage,f.j.,和gould,s.e.(2011)《在突变和配体依赖性刺猬途径激活的临床前模型中的维莫德吉的药代动力学-药效学分析(pharmacokinetic-pharmacodynamicanalysisofvismodegibinpreclinicalmodelsofmutationalandligand-dependenthedgehogpathwayactivation)》《临床癌症研究：美国癌症研究协会的官方杂志(clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch)》17,4682-4692。

●xie,j.,murone,m.,luoh,s.m.,ryan,a.,gu,q.,zhang,c,bonifas,j.m.,lam,c.w.,hynes,m.,goddard,a.等人(1998)《激活散发性基底细胞癌中平滑化突变(activatingsmoothenedmutationsinsporadicbasal-cellcarcinoma)》《自然(nature)》391,90-92。

●yauch,r.l.,dijkgraaf,g.j.,alicke,b.,januario,t.,ahn,c.p.,holcomb,t.,pujara,k.,stinson,j.,callahan,c.a.,tang,t.等人(2009)《在髓母细胞瘤中平滑化突变赋予针对刺猬途径抑制剂的耐药性(smoothenedmutationconfersresistancetoahedgehogpathwayinhibitorinmedulloblastoma)》《科学(science)》326,572-574。

●anders,s.和huber,w.(2010)《用于序列计数数据的差示表达分析(differentialexpressionanalysisforsequencecountdata)》《基因组生物学(genomebiology)》11,r106。

●depristo,m.a.,banks,e.,poplin,r.ganmella,k.v.,maguirej.r.,hartl,c.philippakis,a.a.,delangel,g.,rivas,m.a.,hanna,m.等人(2011)《使用下一代dna测序数据的变异发现和基因分型的框架(aframeworkforvariationdiscoveryandgenotypingusingnext-generationdnasequencingdata)》《自然遗传学(naturegenetics)》43,491—498。

●diskin,s.j.,li,m.,hou,c,yang,s.,glessner,j.,hakonarson,h.,bucan,m.,mans,j.m.,和wang,k.(2008)《从全基因组snp基因分型平台对基因组波动信号强度的调节(adjustmentofgenomicwavesinsignalintensitiesfromwhole-genomesnpgenotypingplatforms)》《核酸研究(nucleicacidsresearch)》36,el26。

●filippakopoulos,p.,qi,j.,picaud,s.,shen,y.,smith,w.b.,fedorov,o,morse,e.m.,keates,t.,hickman,t.t.,felletar等人(2010)《bet布罗莫结构域的选择性抑制(selectiveinhibitionofbetbromodomains)》《自然(nature)》468,1067-1073。

●ferbes,s.a.,bindai,n.,bamford,s.,cole,c,kok,c.y.,beare,d.,jia,m.,shepherd,r.,leung,k.,menzies,a.等人(2011)。《cosmic：在癌症体细胞突变目录中挖掘完整癌基因组(cosmic:miningcompletecancergenomesinthecatalogueofsomaticmutationsincancer)》《核酸研究(nucleicacidsresearch)》39,d945-950。

●dorbes,s.a.,tang,g.,bindai,n.,bamford,s.,dawson,e.,cole,c,kok,y.,jia,m.,ewing,r.,menzies,a.等人(2010)《cosmic(癌症中体细胞突变的目录)：研究人类癌症中的获得性突变的资源(cosmic(thecatalogueofsomaticmutationsincancer):aresourcetoinvestigateacquiredmutationsinhumancancer)》《核酸研究(nucleicacidsresearch)》38,d652-657。

●gonzalez—perez,a.,和lopez--bigas,n.(2011)《改善对具有一致性损害评分的非同义snv的结果的评价(improvingtheassessmentoftheoutcomeofnonsynonymoussnvswithaconsensusdeleteriousnessscore,condel)》，condel《美国人类遗传学杂志(americanjournalofhumangenetics)》88,440-449。

●harfe,b.d.sclierz,p.j.,nissim,s.,tian,h.,mcmahon,a.p.,和tabin,c.j.(2004)《在指定脊椎动物数字身份中基于扩张的时间shh梯度的证据(evidenceforanexpansion--basedtemporalshhgradientinspecifyingvertebratedigitidentities)》《细胞(cell)》118,517-528。

●jonkers,j.,meuwissen,r,vandergulden,h,peterse,h.,vandervalk,m.,和berns,a.(2001)《在用于乳腺癌的条件性小鼠模型中brca2和p3的协同肿瘤抑制活性(synergistictumorsuppressoractivityofbrca2andp53inaconditionalmousemodelforbreastcancer)》《自然遗传学(naturegenetics)》29,418-425。

●kasperm.,jaks,v.,are,a.,bergstrom,a.,schwager,a.,svard,j,teglunds.,barker,n.和toftgard,r.(2011)《损伤通过募集毛囊角质细胞而加强表皮肿瘤发生(woundingenhancesepidermaltumorigenesisbyrecruitinghairfolliclekeratinocytes)》《美国国家科学院学报(proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica)》108,4099-4104。

●madisen,l,zwingman,t.a.,sunkin,s.m,oh,s.w,zariwala,h.a.,gu,h.ng,l.l.,palmiter,r.d.,hawrylycz,m.j,jones,a.r等人(2010)《自然神经科学(natureneuroscience)》13,133-140。

●morgan,m等人(2009)《生物信息学(bioinformatics)》25,2607-2608。

●murone,m等人(1999)《现代生物学(currentbiology)》cb9,76-84。

●rudin,c等人(2012)《自然遗传学(naturegenetics)》44,1111-1116。

●sherry,s等人(2001)《核酸研究(nucleicacidsresearch)》29,308-311。

●tibshirani,r和wang,p.(2008)《生物统计学(biostatistics)》9,18-29。

●venkatraman,e.等人(2007)《生物信息学(bioinformatics)》23,657-663。

●wu,t等人(2010)《生物信息学(bioinformatics)》26,873-881。

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虽然已描述了本公开的具体实施例，但以上的描述是说明性的而不是限制性的。在回顾本说明书和所附权利要求时，本公开的许多变型对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开的全部范围应当参考权利要求连同它们的全部范围的等同物和说明书以及这种变更而确定。前面的实施例仅仅是用于说明的目的，而不应被理解成限制由所附权利要求所限定的本公开的范围。

序列表

seqidno:1-人野生型平滑化氨基酸序列(基因库登记号np_005622.1)

seqidno:2-在smo的氨基酸位置529处具有突变的人平滑化氨基酸序列

seqidno:4-人融合阻抑基因(sufu)氨基酸序列(基因库登记号nm_016169.2)

seqidno:5-人融合阻抑基因(sufu)cdna序列(基因库登记号nm_016169.2)