链霉亲和素突变蛋白及其使用方法与流程

本申请要求2016年4月25日向欧洲专利局提交的欧洲专利申请16166773.8的优先权，所述专利申请的全部内容并入本文用于所有目的。发明领域本发明涉及新的稳定的链霉亲和素突变蛋白，利用重组dna技术产生该突变蛋白的方法，以及这些链霉亲和素突变蛋白在变性条件下用于分离、纯化和测定生物物质(比如重组蛋白)中的用途。因此，本发明还涉及具有固定于其上的本发明的链霉亲和素突变蛋白的固相以及编码本发明突变蛋白的核酸分子。本发明进一步涉及适用于检测、分离或纯化蛋白的试剂盒，其包含本发明的突变蛋白，例如固定于固相上的本发明的突变蛋白。
背景技术：
在大肠杆菌中许多重组蛋白的高水平表达导致形成高度聚集的蛋白，此类高度聚集的蛋白通常称为包涵体。包涵体通常在细胞质中形成。然而，当采用分泌载体时，包涵体也可在周质空间中形成。然而，包涵体不限于大肠杆菌；其也可以在例如酵母、哺乳动物和昆虫细胞中形成。若形成包涵体，则可以通过在纯化过程中使用比如6m盐酸胍(guanidiniumhydrochloride)(也称为盐酸胍(guanidinehydrochloride))或8m尿素的变性条件来纯化携带多组氨酸亲和标签的融合蛋白(参见，例如palmer&wingfield“preparationandextractionofinsolubleinclusion-bodyproteinsfromescherichiacoli”，currprotocproteinsci.2004november；chapter：unit-6.3.doi：10.1002/0471140864.ps0603s38或bornholst&falke“purificationofproteinsusingpolyhistidineaffinitytags”，methodsenzymol.2000；326：245-254)。亲和色谱介质与多组氨酸标签(比如六组氨酸(his6)标签)的相互作用不需要肽标签的特定构象，这使得采用变性条件进行有效纯化成为可能。为此，schmidt和skerra认为，当在例如用于6m盐酸胍存在下自溶解的包涵体中分离重组蛋白时，his6标签是比ii更好的选择(schmidt&skerra，“thestrep-tagsystemforone-steppurificationandhigh-affinitydetectionorcapturingofproteins.”natureprotocols2(2007)，1528-1535)。因此，当采用链霉亲和素结合亲和标签比如亲和标签时，建议将此类链霉亲和素结合亲和标签和his6标签均融合到重组蛋白上，以能够首先通过his6标签在变性条件下自包涵体纯化重组蛋白，并且在重新折叠蛋白质后，通过链霉亲和素结合肽在生理条件下进行第二次亲和纯化。这样做应该能够自包涵体获得高纯度和同质的蛋白质制剂。除了在变性条件下不适合蛋白质纯化的限制外，具有序列trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys(seqidno：3)的ii亲和标签(schmidt&skerra，natureprotocols2(2007)，上文引用或美国专利5,506,121)已被广泛认为是一种非常通用的亲和标签。ii亲和标签尤其广泛用于在快速一步法操作程序中，利用生理条件以高纯度和高功能性提供重组蛋白。对于ii亲和标签，目前最广泛和最有效的基于链霉亲和素的受体，是具有改进的结合亲和力的链霉亲和素突变蛋白，该链霉亲和素突变蛋白命名为(voss&skerra，proteinengineering10(1997)，975-982；美国专利6,103,493或欧洲专利0835934)。该ii与链霉亲和素(以及这些链霉亲和素突变蛋白)的生物素结合袋结合，从而使得能够利用生物素衍生物、优选脱硫生物素来进行温和竞争性洗脱，从而实现亲和树脂的重复使用。在过去的15年中，所述ii：系统有力地应用于纯化、检测和分析重组蛋白(在schmidt&skerra，natureprotocols2中综述，上文引用)，甚至是细胞(knabel等，“reversiblemhcmultimerstainingforfunctionalisolationoft-cellpopulationsandeffectiveadoptivetransfer”naturemedicine8(2002)，631-637)。为此，期望这样一种工具和系统，其允许通过采用链霉亲和素结合肽的亲和色谱在变性条件下纯化融合蛋白。因此，本发明的一个目的是提供一种允许通过基于链霉亲和素的亲和色谱在变性条件下纯化融合蛋白的工具和系统。技术实现要素：第一个方面，本发明提供一种突变蛋白，其选自链霉亲和素的突变蛋白，其中，所述突变蛋白(a)在参照如seqidno：1所示野生型链霉亲和素的氨基酸序列的序列位置127处具有cys残基，和(b)在参照如seqidno：1所示野生型链霉亲和素的氨基酸序列的氨基酸位置115至121的区域中包含至少一个突变。第二个方面，本发明提供一种核酸分子，其包含编码本发明的链霉亲和素突变蛋白的序列，所述链霉亲和素突变蛋白即(a)在参照如seqidno：1所示野生型链霉亲和素的氨基酸序列的序列位置127处具有cys残基，和(b)在参照如seqidno：1所示野生型链霉亲和素的氨基酸序列的氨基酸位置115至121的区域中包含至少一个突变的链霉亲和素突变蛋白。本发明第二方面的核酸可以是载体，其包含在可操作地功能性环境中的至少一个拷贝的此核酸分子。第三个方面，本发明提供一种用根据第二个方面的核酸或载体转化或转染的细胞。本发明还提供一种产生根据第一个方面的链霉亲和素突变蛋白的方法，所述方法包括：(a)用包含编码所述链霉亲和素突变蛋白的核酸的载体转化合适的宿主细胞；(b)在其中发生所述链霉亲和素突变蛋白的表达的条件下培养所述宿主细胞；(c)分离所述突变蛋白。本发明还提供一种在变性条件下分离、纯化或测定蛋白的方法，所述蛋白与以下肽序列融合：a)式trp-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa(seqidno：8)的肽序列，其中xaa代表任意氨基酸，yaa和zaa均表示gly，或者yaa表示glu而zaa表示arg或lys，或b)包含至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列的肽序列，其中所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3至8个氨基酸并至少包含序列-his-pro-baa-，其中baa是谷氨酰胺、天冬酰胺或蛋氨酸，并且其中另一个结合模块具有序列-oaa-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa-(seqidno：9)，其中oaa为trp、lys或arg，xaa为任意氨基酸，其中yaa和zaa均为gly，或者yaa为glu而zaa为lys或arg，所述方法包括在合适的条件下，使包含所述蛋白的样品与链霉亲和素突变蛋白接触，以使所述肽序列结合于所述链霉亲和素突变蛋白，和从所述样品中分离得到的复合物。本发明还提供一种在变性条件下固定蛋白的方法，所述蛋白与以下肽序列融合：a)式trp-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa(seqidno：8)的肽序列，其中xaa代表任意氨基酸，yaa和zaa均表示gly，或者yaa表示glu而zaa表示arg或lys，或b)包含至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列的肽序列，其中所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3至8个氨基酸并至少包含序列-his-pro-baa-，其中baa是谷氨酰胺、天冬酰胺或蛋氨酸，并且其中另一个结合模块具有序列-oaa-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa-(seqidno：9)，其中oaa为trp、lys或arg，xaa为任意氨基酸，其中yaa和zaa均为gly，或者yaa为glu而zaa为lys或arg，所述方法包括在用于固定所述蛋白的条件下，使所述蛋白与携带根据第一个方面的链霉亲和素突变蛋白的固相接触。本发明还提供一种固相，其包含固定于其上的本发明的链霉亲和素突变蛋白。这种固相可以为亲和色谱介质。本发明进一步提供一种试剂盒，其包含一种如本文所述的链霉亲和素突变蛋白，或一种具有固定于其上的如本文所述的链霉亲和素的固相。这种试剂盒进一步包括选自常规缓冲剂、助剂和添加剂的至少一种试剂。本发明还提供固定在固体支持物上的如本文所述的链霉亲和素突变蛋白，所述固体支持物例如色谱树脂、elisa板或用于表面等离子体共振(spr)测量的芯片。通过以下说明、附图和非限制性实例更全面理解本发明的这些方面。发明详述本发明已经发现，将存在于野生型链霉亲和素的序列位置127处的组氨酸残基替代提供这样的突变蛋白，此类突变蛋白允许在变性条件下通过链霉亲和素结合肽纯化融合蛋白。这一发现尤其令人惊讶，因为用半胱氨酸残基替代野生型链霉亲和素中的his127导致了链霉亲和素在7m盐酸胍中的稳定性未显著增加(reznik等，“streptavidinswithintersubunitcrosslinkshaveenhancedstability”，natbiotechnol.1996aug；14(8)：1007-11.)。因此，可能还没有预期到，这种氨基酸交换将使可逆地结合链霉亲和素结合肽的链霉亲和素突变蛋白能够用于在变性条件下经由亲和色谱的蛋白质纯化。这尤其正确，因为根据schmidt&skerra(natureprotocols2，上文引用)的推荐，将his6标签/固定的金属螯合亲和色谱(imac)用于变性条件下的蛋白质纯化，在本发明中还发现了美国专利6,103,493的链霉亲和素突变蛋白“1”(该突变蛋白在野生型链霉亲和素序列的氨基酸位置44至47处具有氨基酸序列val44-thr45-ala46-arg47(seqidno：10)，同时在生理条件下明显比本发明的突变蛋白更稳定)不适于变性条件下的蛋白质纯化(参见本申请的实施例4和5)。而是，在本发明中发现，在参照如seqidno：1所示野生型链霉亲和素的氨基酸序列的氨基酸位置115至121的区域中包含至少一个突变的链霉亲和素突变蛋白得益于由cys替代his127。在国际专利申请wo20140/76277中描述了这种链霉亲和素突变蛋白，其在氨基酸位置115至121区段的区域中包含至少一个突变。因此，本发明的优点在于：在蛋白将在其产生过程中形成包涵体的情况下，无需将链霉亲和素结合亲和标签和his6标签均融合到重组蛋白上。另一优点是，本发明的突变蛋白在变性条件下，比如暴露于4m盐酸胍以及暴露于强碱如naoh时是稳定的(参见实施例4)。因此，本发明的突变蛋白还可有利地用于以下应用，比如生物传感器中，该生物传感器例如用于提供蛋白质：蛋白质、蛋白质：肽以及蛋白质：小分子的相互作用分析的无标记、实时测量的fortebio的或ge的系列仪器中；或芯片中，该芯片用于结合于芯片表面的大量分析物的高通量分析；或珠子中，该珠子比如用于如蛋白质：蛋白质相互作用分析的磁珠或珠子或珠子。在所有此类实例中，用所述的链霉亲和素突变蛋白涂布相应的固相提供了一种通用平台，该平台用于将任意蛋白质简单、可重复、温和且稳定地固定到所述固相。同时，链霉亲和素突变蛋白对高浓度碱(氢氧根离子)的稳定性允许固相再生以供进一步使用。在氨基酸位置115-121的区域之外并且除了在序列位置127处存在半胱氨酸残基，本发明的链霉亲和素突变蛋白可对应于wt-链霉亲和素的氨基酸序列。另一方面，根据本发明的氨基酸序列还可以不同于氨基酸115至121的区域之外的wt-链霉亲和素序列。所述链霉亲和素序列的这种变体包括天然存在的变体以及人工产生的变体，这种修饰被理解为置换，包括美国专利6,103,493公开的那些，所述那些包含二硫键、插入、氨基酸残基的缺失以及n-或/和c-端缺失或添加。根据本发明优选的链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置117、120和121处包含至少一个突变，和/或包含氨基酸118和119的缺失和至少氨基酸位置121的置换。从本文中可以看出，环中氨基酸的缺失不仅可被容许，而且对于纯化携带链霉亲和素结合肽的融合蛋白而言可能甚至是有利的。因此，在本发明内指定的位置处的优选变化之外还包含另外的缺失、置换或添加的链霉亲和素突变蛋白也都落入本发明的保护范围。因此，如本文所用的术语“突变”还包括氨基酸残基的缺失(然而，在链霉亲和素的野生型序列的位置127处的cys残基将总是存在于本发明的突变蛋白中)。然而在这方面注意到，本发明不涵盖这样的链霉亲和素突变蛋白：在所述链霉亲和素突变蛋白中，链霉亲和素的氨基酸114至121(tteanawk)的整个环或链霉亲和素的氨基酸115至121(teanawk)的环区域缺失。然而，在本发明的在氨基酸115至121的区段内包含一个或多个突变的突变蛋白中，在位置115至121中的一个处存在至少一个氨基酸。在此类实施方案中的一些中，在位置117、118、119、120和121处存在氨基酸，而在位置118和/或119处的氨基酸缺失。因此，在这类突变蛋白中，由序列位置115至121形成的区段被缩短一个或两个氨基酸。与其中氨基酸115至121的整体区段缺失的突变蛋白不被用于本发明的这一披露相一致的是，如fletcher等，journalofbiotechnology2003中描述的链霉亲和素突变蛋白不被本发明涵盖。这意味着在本文中下述链霉亲和素突变蛋白被排除：1.其中在序列位置114至121处的野生型氨基酸残基thr-thr-glu-asp-asn-ala-trp-lys(tteanawk，seqidno：17)缺失的突变蛋白。在fletcher等中将该突变蛋白命名为sapv。2.在fletcher等中命名为sapv-alb5和sapv-84的两种突变蛋白，在所述突变蛋白中缺失的九个氨基酸残基thr-thr-glu-asp-asn-ala-trp-lys(seqidno：17)被氨基酸序列hpyfyapellffak(seqidno：18)或eggketltpselrdlv(seqidno：19)替代。本发明优选的链霉亲和素突变蛋白源自链霉亲和素变体，该变体在n-端或/和c-端缩短。特别优选本领域现有技术已知的n-端和c-端缩短的最小链霉亲和素。根据本发明优选的多肽在被诱变区域之外包含最小链霉亲和素的氨基酸序列，该最小链霉亲和素n-端起始于氨基酸位置10至16的区域中，c-端终止于氨基酸位置133至142的区域中。优选地，这种链霉亲和素突变蛋白多肽在突变区域之外对应于这样的最小链霉亲和素，所述最小链霉亲和素包含从位置ala13至ser139的氨基酸序列，并且可选择地具有n-端蛋氨酸残基而非ala13。本申请中氨基酸位置的编号整体参考成熟wt-链霉亲和素的编号(argarana等，nucleicacidsres.14(1986)，1871-1882，还参见图1及seqidno：1和seqidno：2)，所述成熟wt-链霉亲和素也在登录号uniprotkb-p22629下保藏。根据本发明尤其优选的在氨基酸位置115至121的区域中携带一个或多个突变的链霉亲和素突变蛋白可以以不同亚类表征。首先，存在于位置117、120和121处的氨基酸可以根据在位置118和119处的两个氨基酸的缺失是否存在而分别考虑。图2概述了在这两种不同情况下存在于位置117、120和121处的氨基酸，并且所述氨基酸因此可在每一个情况下有助于结合链霉亲和素结合肽。无缺失的突变蛋白可以具备以下特征：最优选地，它们在位置117处携带大疏水性残基如trp、tyr或phe，或带电荷的残基如glu、asp或arg，或亲水性残基如asn或gln，或次优选地，携带疏水性残基leu、met或ala，或极性残基thr、ser或his，与以下组合：i)在位置120处的小残基如ser或ala或最优选的gly，其随后与在位置121处的疏水性残基组合，最优选地与大体积疏水性残基如trp、tyr或phe组合：或者与以下组合：ii)在位置120处的疏水性残基，为leu、ile、met或val或更优选的tyr或phe，其随后与在位置121处的小残基如gly、ala或ser组合，或与gln组合，或与疏水性残基如leu、val、ile、trp、tyr、phe或met组合。缺失氨基酸位置118和119的突变蛋白可以具备以下特征：位置117可以是任意氨基酸，其中大体积疏水性残基如phe、tyr或trp为次优选的，位置120因而最优选为trp，次优选为val，而位置121也是疏水性氨基酸，最优选为met、leu、tyr或phe，或者位置121是小亲水性残基，最优选为ser或thr，或者位置121是arg。下文给出的表1-5也示出了示例性特定突变蛋白序列的概述。在一些实施方案中，本发明的链霉亲和素突变蛋白最重要的特征在于，其对于在野生型序列的序列117至121处的位置117、120和121具有第一序列基序，该第一序列基序在序列位置120处包含gly残基(gly120)。这一基序在序列位置121处优选携带phe或tyr，次优选met残基，并且在序列位置117处携带glu、asp、arg、his、leu、met、asn、gln、thr或ser残基，由此位置117在该基序中为更可变的。所述突变蛋白可在序列位置118和119处具有野生型链霉亲和素氨基酸asn118和/或ala119(同样参见图2)。然而也在本发明的保护范围内的是，asn118和ala119被另外的氨基酸残基替代。这一突变可为保守性置换(例如gln或asp替代asn118，或者例如ser、val或ile替代ala119)，或为非保守性置换(例如带正电荷的或疏水性氨基酸残基替代asn118)。因此，所述基序1可以以下述共有序列1为特征：xaa117gly120yaa121，其中xaa可为任意氨基酸，yaa可为phe或tyr或met。在对于位置117至121的第二序列基序中，本文公开的链霉亲和素突变蛋白在序列位置120处包含疏水性或芳香族氨基酸残基(同样参见图2)。优选地，在序列位置120处的该疏水性或芳香族氨基酸为tyr、phe、leu、ile或met。在此第二序列基序中，疏水性或芳香族氨基酸也可存在于序列位置121(独立地选自位置120)处。优选地，在位置121处的残基是leu、ile和met，次优选地为gly、gln、trp、ser、ala或val。另外，独立于序列位置120和121，这样的突变蛋白也可在序列位置117处具有突变。优选地，在序列位置117处的突变为tyr或phe，次优选为arg、trp或gln残基。具有该第二序列基序的此类突变蛋白，或者可具有野生型链霉亲和素氨基酸asn118和/或ala119，或者可在序列位置118和119处具有突变的残基。因此，该基序2可以以下述共有序列2为特征：aaa117baa120caa121，其中aaa可为tyr、phe、arg、trp或gln，baa可为tyr、phe、leu、ile或met，caa可为任意氨基酸。在对于本文公开的在序列位置117至121处具有突变的链霉亲和素突变蛋白的第三序列基序中，在序列位置118和119处的残基缺失(同样参见图2)。在上下文中，在序列位置117处，优选his、glu、gln、thr、arg、asn、lys、ser、ala或ile残基，在序列位置120处，高度优选的氨基酸则为trp或次优选为val残基，而在序列位置121处，优选tyr、leu、met、thr、ser、phe或arg残基。因此，该基序3则可以以下述共有序列3为特征：daa117eaa118faa119gaa120haa121，其中daa和haa可为任意氨基酸，eaa和faa均缺失，和gaa可为trp或val。然而，上述及图2所示的共有序列1到3不应被视为限制了本发明的合适的突变蛋白在wt-链霉亲和素的序列位置117至121的区域中的突变。在该区段中的突变的其它示例性实例示于下表1至5。本文注意到，在国际专利申请wo2014/076277中首次描述了具有此类突变的链霉亲和素突变蛋白及它们结合链霉亲和素结合肽的能力。表1至5：本发明的突变蛋白在wt-链霉亲和素的氨基酸序列的序列位置117至121处的突变的实例表1表2表3wtala117asn118ala119trp120lys121突变蛋白“1”ala117asn118ala119trp120lys121m101(seqidno：75)tyr117asn118ala119phe120leu121m106(seqidno：76)phe117asn118ala119phe120leu121m111(seqidno：77)tyr117asn118ala119leu120trp121m100(seqidno：78)phe117asn118ala119tyr120ile121m110(seqidno：79)tyr117asn118ala119tyr120leu121m104(seqidno：80)tyr117asn118ala119tyr120gln121m108(seqidno：81)phe117asn118ala119ile120trp121表4表5wtala117asn118ala119trp120lys121突变蛋白“1”ala117asn118ala119trp120lys121m300(seqidno：93)ala117---118---119trp120tyr121m301(seqidno：94)his117---118---119trp120met121m302(seqidno：95)his117---118---119trp120tyr121m303(seqidno：96)glu117---118---119trp120tyr121m304(seqidno：97)gln117---118---119trp120tyr121如表1至5公开，本发明的示例性链霉亲和素突变蛋白在野生型链霉亲和素氨基酸序列的序列位置117至121处包含或具有seqidnos：21至97中任一个的序列之一。这些链霉亲和素突变蛋白或者可在其它任意序列位置中任意处具有野生型链霉亲和素序列，或者具有任意已知链霉亲和素突变蛋白的序列，例如，在氨基酸位置44至47处包含氨基酸序列val44-thr45-ala46-arg47(seqidno：10)或ile44-gly45-ala46-arg47(seqidno：11)的已知突变蛋白“1”或“2”的序列。在一些实施方案中，本发明的突变蛋白在序列位置117至121处包含如下氨基酸序列：glu117asn118ala119gly120phe121(seqidno：56)，asp117asn118ala119gly120tyr121(seqidno：57)，glu117asn118ala119gly120tyr121(seqidno：58)，arg117asn118ala119met120met121(seqidno：59)，arg117asn118ala119gly120phe121(seqidno：60)，ala117asn118ala119pro120ala121(seqidno：61)，ala117asn118ala119met120val121(seqidno：62)，gln117asn118ala119ser120ala121(seqidno：63)，ala117asn118ala119gly120phe121(seqidno：64)，gln117asn118ala119met120val121(seqidno：65)和his117---118---119trp120tyr121(seqidno：95)。此外，这种突变蛋白可包含，例如在任意其他位置(除了本发明所有突变蛋白共有的位置127处cys残基)的野生型链霉亲和素序列、突变蛋白“1”的序列或突变蛋白“2”的序列。在其它示例性实施方案中，除了在序列位置127处的cys残基外，本发明的链霉亲和素突变蛋白可包含国际专利申请wo2014/076277的图4所示的下述突变蛋白中任一个的序列，或由所述序列组成，即如下突变蛋白：m400、m402、m4001、突变蛋白“1”-m36、突变蛋白“1”-m23、突变蛋白“1”-m41、突变蛋白“1”-m4、突变蛋白“1”-m12、突变蛋白“1”-m22、突变蛋白“1”-m31、突变蛋白“1”-m32、突变蛋白“1”-m35、突变蛋白“1”-m38、突变蛋白“1”-m40、突变蛋白“1”-m42、突变蛋白“1”-m45、突变蛋白“1”-m46、突变蛋白“1”-m47、突变蛋白“1”-m7、突变蛋白“1”-m10、突变蛋白“1”-m17、突变蛋白“1”-m21、突变蛋白“1”-m24、突变蛋白“1”-m27、突变蛋白“1”-m28、突变蛋白“1”-m30、突变蛋白“1”-m33、突变蛋白“1”-m1、突变蛋白“1”-m3、突变蛋白“1”-m8、突变蛋白“1”-m15、突变蛋白“1”-m6、突变蛋白“1”-m9、突变蛋白“1”-m20、突变蛋白“1”-m34、突变蛋白“1”-m14、突变蛋白“1”-m18、突变蛋白“1”-m19、m4001-m8、m4001-m21、m4001-m9、m4001-m1、m4001-m2、m4001-m3、m4001-m5、m4001-m13、m4001-m14、m4001-m24、m4001-m4、m4001-m6、m4001-m7、m4001-m10、m4001-m15、m4001-m23、m4001-m17、m4001-m12、m4001-m20、突变蛋白“1”-m101、突变蛋白“1”-m106、突变蛋白“1”-m111、突变蛋白“1”-m100、突变蛋白“1”-m110、突变蛋白“1”-m104、突变蛋白“1”-m108、突变蛋白“1”-m207、突变蛋白“1”-m212、突变蛋白“1”-m202、突变蛋白“1”-m204、突变蛋白“1”-m206、突变蛋白“1”-m208、突变蛋白“1”-m203、突变蛋白“1”-m209、突变蛋白“1”-m200、突变蛋白“1”-m201、突变蛋白“1”-m211、突变蛋白“1”-m300、突变蛋白“1”-m301、突变蛋白“1”-m302、突变蛋白“1”-m303、突变蛋白“1”-m304和m1-9。现在转到本发明的突变蛋白的实际应用(例如，在变性条件下的亲和色谱)，其可有利的是使用配体，由于更高的结合亲和力或/和由于以比链霉亲和素结合肽更高的浓度存在，该配体能够分离链霉亲和素结合肽(例如如本文所述(ii)肽或di-tag肽)与根据本发明的链霉亲和素突变蛋白的结合。通常该配体起到(ii)肽的竞争者的作用。该(竞争性)配体通常以游离形式存在，意为不与任何蛋白或其它分子融合。以这种方式，可以在所选择的，例如变性洗脱条件下释放(一般通过竞争性洗脱)结合的链霉亲和素结合肽配体，或释放链霉亲和素结合肽如(ii)肽或di-tag肽与之融合的蛋白。这例如对于下述是重要的：将结合的融合蛋白自链霉亲和素突变蛋白亲和柱上洗脱，或者逆转多聚体低亲和力融合蛋白的结合，该多聚体低亲和力融合蛋白携带链霉亲和素结合肽并且经由本发明的链霉亲和素突变蛋白的骨架多聚体化(多聚体)。因此，在这方面，本发明涉及这样的链霉亲和素突变蛋白：该链霉亲和素突变蛋白对肽配体的结合亲和力使得它们可以通过其它链霉亲和素配体进行竞争性洗脱，所述其它链霉亲和素配体例如生物素、亚氨基生物素、硫辛酸、硫代生物素、脱硫生物素、二氨基生物素、haba(羟基偶氮苯-苯甲酸)或/和二甲基-haba。使用有色物质如haba或二甲基-haba的优势可在于，从柱子洗脱能够被视觉检测到。然而，除这些外，本发明链霉亲和素突变蛋白对肽配体、特别是对ii的结合亲和力通常高于wt-链霉亲和素或美国专利6,103,493中公开的突变蛋白“1”或“2”。因此，在一些实施方案中，更高亲和力的配体如硫代生物素或生物素优选进行高强度洗脱(sharpelution)。或者，结合于生物素结合袋的分离的肽配体，例如如本文所述的，可被用于竞争性洗脱。为了完整性，本文指出链霉亲和素结合肽(其通常与目的蛋白融合或缀合)与本发明的链霉亲和素突变蛋白的相互作用/结合可不仅需由竞争性洗脱破坏，还通过能够破坏该非共价复合物的任何其它方式破坏。例如，如果这种融合蛋白固定于涂布有本发明链霉亲和素突变蛋白的表面比如表面等离子体共振芯片、elisa板或甚至是色谱树脂，该结合可通过ph的变化而被破坏，所述ph的变化例如通过添加碱如naoh进行。这种方法甚至不仅对于表面等离子体共振芯片还对于具有固定于其上的本发明的链霉亲和素突变蛋白的色谱树脂的再生是优选的。对于某些检测方法可优选的是以被标记形式使用本发明的链霉亲和素突变蛋白。因此，本发明进一步的主题为根据本发明的多肽，其特征在于所述多肽携带至少一个标记。合适的标记基团是本领域技术人员已知的，包括常用的放射性标记、荧光标记、发光标记和生色标记，以及产生能够在化学或酶促反应中测定的物质的物质和酶。关于这方面，用于wt-链霉亲和素的所有已知标记也能够偶联于根据本发明的链霉亲和素突变蛋白。本发明的另一方面涉及包含编码本发明链霉亲和素突变蛋白的序列的核酸。可选择地，该核酸可操作地连接至编码信号肽的序列，在特定实施方案中，编码信号肽的序列是编码ompa信号肽的序列。此外，还可以使用其它信号肽，并且根据使用的表达系统或宿主细胞，这甚至可以是尤其优选的。大量此类信号肽都是本领域已知的，因此本文不再详述。然而，优选细胞质表达，即采用起始蛋氨酸代替信号肽(参见schmidt&skerra，j.chromatogr.a676(1994)，337-345)。本发明的另一个方面涉及包含在可操作地功能性环境中的至少一个拷贝的前述核酸的载体。可操作地功能性环境理解为那些使得能够、有利于、促进或/和增加表达的元件，所述表达即mrna的转录或/和随后的处理。这些元件的实例为启动子、增强子、转录起始位点和终止位点、翻译起始位点、polya-位点等。所述载体的选择取决于预期表达系统，对于此，考虑单拷贝质粒、多拷贝质粒以及促进核酸整合到宿主基因组中的介质。大量合适的载体是本领域已知的，因此本文不再详述。这些载体可选择地包含用于载体的标准元件，例如抗性、选择性标记物或/和例如能够实现核酸扩增或诱导表达的元件。本发明的另一个方面涉及细胞，该细胞用所述载体转化或转染，所述载体携带至少一个拷贝的编码根据本发明的链霉亲和素突变蛋白的核酸序列作为插入物。细胞的选择并非特别重要，通常而言可以使用适合这些目的的任意细胞。考虑原核以及真核细胞和酵母。出于实际理由，通常优选原核细胞，在目前的情况下，尤其选择大肠杆菌来表达非糖基化的蛋白。本发明的还一个方面涉及用于产生根据本发明的链霉亲和素突变蛋白的方法，其特征在于以下步骤：(a)用包含编码所述链霉亲和素突变蛋白的核酸的载体转化合适的宿主细胞；(b)在其中发生所述链霉亲和素突变蛋白的表达的条件下培养所述宿主细胞；(c)分离所述多肽。关于所述产生过程，由于根据本发明的链霉亲和素突变蛋白能够结合于内源性生物素，因此它们可能具有毒性作用。因此，在培养宿主细胞时，应当选择所述条件，使得形成的表达产物通过合适的信号序列从使用的宿主细胞内部运送到例如周质中或到培养基中，或者该表达产物以不溶性包涵体的形式聚集在细胞内部。在前一种情况下，根据本发明的链霉亲和素突变蛋白可以从周质细胞级分或细胞上清液中分离出来，而在后一种情况下，根据本发明的方法的步骤(c)包括裂解宿主细胞，分离包涵体形式的链霉亲和素突变蛋白，和使链霉亲和素突变蛋白复性。在这种情况下，大肠杆菌是优选的宿主细胞。根据本发明的链霉亲和素突变蛋白或链霉亲和素突变蛋白/肽配体体系的实际应用，在实质上与常规链霉亲和素/生物素或链霉亲和素/肽配体体系的实际应用相同。然而，如上所述，本文所述的突变蛋白具有以下优点：所有这些实际应用都可以在提供变性条件的一种或多种离液试剂的存在下实施。相比于常规链霉亲和素/生物素体系或如美国专利6,103,493公开的体系的这一优势尤其应用于亲和色谱，以及应用于重组蛋白的纯化、分离或测定方法。因此，本发明还涉及根据本发明的链霉亲和素突变蛋白在用于在变性条件下分离、纯化、检测或固定蛋白的方法中的用途。所述目的蛋白可与a)式trp-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa(seqidno：8)的肽序列融合，其中xaa代表任意氨基酸，yaa和zaa均表示gly，或者yaa表示glu而zaa表示arg或lys。或者，所述目的蛋白可与b)包含至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列的肽序列融合，其中所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3至8个氨基酸并至少包含序列-his-pro-baa-，其中baa是谷氨酰胺、天冬酰胺或蛋氨酸，并且其中另一个结合模块具有序列-oaa-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa-(seqidno：9)，其中oaa为trp、lys或arg，xaa为任意氨基酸，其中yaa和zaa均为gly，或者yaa为glu而zaa为lys或arg。从例如国际专利申请wo02/077018或美国专利7,981,632中已知具有这种至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列的亲和肽。在所述分离、纯化或检测方法中，在合适的和同时变性的条件下，使含有待分离或纯化的蛋白的液体与可选择地固定的链霉亲和素突变蛋白接触，以便将肽序列结合于链霉亲和素突变蛋白。之后，将产生的复合物从液体中分离，并从所述复合物中释放蛋白或检测蛋白。在一些实施方案中，所述肽序列优选ii。在其它实施方案中，所述肽序列优选di-tag3序列(wshpqfekgggsgggsgggswshpqfek；seqidno：5)，在国际专利申请wo02/077018或美国专利7,981,632中描述的di-tag2序列trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys-(glyglyglyser)2-trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys(seqidno：6)或序列wshpqfekgggsgggsggsawshpqfek(seqidno：7，也称为)。所述肽序列优选融合于蛋白的n-或/和c-端。所述链霉亲和素突变蛋白可结合于固相或可能够结合于固相。在分离或纯化方法中利用根据本发明的链霉亲和素突变蛋白/肽配体体系的优势在于，可以使用(除了所述变性条件外)非常温和的条件来洗脱携带肽配体的融合蛋白。因此，可以将与链霉亲和素突变蛋白偶联的固相，比如已吸附融合蛋白的亲和色谱柱，与足够浓度的选自生物素及其衍生物的配体一起温育，以便再次从复合物中释放该融合蛋白。就此而论，证实生物素的使用是特别有利的。根据本发明的链霉亲和素突变蛋白可用于检测方法，其方式与已知用于常规链霉亲和素的相应方法实质上类似。另一个应用是在变性条件下定性或定量测定目的蛋白，该目的蛋白可与a)式trp-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa的肽序列融合，其中xaa代表任意氨基酸，yaa和zaa均表示gly，或者yaa表示glu而zaa表示arg或lys。可选地，所述目的蛋白可与b)包含至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列的肽序列融合，其中所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3至8个氨基酸并至少包含序列-his-pro-baa-，其中baa是谷氨酰胺、天冬酰胺或蛋氨酸，并且其中另一个结合模块具有序列-oaa-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa-(seqidno：9)，其中oaa为trp、lys或arg，xaa为任意氨基酸，其中yaa和zaa均为gly，或者yaa为glu而zaa为lys或arg。在该方法中，在变性但其它合适的条件下使待测定的蛋白与标记的链霉亲和素突变蛋白接触，以便将肽序列与所述链霉亲和素突变蛋白结合，洗涤，测定所述标记。这种测定方法可以例如定性地进行以在蛋白质印记中检测蛋白，或如在elisa中定量地进行。合适的标记为全部已知的放射性和非放射性标记基团，例如发光基团、酶、金属、金属配合物等。所述链霉亲和素可如通过共价偶联而被直接标记。然而，也可使用间接标记，比如标记的抗链霉亲和素抗体或生物素化的酶等。本发明进一步有利的方面是根据本发明的链霉亲和素突变蛋白在变性条件下固定目的蛋白的用途，该目的蛋白与a)肽序列trp-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa融合，其中xaa代表任意氨基酸，yaa和zaa均表示gly，或者yaa表示glu而zaa表示arg或lys。可选地，所述目的蛋白与b)包含至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列的肽序列融合，其中所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3至8个氨基酸并至少包含序列-his-pro-baa-，其中baa是谷氨酰胺、天冬酰胺或蛋氨酸，并且其中另一个结合模块具有序列-oaa-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa-(seqidno：9)，其中oaa为trp、lys或arg，xaa为任意氨基酸，并且其中yaa和zaa均为gly，或者yaa为glu而zaa为lys或arg。在一个实施方案中，所述肽序列是序列(wshpqfekgggsgggsgggswshpqfek；seqidno：5)。在另一个实施方案中，所述肽序列是序列wshpqfekgggsgggsggsawshpqfek(seqidno：7)。该固定优选在涂布有本发明的链霉亲和素突变蛋白的固相上进行，所述固相比如微孔板、珠子(例如由琼脂糖或其它聚合物例如聚甲基丙烯酸酯制成)、由有机或顺磁性材料制成的微珠、由有机或顺磁性材料制成的纳米珠或传感器芯片，该芯片例如biacoretm芯片或其它例如用于横向流动分析或制备蛋白质阵列的支持物(support)。术语“变性条件”，“变性(denaturation/denaturing)”在本文中根据它们在蛋白质化学/蛋白质折叠领域中的常规含义使用。因此，“变性”用于指蛋白质通过暴露于离液剂并与其接触而失去以其天然状态存在的四级结构、三级结构和/或二级结构的过程。离液剂(chaotropicagent/chaotrope)是能够在水性溶液中破坏水分子之间的氢键网络(即发挥离液活性)的化合物。这通过弱化疏水效应对存在于水性溶液中的蛋白质的天然状态的稳定性产生影响。离液剂例如使由水分子形成的蛋白质的结构中的有序量(amountoforder)在本体(bulk)和围绕疏水性氨基酸的水化壳中均降低，并且可以引起其变性。因此，如本文所用的“变性条件”是指这样的条件：在该条件中离液剂以能够诱导目的蛋白的折叠结构的至少部分损失的量存在。可用于本发明的方法中的离液剂的实例包括但不限于：尿素、硫脲、盐酸胍、高氯酸锂、氢氧根离子以及它们的组合。变性条件的示例性实例包括氯化胍以约2m至约6m存在(在高浓度的氯化胍下，约6m蛋白质失去其有序结构，并且它们倾向于变得随机螺旋)，尿素以约1至约8m存在，或使用高氯酸锂的浓缩溶液(例如，约4.5m)。在本发明的方法中使用的变性条件的另一个实例是氢氧根离子以例如约0.05m、或约1m、或约2m(相当于1n或2nnaoh溶液)的浓度存在。在本上下文中，注意到也有可能在常规链霉亲和素/生物素(衍生物)体系中使用根据本发明的链霉亲和素突变蛋白。换言之，这意味着根据本发明的链霉亲和素突变蛋白用于测定或分离携带能够结合于链霉亲和素的基团的物质。如果只是wt-链霉亲和素的一部分被根据本发明的链霉亲和素突变蛋白替代，在这种情况下经由混合四聚体的形成可获得特定效应。本发明的另一方面还涉及一种具有固定于其上的如本文所述的链霉亲和素突变蛋白的固相。合适的固相的示例性实例包括纤维素膜、塑料膜、生物传感器、横向流动装置或亲和色谱介质。亲和色谱介质的实例包括，仅举几个例子，多糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、多糖接枝二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝二氧化硅、聚环氧乙烷接枝二氧化硅、聚(2-羟乙基天冬酰胺)二氧化硅、聚(n-异丙基丙烯酰胺)接枝二氧化硅、苯乙烯-二乙烯基苯凝胶、丙烯酸酯或丙烯酰胺与二醇的共聚物、多糖与n，n′-亚甲基双丙烯酰胺的共聚物以及它们任意两个或更多个的组合。其它公知的同样适用于本发明的亲和色谱介质(或固定相)的实例包括衍生化二氧化硅或交联凝胶。交联凝胶(通常以珠子形式制造)可以基于天然聚合物，即基于天然存在的聚合物类。例如，色谱固定相所基于的天然聚合物是多糖。相应的多糖通常是交联的。多糖介质的实例是琼脂糖凝胶(例如，superflowtm琼脂糖或材料，例如可以以不同的珠子和孔径尺寸商购获得的superflowtm)或交联葡聚糖凝胶。另外的示例性实例是葡聚糖与其共价键合的颗粒状交联琼脂糖介质，其可作为或商购获得(以多种珠子尺寸和多种孔径)，两者均可从gehealthcare获得。这种色谱材料的另一示例性实例是其也可以以不同的珠子和孔径尺寸从gehealthcare获得。本发明的另一方面涉及试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的链霉亲和素突变蛋白或具有固定于其上的如本文所述的链霉亲和素突变蛋白的固相。可选地，所述试剂盒包含标准缓冲液、助剂和添加剂。这种试剂盒特别预期用于上述分离、纯化、分析或测定方法中的一个。然而，该试剂盒也适用于其它其中使用常规链霉亲和素/生物素体系的方法，例如用于核酸杂交测定或免疫测定。所述试剂盒可包含根据本发明的作为游离、非修饰蛋白或/和以固相结合或/和被标记形式的链霉亲和素突变蛋白。本发明还通过下述表格、附图和实例进一步阐明。附图简要说明图1a示出了成熟野生型链霉亲和素的全长氨基酸序列(残基1至159；seqidno：1)，而图1b示出了成熟野生型链霉亲和素的截短版本的氨基酸序列(残基14至139；seqidno：2)，其用于本发明以产生本发明的突变蛋白。图2示出了本发明的在链霉亲和素序列残基117至121的肽区段内具有至少一个突变的突变蛋白的三个序列基序。优选的残基以黑体表示，次优选的残基正常显示。氨基酸残基应被认为是逐个位置的，并且每一个在原则上可与在另一个位置处存在的任意其他残基组合。序列基序1的特征在于，在位置120处高度优选甘氨酸，并且其可与在位置121处的大疏水性残基优选酪氨酸或苯丙氨酸或者次优选蛋氨酸组合，并且与在位置117处的带电荷的、优选谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或组氨酸或者次优选亲水性残基如谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸或疏水性残基如亮氨酸或蛋氨酸组合。序列基序2的特征在于，在位置120处高度优选大疏水性残基来代替小甘氨酸，该大疏水性残基优选酪氨酸或苯丙氨酸但不是色氨酸，而在位置120处亮氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸为次优选的。然后，在位置117和121处还优选疏水性残基，由此对于位置117优选芳香族酪氨酸或苯丙氨酸，而对于位置121优选大的但并非芳香族的疏水性残基，该大的但并非芳香族的疏水性残基最优选亮氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸。对于位置117，次优选的为残基精氨酸、色氨酸或谷氨酰胺，对于位置121，次优选的为残基谷氨酰胺、甘氨酸、色氨酸、丝氨酸、丙氨酸或缬氨酸。序列基序3的特征在于，在位置118和119处的氨基酸缺失。这种情况下，高度优选在原位置120处的色氨酸，而次优选缬氨酸，并且这些残基可优选与在位置121处的酪氨酸组合，由此在位置121处还可存在其它残基如亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或精氨酸，以及最优选地在位置117处可存在氢键受体和/或供体如组氨酸、谷氨酰胺或谷氨酸，或次优选还有其它残基如苏氨酸、精氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸或异亮氨酸。图3示出了本文实验产生并表征的所有突变蛋白的氨基酸序列(突变蛋白m302(seqidno：13)、m302c(seqidno：14)、m1-9(seqidno：15)和m1-9c(seqidno：16))，并且所述氨基酸序列与野生型链霉亲和素(seqidno：2)和美国专利6,103,493中描述的突变蛋白“1”(seqidno：12)(该突变蛋白“1”以其商品名商购可获得)的氨基酸位置14至139的氨基酸序列进行比对。当所述突变蛋白由大肠杆菌在细胞溶质中作为包涵体产生以进行随后的重新折叠、纯化和分析时，所得产生的蛋白序列如所示在n-端(位置13，图4未示出)附加了蛋氨酸。破折号(-)表示突变蛋白m302和m302c中缺失的氨基酸。对于这两种氨基酸，以保持等同位置处的可比性的方式，进行氨基酸编号。然而，应当注意的是，其中在序列位置118和119处的氨基酸残基缺失的突变蛋白m302和m302c具有125个氨基酸残基，这比突变蛋白“1”和突变蛋白m1-9和m1-9c(这些突变蛋白具有127个氨基酸残基长度)短两个氨基酸。在本发明的突变蛋白(m302c和m1-9c)中，序列位置127处的cys残基加下划线并以粗体描绘。此外，在突变蛋白m302、m302c、m1-9和m1-9c中的序列位置117至121区域中突变的氨基酸以粗体显示。图4示出了与突变蛋白“1”相比，突变蛋白m302、m302c、m1-9和m1-9c的稳定性的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析。sds-page样品在加载至凝胶前未煮沸，以便能够确定sds(去垢剂)的变性作用对链霉亲和素突变蛋白的影响。sds-page是在非还原条件下进行的。图5示出了猫免疫缺陷病毒gag蛋白(fivgag)在变性条件下通过亲和色谱纯化的效率的sds-page凝胶分析，其中将链霉亲和素肽trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys-(glyglyglyser)2-gly-gly-ser-ala-trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys(seqidno：110)在c-端与该fivgag融合。图5的sds-page分析示出了使用本发明的链霉亲和素突变蛋白m1-9c的亲和色谱与使用突变蛋白“1”和m1-9的亲和色谱的比较。更详细的，-泳道1示出了在4m尿素存在下采用突变蛋白“1”作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道2示出了在4m盐酸胍存在下采用突变蛋白“1”作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道3示出了分子标记物，-泳道4示出了在4m尿素存在下采用突变蛋白m1-9作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道5示出了在6m尿素存在下采用突变蛋白m1-9作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道6示出了在4m盐酸胍存在下采用突变蛋白m1-9作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道7示出了在6m盐酸胍存在下采用突变蛋白m1-9作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道8示出了在4m尿素存在下采用突变蛋白m1-9c作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道9示出了在6m尿素存在下采用突变蛋白m1-9c作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道10示出了在4m盐酸胍存在下采用突变蛋白m1-9c作为亲和试剂的纯化的洗脱液，-泳道11示出了在6m盐酸胍存在下采用突变蛋白m1-9c作为亲和试剂的纯化的洗脱液，图6示出了野生型链霉亲和素(wt-strep，seqidno：2)、链霉亲和素突变蛋白“1”(seqidno：12)、链霉亲和素突变蛋白m1-9(seqidno：15)和链霉亲和素突变蛋白m1-9c(seqidno：16)的熔融温度曲线。具体实施方式一般方法使用传统的基因工程方法(参见例如sambrook等，molecularcloning.alaboratorymanual(1989)，coldspringharborpress)进行dna操作，大肠杆菌k12top10(lifetechnologies)用于克隆，大肠杆菌bl21用于在包涵体形成下表达猫免疫缺陷病毒gag蛋白(fivgag)，其与链霉亲和素肽trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys-(glyglyglyser)2-gly-gly-ser-ala-trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys(seqidno：7)融合。根据schmidt&skerraj.chromatogr.a676(1994)，337-345，进行链霉亲和素突变蛋白的细胞溶质表达，用于随后的蛋白分离，以偶联到琼脂糖凝胶。由sequencelaboratoriesgmbh根据标准双脱氧技术进行测序。利用appliedbiosystemsexpeditedna合成仪合成引物和寡核苷酸。实施例1：诱变/产生编码突变蛋白m302c和m1-9的表达载体分别从亲本突变蛋白m302和m1-9的表达载体开始，通过位点特异性诱变产生编码突变蛋白m302c和m1-9c的表达载体(参见国际专利申请wo2014/076277的实施例8中对基于pask75的突变蛋白m302和m1-9的表达载体的描述)。通过用于扩增表达载体的引物引入突变his127-＞cys的密码子。将这两种具有相反扩增方向的引物退火至表达载体，然后用pcr扩增表达载体。实施例2：以制备性规模产生链霉亲和素突变蛋白按照例如国际专利申请wo2014/076277所述产生链霉亲和素突变蛋白“1”(seqidno：12)、m1-9(seqidno：15)和m302(seqidno：13)。同样采用重组最小链霉亲和素的已知表达系统(schmidt和skerra(1994)，上文引用)以制备性规模产生链霉亲和素突变蛋白m1-9c(seqidno：16)和m302c(seqidno：14)。为此，通过使用单个sacii和hindiii限制性位点，将编码区的主要部分自包含wt-链霉亲和素编码区和t7启动子的载体psa1中移除，并且替代为来自突变的pask-iba2-sam1质粒的相应区域。随后，如schmidt和skerra(1994)(上文引用)所述，wt-链霉亲和素和链霉亲和素突变蛋白以细胞质包涵体的形式表达，溶解，复性以及通过部分硫酸铵沉淀纯化。使用agilent2100生物分析仪检查所得到的链霉亲和素突变蛋白的纯度。实施例3：在变性条件下链霉亲和素突变体的稳定性分析。为了确定链霉亲和素突变蛋白的稳定性，进行sds-page分析。用于sds-page的突变蛋白的样品在加载至凝胶前未煮沸，以便能够确定sds(去垢剂)的变性作用对链霉亲和素突变蛋白的影响。sds-page在非还原条件下进行且所述凝胶由考马斯亮蓝染色。图4示出了sds-page的结果，其中比较了在这些变性条件下突变蛋白m302、m302c、m1-9和m1-9c与突变蛋白“1”的稳定性。值得注意的是，如从突变蛋白“1”的泳道中的单个突出条带可以看出，即使在sds存在下，该突变蛋白的四聚体形式也保持完整，这表明突变蛋白“1”在变性条件下非常稳定。与此相对地，如从sds-page扩展程度的不稳定性中单体亚基的条带可以看出，突变蛋白m1-9的稳定性要差得多。对于突变蛋白m302，这种不稳定性甚至更加明显。该突变蛋白在sds-page的变性条件下完全解离成其单体。从图4中还可以看出，在位置127处引入cys残基极大地增加了突变蛋白m1-9和m302在这些条件下的稳定性。突变蛋白m1-9c似乎仅以其四聚体形式存在。在这些条件下，突变蛋白302的稳定化的相对增加似乎甚至更加明显。突变蛋白m302c似乎能够在很大程度上维持其四聚体结构，在这些条件下仅有一小部分该链霉亲和素突变蛋白解离成单体。实施例4：融合蛋白的产生和在变性条件下经由亲和色谱自包涵体中纯化该融合蛋白按照本发明实施例3以及国际专利申请wo2014/076277的实施例9所述制备链霉亲和素突变蛋白m1-9(seqidno：15)和m1-9c(seqidno：16)以及美国专利6,103,493的链霉亲和素突变蛋白“1”(seqidno：12)。然后，根据制造商的说明将链霉亲和素突变蛋白与nhs活化琼脂糖凝胶4fastflow(gehealthcare)偶联(参见schmidt和skerra，1994，上文引用)。根据制造商的说明和如国际专利申请wo2014/076277中所述，用bca分析(pierce)测定具有相应链霉亲和素突变蛋白的琼脂糖凝胶加载(superflowtm)。为了检测这两种链霉亲和素突变蛋白和以这种方式固定的us6,103,493的链霉亲和素突变蛋白“1”在变性条件下在携带strep-tagii的融合蛋白的亲和纯化中的行为，采用表达载体pasg-103(ibagmbh，目录号5-4103-001)在大肠杆菌bl21中表达与链霉亲和素肽trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys-(glyglyglyser)2-gly-gly-ser-ala-trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys(也以其商标而已知)融合的重组猫免疫缺陷病毒gag蛋白。这种表达载体的应用导致在大肠杆菌bl21的细胞溶质中形成fivgag蛋白的包涵体。根据以下方案实施重组蛋白表达和细胞收获。在含有氨苄青霉素的lb培养基中培养转化的大肠杆菌bl21细胞，并在达到足够的od时诱导它们。将细胞团块通过离心收获并重悬浮于缓冲液w(100mmtris-clph8，150mmnacl，1mmedta)中。然后在缓冲液w中通过超声处理破碎细胞，之后离心。通过在室温下搅拌15-60分钟，将团块在含有8m尿素或6m盐酸胍的缓冲液w(重量为100mg/ml缓冲液)中裂解。通过用缓冲液w稀释将样品调节至4m、6m尿素、4m和6m盐酸胍的浓度，然后离心。然后将上清液分别施加至突变蛋白“1”的1ml柱(即市售的柱)和突变体m1-9和m1-9c的1ml柱上。如上所述，在每种情况下，将superflowtm用作亲和色谱树脂，所述亲和色谱树脂上偶联相应的链霉亲和素突变蛋白。用缓冲液w和样品的合适的尿素或盐酸胍浓度平衡柱子。对于采用4m尿素和4m盐酸胍浓度的实验，分别地，将2ml包含融合蛋白的样品施加至柱子。对于采用6m尿素和6m盐酸胍浓度的实验，分别地，施加3ml包含融合蛋白的样品以提供等量的蛋白。每个洗涤步骤用一个柱体积(cv)的缓冲液w+尿素/胍洗涤柱子，直至流出液(flowthrough)的a280nm在0.1以下或达到恒定信号。通过将0.8、1.4和0.8cv的缓冲液w+50mm生物素和尿素/胍连续施加到采用的链霉亲和素突变蛋白的柱子上进行洗脱。通过sds-page分析亲和纯化的有效性。图5示出了采用本发明的链霉亲和素突变蛋白m1-9c与突变蛋白“1”和m1-9的亲和色谱的比较。虽然在所有实验中蛋白质纯度都很高，但没有树脂能够以6m盐酸胍的浓度纯化猫免疫缺陷病毒gag蛋白。如从图5可以看出，在含有4m尿素的缓冲液w中用突变蛋白“1”仅纯化了少量蛋白质，而在具有4m尿素和6m尿素的变性条件下使用突变体m1-9的纯化是成功的。这里应注意，对于采用6m尿素的突变蛋白m1-9，图5的凝胶显示出较低蛋白质浓度的条带。然而，后来的结果表明4m和6m尿素之间没有差异。此外，对于突变蛋白m1-9，观察到其可以用于采用4m胍的亲和纯化，但当将尿素用作变性剂(denurant)时，可以洗脱更多的融合蛋白。对于突变蛋白m1-9c，发现当使用4m或6m尿素时，将突变蛋白m1-9c用作纯化的亲和材料导致洗脱液显示出高蛋白质浓度。除了sds-page分析，使用1mmhaba或10mmnaoh测试树脂是否可以适当再生。这样做时，进行了以下观察。在具有尿素和胍的变性条件下进行纯化后，采用缓冲液r(100mmtris-clph8，150mmnacl，1mmedta，1mmhaba)可成功地使strep-tactin突变蛋白“1”的树脂再生。在尿素纯化后，使用10mmnaoh可成功使突变蛋白m1-9的树脂再生，但该树脂在胍纯化过程中被破坏，而在采用尿素或胍作为离液剂的纯化后，使用10mmnaoh均可成功使突变蛋白m1-9c的树脂再生。此外，发现可以采用浓度高达500mm的naoh使突变蛋白m1-9c的树脂再生，而在高于100mm的naoh浓度下突变蛋白m1-c的树脂被破坏。这些实验的结论可总结如下。突变蛋白“1”不适合在变性条件下纯化蛋白。虽然突变蛋白m1-9可用于采用4m和6m尿素的纯化，但当变性缓冲液含有胍时，该突变蛋白不适于纯化，因为胍会破坏突变蛋白m1-9。由于胍是广泛用于从包涵体中纯化蛋白质的变性剂，因此突变体m1-9的实际应用受到严重限制。与此相对地，当将4m或6m尿素以及4m盐酸胍作为离液剂时，突变蛋白m1-9c成功地用于纯化fivgag融合蛋白。此外，发现突变蛋白m1-9c对于暴露于胍是稳定的并且允许树脂材料的再生和再利用。因此，如果要在变性条件下纯化蛋白质并且需要包括高浓度尿素和胍的广范围的变性条件，突变蛋白m1-9c是首选的分子。此外，由于突变蛋白m1-9c的树脂在高达500mm的naoh浓度下稳定，突变蛋白m1-9c的树脂可以有利地用于在需要原位清洗(cip)方案来移除杂质(impurification)的商业环境中的蛋白质的亲和纯化，因为已发现500mmnaoh是非常有效的cip试剂。因此，由于突变体m1-9c对含有链霉亲和素结合序列(例如肽序列)的亲和肽的高亲和力，其现在能够在使用高效cip的生理和/或变性条件下非常有效地纯化商业融合蛋白，由此有助于提高使用所述融合蛋白的安全性。实施例5：链霉亲和素突变蛋白的熔融温度(tm)的测定使用boivin等(proteinexpressionandpurification91(2013)192-206)描述的基于thermofluor的分析，在生理条件下测定野生型核心链霉亲和素(seqidno：2，可从ibagmbh获得，目录号02-20203)、链霉亲和素突变蛋白“1”(seqidno：12)、m1-9(seqidno：15)和m1-9c(seqidno：16)的熔融温度，以便评价它们的热稳定性。更详细地，所述测量在缓冲液w(100mmtris-clph8，150mmnacl，1mmedta)中进行，总样品体积为25μl。将sypro橙用作染色剂(thermofluor)，其中样品含有2μlsypro橙(通过将5000xsypro橙储备溶液凝胶染色剂s5692-50ul(sigma)预稀释至62x的浓度，以得到在样品中5xsypro的最终浓度，制备了该溶液)。蛋白质浓度为5μm。为了测量，将样品移液到96孔rt-pcr板中，并用透明膜密封孔。然后使用1℃/分钟的加热速率启动热循环仪，并监测荧光随时间的增加。使用该方法，获得以下熔融温度(也参见图6，其示出了相应蛋白的熔融曲线)：突变蛋白熔融温度(tm)(℃)wt-链霉亲和素(氨基酸14至139)75突变蛋白“1”75m1-951m1-9c75表6：突变蛋白的熔融点如从表6中可以看出，突变蛋白“1”与野生型链霉亲和素具有相同的75℃的熔融温度，因此其热稳定性比突变蛋白m1-9显著更好。然而，与突变蛋白“1”相对地，尽管突变蛋白m1-9具有显著较低的热稳定性，但其适合用于在变性条件下的蛋白质亲和纯化中(参见上文实施例4)。这一发现不仅仅是令人惊讶的，因为reznik等(natbiotechnol.199，上文引用)发现链霉亲和素的生物素结合能力与热稳定性高度相关，这表明维持四聚体结构对于链霉亲和素维持其生物素结合能力是必需的，因此其对于链霉亲和素突变蛋白维持其结合链霉亲和素结合肽的能力也是必需的，该链霉亲和素结合肽竞争性结合生物素。然而，鉴于仅51℃的熔融温度，本领域技术人员可以预期，突变蛋白m1-9根本不适合在变性条件下的蛋白质的亲和纯化。本领域技术人员也不会预期到在链霉亲和素序列位置127处引入cys残基(如在突变蛋白m1-9c中那样)，在维持例如突变蛋白m1-9在变性条件下的亲和纯化的能力的同时，还将稳定性改善至初始突变体“1”或野生型链霉亲和素的水平。本领域技术人员很容易理解，本发明很适于实施上述目的以及获得结果和优点，以及其中所固有的那些。此外，对本领域技术人员显而易见的是，可以对本文公开的本发明进行不同的替换和修改，而并不脱离本发明的保护范围和本发明的精神。当前代表某些实施方案的本文所述组合物、方法、操作步骤、处理、分子和特定化合物是示例性的，其并非旨在限制发明的保护范围。其中的变化和本领域技术人员将会想到的涵盖于本发明的精神内的其它用途均受本发明权利要求保护范围限定。本发明说明书中对已经公开的文件的列出或讨论不应该必然地被认为是承认所述文件是本领域现有技术的一部分或为公知常识。在本文示例性描述的本发明可适当地不存在本文并未详细公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩大理解，并无限制性。此外，本文采用的术语和表达已用作描述的措辞，并非限制性，并且没有在使用这些术语和表达时排除所示和描述的特征或其部分的任何等同形式的意图，而是认可可以在本发明要求保护的范围内进行各种修改。因而，应该理解，尽管通过示例性实施例和可选择的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可对本文呈现的发明进行修改和改变，这种修改和改变被认为是在本发明的保护范围内。本文对本发明进行了宽泛和一般性描述。落入一般公开内容内的每一个较窄种类和亚属分组也形成本发明的一部分。在从类别中去除任何主题的前提或负面限制情况下，这包括了本发明的一般性描述，无论删除的内容是否在本文详细说明。其它实施方案都在下述权利要求范围内。此外，在本发明的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明还由此按照马库什组的任何个别成员或成员亚组进行了描述。本申请中公开的氨基酸序列的列表：seqidno：1成熟野生型链霉亲和素的氨基酸序列(残基1至159)seqidno：2成熟野生型链霉亲和素的氨基酸序列(残基14至139)seqidno：3trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys，ii亲和标签seqidno：4trp-arg-his-pro-gln-phe-gly-gly，亲和标签seqidno：5trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys-(glyglyglyser)3-trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys，di-tag3序列seqidno：6trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys-(glyglyglyser)2-trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys，di-tag2序列seqidno：7trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys-(glyglyglyser)2-gly-gly-ser-ala-trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys，seqidno：8trp-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa，其中xaa代表任意氨基酸，yaa和zaa均表示gly，或者yaa表示glu而zaa表示arg或lysseqidno：9oaa-xaa-his-pro-gln-phe-yaa-zaa-，其中oaa为trp、lys或arg，xaa为任意氨基酸，并且其中yaa和zaa均为gly，或者yaa为glu而zaa为lys或argseqidno：10val44-thr45-ala46-arg47seqidno：11ile44-gly45-ala46-arg47seqidno：12：突变蛋白“1”seqidno：13：突变蛋白m302seqidno：14：突变蛋白m302cseqidno：15：突变蛋白m1-9seqidno：16：突变蛋白m1-9cseqidno：17thr-thr-glu-asp-asn-ala-trp-lys(tteanawk)seqidno：18hpyfyapellffakseqidno：19eggketltpselrdlvseqidno：20ala117asn118ala119trp120lys121(野生型链霉亲和素)当前第1页12