分离基质的制作方法

本发明涉及亲和色谱的领域，且更特别地涉及蛋白a的突变的免疫球蛋白-结合结构域，其可用于免疫球蛋白的亲和色谱。本发明还涉及所述突变的结构域的多聚体和涉及含有突变的结构域或多聚体的分离基质。发明背景免疫球蛋白代表全世界生产或开发的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求以及由此的价值已导致重点放在制药公司上，以使它们各自的mab生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。亲和色谱在大多数情况下作为这些免疫球蛋白分子，例如单克隆或多克隆抗体的纯化中的关键步骤之一而使用。一类特别感兴趣的亲和试剂是能够特异性结合免疫球蛋白分子的不变部分的蛋白，这样的相互作用是独立于抗体的抗原-结合特异性的。这样的试剂可广泛用来从不同的样品(例如但不限于血清或血浆制备物或细胞培养物来源的原料)亲和色谱回收免疫球蛋白。这样的蛋白的例子是葡萄球菌蛋白a，其含有能够结合来自不同物种的igg免疫球蛋白的fc和fab部分的结构域。这些结构域通常被称为e-、d-、a-、b-和c-结构域。基于葡萄球菌蛋白a(spa)的试剂由于它们的高亲和性和选择性，已发现广泛用于生物
技术领域：
，例如用于抗体的捕获和纯化的亲和色谱以及用于检测或定量。目前，基于spa的亲和介质很可能是最广泛使用的从不同的样品(包括工业细胞培养上清液)分离单克隆抗体及其片段的亲和介质。因此，包含蛋白a-配体的各种基质是可市售获得的，例如，以天然蛋白a的形式(例如proteinasepharose™,gehealthcare,uppsala,sweden)，并且还包含重组蛋白a(例如rprotein-asepharose™,gehealthcare)。更特别地，在商业重组蛋白a产品中进行的基因操纵旨在促进其附接于载体和提高配体的生产力。这些应用，像其它亲和色谱应用，需要综合考虑污染物的确切去除。这样的污染物可以例如是在色谱程序中吸附在固定相或基质上的未洗脱的分子，例如非-希望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、细菌和病毒。从基质除去这样的污染物通常在第一次洗脱所需产物后进行，以在随后使用之前使基质再生。这样的除去通常涉及称为原位清洁(cip)的程序，其中能够从固定相洗脱污染物的试剂被使用。经常使用的一类这样的试剂是通过所述固定相的碱性溶液。目前最广泛使用的清洁和消毒剂是naoh，且其浓度可在从0.1至最多例如1m的范围内，这取决于污染的程度和性质。这个策略与基质暴露于具有13以上的ph-值的溶液有关。对于许多含有蛋白质亲和配体的亲和色谱基质，这样的碱性环境是非常苛刻的条件且由于配体对所涉及的高ph的不稳定性，因此导致能力下降。因此，广泛的研究已经集中于工程改造的蛋白配体的开发，所述配体表现出改进的耐碱性ph-值的能力。例如，gülich等(susannegülich,martinlinhult,per-åkenygren,mathiasuhlén,sophiahober,journalofbiotechnology80(2000),169-178)提出蛋白工程改造以改进链球菌白蛋白-结合结构域(abd)在碱性环境中的稳定性特性。gülich等创建一种abd突变体，其中所有4个天冬酰胺残基已被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)替代。此外，gülich等报告他们的突变体表现出一种类似于天然蛋白的靶蛋白结合行为，并且含有工程改造的配体的亲和柱在重复暴露于碱性条件后显示出比使用亲本的非-工程改造的配体制备的柱更高的结合能力。因此，从中得出结论，所有4个天冬酰胺残基可被替代，而对结构和功能无任何显著的影响。最近的工作显示，也可对蛋白a(spa)进行修改以实现类似的特性。美国专利申请公布us2005/0143566，其通过引用以其整体结合到本文中，公开当至少一个天冬酰胺残基被突变为并非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，该突变赋予在至多约13-14的ph-值时，与亲本spa，例如spa的b-结构域，或蛋白z(一种源自spa的b-结构域的合成构建体)相比，增加的化学稳定性(us5,143,844，通过引用以其整体结合在此)。作者表明当这些突变的蛋白用作亲和配体时，分离介质如所期望的可更好地耐受使用碱性试剂的清洁程序。为增加碱稳定性目的，蛋白a结构域的另外的突变还已经公开于us8,329,860、jp2006304633a、us8,674,073、us2010/0221844、us2012/0208234、us9,051,375、us2014/0031522、us2013/0274451和wo2014/146350中，其全部通过引用以其整体结合到本文中。然而，目前可获得的突变体仍然是对碱性ph敏感的，并且在清洁期间的naoh浓度通常被限制在0.1m，这意味着完全的清洁难以实现。较高的naoh浓度(这将改进清洁)导致不可接受的能力丧失。因此，本领域仍有获得含有蛋白配体的分离基质的需要，所述蛋白配体具有对碱性清洁程序的进一步改进的稳定性。对这样的分离基质也存在需要，所述分离基质具有改进的结合能力，以允许治疗性抗体的经济有效纯化。发明简述本发明的一个方面是提供具有改进的碱稳定性的多肽。这用fc-结合多肽实现，所述多肽包含葡萄球菌蛋白a(spa)的亲本fc-结合结构域的突变体，其由seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:22、seqidno51或seqidno52定义或与这些序列具有至少80%、例如至少90%、95%或98%同一性，其中至少对应于seqidno:4-7的位置11的位置的天冬酰胺或丝氨酸残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。或者，所述多肽包含由seqidno53定义或与seqidno53具有至少80%或至少90%、95%或98%同一性的序列。x1qx2afyeilx3lpnlteeqrx4x5fix6x7lkdx8psx9sx10x11x12laeakx13x14nx15aq(seqidno53)其中彼此独立地：x1=a或q或被缺失x2=e、k、y、t、f、l、w、i、m、v、a、h或rx3=h或kx4=a或nx5=a、g、s、y、q、t、n、f、l、w、i、m、v、d、e、h、r或kx6=q或ex7=s或kx8=e或dx9=q或v或被缺失x10=k、r或a或被缺失x11=a、e或n或被缺失x12=i或lx13=k或rx14=l或yx15=d、f、y、w、k或r一个优点是相对于亲本多肽碱稳定性改进，并维持对免疫球蛋白和其它含有fc的蛋白的高选择性结合。本发明的第二个方面是提供具有改进的碱稳定性的多聚体，其包含多个多肽。这用上文公开的多肽的多聚体实现。本发明的第三个方面是提供编码具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的核酸或载体。这用编码上文公开的多肽或多聚体的核酸或载体实现。本发明的第四个方面是提供能够表达具有改进的碱稳定性的多肽或多聚体的表达系统。这用包含上文公开的核酸或载体的表达系统实现。本发明的第五个方面是提供能够选择性结合免疫球蛋白和其它含有fc的蛋白并显示改进的碱稳定性的分离基质。这用包含至少11mg/ml与多孔载体共价偶联的fc-结合配体的分离基质实现，其中：a)所述配体包含碱稳定的蛋白a结构域的多聚体，b)所述多孔载体包含具有56-70微米的体积加权的中位直径(d50,v)和55-80mg/ml的干固体重量的交联聚合物颗粒。或者，其用包含至少15mg/ml与多孔载体共价偶联的fc-结合配体的分离基质实现，其中所述配体包含碱稳定的蛋白a结构域的多聚体。一个优点是提供高的动态结合能力。其它优点是实现高度的碱稳定性。本发明的第六个方面是提供分离免疫球蛋白或其它含有fc的蛋白的有效和经济的方法。这用包括以下步骤的方法实现：a)使包含免疫球蛋白的液体样品与上文公开的分离基质接触，b)用洗涤液洗涤分离基质，c)用洗脱液从分离基质洗脱免疫球蛋白，和d)用清洁液清洁分离基质。本发明的其它合适的实施方案描述于从属权利要求。同时待审的申请pctep2015/076639、pctep2015/076642、gb1608229.9和gb1608232.3通过引用以其整体结合到本文中。定义术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并被理解为也包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。术语“fc-结合多肽”和“fc-结合蛋白”分别指能够结合抗体的可结晶部分(fc)的多肽或蛋白并包括例如蛋白a和蛋白g，或维持所述结合特性的其任何片段或融合蛋白。术语“接头”在本文中意指使多聚体中的两个多肽单位、单体或结构域彼此连接的元件。术语“间隔区”在本文中指将多肽或多肽多聚体连接于载体的元件。关于氨基酸序列的比较，术语“%同一性”通过标准比对算法例如altshul等(1990)j.mol.biol.,215:403-410描述的basiclocalalignmenttool(blasttm)确定。为此基于网络的软件可自由获自usnationallibraryofmedicine的http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgiprogram=blastp&page_type=blastsearch&link_loc=blasthome。此处，算法“blastp(蛋白-蛋白blast)”用于询问序列与主题序列的比对和确定例如%同一性。如本文使用的，术语"包含(comprises)"、"包含(comprising)"、"含有"、"具有"等可具有在美国专利法中属于它们的含义和可意指"包括(including)"、"包括(including)"等；"基本上由……组成"或"基本上包括"同样具有美国专利法中给予的含义，和该术语是开放式的，允许存在超过所列举的对象，只要所列举的对象的基本或新特征并未由于存在超过所列举对象而改变，但不包括现有技术实施方案。附图简述图1显示如由seqidno:1-7和51-52定义的fc-结合结构域的比对。图2显示来自实施例2的、对于偶联于spr生物传感器芯片的亲本和突变的四聚体zvar(seqidno7)多肽变体的碱稳定性的结果。图3显示来自实施例4的、对于偶联于琼脂糖珠的亲本和突变的四聚体zvar(seqidno7)多肽变体的碱稳定性(0.5mnaoh)的结果。图4显示来自实施例4的、对于偶联于琼脂糖珠的亲本和突变的四聚体zvar(seqidno7)多肽变体的碱稳定性(1.0mnaoh)的结果。图5显示来自实施例7的、对于偶联有不同量的突变的多聚体变体(seqidno.20)的琼脂糖珠的碱稳定性(1.0mnaoh)的结果。结果作为相对剩余动态能力(qb10%，6min停留时间)与在1mnaoh中的孵育时间作图。图6显示来自实施例7的、对于偶联有不同量的突变的多聚体变体(seqidno.20)的琼脂糖珠的碱稳定性(1.0mnaoh)的结果。结果作为在1mnaoh中孵育31h后的相对剩余动态能力(qb10%，6min停留时间)与原型的配体含量作图。实施方案的详细描述一方面，本发明公开一种fc-结合多肽，其包含葡萄球菌蛋白a(spa)的fc-结合结构域的突变体，或基本上由葡萄球菌蛋白a(spa)的fc-结合结构域的突变体组成，所述突变体由以下序列定义，或与其具有至少90%、至少95%或至少98%同一性：如在图1中说明的seqidno:1(e-结构域)、seqidno:2(d-结构域)、seqidno:3(a-结构域)、seqidno:22(变体a-结构域)、seqidno:4(b-结构域)、seqidno:5(c-结构域)、seqidno:6(蛋白z)、seqidno:7(zvar)、seqidno51(无接头区氨基酸1-8和56-58的zvar)或seqidno52(无接头区氨基酸1-8和56-58的c-结构域)，其中至少在对应于seqidno:4-7的位置11的位置*的天冬酰胺(或在seqidno2的情况下为丝氨酸)残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。蛋白z(seqidno:6)是如在us5143844(通过引用以其整体并入本文)中公开的突变的b-结构域，而seqidno7表示蛋白z的另外突变的变体，在此称为zvar，具有突变n3a、n6d、n23t。seqidno:22是来自金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)菌株n315的蛋白a的a-结构域的天然变体(具有a46s突变，使用图1的位置术语)。这些结构域中的n11突变赋予与亲本结构域/多肽比较的改进的碱稳定性，而不损害免疫球蛋白-结合特性。因此，该多肽也可被描述为fc-或免疫球蛋白-结合多肽，或者备选地描述为fc-或免疫球蛋白-结合多肽单位。*纵贯本说明书，使用图1的氨基酸残基位置编号约定，和位置编号被指定为对应于seqidno4-7中的编号。这也适用于多聚体，其中根据图1的约定，位置编号指定在多肽单位或单体中的位置。seqidno51(截短的zvar)qqnafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqseqidno52(截短的c结构域)qqnafyeilhlpnlteeqrngfiqslkddpsvskeilaeakklndaq在备选的语言中，本发明公开包含如由seqidno53定义的或与seqidno53具有至少90%、至少95%或至少98%同一性的序列的fc-结合多肽。seqidno53x1qx2afyeilx3lpnlteeqrx4x5fix6x7lkdx8psx9sx10x11x12laeakx13x14nx15aq其中彼此独立地：x1=a、q或被缺失x2=e、k、y、t、f、l、w、i、m、v、a、h或rx3=h或kx4=a或nx5=a、g、s、y、q、t、n、f、l、w、i、m、v、d、e、h、r或k，例如s、y、q、t、n、f、l、w、i、m、v、d、e、h、r或kx6=q或ex7=s或kx8=e或dx9=q、v或被缺失x10=k、r、a或被缺失x11=a、e、n或被缺失x12=i或lx13=k或rx14=l或yx15=d、f、y、w、k或r。特别地，seqidno53中的氨基酸残基可彼此独立地是：x1=a或被缺失x2=ex3=hx4=nx6=qx7=sx8=dx9=v或被缺失x10=k或被缺失x11=a或被缺失x12=ix13=kx14=l。在某些实施方案中，seqidno53中的氨基酸残基可以是：x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l。在一些实施方案中x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d和x1、x9、x10和x11中的一个或多个被缺失。在进一步的实施方案中，x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=s、y、q、t、n、f、l、w、i、m、v、d、e、h、r或k、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d，或备选地x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=f、y、w、k或r。n11(x2)突变(如n11e或n11k突变)可以是唯一的突变或多肽还可包含另外的突变，例如对应于seqidno:4-7的位置3、6、9、10、15、18、23、28、29、32、33、36、37、40、42、43、44、47、50、51、55和57的至少一个位置的取代。在这些位置的一个或多个中，原始氨基酸残基可以例如用不是天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸取代。原始氨基酸残基可以例如用丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸取代。而且，一个或多个氨基酸残基可以例如从位置1-6和/或从位置56-58缺失。在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置9的位置的氨基酸残基(x1)是并非谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸，例如丙氨酸，或者其可被缺失。在位置9和11的突变的组合提供特别好的碱稳定性，如由实施例显示的。在特定的实施方案中，在seqidno:7中，在位置9的氨基酸残基是丙氨酸和在位置11的氨基酸残基是赖氨酸或谷氨酸，例如赖氨酸。在位置9的突变在同时待审的申请pct/se2014/050872中也有讨论，其通过引用以其整体结合到本文中。在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置50的位置的氨基酸残基(x13)是精氨酸或谷氨酸。在某些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置3的位置的氨基酸残基是丙氨酸和/或对应于seqidno:4-7的位置6的位置的氨基酸残基是天冬氨酸。在位置3和6的氨基酸残基之一可以是天冬酰胺，而在可供选择的实施方案中，在位置3和6的两个氨基酸残基可以是天冬酰胺。在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置43的位置的氨基酸残基(x11)是丙氨酸或谷氨酸，例如丙氨酸，或者其可被缺失。在特定的实施方案中，在seqidno:7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和赖氨酸/谷氨酸，而在位置43的氨基酸残基是丙氨酸或谷氨酸。在某些实施方案中，在对应于seqidno:4-7的位置28的位置的氨基酸残基(x5)是丙氨酸或天冬酰胺，例如丙氨酸。在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置40的位置的氨基酸残基(x9)选自天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和缬氨酸，或选自谷氨酸和缬氨酸，或者其可被缺失。在特定的实施方案中，在seqidno:7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和谷氨酸，而在位置40的氨基酸残基是缬氨酸。任选地，在位置43的氨基酸残基则可以是丙氨酸或谷氨酸。在某些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置42的位置的氨基酸残基(x10)是丙氨酸、赖氨酸或精氨酸，或者其可被缺失。在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置18的位置的氨基酸残基(x3)是赖氨酸或组氨酸，例如赖氨酸。在某些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置33的位置的氨基酸残基(x7)是赖氨酸或丝氨酸，例如赖氨酸。在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置37的位置的氨基酸残基(x8)是谷氨酸或天冬氨酸，例如谷氨酸。在某些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置51的位置的氨基酸残基(x14)是酪氨酸或亮氨酸，例如酪氨酸。在一些实施方案中，对应于seqidno:4-7的位置44的位置的氨基酸残基(x12)是亮氨酸或异亮氨酸。在特定的实施方案中，在seqidno:7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和赖氨酸/谷氨酸，而在44位的氨基酸残基是异亮氨酸。任选地，在43位的氨基酸残基则可以是丙氨酸或谷氨酸。在一些实施方案中，在对应于seqidno:4-7的位置1、2、3和4或位置3、4、5和6的位置的氨基酸残基已被缺失。在这些实施方案的特定变体中，亲本多肽是蛋白a的c结构域(seqidno:5)。天然c结构域上的这些缺失的作用在us9018305和us8329860中描述，其通过引用以其整体结合到本文中。在某些实施方案中，在seqidno4-7(例如在seqidno7)中的突变选自：n11k；n11e；n11y；n11t；n11f；n11l；n11w；n11i；n11m；n11v；n11a；n11h；n11r；n11e,q32a；n11e,q32e,q40e；n11e,q32e,k50r；q9a,n11e,n43a；q9a,n11e,n28a,n43a；q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i；q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i；n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y；q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i；q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y；n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i；q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i；q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r；q9a,n11k,h18k,d37e,a42r；q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i和q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i。这些突变提供特别高的碱稳定性。在seqidno4-7，例如在seqidno7中的突变，也可选自n11k；n11y；n11f；n11l；n11w；n11i；n11m；n11v；n11a；n11h；n11r；q9a,n11e,n43a；q9a,n11e,n28a,n43a；q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i；q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i；q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i；n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y；q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y；n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i；q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i和q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r。在一些实施方案中，该多肽包含以下序列，或基本上由其组成：由选自以下的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列：seqidno8、seqidno9、seqidno10、seqidno11、seqidno12、seqidno13、seqidno14、seqidno15、seqidno16、seqidno23、seqidno24、seqidno25、seqidno26、seqidno27、seqidno28、seqidno29、seqidno36、seqidno37、seqidno38、seqidno39、seqidno40、seqidno41、seqidno42、seqidno43、seqidno44、seqidno45、seqidno46、seqidno47、seqidno48、seqidno49和seqidno50。它可例如包含以下序列，或基本上由其组成：由选自以下的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列：seqidno8、seqidno9、seqidno10、seqidno11、seqidno16、seqidno23、seqidno24、seqidno25、seqidno26、seqidno27、seqidno28和seqidno29。它也可包含以下序列，或基本上由其组成：由选自以下的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列：seqidno8、seqidno9、seqidno10、seqidno11、seqidno16、seqidno23、seqidno24、seqidno25、seqidno27、seqidno28、seqidno38、seqidno40；seqidno41；seqidno42；seqno43、seqidno44、seqidno45、seqidno46、seqidno47和seqidno48。在某些实施方案中，该多肽包含以下序列，或基本上由其组成：由选自seqidno54-70的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列；包含以下序列，或基本上由其组成：由选自seqidno71-75的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列；或其可包含以下序列，或基本上由其组成：由选自seqidno76-79的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列。其还可包含以下序列，或基本上由其组成：由选自seqidno89-95的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列。多肽可例如由选自以上各组或选自这些组的亚集的序列定义，但它还可包含另外的n-和/或c-末端的氨基酸残基，如在n-末端的前导序列和/或在c-末端的尾序列。seqidno8zvar(q9a,n11e,n43a)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkseqidno9zvar(q9a,n11e,n28a,n43a)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkseqidno10zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkseqidno11zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno12zvar(n11e,q32a)vdakfdkeqqeafyeilhlpnlteeqrnafiaslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno13zvar(n11e)vdakfdkeqqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno14zvar(n11e,q32e,q40e)vdakfdkeqqeafyeilhlpnlteeqrnafieslkddpsesanllaeakklndaqapkseqidno15zvar(n11e,q32e,k50r)vdakfdkeqqeafyeilhlpnlteeqrnafieslkddpsqsanllaeakrlndaqapkseqidno16zvar(n11k)vdakfdkeqqkafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno23zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)vdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkseqidno24zvar(q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno25zvar(q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqraafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkseqidno26zvar(n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)vdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakklndaqapkseqidno27zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakklndaqapkseqidno28zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r)vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrailaeakrlndaqapkseqidno29zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r)vdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkseqidno36b(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)adnkfnkeaqeafyeilhlpnlneeqrngfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno37c(q9a,n11e,e43a)adnkfnkeaqeafyeilhlpnlteeqrngfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno38zvar(n11y)vdakfdkeqqyafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno39zvar(n11t)vdakfdkeqqtafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno40zvar(n11f)vdakfdkeqqfafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno41zvar(n11l)vdakfdkeqqlafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno42zvar(n11w)vdakfdkeqqwafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno43zvar(n11i)vdakfdkeqqiafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno44zvar(n11m)vdakfdkeqqmafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno45zvar(n11v)vdakfdkeqqvafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno46zvar(n11a)vdakfdkeqqaafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno47zvar(n11h)vdakfdkeqqhafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno48zvar(n11r)vdakfdkeqqrafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsanllaeakklndaqapkseqidno49zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkseqidno50zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkseqidno54zvar(q9a,n11e,a29g,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrngfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno55zvar(q9a,n11e,a29s,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnsfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno56zvar(q9a,n11e,a29y,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnyfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno57zvar(q9a,n11e,a29q,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnqfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno58zvar(q9a,n11e,a29t,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrntfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno59zvar(q9a,n11e,a29n,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnnfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno60zvar(q9a,n11e,a29f,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnffiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno61zvar(q9a,n11e,a29l,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnlfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno62zvar(q9a,n11e,a29w,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnwfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno63zvar(q9a,n11e,a29i,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnifiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno64zvar(q9a,n11e,a29m,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnmfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno65zvar(q9a,n11e,a29v,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnvfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno66zvar(q9a,n11e,a29d,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrndfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno67zvar(q9a,n11e,a29e,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnefiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno68zvar(q9a,n11e,a29h,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnhfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno69zvar(q9a,n11e,a29r,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnrfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno70zvar(q9a,n11e,a29k,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnkfiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno71zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53f)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklnfaqapkseqidno72zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53y)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklnyaqapkseqidno73zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53w)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklnwaqapkseqidno74zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53k)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklnkaqapkseqidno75zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53r)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklnraqapkseqidno76zvar(q9del,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)vdakfdke_qeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno77zvar(q9a,n11e,q40del,a42k,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddps_skailaeakklndaqapkseqidno78zvar(q9a,n11e,q40v,a42del,n43a,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvs_ailaeakklndaqapkseqidno79zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43del,l44i)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvsk_ilaeakklndaqapkseqidno89zvar(d2del,a3del,k4del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)v___fdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno90zvar(v1del,d2del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,k58del)__akfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqap_seqidno91zvar(k4del,f5del,d6del,k7del,e8del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)vda_____aqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno92zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,a56del,p57del,k58del)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaq___seqidno93zvar(v1del,,d2del,a3del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)___kfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno94zvar(v1del,d2del,a3del,k4del,f5del,d6del,k7del,e8del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)________aqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkseqidno95zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,k58_insyedg)vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkyedg在第二个方面，本发明公开了包含多个由上文公开的任何实施方案定义的多肽单位或基本上由其组成的多聚体。多聚体的使用可增加免疫球蛋白结合能力，和多聚体还可具有比单体更高的碱稳定性。多聚体可例如是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。它可以是同多聚体，其中多聚体中的所有单位是相同的，或者它可以是异多聚体，其中至少一个单位与其它不同。有利的是，多聚体中的所有单位是碱稳定的，例如通过包含上文公开的突变。多肽可通过多肽的c-末端和n-末端之间的肽键直接彼此连接。或者，多聚体中两个或更多个单位可通过包含寡聚体或多聚体物类的接头，例如包含具有至多25或30个氨基酸、例如3-25或3-20个氨基酸的肽的接头连接。接头可例如包含由以下氨基酸序列定义或与所述氨基酸序列具有至少90%同一性或至少95%同一性的肽序列，或基本上由所述肽序列组成：选自apkvdakfdke、apkvdnkfnke、apkadnkfnke、apkvfdke、apakfdke、akfdke、apkvda、vdakfdke、apkkfdke、apk、apkyedgvdakfdke和yedg，或备选地选自apkadnkfnke、apkvfdke、apakfdke、akfdke、apkvda、vdakfdke、apkkfdke、apkyedgvdakfdke和yedg的氨基酸序列。它们也可基本上由以下肽序列组成：所述肽序列由选自apkadnkfnke、apkvfdke、apakfdke、akfdke、apkvda、vdakfdke、apkkfdke、apk和apkyedgvdakfdke的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%同一性或至少95%同一性。在一些实施方案中，接头不由肽apkvdakfdke或apkvdnkfnke组成，或备选地，不由肽apkvdakfdke、apkvdnkfnke、apkfnke、apkfdke、apkvdke或apkadke组成。这样的接头的性质应优选地不使蛋白单位的空间构象失去稳定。这可例如通过避免在接头中存在脯氨酸来实现。此外，所述接头还应优选地在碱性环境中足够稳定，以不损害突变的蛋白单位的特性。为此目的，如果接头不含有天冬酰胺，则是有利的。如果接头不含有谷氨酰胺，则可另外是有利的。多聚体可进一步在n-末端包含多个氨基酸残基，例如源自克隆过程的氨基酸残基，或构成来自裂解的信号序列的残基的氨基酸残基。另外的氨基酸残基的数量可例如是20或更少、例如15或更少、例如10或更少、或5或更少。作为具体的实例，多聚体可在n-末端包含aq、aqgt、vdakfdke、aqvdakfdke或aqgtvdakfdke序列。在某些实施方案中，多聚体可包含选自seqidno80-87的序列，或基本上由其组成。这些和另外的序列在下文列出，和命名为亲本(突变)n，其中n是多聚体中单体单位的数量。seqidno17zvar(q9a,n11e,n43a)4aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkcseqidno18zvar(q9a,n11e,n28a,n43a)4aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsqsaallaeakklndaqapkcseqidno19zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i)4aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskeilaeakklndaqapkcseqidno20zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)4aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno30zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)4aqgtvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkvdakfdkeqqkafyeilklpnlteeqrnafiqklkdepsqsrailaeakryndaqapkcseqidno31zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r)4aqgtvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkvdakfdkeaqkafyeilklpnlteeqrnafiqslkdepsqsrnllaeakklndaqapkcseqidno32zvar(q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i)4aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqraafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno33zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)6aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno34zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)4aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvskailaeakklndaqapkcseqidno35zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)4aqgtvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkdepsvsrailaeakklndaqapkcseqidno80zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)2，其中接头中的d2、a3和k4缺失vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno81zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)2，其中接头中的k58、v1和d2缺失vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno82zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)2，其中接头中的p57、k58、v1、d2和a3缺失vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno83zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)2，其中接头中的k4、f5、d6、k7和e8缺失vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdaaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno84zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)2，其中接头中的a56、p57和k58缺失vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno85zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)2，其中接头中的v1、d2和a3缺失vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkkfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno86zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)2，其中接头中的v1、d2、a3、k4、f5、d6、k7和e8缺失vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno87zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)2，其中在接头的k58和v1之间插入yedgvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkyedgvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkcseqidno88zvar2vdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkvdakfdkeaqeafyeilhlpnlteeqrnafiqslkddpsvskailaeakklndaqapkc在一些实施方案中，如上文公开的多肽和/或多聚体还包含在c-末端或n-末端的一个或多个偶联元件，其选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。偶联元件还可位于距c-末端或n-末端的1-5个氨基酸残基内，例如1-3或1-2个氨基酸残基内。偶联元件可以例如是在c-末端的单一半胱氨酸。偶联元件可直接连接于c-或n-末端，或它/它们可通过包含至多15个氨基酸，例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的一段序列(stretch)连接。这段序列优选在碱性环境中应该也是足够稳定的，不损害突变蛋白的特性。为此目的，如果这段序列不含天冬酰胺，则是有利的。如果这段序列不含谷氨酰胺，则可另外是有利的。具有c-末端半胱氨酸的优点是蛋白的终点偶联可通过半胱氨酸硫醇与载体上的亲电子基团的反应完成。这提供对于结合能力是重要的偶联蛋白的优越移动性。多肽或多聚体的碱稳定性可通过使之偶联于spr芯片，例如如在实施例中所述，使用例如nhs-或马来酰亚胺偶联化学反应偶联于biacorecm5传感器芯片，并在指定温度下，例如22+/-2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，通常使用多克隆人igg测量芯片的免疫球蛋白-结合能力来评价。孵育可例如在0.5mnaoh中进行许多个10min的循环，例如100、200或300个循环。于22+/-2℃，在0.5mnaoh中在100个10min的孵育循环后，基质的igg能力可以是孵育前igg能力的至少55%，例如至少60%、至少80%或至少90%。或者，对于如上测量的特定突变体在100个循环后的剩余igg能力可与对亲本多肽/多聚体的剩余的igg能力比较。在这种情况下，对于突变体的剩余的igg能力可以是亲本多肽/多聚体的至少105%，例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%。在第三方面，本发明公开编码根据以上公开的任何实施方案的多肽或多聚体的核酸。因此，本发明涵盖编码多肽或多聚体的本发明核酸序列的所有形式，例如rna和dna。本发明涵盖载体，例如质粒，其除了编码序列，还包含用于表达根据本发明的多肽或多聚体所需的信号序列。在一个实施方案中，载体包含编码根据本发明的多聚体的核酸，其中编码各个单位的独立的核酸可具有同源或异源的dna序列。在第四方面，本发明公开了表达系统，其包含如上公开的核酸或载体。表达系统可以例如是革兰氏阳性或革兰氏阴性原核宿主细胞系统，例如大肠杆菌(e.coli)或芽孢杆菌(bacillussp)，其已被修饰为表达本发明的多肽或多聚体。在可供选择的实施方案中，表达系统是真核宿主细胞系统，例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，或哺乳动物细胞，例如cho细胞。在第五个方面，本发明公开了分离基质，其中多个根据上文公开的任何实施方案的多肽或多聚体已偶联至固体载体。分离基质可包含至少11、例如11-21、15-21或15-18mg/ml与多孔载体共价偶联的fc-结合配体，其中：a)配体包含碱稳定的蛋白a结构域的多聚体，b)多孔载体包含具有56-70、例如56-66微米的体积加权的中位直径(d50,v)和55-80、例如60-78或65-78mg/ml的干固体重量的交联聚合物颗粒。交联聚合物颗粒还可具有对于mw110kda的葡聚糖，对应于0.69-0.85、例如0.70-0.85或0.69-0.80的反相凝胶过滤色谱kd值的孔径。合适地，交联聚合物颗粒可具有高的刚性，以能够耐受高的流速。刚性可用压力-流动试验测量，如实施例8进一步描述的，其中用基质装填的柱经受递增流速的蒸馏水。压力逐步增加，和测量流速和背压，直到流速开始随压力增加而降低。测量达到的最大流速和最大压力(对应于最大流速的背压)，和用作刚性的度量。当以床高度300+/-10mm在finelinetm35柱(gehealthcarelifesciences)中测量时，最大压力可合适地为至少0.58mpa、例如至少0.60mpa。这允许使用更小的粒径，其对于动态能力是有利的。多聚体可例如包含碱稳定的蛋白a结构域的四聚体、五聚体、六聚体或七聚体，例如碱稳定的蛋白a结构域的六聚体。高配体含量与粒度范围、干固体重量范围和任选的kd范围组合，提供高的结合能力，例如使得对于igg的10%穿透动态结合能力在2.4min停留时间时是至少45mg/ml，例如至少50或至少55mg/ml。备选地或另外地，对于igg的10%穿透动态结合能力在6min停留时间时可以是至少60mg/ml，例如至少65、至少70或至少75mg/ml。碱稳定的蛋白a多聚体对igg具有高度选择性，和分离基质在20mm磷酸盐缓冲液、180mmnacl、ph7.5中可合适地对人igg2具有低于0.2mg/ml、例如低于0.1mg/ml的离解常数。这可根据描述于npakiman等:japplsci12,1136-1141(2012)的吸附等温线方法测定。在某些实施方案中，碱稳定的蛋白a结构域包含葡萄球菌蛋白a(spa)的亲本fc-结合结构域的突变体，如由seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:22、seqidno51或seqidno52所定义，或与其具有至少80%、例如至少90%、95%或98%同一性，其中至少对应于seqidno:4-7的位置11的位置的天冬酰胺或丝氨酸残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸，例如选自谷氨酸和赖氨酸的氨基酸。对应于seqidno:4-7的位置40的位置的氨基酸残基可进一步是缬氨酸，或被突变为缬氨酸。碱稳定的蛋白a结构域还可包含上文的多肽和/或多聚体实施方案中描述的任何突变。在一些实施方案中，碱稳定的蛋白a结构域包含fc-结合多肽，其具有由seqidno53定义或与其具有至少80%或至少90、95%或98%同一性的氨基酸序列。x1qx2afyeilx3lpnlteeqrx4x5fix6x7lkdx8psx9sx10x11x12laeakx13x14nx15aq(seqidno53)其中彼此独立地：x1=a或q或被缺失x2=e、k、y、t、f、l、w、i、m、v、a、h或rx3=h或kx4=a或nx5=a、g、s、y、q、t、n、f、l、w、i、m、v、d、e、h、r或kx6=q或ex7=s或kx8=e或dx9=q或v或被缺失x10=k、r或a或被缺失x11=a、e或n或被缺失x12=i或lx13=k或rx14=l或yx15=d、f、y、w、k或r。在一些实施方案中，氨基酸残基可彼此独立地是：a)x1=a或被缺失、x2=e、x3=h、x4=n、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v或被缺失、x10=k或被缺失、x11=a或被缺失、x12=i、x13=k、x14=l；b)x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d；c)x1是a、x2=e、x3=h、x4=n、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d；或d)x1是a、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。在某些实施方案中，本发明公开了分离基质，其包含至少15、例如15-21或15-18mg/ml与多孔载体共价偶联的fc-结合配体，其中配体包含碱稳定的蛋白a结构域的多聚体。这些多聚体可合适地如上文描述的任何实施方案所公开，或如下文所列举的。这样一种基质可用来分离免疫球蛋白或其它含有fc的蛋白，并且由于多肽/多聚体的改进的碱稳定性，基质将耐受在清洁期间的高碱性的条件，这对于长期重复用于生物处理分离装置是至关重要的。基质的碱稳定性可通过通常于特定的温度下，例如22+/-2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，使用多克隆人igg测量免疫球蛋白-结合能力来评价。孵育可例如在0.5m或1.0mnaoh中进行多个15min循环，例如100、200或300个循环，对应于25、50或75h的总孵育时间。于22+/-2℃，在0.5mnaoh中经96-100个15min孵育循环或24或25h的总孵育时间后，基质的igg能力可以是孵育前igg能力的至少80，例如至少85、至少90或至少95%。于22+/-2℃，在1.0mnaoh中经24h的总孵育时间后，基质的能力可以是孵育前igg能力的至少70，例如至少80或至少90%。在22+/-2c下在1.0m水性naoh中孵育31h后，在2.4min或6min停留时间时对于igg的10%穿透动态结合能力(qb10%)可例如减少少于20%。如技术人员应该理解的，表达的多肽或多聚体在被固定到载体之前，应被纯化至合适的程度。这样的纯化方法是本领域熟知的，且基于蛋白的配体固定于载体容易使用标准方法进行。合适的方法和载体将在下文更详细地讨论。根据本发明的基质的固体载体可以是任何合适的熟知的种类。常规亲和分离基质通常具有有机性质并基于将亲水性表面暴露于所用的水性介质的聚合物，即暴露羟基(-oh)、羧基(-cooh)、羧酰氨基(-conh2，可能呈现为n-取代的形式)、氨基(-nh2，可能呈现为取代的形式)、寡-或聚氧乙烯基团在它们的外表面和(如果存在)也在内表面上。固体载体可适合为多孔的。孔隙率可以表示为kav或kd值(特定尺寸的探针分子可用的孔体积的分数)，其通过反相尺寸排阻色谱，例如根据在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法测量。kav作为比率(ve-v0)/(vt-v0)测定，其中ve是探针分子(例如葡聚糖110kd)的洗脱体积，v0是柱的空隙容积(例如，高mw空隙标志物、例如粗葡聚糖的洗脱体积)和vt是柱的总体积。kd可作为(ve-v0)/vi测定，其中vi是能够进入除了基质体积(由基质聚合物分子占据的体积)之外的所有体积的盐(例如nacl)的洗脱体积。按照定义，kd和kav值二者总是在0-1范围内。kav值可有利地为0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用mw110kda的葡聚糖作为探针分子测量的。用mw110kda的葡聚糖测量的kd值可合适地是0.68-0.90，例如0.68-0.85或0.70-0.85。其优点是载体具有大分数的孔，所述孔能够容纳本发明的多肽/多聚体和结合于多肽/多聚体的免疫球蛋白并提供免疫球蛋白朝向结合位点和离开结合位点的质量运输。多肽或多聚体可经由常规偶联技术，利用存在于配体中的例如硫醇基、氨基和/或羧基，附接于载体。双环氧化物(bisepoxides)、表氯醇、cnbr、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)等是熟知的偶联试剂。在载体和多肽/多聚体之间，可引入一种称为间隔区的分子，其改进多肽/多聚体的可利用性并促进多肽/多聚体化学偶联于载体。取决于多肽/多聚体的性质和偶联条件，偶联可以是多点偶联(例如经由多个赖氨酸)或单点偶联(例如经由单一半胱氨酸)。或者，多肽/多聚体可通过非-共价键合，例如物理吸附或生物特异性吸附，附接于载体。在一些实施方案中，基质包含5-25，例如5-20mg/ml、5-15mg/ml、5-11mg/ml或6-11mg/ml的偶联于载体的多肽或多聚体。偶联的多肽/多聚体的量可受在偶联过程中所用的多肽/多聚体的浓度，受所用的激活和偶联条件和/或受所用载体的孔结构的控制。作为一般规则，基质的绝对结合能力随着偶联多肽/多聚体的量增加，至少达到其中孔变得受偶联的多肽/多聚体显著阻塞的点。不受理论的约束，似乎对于载体所述的kd值，孔被偶联配体的阻塞具有较低的重要性。每mg偶联的多肽/多聚体的相对结合能力将在高偶联水平上降低，导致在以上指定范围内的成本-效益最优。在某些实施方案中，多肽或多聚体通过硫醚键偶联于载体。执行这样的偶联的方法是本领域熟知的并由本领域技术人员使用标准技术和设备容易地进行。硫醚键是柔性和稳定的，且一般适用于亲和色谱。特别是当硫醚键经由多肽或多聚体上的末端或接近-末端的半胱氨酸残基时，偶联的多肽/多聚体的移动性增加，这提供了改进的结合能力和结合动力学。在一些实施方案中，多肽/多聚体经由如上所述的蛋白上提供的c-末端半胱氨酸偶联。这允许半胱氨酸硫醇有效偶联于载体上的亲电子基团，例如环氧化物基团、卤代醇基团等，导致硫醚桥偶联。在某些实施方案中，载体包含多羟基聚合物，例如多糖。多糖的例子包括例如葡聚糖、淀粉、纤维素、支链淀粉、琼脂、琼脂糖等。多糖是固有亲水的，具有低程度的非特异性相互作用，它们提供高含量的反应性(可激活的)羟基且它们对用于生物处理的碱性清洁溶液一般是稳定的。在一些实施方案中，载体包含琼脂或琼脂糖。用于本发明的载体可根据标准方法，例如逆悬浮凝胶化(inversesuspensiongelation)(shjertén:biochimbiophysacta79(2),393-398(1964)容易地制备。或者，基础基质是可市售获得的产品，例如以sepharose™ff(gehealthcare)商品名销售的交联的琼脂糖珠。在对于大规模分离是特别有利的实施方案中，使用在us6602990或us7396467(通过引用以其整体结合到本文中)中描述的方法，载体经修改以增加其刚性，因而使基质更适合于高流速。在某些实施方案中，载体，例如聚合物、多糖或琼脂糖载体被交联，例如用羟烷基醚交联。产生这样的交联的交联剂可以是例如表卤代醇像表氯醇、双环氧化物像丁二醇二缩水甘油醚、烷基化剂像烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚。交联对于载体的刚性是有益的并改进化学稳定性。羟烷基醚交联是碱稳定性的且不引起显著非特异性吸附。或者，固体载体是基于合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物，例如基于二乙烯基和单乙烯基-取代的苯的基质的情况下，基质的表面常常被亲水化，以使如上定义的亲水性基团暴露于周围的水性液体。这样的聚合物根据标准方法，见例如“styrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerization”(rarshady:chimicael'industria70(9),70-75(1988))容易地生产。或者，使用可市售获得的产品，例如source™(gehealthcare)。在另一个替代中，根据本发明的固体载体包含无机性质的载体，例如二氧化硅、氧化锆等。在再另一个实施方案中，固体载体呈现为另一种形式，例如表面、芯片、毛细管或滤器(如膜或深度过滤基质)。关于根据本发明的基质的形状，在一个实施方案中，基质呈现为多孔的整料的形式。在可供选择的实施方案中，基质以可以是多孔或无孔的串珠或粒子形式呈现。以串珠或粒子形式呈现的基质可用作填充床或以悬浮的形式使用。悬浮的形式包括称为膨胀床和纯粹的悬浮液的那些，其中颗粒或珠自由移动。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离程序通常遵循具有浓度梯度的常规色谱。在纯粹的悬浮液的情况下，使用分批的模式。在第六个方面，本发明公开了一种分离免疫球蛋白的方法，其中使用上文公开的分离基质。所述方法可包括以下步骤：a)使包含免疫球蛋白的液体样品与上文公开的分离基质接触，b)用洗涤液洗涤分离基质，c)用洗脱液从分离基质洗脱免疫球蛋白，和d)用清洁液清洁分离基质，所述清洁液可包含0.1–1.0mnaoh或koh、例如0.4–1.0mnaoh或koh。步骤a)–d)可重复至少10次，例如至少50次或50–200次。在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：a)使包含免疫球蛋白的液体样品与如以上公开的分离基质接触，b)用洗涤液洗涤所述分离基质，c)用洗脱液从分离基质洗脱免疫球蛋白，和d)用清洁液清洁分离基质，所述清洁液可备选地称为原位清洁(cip)液体，例如接触(孵育)为至少10min。该方法还可包括以下步骤：在步骤a)之前，提供根据上文描述的任何实施方案的亲和分离基质和提供包含免疫球蛋白和至少一种其它物质的溶液作为液体样品，以及在步骤c)之后，回收洗出液和任选地使洗出液经历进一步的分离步骤，例如通过阴离子或阳离子交换色谱、多元色谱和/或疏水相互作用色谱。液体样品、洗涤液和洗脱液的合适组成，以及执行分离的一般条件是亲和色谱领域且特别是蛋白a色谱领域熟知的。包含含有fc的蛋白和至少一种其它物质的液体样品可包含宿主细胞蛋白(hcp)，例如cho细胞、大肠杆菌或酵母蛋白。cho细胞和大肠杆菌蛋白的含量可便利地通过针对这些蛋白质的免疫分析法测定，如得自cygnustechnologies的chohcp或大肠杆菌hcpelisa试剂盒。宿主细胞蛋白或cho细胞/大肠杆菌蛋白可在步骤b)期间被解除吸附。洗脱可通过使用用于从蛋白a介质洗脱的任何合适的溶液进行。这可以例如是具有ph5或更低，例如ph2.5-5或3-5的溶液或缓冲液。它在一些情况下也可以是具有ph11或更高，例如ph11-14或ph11-13的溶液或缓冲液。在一些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲梯度包含至少一种单-、二-或三官能的羧酸或这样的羧酸的盐。在某些实施方案中，洗脱缓冲液或洗脱缓冲梯度包含至少一个选自乙酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐和甲酸盐的阴离子物类。在一些实施方案中，清洁液是碱性的，例如具有13-14的ph。这样的溶液提供基质的有效的清洁，特别是在区间的上端。在某些实施方案中，清洁液包含0.1-2.0mnaoh或koh，例如0.5-2.0或0.5-1.0mnaoh或koh。这些是有效的清洁溶液，并且当naoh或koh浓度是在0.1m以上或至少0.5m时尤其如此。本发明的多肽的高稳定性使得使用这样的强碱性溶液成为可能。该方法还可包括用消毒液消毒基质的步骤，所述消毒液可例如包含过氧化物，例如过氧化氢和/或过酸，例如过乙酸或过甲酸。在一些实施方案中，步骤a)-d)重复至少10次，例如至少50次、50-200、50-300或50-500次。这对工艺经济是重要的，因为基质可重复利用多次。步骤a)-c)也可重复至少10次，例如至少50次、50-200、50-300或50-500次，其中步骤d)在多个步骤c)的情况后进行，以致步骤d)进行至少10次，例如至少50次。步骤d)可例如在每第2个至第20个步骤c)的情况进行。实施例蛋白的诱变位点定向诱变通过两-步骤pcr，使用编码突变的寡核苷酸进行。作为模板，使用含有z、b或者c的单一结构域的质粒。pcr片段被连接到大肠杆菌表达载体。使用dna测序以验证插入片段的正确序列。为形成突变体的多聚体，使用位于b、c或z结构域的起始密码子(gtagac)的acci位点，其对应于氨基酸vd。用acci和磷酸酶处理，消化用于单体结构域的载体。设计对每个变体特异性的acci粘性-末端引物，两个重叠的pcr产物从每个模板生成。纯化pcr产物并通过在2%琼脂糖凝胶上比较pcr产物估测浓度。等量的成对pcr产物在连接缓冲液中杂交(90℃->25℃，45min)。生成的产物组成可能被连接到acci位点的大约¼的片段(正确的pcr片段和/或消化的载体)。连接和转化后，集落经pcr筛选以鉴定含有所需突变体的构建体。通过dna测序验证阳性克隆。构建体表达和纯化构建体通过大肠杆菌k12在标准培养基中的发酵在细菌周质中表达。发酵后，细胞经热处理以释放周质内容物到培养基中。释放到培养基中的构建体用具有0.2µm孔径的膜，通过微滤回收。每个构建体，现在在来自过滤步骤的渗透液中，通过亲和纯化。将渗透液装载到含有固定化igg的色谱介质(iggsepharose6ff,gehealthcare)上。装载的产物用磷酸盐缓冲盐水洗涤并通过降低ph洗脱。将洗脱池调节至中性ph(ph8)并通过加入二硫苏糖醇还原。然后将样品装载到阴离子交换剂中。洗涤步骤后，在nacl梯度中洗脱构建体以使其与任何污染物分离。洗脱池通过超滤被浓缩至40-50mg/ml。应该注意到，固定化igg介质上的构建体的成功亲和纯化表明所述的构建体具有对igg的高亲和力。纯化的配体用rpclc-ms分析以确定纯度并确定分子量对应于期望值(基于氨基酸序列)。实施例1表1中列出的纯化的单体配体(对于seqidno8-16、23-28和36-48，还包含在n-末端的aqgt前导序列和在c末端的半胱氨酸)，使用gehealthcare的胺偶联试剂盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亚胺偶联)，以足以在biacore表面等离子体共振(spr)仪器(gehealthcare,sweden)中给出约200-1500ru的信号强度的量，在biacorecm5传感器芯片(gehealthcare,sweden)上固定化。为跟踪固定化表面的igg结合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流过芯片并记录信号强度(与结合的量成比例)。然后表面经原位清洁(cip)，即于室温(22+/-2℃)下，用500mmnaoh冲洗10分钟。重复96-100个循环并在每个循环后按剩余的igg结合能力(信号强度)跟踪固定化配体碱稳定性。结果示于表1中并表明至少配体zvar(n11k)1、zvar(n11e)1、zvar(n11y)1、zvar(n11t)1、zvar(n11f)1、zvar(n11l)1、zvar(n11w)1、zn11i)1、zvar(n11m)1、zvar(n11v)1、zvar(n11a)1、zvar(n11h1)、zvar(n11r)1、zvar(n11e,q32a)1、zvar(n11e,q32e,q40e)1和zvar(n11e,q32e,k50r)1、zvar(q9a,n11e,n43a)1、zvar(q9a,n11e,n28a,n43a)1、zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i)1、zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)1、zvar(q9a,n11e,n28a,q40v,a42k,n43a,l44i)1、zvar(n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)1、zvar(q9a,n11k,h18k,s33k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r,l51y)1、zvar(n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)1、zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i)1和zvar(q9a,n11k,h18k,d37e,a42r,n43a,l44i,k50r)1，以及zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)1在位置29具有g,s,y,q,t,n,f,l,w,i,m,v,d,e,h,r或k的变体、zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)1在位置53具有f,y,w,k或r的变体和其中q9、q40、a42或n43已被缺失的zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)1的变体，具有与亲本结构zvar1(用作参考)比较的改进的碱稳定性。此外，配体b(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)1和c(q9a,n11e,e43a)1具有与用作参考的亲本b和c结构域比较的改进的稳定性。表1.用biacore(0.5mnaoh)评价的单体配体。biacore实验还可用于测定配体和igg之间的结合和离解速率。这用如上文所述的装置和用igg1单克隆抗体作为探针分子使用。对于参考zvar1，结合速率(105m-1s-1)是3.1和离解速率(105s-1)是22.1，得到713pm的亲和力(离解速率/结合速率)。对于zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)1(seqidno.11)，结合速率是4.1和离解速率是43.7，亲和力为1070pm。因此对于突变的变体而言，igg亲和力略微更高。实施例2表2中列出的纯化的二聚体、四聚体和六聚体配体，使用gehealthcare的胺偶联试剂盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亚胺偶联)，以足以在biacore仪器(gehealthcare,sweden)中给出约200-1500ru的信号强度的量，在biacorecm5传感器芯片(gehealthcare,sweden)上固定化。为跟踪固定化表面的igg结合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流过芯片并记录信号强度(与结合的量成比例)。然后表面经原位清洁(cip)，即于室温(22+/-2℃)下，用500mmnaoh冲洗10分钟。重复300个循环并在每个循环后按剩余的igg结合能力(信号强度)跟踪固定化配体碱稳定性。结果示于表2和图2中并表明至少配体zvar(q9a,n11e,n43a)4、zvar(q9a,n11e,n28a,n43a)4、zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43e,l44i)4和zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)4、zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42k,n43a,l44i)4和zvar(q9a,n11e,d37e,q40v,a42r,n43a,l44i)4具有与亲本结构zvar4(其用作参考)比较的改进的碱稳定性。六聚体配体zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)6也具有与用作参考的亲本结构zvar6比较的改进的碱稳定性。此外，具有来自两个单体单位之间的接头区的a)d2,a3,k4;b)k58,v1,d2;c)p57,k58,v1,d2,a3;d)k4,f5,d6,k7,e8;e)a56,p57,k58;v1,d2,a3或f)v1,d2,a3,k4,f5,d6,k7,e8的缺失的zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)二聚体具有与用作参考的亲本结构zvar2比较的改进的碱稳定性。具有在接头区在k58和v1之间的yedg插入的zvar(q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i)二聚体也具有与zvar2比较的改进的碱稳定性。表2.用biacore(0.5mnaoh)评价的二聚体、四聚体和六聚体配体实施例3使用1mnaoh代替在实施例2中的500mm，用3个配体的100个cip循环重复实施例2。结果示于表3并表明所有3个配体在1mnaoh中也具有与用作参考的亲本结构zvar4比较的改进的碱稳定性。表3.用biacore(1mnaoh)评价的四聚体配体。实施例4表2的纯化的四聚体配体(全部具有另外的n-末端半胱氨酸)使用下面描述的方法在琼脂糖珠上固定化并对能力和稳定性进行评价。结果示于表4和图3。表4.在柱(0.5mnaoh)中评价的具有四聚体配体的基质。激活所用的基础基质是根据us6602990(通过引用以其整体结合到本文中)的方法制备的85微米(体积-加权的，d50v)中位直径的刚性交联琼脂糖珠，并且根据在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法，对于mw110kda的葡聚糖具有对应于反相凝胶过滤色谱kav值0.70的孔径。于25℃，将25ml(g)排干的基础基质、10.0ml蒸馏水和2.02gnaoh在带有机械搅拌的100ml烧瓶中混合10min。加入4.0ml表氯醇并进行反应2小时。激活的凝胶用10个凝胶沉降体积(gv)的水洗涤。偶联向在50mlfalcon试管中的20ml配体溶液(50mg/ml)中加入169mgnahco3、21mgna2co3、175mgnacl和7mgedta。将falcon试管置于辊式摇床上5-10min，然后加入77mgdte。还原进行>45min。然后将配体溶液在用sephadexg-25填充的pd10柱上脱盐。脱盐溶液中的配体含量通过测量276nmuv吸收来确定。激活的凝胶用3-5gv{0.1m磷酸盐/1mmedtaph8.6}洗涤，然后根据在us6399750(通过引用以其整体结合到本文中)中描述的方法偶联配体。用于实验的所有缓冲液用氮气脱气至少5-10min。凝胶的配体含量可通过改变配体溶液的量和浓度控制。固定后，凝胶用蒸馏水洗涤3xgv。混合凝胶+1gv{0.1m磷酸盐/1mmedta/10%硫代甘油ph8.6}，在室温下，将试管放置于摇床上过夜。然后用3xgv{0.1mtris/0.15mnaclph8.6}和0.5mhac交替洗涤凝胶，然后用8-10xgv蒸馏水洗涤。将凝胶样品送至外部实验室用于氨基酸分析并从总氨基酸含量计算配体含量(mg/ml凝胶)。蛋白gammanorm165mg/ml(octapharma)，在平衡缓冲液中稀释至2mg/ml。平衡缓冲液pbs磷酸盐缓冲液10mm+0.14mnacl+0.0027mkcl,ph7,4(medicago)吸附缓冲液pbs磷酸盐缓冲液10mm+0.14mnacl+0.0027mkcl,ph7,4(medicago)洗脱缓冲液100mm乙酸盐ph2.9动态结合能力将2ml树脂填充到tricorn™5100柱中。穿透能力用äktaexplorer10系统，以6分钟的停留时间(0.33ml/min流速)测定。使平衡缓冲液通过旁路柱，直到获得稳定的基线。这在自动归零之前进行。将样品施加于柱直至获得100%uv信号。然后，再次应用平衡缓冲液直至获得稳定的基线。将样品装载于柱直至达到85%的最大吸光度的uv信号。然后用5个柱体积(cv)的平衡缓冲液，以0.5ml/min的流速洗涤柱。蛋白用5cv洗脱缓冲液，以0.5ml/min的流速洗脱。然后柱用0.5mnaoh，以0.2ml/min的流速清洁并用平衡缓冲液再平衡。为计算在10%时的穿透能力，采用以下方程。即是，装载到柱中直至柱流出液中的igg浓度是进料中igg浓度的10%的igg的量。a100%=100%uv信号；asub=来自非-结合igg亚类的吸光度的贡献；a(v)=以给定的施加体积的吸光度；vc=柱体积；vapp=直至10%穿透的施加体积；vsys=系统死体积；c0=进料浓度。计算在10%穿透时的动态结合能力(dbc)。对10和80%穿透，计算动态结合能力(dbc)。cip-0.5mnaoh在重复暴露于碱性清洁溶液之前和之后测定10%穿透dbc(qb10)。每个循环包括用0.5mnaoh，以0.5/min的速率泵送通过柱20min的cip步骤，此后柱静置4h。暴露在室温(22+/-2℃)下发生。在该孵育后，用平衡缓冲液，以0.5ml/min的流速洗涤柱20min。表4显示6个4h的循环(即暴露于0.5mnaoh的24h累积时间)后的剩余能力，以绝对数值和相对于初始能力表示。实施例5用示于表5中的四聚体配体重复实施例4，但用用于cip步骤的1.0mnaoh代替0.5m。结果示出于表5和图4中。表5.在柱-1.0mnaoh中评价的具有四聚体配体的基质实施例6基础基质使用的基础基质是根据us6602990的方法制备的一组59-93微米(体积加权的，d50v)中位直径(在malvernmastersizer2000激光衍射仪器上测定)的刚性交联琼脂糖珠样品，并且根据上述方法，使用用在0.2mnacl中的原型装填的hr10/30柱(gehealthcare)和用一定范围的葡聚糖级分作为探针分子(流速0.2ml/min)，对于mw110kda的葡聚糖具有对应于反相凝胶过滤色谱kd值0.62-0.82的孔径。珠样品的干重量范围为53-86mg/ml，如通过在105°c干燥1.0ml沥干滤饼样品过夜和称重测定的。表6.基础基质样品偶联将100ml基础基质用10个凝胶体积的蒸馏水在玻璃滤器上洗涤。将凝胶称重(1g=1ml)和与30ml蒸馏水和8.08gnaoh(0.202mol)在250ml具有搅动器的烧瓶中混合。在水浴中将温度调整至27+/-2°c。在90+/-10分钟期间在剧烈搅拌(约250rpm)下加入16ml表氯醇(0.202mol)。使反应继续另外80+/-10分钟，然后用>10个凝胶体积的蒸馏水在玻璃滤器上洗涤凝胶，直到达到中性ph。该激活的凝胶直接用于如下所述的偶联。向在50mlfalcon试管中的16.4ml配体溶液(50mg/ml)中加入139mgnahco3、17.4mgna2co3、143.8mgnacl和141mgedta。将falcon试管置于辊式摇床上5-10min，然后加入63mgdte。还原进行>45min。然后将配体溶液在用sephadexg-25填充的pd10柱上脱盐。脱盐溶液中的配体含量通过测量276nmuv吸收来确定。激活的凝胶用3-5gv{0.1m磷酸盐/1mmedtaph8.6}洗涤，然后根据us63997505.2.2中描述的方法偶联配体，尽管具有显著更高的配体量(见下文)。用于实验的所有缓冲液用氮气脱气至少5-10min。凝胶的配体含量通过改变配体溶液的量和浓度，添加5-20mg配体/ml凝胶而控制。配体是碱稳定的突变体的四聚体(seqidno.20)或六聚体(seqidno.33)。固定后，凝胶用蒸馏水洗涤3xgv。将凝胶+1gv{0.1m磷酸盐/1mmedta/10%硫代甘油ph8.6}混合，和在室温下，将试管放置于摇床上过夜。然后用3xgv{0.1mtris/0.15mnaclph8.6}和0.5mhac交替洗涤凝胶，然后用8-10xgv蒸馏水洗涤。将凝胶样品送至外部实验室用于氨基酸分析并从总氨基酸含量计算配体含量(mg/ml凝胶)。评价以2.4和6min停留时间，对于多克隆人igg的qb10%动态能力如实施例4所述进行测定。表7.原型结果*seqidno21实施例7如上制备的具有不同配体含量(四聚体，seqidno:20)的一系列原型在1mnaoh中在22+/-2°c孵育4、8和31小时，在孵育之前和之后测量动态igg能力(qb10%，6min停留时间)。原型显示于表8和结果显示于图5和6。可见到，对这种苛刻的碱处理的稳定性随配体含量的增加而增加。表8.在1mnaoh中孵育的样品原型配体含量(mg/ml)qb10%，6min，孵育前(mg/ml)n11278le281379n171673n162073实施例8基质的压力-流动试验将300ml沉降基质在具有35mm内径和330mm管高度的finelinetm35柱(gehealthcarelifesciences,uppsala,sweden)中装填。将凝胶悬浮于蒸馏水中以产生620ml的浆液体积，和装填床的高度为300+/-10mm。装填压力为0.10+/-0.02巴(10+/-2kpa)。然后以递增的泵速泵送蒸馏水通过柱，和对于每个泵设定在5min后测量流速(表示为线性流速cm/h)和背压(mpa)。继续测量，直到达到最大流速和最大压力，即，当在递增的背压下流速开始减少时达到的流速和背压。表9基质的压力流动性能基质最大流速cm/h最大压力(mpa)51713430.5610613060.56531c5130.51p108620.60s911720.64p10和s9基质具有更高的刚性，如通过最大压力指示的，因此能够承受相对高的流速，尽管它们低(59-64微米)的中位粒径。本书面说明书使用实施例来公开本发明，包括最佳模式，并且还能使本领域的任何技术人员实践本发明，包括制造和使用任何设备或系统并执行任何结合的方法。本发明的可专利性范围由权利要求书限定，并且可包括本领域技术人员可设想的其它实施例。这样的其它实施例意欲落入权利要求书的范围内，只要它们具有与权利要求书的文字语言相同的结构要素，或它们包括与权利要求书的文字语言无实质性差异的等同结构要素。本文中提及的所有专利和专利申请通过引用以其整体结合到本文中，如同它们各自结合到本文中一样。实施方案的详细列表i.fc-结合多肽，其包含由seqidno53定义或与seqidno53具有至少90%或至少95%或98%同一性的序列x1qx2afyeilx3lpnlteeqrx4x5fix6x7lkdx8psx9sx10x11x12laeakx13x14nx15aq(seqidno53)其中彼此独立地：x1=a或q或被缺失x2=e、k、y、t、f、l、w、i、m、v、a、h或rx3=h或kx4=a或nx5=a、g、s、y、q、t、n、f、l、w、i、m、v、d、e、h、r或kx6=q或ex7=s或kx8=e或dx9=q或v或被缺失x10=k、r或a或被缺失x11=a、e或n或被缺失x12=i或lx13=k或rx14=l或yx15=d、f、y、w、k或r。ii.实施方案i的多肽，其中：x1=a或被缺失、x2=e、x3=h、x4=n、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v或被缺失、x10=k或被缺失、x11=a或被缺失、x12=i、x13=k、x14=l。iii.实施方案i或ii的多肽，其中x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。iv.实施方案i或ii的多肽，其中x1被缺失、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。v.实施方案i或ii的多肽，其中x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=s、y、q、t、n、f、l、w、i、m、v、d、e、h、r或k、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。vi.实施方案i或ii的多肽，其中x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9被缺失、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。vii.实施方案i或ii的多肽，其中x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10被缺失、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。viii.实施方案i或ii的多肽，其中x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11被缺失、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。ix.实施方案i或ii的多肽，其中x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=f、y、w、k或r。x.fc-结合多肽，其包含葡萄球菌蛋白a(spa)的亲本fc-结合结构域的突变体，所述突变体由seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:22、seqidno51或seqidno52定义或与其具有至少90%、例如至少95%或98%同一性，其中至少在对应于seqidno:4-7的位置11的位置的天冬酰胺或丝氨酸残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。xi.实施方案x的多肽，包含葡萄球菌蛋白a(spa)的亲本fc-结合结构域的突变体，所述突变体由seqidno51或seqidno52定义或与其具有至少90%、例如至少95%或98%同一性。xii.实施方案x或xi的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置11的位置的氨基酸残基是谷氨酸。xiii.实施方案x-xii中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置11的位置的氨基酸残基是赖氨酸。xiv.实施方案x-xiii中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置29的位置的氨基酸残基是甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸。xv.实施方案x-xiv中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置9的位置的氨基酸残基是丙氨酸。xvi.实施方案x-xv中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置9的位置的氨基酸残基已被缺失。xvii.实施方案x-xvi中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置50的位置的氨基酸残基是精氨酸或谷氨酸、例如精氨酸。xviii.实施方案x-xvii中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置43的位置的氨基酸残基已被缺失。xix.实施方案x-xviii中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置28的位置的氨基酸残基是丙氨酸或天冬酰胺。xx.实施方案x-xix中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置40的位置的氨基酸残基选自天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和缬氨酸。xxi.实施方案x-xx中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置40的位置的氨基酸残基已被缺失。xxii.实施方案x-xxi中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置42的位置的氨基酸残基是丙氨酸、赖氨酸或精氨酸、例如精氨酸。xxiii.实施方案x-xxii中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置42的位置的氨基酸残基已被缺失。xxiv.实施方案x-xxiii中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置44的位置的氨基酸残基是亮氨酸或异亮氨酸、例如异亮氨酸。xxv.实施方案x-xxiv中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置44的位置的氨基酸残基已被缺失。xxvi.实施方案x-xxv中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置53的位置的氨基酸残基是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸或赖氨酸。xxvii.实施方案x-xxvi中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置18的位置的氨基酸残基是赖氨酸或组氨酸、例如赖氨酸。xxviii.实施方案x-xxvii中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置33的位置的氨基酸残基是赖氨酸或丝氨酸、例如赖氨酸。xxix.实施方案x-xxviii中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置37的位置的氨基酸残基是谷氨酸或天冬氨酸、例如谷氨酸。xxx.实施方案x-xxix中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置51的位置的氨基酸残基是酪氨酸或亮氨酸、例如酪氨酸。xxxi.实施方案x-xxx中任一项的多肽，其中在对应于seqidno:4-7的位置1、2、3、4、5、6、7、8、56、57或58的位置的一个或多个氨基酸残基已被缺失。xxxii.实施方案x-xxxi中任一项的多肽，其中所述突变选自：q9a,n11e,a29g,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29s,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29y,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29q,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29t,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29n,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29f,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29l,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29w,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29i,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29m,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29v,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29d,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29e,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29h,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,a29r,q40v,a42k,n43a,l44i;和q9a,n11e,a29k,q40v,a42k,n43a,l44i。xxxiii.实施方案x-xxxii中任一项的多肽，其中所述突变选自：q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53f;q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53y;q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53w;q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53k;和q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,d53r。xxxiv.实施方案x-xxxiii中任一项的多肽，其中所述突变选自：q9del,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,q40del,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,q40v,a42del,n43a,l44i;和q9a,n11e,q40v,a42k,n43del,l44i。xxxv.实施方案x-xxxiv中任一项的多肽，其中所述突变选自：d2del,a3del,k4del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i;v1del,d2del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,k58del;v1del,d2del,a3del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,p57del,k58del;k4del,f5del,d6del,k7del,e8del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i;q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,a56del,p57del,k58del;v1del,,d2del,a3del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i;v1del,d2del,a3del,k4del,f5del,d6del,k7del,e8del,q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i;和q9a,n11e,q40v,a42k,n43a,l44i,k58_insyedg。xxxvi.实施方案i-xxxi中任一项的多肽，包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列或基本上由其组成：seqidno54、seqidno55、seqidno56、seqidno57、seqidno58、seqidno59、seqidno60、seqidno61、seqidno62、seqidno63、seqidno64、seqidno65、seqidno66、seqidno67、seqidno68、seqidno69和seqidno70。xxxvii.实施方案i-xxxi中任一项的多肽，包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列或基本上由其组成：seqidno71、seqidno72、seqidno73、seqidno74和seqidno75。xxxviii.实施方案i-xxxi中任一项的多肽，包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列或基本上由其组成：seqidno76、seqidno77、seqidno78和seqidno79。xxxix.实施方案i-xxxi中任一项的多肽，包含与选自以下的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列或基本上由其组成：seqidno89、seqidno90、seqidno91、seqidno92、seqidno93、seqidno94和seqidno95。xl.任何前述实施方案的多肽，与由seqidno1、seqidno2、seqidno3、seqidno4、seqidno5、seqidno6或seqidno7定义，例如由seqidno7定义的多肽相比，所述多肽具有改进的碱稳定性。xli.任何前述实施方案的多肽，与由seqidno1、seqidno2、seqidno3、seqidno4、seqidno5、seqidno6或seqidno7定义，例如由seqidno7定义的亲本多肽相比，所述多肽具有改进的碱稳定性。xlii.实施方案xl或xli的多肽，其中在0.5m或1.0m水性naoh中在22+/-2°c下孵育24、25h后，通过剩余igg-结合能力测量，碱稳定性得到改进。xliii.多聚体，包含多个由任何前述实施方案定义的多肽，或基本上由其组成。xliv.实施方案xliii的多聚体，其中所述多肽通过包含至多25个氨基酸、例如3-25或3-20个氨基酸的接头连接。xlv.实施方案xliii或xliv的多聚体，其中至少两个多肽通过接头连接，所述接头包含与选自apkvdakfdke、apkvdnkfnke、apkadnkfnke、apkvfdke、apakfdke、akfdke、apkvda、vdakfdke、apkkfdke、apk、apkyedgvdakfdke和yedg的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列，或基本上由其组成。xlvi.实施方案xliv或xlv的多聚体，其为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。xlvii.实施方案xliv-xlvi中任一项的多聚体，其包含选自由seqidno80、seqidno81、seqidno82、seqidno83、seqidno84、seqidno85、seqidno86和seqidno87定义的序列的序列，或基本上由其组成。xlviii.任何前述实施方案的多肽或多聚体，其进一步在c-末端或n-末端，或离c-末端或n-末端的1-5氨基酸残基内，包含一个或多个选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基的偶联元件。xlix.核酸或载体，编码任何前述实施方案的多肽或多聚体。l.表达系统，其包含实施方案xlix的核酸或载体。li.分离基质，其中实施方案i–xlviii中任一项的多种多肽或多聚体与固体载体偶联。lii.分离基质，包含至少11mg/ml与多孔载体共价偶联的fc-结合配体，其中：a)所述配体包含碱稳定的蛋白a结构域的多聚体，b)所述多孔载体包含具有55-70微米的体积加权的中位直径(d50,v)和55-80mg/ml的干固体重量的交联聚合物颗粒。liii.分离基质，包含至少15、例如15-21或15-18mg/ml与多孔载体共价偶联的fc-结合配体，其中所述配体包含碱稳定的蛋白a结构域的多聚体。liv.实施方案li或liii的分离基质，其中所述交联聚合物颗粒包含交联多糖颗粒。lv.实施方案li-liv中任一项的分离基质，其中所述交联聚合物颗粒包含交联琼脂糖颗粒。lvi.实施方案li-lv中任一项的分离基质，其中所述交联聚合物颗粒具有对于mw110kda的葡聚糖，对应于0.70-0.85的反相凝胶过滤色谱kd值的孔径。lvii.实施方案li-lvi中任一项的分离基质，当以300+/-10mm床高度在finelinetm35柱中装填时，其具有至少0.58、例如至少0.60mpa的最大压力。lviii.实施方案li-lvii中任一项的分离基质，其中所述多聚体包含碱稳定的蛋白a结构域的四聚体、五聚体、六聚体或七聚体。lix.实施方案li-lviii中任一项的分离基质，其中所述多聚体包含碱稳定的蛋白a结构域的六聚体。lx.实施方案li-lix中任一项的分离基质，其中所述多肽通过包含至多25个氨基酸、例如3-25或3-20个氨基酸的接头连接。lxi.实施方案li-lx中任一项的分离基质，其中至少两个多肽通过接头连接，所述接头包含与选自apkvdakfdke、apkvdnkfnke、apkadnkfnke、apkvfdke、apakfdke、akfdke、apkvda、vdakfdke、apkkfdke、apk、apkyedgvdakfdke和yedg的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列，或基本上由其组成。lxii.实施方案li-lxi中任一项的分离基质，以2.4min停留时间，对于igg具有至少45mg/ml、例如至少50mg/ml或至少55mg/ml的10%穿透动态结合能力。lxiii.实施方案li-lxii中任一项的分离基质，以6min停留时间，对igg具有至少60mg/ml、例如至少65、至少70或至少75mg/ml的10%穿透动态结合能力。lxiv.实施方案li-lxiii中任一项的分离基质，其中以2.4或6min停留时间对igg的10%穿透动态结合能力，在1.0m水性naoh中在22+/-2c孵育31h后减少少于20%。lxv.实施方案li-lxiv中任一项的分离基质，在20mm磷酸盐缓冲液、180mmnacl、ph7.5中对igg2具有低于0.2mg/ml、例如低于0.1mg/ml的离解常数。lxvi.实施方案li-lxv中任一项的分离基质，其中多肽或多聚体通过硫醚键与固体载体或多孔载体偶联。lxvii.实施方案li-lxvi中任一项的分离基质，其中固体载体或多孔载体是多糖。lxviii.实施方案li-lxvii中任一项的分离基质，其中在0.5mnaoh中在22+/-2°c孵育24h后基质的igg能力是孵育前igg能力的至少80、例如至少85、至少90或至少95%。lxix.实施方案li-lxviii中任一项的分离基质，其中在1.0mnaoh中在22+/-2°c孵育24h后基质的igg能力是孵育前igg能力的至少70、例如至少80或至少90%。lxx.实施方案li-lxix中任一项的分离基质，其中所述碱稳定的蛋白a结构域或多个多肽/多聚体包含葡萄球菌蛋白a(spa)的亲本fc-结合结构域的突变体，所述突变体由seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:22、seqidno51或seqidno52定义，或与其具有至少80%、例如至少90%、95%或98%同一性，其中至少在对应于seqidno:4-7的位置11的位置的天冬酰胺或丝氨酸残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。lxxi.实施方案lxx的分离基质，其中在对应于seqidno:4-7的位置11的位置的氨基酸残基是谷氨酸或赖氨酸或已被突变为谷氨酸或赖氨酸。lxxii.实施方案lxx或lxxi的分离基质，其中在对应于seqidno:4-7的位置40的位置的氨基酸残基是缬氨酸或已被突变为缬氨酸。lxxiii.实施方案li-lxix中任一项的分离基质，其中所述碱稳定的蛋白a结构域或多个多肽/多聚体包含具有由seqidno53定义或与seqidno53具有至少80%、例如至少90、95或98%同一性的氨基酸序列的fc-结合多肽，x1qx2afyeilx3lpnlteeqrx4x5fix6x7lkdx8psx9sx10x11x12laeakx13x14nx15aq(seqidno53)其中彼此独立地：x1=a或q或被缺失x2=e、k、y、t、f、l、w、i、m、v、a、h或rx3=h或kx4=a或nx5=a、g、s、y、q、t、n、f、l、w、i、m、v、d、e、h、r或kx6=q或ex7=s或kx8=e或dx9=q或v或被缺失x10=k、r或a或被缺失x11=a、e或n或被缺失x12=i或lx13=k或rx14=l或yx15=d、f、y、w、k或r。lxxiv.实施方案lxxiiii的分离基质，其中彼此独立地：x1=a或被缺失、x2=e、x3=h、x4=n、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v或被缺失、x10=k或被缺失、x11=a或被缺失、x12=i、x13=k、x14=l。lxxv.实施方案lxxiii的分离基质，其中彼此独立地：x1=a、x2=e、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。lxxvi.实施方案lxxiii的分离基质，其中彼此独立地：其中x1是a、x2=e、x3=h、x4=n、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。lxxvii.实施方案lxxiii的分离基质，其中彼此独立地：其中x1是a、x3=h、x4=n、x5=a、x6=q、x7=s、x8=d、x9=v、x10=k、x11=a、x12=i、x13=k、x14=l和x15=d。lxxviii.实施方案li-lxxvii中任一项的分离基质，其中所述多聚体或多肽进一步在c-末端或n-末端，或距c-末端或n-末端的1-5个氨基酸残基内，包含一个或多个选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基的偶联元件。lxxix.实施方案li-lxxviii中任一项的分离基质，其中所述多聚体或多肽进一步在n-末端包含前导序列，其包含1-20个氨基酸残基。lxxx.分离免疫球蛋白的方法，其中使用实施方案li-lxxix中任一项的分离基质。lxxxi.实施方案lxxx的方法，包括以下步骤：a)使包含免疫球蛋白的液体样品与实施方案li-lxxix中任一项的分离基质接触，b)用洗涤液洗涤所述分离基质，c)用洗脱液从分离基质洗脱免疫球蛋白，和d)用清洁液清洁分离基质。lxxxii.实施方案lxxxi的方法，其中清洁液是碱，例如具有13–14的ph。lxxxiii.实施方案lxxxi或lxxxii的方法，其中清洁液包含0.1–1.0mnaoh或koh，例如0.5–1.0m或0.4-1.0mnaoh或koh。lxxxiv.实施方案lxxxi–lxxxiii中任一项的方法，其中步骤a)–d)重复至少10次，例如至少50次或50–200次。lxxxv.实施方案lxxxi–lxxxiv中任一项的方法，其中步骤a)–c)重复至少10次、例如至少50次或50–200次，和其中步骤d)在多个步骤c)的情况后进行，例如至少10或至少50次。当前第1页12