用于诊断和治疗病毒感染的方法和系统与流程

本申请要求2016年5月3日提交的美国临时申请第62/331,233号、2016年7月29日提交的美国临时申请第62/368,983号和2017年2月15日提交的美国临时申请第62/459,550号的权益，各案的全部内容都以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

近期寨卡病毒(zikavirus；zikv)在南美州的扩散和由于在怀孕期间感染而导致的严重先天缺陷已经在世界范围内引起对zikv的关注。目前，疾病控制与预防中心(centersfordiseasecontrolandprevention)关于急性zikv感染的诊断算法目前建议使用zikv逆转录酶-聚合酶链反应(reversetranscriptase-polymerasechainreaction；rt-pcr)对在症状发作的前7天内采集的试样执行初始测试。这一建议考虑了病毒血症相对较短的持续时间以及在zikvigm血清学分析中观察到的广泛交叉反应性。虽然zikvrt-pcr测试可以提供zikv诊断以及对chikv和denv感染进行多重诊断的机会，但鉴于轻度或无症状zikv感染的发生率较高，在能通过rt-pcr检测病毒血症时，患者可能未实行医学治疗。因此，cdc建议也对在疾病发作之后4天或更长时间采集的血清试样执行zikvigm抗体测试。然而，作为cdc根据紧急使用授权(emergencyuseauthorization；eua)而授权的唯一igm分析，寨卡mac-elisa分析需要三天完成并且需要通过噬斑减少中和测试(plaquereductionneutralizationtesting；prnt)进行确证测试以解决由交叉反应性引起的假阳性问题。噬斑减少中和测试(prnt)是目前针对zikv感染的最高标准测试，它是一种特别复杂的方法，周转时间较长并且可用性有限，而且不能区分抗体同型。此外，研究显示，在先前已经感染相关黄病毒或针对相关黄病毒进行疫苗接种(即，继发性黄病毒感染)的人中，prnt历史上使用高4倍的效价仍可能无法将zikv感染与其它黄病毒感染相区别。在哥伦比亚近期的zikv爆发中，不到10％的zikv诊断是通过rt-pcr确定，而超过90％依赖于症状和患者病史，即，个体在症状发作之前在有选自确定zikv流行的实验室抗体的区域生活或旅行。因此，需要得到具有较宽诊断范围并能够将zikv感染与denv感染相区分的血清学测试。

技术实现要素：

在某些方面，本公开提供一种用于检测受试者的生物样品中选自iga和igg的抗体的方法，所述方法包括：(a)从所述受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品的第一部分与一种或多种黄病毒(flaviviral)或甲病毒(alphaviral)抗原接触，其中所述黄病毒或甲病毒抗原结合至iga和igg中的一种或两种，由此形成免疫复合物；(c)通过检测与每一种所述黄病毒或甲病毒抗原中结合的选自iga和igg的抗体来检测所述生物样品中选自iga和igg的抗体。在某些实施方案中，所述检测包括检测所述生物样品中与所述黄病毒或甲病毒抗原结合的选自iga和igg的抗体的含量。在某些实施方案中，黄病毒或甲病毒抗原选自寨卡病毒抗原、登革病毒(denguevirus)抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎(tick-borneencephalitis)病毒抗原、日本脑炎病毒(japaneseencephalitisvirus；jev)、西尼罗病毒(westnilevirus)抗原、马亚罗病毒(mayarovirus)抗原及基孔肯雅病毒(chikungunyavirus)抗原。黄病毒抗原可以选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原。黄病毒抗原可以是寨卡病毒抗原。

用于检测受试者的生物样品中选自iga和igg的抗体的方法还可以包括步骤(b1)：使步骤(b)的免疫复合物与蛋白质变性剂接触，其中所述温和蛋白质变性剂的存在浓度足以使含有低亲合力抗体的免疫复合物不稳定，但不足以使含有高亲合力抗体的免疫复合物不稳定，其中所述步骤(b1)是在步骤(b)之后且在步骤(c)之前进行。所述方法还可以包括步骤(c1)，其中步骤(c1)包括通过获得步骤(c)中所述igg的含量与所述生物样品中未暴露于所述蛋白质变性剂的第二部分中igg的对照值的比率来评价igg的亲合力，其中当所述比率是约0.5或更小值时，所述亲合力较低，并且当所述比率是约0.6或更大值时，所述亲合力较高，其中所述步骤(c1)是在步骤(c)之后进行。步骤(b1)的接触可以包括将所述免疫复合物与蛋白质变性剂一起培育约1分钟到约25分钟，如约10分钟到约20分钟的时段。所述培育之后可以是冲洗步骤，用以去除所述蛋白质变性剂，以及未结合的和低亲合力的抗体，其中所述冲洗步骤是在步骤(c)之前进行。

在某些实施方案中，蛋白质变性剂选自尿素、甲酰胺、胍、水杨酸钠、二甲亚砜和丙二醇，及其组合。蛋白质变性剂可以包含尿素。

在某些方面，本公开提供一种诊断受试者的寨卡病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品的第一部分与寨卡病毒抗原接触，其中所述寨卡病毒抗原结合至选自iga和igg的抗体，由此形成免疫复合物；(c)通过检测结合至所述寨卡病毒抗原的选自iga和igg的抗体来检测所述生物样品中选自iga和igg的抗体；并且(d)当检测到生物样品中存在选自iga和igg的抗体时，诊断所述受试者患有寨卡病毒感染。

在某些方面，本公开提供一种诊断和治疗有需要受试者的寨卡病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品的第一部分与寨卡病毒抗原接触，其中所述寨卡病毒抗原结合至选自iga和igg的抗体，由此形成免疫复合物；(c)通过检测结合至所述寨卡病毒抗原的选自iga和igg的抗体来检测所述生物样品中选自iga和igg的抗体；(d)当检测到生物样品中存在选自iga和igg的抗体时，诊断所述受试者患有寨卡病毒感染；并且任选地(e)向确诊的受试者施用有效量的抗病毒剂。

在某些方面，本公开提供一种诊断雌性受试者的寨卡病毒感染并预防由于所述感染传播给胎儿而引起的疾病的方法，所述方法包括：(a)从雌性受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品的第一部分与寨卡病毒抗原接触，其中所述寨卡病毒抗原结合至选自iga和igg的抗体，由此形成免疫复合物；(c)通过检测结合至所述寨卡病毒抗原的选自iga和igg的抗体来检测所述生物样品中选自iga和igg的抗体；(d)当检测到生物样品中存在选自iga和igg的抗体时，诊断所述受试者患有寨卡病毒感染；并且任选地(e)向确诊的受试者施用避孕药。

在某些实施方案中，所述诊断受试者的寨卡病毒感染的方法、所述诊断和治疗受试者的寨卡病毒感染的方法，和/或所述诊断雌性受试者的寨卡病毒感染并预防由于所述感染传播给胎儿而引起的疾病的方法还包括步骤(b1)：使步骤(b)的免疫复合物与蛋白质变性剂接触，其中所述蛋白质变性剂的存在浓度足以使含有低亲合力抗体的免疫复合物不稳定，但不足以使含有高亲合力抗体的免疫复合物不稳定，其中所述步骤(b1)是在步骤(b)之后且在步骤(c)之前进行。

在某些实施方案中，所述诊断受试者的寨卡病毒感染的方法、所述诊断和治疗受试者的寨卡病毒感染的方法，和/或所述诊断雌性受试者的寨卡病毒感染并预防由于所述感染传播给胎儿而引起的疾病的方法还包括步骤(c1)，其中步骤(c1)包括通过获得步骤(c)中所述igg的含量与所述生物样品中未暴露于所述蛋白质变性剂的第二部分中igg的对照值的比率来评价igg的亲合力，其中当所述比率小于0.5时，所述亲合力较低，并且当所述比率大于0.6时，所述亲合力较高，其中步骤(c1)是在步骤(c)之后且在步骤(d)之前进行。步骤(d)还可以包括当所述亲合力较低时，诊断所述受试者患有急性感染，并且当所述亲合力较高时，诊断所述受试者患有慢性感染。在某些实施方案中，步骤(b1)的接触包括将所述免疫复合物与蛋白质变性剂一起培育约1分钟到约25分钟，如约10分钟到约20分钟的时段。在某些实施方案中，所述培育之后是冲洗步骤，用以去除所述蛋白质变性剂，以及未结合的和低亲合力的抗体。

在某些实施方案中，蛋白质变性剂选自尿素、甲酰胺、胍、水杨酸钠、二甲亚砜和丙二醇，及其组合。蛋白质变性剂可以包含尿素。

在某些实施方案中，所述检测包括检测所述生物样品中结合至所述寨卡病毒抗原的选自iga和igg的抗体的含量。所述检测可以包括检测第一可检测标记，其中所述第一可检测标记与第一抗体相联，所述第一抗体结合至与所述寨卡抗原结合的所述iga。第一抗体可以是抗人iga抗体。第一可检测标记可以发射主要波长的信号。在某些实施方案中，所述检测包括检测第二可检测标记，其中所述第二可检测标记与第二抗体相联，所述第二抗体结合至与所述寨卡抗原结合的所述igg。第二抗体可以是抗人igg抗体。第二可检测标记可以发射次要波长的信号。主要波长可以不同于次要波长。

在某些实施方案中，所述诊断包括将结合至所述寨卡病毒抗原的所述igg的含量与慢性登革感染患者参考群体的基于登革的截止值相比较，其中当结合至所述寨卡病毒抗原的所述igg的含量大于所述基于登革的截止值时，所述受试者被诊断患有寨卡病毒感染。所述基于登革的截止值可以比在所述慢性登革感染患者参考群体的生物样品中所测量的结合至所述寨卡病毒抗原的igg的含量的平均值高约二到五个标准差。所述基于登革的截止值可以比在所述慢性登革感染患者参考群体的生物样品中所测量的结合至所述寨卡病毒抗原的igg的含量的平均值高约二或约三个标准差。登革感染患者参考群体可能无任何先前或当前寨卡病毒感染。

在某些实施方案中，诊断包括将结合至所述寨卡病毒抗原的所述iga的含量与健康患者参考群体的健康对照截止值相比较，其中当结合至所述寨卡病毒抗原的所述iga的含量大于所述健康对照截止值时，所述受试者被诊断患有急性寨卡病毒感染。健康对照截止值可以比由所述健康患者参考群体的生物样品测量的结合至所述寨卡病毒抗原的iga的含量的平均值高约二到约五个标准差。健康患者群体可能无任何先前或当前寨卡病毒感染或登革病毒感染。

在某些实施方案中，生物样品是在所述受试者初始暴露于寨卡病毒的九十天内或在所述受试者的寨卡病毒症状发作之后的九十天内从所述受试者采集。生物样品可以在所述受试者初始暴露于寨卡病毒的五十天内或在所述受试者的寨卡病毒症状发作之后的五十天内从所述受试者采集。生物样品可以在所述受试者初始暴露于寨卡病毒的十天内或在所述受试者的寨卡病毒症状发作之后的十天内从所述受试者采集。生物样品可以在所述受试者初始暴露于寨卡病毒的五天内或在所述受试者的寨卡病毒症状发作之后的十天内从所述受试者采集。

在某些实施方案中，所述方法是对在所述受试者初始暴露于寨卡病毒之后或所述受试者的寨卡病毒症状发作之后的不同时间从所述患者采集的两个或更多个生物样品执行。在某些实施方案中，检测包括检测所述生物样品中结合至所述寨卡病毒抗原的iga和igg两种。检测结合至所述寨卡病毒抗原的选自igg和iga的抗体可以通过使用以下任一种方法进行：基于包括金属、玻璃、石英和硝化纤维素在内的等离子体和非等离子体基底的微阵列平台、elisa、数字式elisa、侧流分析、流式荧光检测术(luminex)、化学发光分析、基于珠粒的荧光分析和电化学发光分析，或其组合。生物样品可以选自全血、血浆、血清和唾液。生物样品的体积可以是约0.5到约500微升。

在某些实施方案中，受试者在病毒感染症状发作的四周内被诊断患有寨卡病毒感染。受试者可以在病毒感染症状发作的一周内被诊断患有寨卡病毒感染。寨卡病毒抗原可以包含重组寨卡病毒抗原。重组寨卡病毒抗原可以是寨卡病毒ns1或ns5蛋白质。重组寨卡病毒抗原可以是乌干达(uganda)mr766和苏里南(suriname)z1106033。

在某些实施方案中，所述诊断准确地区分90％或超过90％的测试受试者的寨卡病毒感染与其它黄病毒或甲病毒感染。所述诊断可以准确地区分90％或超过90％的测试受试者的寨卡病毒感染与登革病毒感染。

在某些方面，本公开提供一种诊断受试者的第一和第二病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品的第一部分与独立地选自黄病毒抗原和甲病毒抗原的第一病毒抗原和第二病毒抗原接触，由此形成免疫复合物；(c)通过检测结合至所述第一病毒抗原的选自iga、igm和igg的抗体以及结合至所述第二病毒抗原的选自iga、igm和igg的抗体来检测所述生物样品中选自iga、igm和igg的抗体；并且(d)当检测到结合至所述第一病毒抗原的选自iga、igm和igg的抗体时，诊断所述受试者患有所述第一病毒感染，并且当检测到结合至所述第二病毒抗原的选自iga和igg的抗体时，诊断所述受试者患有所述第二病毒感染。

在某些实施方案中，诊断受试者的第一和第二病毒感染的方法还包括步骤(b1)：使步骤(b)的免疫复合物与蛋白质变性剂接触，其中所述蛋白质变性剂的存在浓度足以使含有低亲合力抗体的免疫复合物不稳定，但不足以使含有高亲合力抗体的免疫复合物不稳定，其中所述步骤(b1)是在步骤(b)之后且在步骤(c)之前进行。在某些实施方案中，诊断受试者的第一和第二病毒感染的方法还包括步骤(c1)，其中步骤(c1)包括通过获得步骤(c)中所述igg的含量与所述生物样品中未暴露于所述蛋白质变性剂的第二部分中igg的对照值的比率来评价igg的亲合力，其中当所述比率低于0.5时，所述亲合力较低，并且当所述比率大于0.6时，所述亲合力较高，其中步骤(c1)是在步骤(c)之后且在步骤(d)之前进行。步骤(d)还可以包括当所述亲合力较低时，诊断所述受试者患有急性感染，并且当所述亲合力较高时，诊断所述受试者患有慢性感染。步骤(b1)的所述接触可以包括将所述免疫复合物与蛋白质变性剂一起培育约1分钟到约25分钟，如约10分钟到约20分钟的时段。培育之后可以是冲洗步骤，用以去除所述蛋白质变性剂，以及未结合的和低亲合力的抗体。蛋白质变性剂可以选自尿素、甲酰胺、胍、水杨酸钠、二甲亚砜和丙二醇，及其组合。蛋白质变性剂可以包含尿素。

在某些实施方案中，第一病毒感染和第二病毒感染独立地选自黄病毒感染和甲病毒感染。黄病毒感染和甲病毒感染可以选自寨卡病毒、登革病毒、黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、西尼罗病毒、马亚罗病毒及基孔肯雅病毒。

在某些实施方案中，所述诊断准确地区分90％或超过90％的测试受试者的所述第一与第二病毒感染。所述诊断可以准确地区分90％或超过90％的测试受试者的寨卡病毒感染与其它黄病毒或甲病毒感染。所述诊断可以准确地区分90％或超过90％的测试受试者的寨卡病毒感染与登革病毒感染。

在某些实施方案中，第一病毒抗原选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎病毒抗原、西尼罗病毒抗原、马亚罗病毒抗原及基孔肯雅病毒抗原。在某些实施方案中，第二病毒抗原选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎病毒抗原、西尼罗病毒抗原、马亚罗病毒抗原及基孔肯雅病毒抗原。所述第一病毒抗原可以是寨卡病毒抗原并且所述第二病毒抗原可以是登革病毒抗原。

在某些实施方案中，所述检测包括检测所述生物样品中结合至所述第一病毒抗原的选自iga、igm和igg的抗体的含量。检测可以包括检测所述生物样品中结合至所述第二病毒抗原的选自iga、igm和igg的抗体的含量。所述第一病毒抗原可以与所述第二病毒抗原分离。所述第一病毒抗原可以在独立容器中与所述第二病毒抗原分离。检测结合至所述第一或第二病毒抗原的igg可以包括检测第一波长的光并且检测结合至所述第一或第二病毒抗原的iga或igm包括检测第二波长的光。所述第一波长的光可以不同于所述第二波长的光。

在某些实施方案中，检测结合至所述第一和第二病毒抗原的选自iga和igg的抗体是通过使用以下任一种方法进行：基于包括金属、玻璃、石英和硝化纤维素在内的等离子体和非等离子体基底的微阵列平台、elisa、数字式elisa、侧流分析、流式荧光检测术、化学发光分析、基于珠粒的荧光分析和电化学发光分析。在某些实施方案中，所述第一和第二病毒抗原与包含第一和第二区的基底相联，其中所述第一病毒抗原与所述第一区相联并且所述第二病毒抗原与所述第二区相联。

在某些实施方案中，基底具有等离子体活性。基底可以包含布置于所述基底上的金属膜，其布置方式使得近红外荧光相对于不含所述金属膜的基底增大5倍到100倍或更高倍数。基底可以包含不连续地布置于所述基底上的金属膜，其中所述金属膜具有表面暴露面积在约100nm²与40,000nm²之间的隔离岛状区域，所述隔离岛通过约10到约60nm的间隙隔开。金属膜可以包含选自金和银的金属。

在某些实施方案中，诊断受试者的第一和第二病毒感染的方法还包括诊断第三、第四、第五、第六或第七病毒感染，所述方法还包括：在步骤(b)中，使所述生物样品与独立地选自黄病毒抗原和甲病毒抗原的第三、第四、第五或第六病毒抗原接触；在步骤(c)中，通过检测结合至所述第三、第四、第五或第六病毒抗原的选自iga、igm和igg的抗体来检测所述生物样品中选自iga、igm和igg的抗体；并且在步骤(d)中，当检测到结合至所述第三病毒抗原的选自iga和igg的抗体时，诊断所述受试者患有所述第三病毒感染，当检测到结合至所述第四病毒抗原的选自iga和igg的抗体时，诊断所述受试者患有所述第四病毒感染，当检测到结合至所述第五病毒抗原的选自iga和igg的抗体时，诊断所述受试者患有所述第五病毒感染，以及当检测到结合至所述第六病毒抗原的选自iga和igg的抗体时，诊断所述受试者患有所述第六病毒感染。

在某些实施方案中，步骤(b)至(c)一起并且按次序在2小时或更短时间内执行。在某些实施方案中，一起并且按次序执行的步骤(b)、(c)和(d)是在2小时或更短时间内执行。在某些实施方案中，生物样品的体积是约0.5到约500微升，如约0.5到约20微升。

在某些方面，本公开提供一种用于测定生物样品中的一种或多种抗体与黄病毒或甲病毒抗原的结合程度的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使所述生物样品的第一部分与所述黄病毒或甲病毒抗原在允许形成免疫复合物的条件下接触；(b)使所述免疫复合物与蛋白质变性剂接触，其中所述蛋白质变性剂的存在浓度足以使含有低亲合力抗体的免疫复合物不稳定，但不足以使含有高亲合力抗体的免疫复合物不稳定；并且(c)测定所述生物样品中选自igg的一种或多种抗体与所述抗原的结合程度。在某些实施方案中，抗原被固定于基底上。

在某些实施方案中，所述用于测定生物样品中的一种或多种抗体与黄病毒或甲病毒抗原的结合程度的方法还包括通过获得步骤(c)中所述igg的含量与所述生物样品中未暴露于所述蛋白质变性剂的第二部分中igg的对照值的比率来评价所述抗体的亲合力，其中当所述比率是约0.5或更小值时，所述亲合力较低，并且当所述比率是约0.6或更大值时，所述亲合力较高。

在某些实施方案中，igg的对照值是通过遵循所述方法的步骤(a)和(c)但不包括步骤(b)，评价生物样品的第二部分而获得。igg的对照值可以通过遵循所述方法的步骤(a)、(b)和(c)但不包括步骤(b1)，评价所述生物样品的第二部分而获得。当所述亲合力较低时，所述生物样品中的感染可以归类为急性的，并且当所述亲合力较高时，所述生物样品中的感染可以归类为慢性的。

在某些方面，本公开提供一种用于测定受试者的生物样品中的igg抗体与黄病毒或甲病毒抗原的结合程度的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供具有表面的基底，其包含抗原结合至所述表面，其中所述抗原选自黄病毒和甲病毒抗原；(b)使所述表面与生物样品的第一部分在允许所述抗体与所述抗原之间形成免疫复合物的条件下接触；(c)对所述基底执行洗涤步骤，其中所述洗涤步骤包括使所述基底的所述表面与蛋白质变性剂接触，所述蛋白质变性剂的浓度足以使含有低亲合力抗体的免疫复合物不稳定，但不足以使含有高亲合力抗体的免疫复合物不稳定；并且(d)检测所述生物样品中结合至所述黄病毒或甲病毒抗原的igg的含量。

在某些实施方案中，步骤(c)的接触包括将所述基底的所述表面与蛋白质变性剂一起培育约1分钟到约25分钟，如约10分钟到约20分钟的时段。在某些实施方案中，所述培育之后是冲洗步骤，用以去除所述蛋白质变性剂，以及未结合的和低亲合力的抗体。

在某些实施方案中，所述检测包括使所述基底接触与抗igg相联的一种或多种可检测标记。在某些实施方案中，所述用于测定受试者的生物样品中的igg抗体与黄病毒或甲病毒抗原的结合程度的方法还包括通过获得步骤(d)中所述igg的含量与生物样品中未暴露于所述洗涤步骤的第二部分中igg的对照值的比率来评价所述抗体的亲合力，其中当所述比率是约0.5或更小值时，所述亲合力较低，并且当所述比率是约0.6或更大值时，所述亲合力较高。igg的对照值可以通过遵循步骤(a)、(b)和(d)但不包括洗涤步骤(c)来评价生物样品的第二部分而获得。当所述亲合力较低时，所述生物样品中的感染可以归类为急性的，并且当所述亲合力较高时，所述生物样品中的感染可以归类为慢性的。

本文所描述的系统和方法的生物样品可以选自全血、血浆、血清、尿液和唾液。生物样品的体积可以是约0.5μl到约500μl，如约0.5μl到约20μl。蛋白质变性剂可以选自尿素、甲酰胺、胍、水杨酸钠、二甲亚砜和丙二醇，及其组合。蛋白质变性剂可以包含尿素。基底可以包含等离子体纳米结构。基底可以包含珠粒或96孔板。基底可以包含金属、玻璃、聚苯乙烯、石英、硅石、尼龙、硝化纤维素、聚氯乙烯、聚二甲基硅氧烷、聚偏二氟乙烯、聚多巴胺、硅、二氧化硅、聚合物、氧化铁、塑料及其组合。基底可以包含处于所述基底的所述表面上的金属膜。黄病毒或甲病毒抗原可以选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎病毒抗原、日本脑炎病毒(jev)、西尼罗病毒抗原、马亚罗病毒抗原及基孔肯雅病毒抗原。黄病毒抗原可以选自寨卡病毒抗原和登革病毒抗原。黄病毒抗原可以是寨卡病毒抗原。在一些实施方案中，所述方法包括对来自所述受试者的样品重复所述方法的步骤第二次。重复所述方法第二次可以在所述受试者初始暴露于第一病毒或第二病毒之后不到14天或在病毒感染症状初始发作之后不到14天，第一次执行所述方法时进行。重复所述方法第二次可以在所述受试者初始暴露于所述第一病毒或第二病毒之后14天或更长时间或在病毒感染症状初始发作之后14天或更长时间进行。

在某些方面，本公开提供一种用于诊断受试者的病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含：具有等离子体膜的基底；一种或多种病毒抗原，其中所述一种或多种病毒抗原被固定于所述基底上；以及有关使用所述基底分析样品中感染的存在的说明书。所述试剂盒的一种或多种病毒抗原可以选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎病毒抗原、日本脑炎病毒(jev)、西尼罗病毒抗原、马亚罗病毒抗原及基孔肯雅病毒抗原。所述试剂盒的一种或多种病毒抗原可以选自寨卡病毒抗原和登革病毒抗原。寨卡病毒抗原可以是重组寨卡病毒抗原，例如寨卡病毒ns1蛋白质、寨卡病毒ns5蛋白质、乌干达mr766和苏里南z1106033。

所述试剂盒还可以包含蛋白质变性剂。蛋白质变性剂可以选自尿素、甲酰胺、胍、水杨酸钠、二甲亚砜和丙二醇，及其组合。蛋白质变性剂可以包含尿素。

在某些实施方案中，所述试剂盒还可以包含一种或多种与抗人iga或抗人igg抗体相联的可检测标记、一种或多种稀释剂缓冲剂、一种或多种洗涤缓冲剂。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含具有等离子体膜的基底，其中所述等离子体膜使近红外荧光相对于不含所述金属膜的基底增大5倍至100倍或更高倍数。等离子体膜可以是具有隔离岛的不连续au或au/ag膜，例如面积为约2000nm²到约40,000nm²的隔离岛，所述隔离岛通过10nm到60nm的间隙隔开。在某些实施方案中，等离子体膜具有约500nm到1400nm的等离子体共振峰。

本公开的其它方面和优势将因以下具体描述而变得为本领域技术人员显而易见，其中具体描述仅显示和描述了本公开的说明性实施方案。应意识到，本公开能够具有其它和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面具有未脱离本公开的修改。因此，应将附图和描述视为本质上说明性的而非限制性的。

以引用的方式并入

本说明书中提到的所有公开、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，其引用的程度如特定且个别地指示每一个公开、专利或专利申请以引用的方式并入一般。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中细致阐述。通过参考以下具体实施方式和附图将更好地理解本发明的特征和优势，以下具体实施方式阐述了利用本发明原理的说明性实施方案，在附图中：

图1a-b显示了在等离子体金基底(pgold)上检测的示例登革igg和igm抗体含量。

图2a-b显示了使用可商购的分析检测的示例登革igg和igm抗体含量。图2a中示出了登革病毒iggdxselect测试(focusdiagnostics；加利福尼亚州赛普里斯(cypress,california))的结果。图2b中示出了panbio登革igm捕捉elisa(alere；马萨诸塞州沃尔瑟姆(waltham,massachusetts))的结果。

图3a显示了具有登革感染(半实心圆)或在症状发作之后的指定天数范围内具有寨卡感染(实心圆—1-7天；向上三角形—8-15天；菱形—16-50天；向下三角形—51-100天)的样品中针对寨卡抗原的igg/iga抗体含量的示例2d标绘图。相较于寨卡样品，登革样品显示出较低的寨卡igg和iga含量。所示igg截止值表示高于所检测的登革样品的平均寨卡igg含量3个标准差。所示iga截止值表示高于所检测的对照样品的平均寨卡iga含量3个标准差。

图3b显示具有zikv感染和denv感染的血清样品中针对zikv抗原的igg/iga抗体含量的示例2d标绘图(图a)，以及具有zikv感染和denv感染的血清样品中针对zikv抗原的iga/igm抗体含量的示例2d标绘图(图b)。在图(a)中，对zikviga呈阳性并且对zikvigg呈阴性的具有zikv感染的一个样品以空心圆显示。在两个标绘图中，基于疾病发作与样品采集之间的天数，将zikv感染的样品分成4个亚组(实心圆—1-7天；向上三角形—8-15天；菱形—16-50天；向下三角形—51-100天)。所有信号水平都通过参考样品归一化。

图4显示了具有登革感染、寨卡感染或无已知黄病毒感染(对照)的样品中zikvigg、igm和iga抗体含量的示例盒形图(a-c)(实心圆—1-7天；向上三角形—8-15天；菱形—16-50天；向下三角形—51-100天)。在图(a)中，所示针对zikv抗原的igg信号的截止值表示高于所检测的denv感染样品的平均zikvigg含量3个标准差(sd)。在图(b)中，所示针对zikv抗原的igm信号的“截止值”表示高于所检测的对照样品的平均zikvigm含量3个标准差(sd)。在图(c)中，所示针对zikv抗原的iga信号的“截止值”表示高于所检测的对照样品的平均zikviga含量3个标准差(sd)。所有信号水平都通过参考样品归一化。

图5显示了根据一个实施方案，在等离子体金基底(pgold)上检测的具有登革感染、寨卡感染或无已知黄病毒感染(健康对照)的试样中登革igg抗体含量的示例条形图。抗体信号是使用登革2抗原检测。

图6显示了根据一个实施方案，在等离子体金基底(pgold)上检测的具有登革感染、寨卡感染或无已知黄病毒感染(健康对照)的试样中登革igm抗体含量的示例条形图。

图7a-c显示分析结果的示例2d标绘图。图a显示了具有zikv感染或denv感染的样品中针对zikv抗原和denv2抗原的igg抗体含量。图b显示了具有zikv感染或denv感染的样品中针对zikv抗原和denv2抗原的iga抗体含量。图c显示了具有zikv感染或denv感染的血清样品中针对denv2抗原的iga/igm抗体含量。在所有标绘图中，基于疾病发作与样品采集之间的天数，将zikv感染的样品分成4个亚组(实心圆-1-7天；向上三角形-8-15天；菱形-16-50天；向下三角形-51-100天)。所有信号水平都通过参考样品归一化。

图8显示在疾病发作之后指定天数范围内具有zikv感染的样品中zikvigg、igm和iga含量的示例盒形图(a-c)(实心圆-1-7天；向上三角形—8-15天；菱形—16-50天；向下三角形—51-100天)。在图(a)中，所示针对zikv抗原的igg信号的截止值表示高于所检测的denv感染样品的平均zikvigg含量3个标准差(sd)。在图(b)中，所示针对zikv抗原的igm信号的“截止值”表示高于所检测的对照样品的平均zikvigm含量3个标准差(sd)。在图(c)中，所示针对zikv抗原的iga信号的“截止值”表示高于所检测的对照样品的平均zikviga含量3个标准差(sd)。在图(b)中，所示针对zikv抗原的igm信号的“截止值”表示高于所检测的对照样品的平均zikvigm含量3个标准差(sd)。在图(c)中，所示针对zikv抗原的iga信号的“截止值”表示高于所检测的对照样品的平均zikviga含量3个标准差(sd)。所有信号水平都通过参考样品归一化。

图9显示了根据一个实施方案，在等离子体金基底(pgold)上检测的具有登革感染、寨卡感染或无已知黄病毒感染(健康对照)的试样中寨卡igg抗体含量的示例条形图。

图10在图(a)-(c)中显示了具有denv感染、zikv感染或无已知zikv或denv感染史(对照)的血清样品中denvigg、igm和iga抗体含量的示例盒形图。所有信号水平都通过参考样品归一化。

图11显示了具有登革感染(半实心圆)或在症状发作之后的指定天数范围具有寨卡感染(实心圆—1-7天；向上三角形—8-15天；菱形—16-50天；向下三角形—51-100天)的样品中针对寨卡ns1抗原的igm抗体信号和针对登革抗原的igm抗体信号的示例2d标绘图。所示两个截止值表示高于所检测的对照样品的平均信号3个标准差。来自感染寨卡病毒的患者的样品显示的针对寨卡病毒抗原的平均igm信号高于针对登革病毒抗原的平均igm信号，并且来自感染登革病毒的患者的样品显示的针对登革病毒抗原的平均igm信号高于针对寨卡病毒抗原的平均igm信号。

图12是根据一个实施方案，在等离子体金膜上的结合元件阵列的图解说明。pgold生物芯片包含分入16个孔中的pgold载片，其中每个孔具有相同的zikv/denv抗原微阵列。对于每个微阵列，zikv抗原和denv抗原斑点一式三份被固定于pgold上。在分析测试过程中，将人血清施加到微阵列上，其中如果存在不同人类抗体同型，则针对zikv和denv抗原的不同人类抗体同型将被捕捉在相应zikv和denv抗原上。在洗涤步骤之后，将抗人igg-irdye680偶联物与抗人iga-irdye800偶联物的混合物施加到微阵列上以用irdye680标记捕捉的人igg抗体并用irdye800标记捕捉的人iga抗体。接着，用荧光读取器扫描并分析pgold生物芯片。在特定抗原斑点处的荧光通道和强度与针对某一抗原的特定抗体同型的量相关。

图13在图(a)-(b)中显示了根据一个实施方案，在等离子体金膜(pgold)上的示例多路复用寨卡病毒/登革病毒(zikv/denv)抗原微阵列。图(a)示意性地示出了在pgold上的示例多路复用分析结构。zikv抗原、denv抗原和对照斑点一式三份地固定于pgold上。将人血清施加到微阵列上，其中如果存在不同人类抗体同型，则针对zikv和denv抗原的不同人类抗体同型可以被捕捉于相应zikv和denv抗原上。在洗涤步骤之后，将irdye680标记的抗人igg二次抗体与irdye800标记的抗人iga二次抗体的混合物施加到微阵列上以用irdye680标记捕捉的人igg抗体并用irdye800标记捕捉的人iga抗体。图(b)显示了分别针对具有zikv感染、denv感染或无已知黄病毒感染(健康对照)的三位个体执行所述分析的示例irdye680荧光图像(上图)和irdye800荧光图像(下图)。

图14在图(a)-(b)中显示了根据一个实施方案，在等离子体金膜(pgold)上的zikvigg和iga抗体的示例滴定曲线。图a显示了通过对等离子体金载片和玻璃显微镜载片(fisherhealthcare,us)上从100倍稀释到10,000,000倍稀释的各种zikvigg阳性血清样品稀释液的三个重复微阵列斑点上irdye680发射的中值荧光强度求平均值而生成的zikvigg的示例滴定曲线。图b显示了通过对等离子体金载片和玻璃显微镜载片上从100倍稀释到10,000,000倍稀释的各种zikviga阳性血清样品稀释液的三个重复微阵列斑点上irdye800发射的中值荧光强度求平均值而生成的zikviga的示例滴定曲线。误差条表示2个载片的4个重复分析的分析标准差。

图15显示了具有登革感染(64个患者)、寨卡感染(29个患者)或无已知黄病毒感染(对照，50个患者)的样品中的denvigg抗体含量，以及具有登革感染和寨卡感染的样品中的denvigg亲合力水平的示例盒形图(a-b)。还显示了在疾病发作与样品采集之间的四组天数(疾病后1-7天、8-15天、16-50天及51-100天)期间zikvigg亲合力水平的示例标绘图(c)。denv和zikvigg亲合力是通过用尿素处理的igg含量测量值除以未用尿素处理的igg含量测量值计算得到。

图16显示了具有登革感染(具有继发性denv感染和可检测的denvrna的8个患者)、寨卡感染(具有继发性zikv感染的49个患者)或无已知黄病毒感染(对照，50个患者)的样品中zikvigg和iga抗体含量的示例盒形图(a和e)以及denvigg和iga抗体含量的示例盒形图(c和f)。还显示了寨卡感染的两个不同样品(具有可检测的zikvrna的49个患者和临床上被诊断患有zikv感染的29个患者)的zikvigg亲合力水平的示例标绘图(b)以及具有登革感染(具有继发性denv感染和可检测的denvrna的8个患者)和寨卡感染(具有继发性zikv感染和可检测的zikvrna的49个患者)的样品的denvigg亲合力水平的示例标绘图(d)。

图17显示了来自两组患者的血清试样中zikvigg抗体含量的示例盒形图(a)：具有继发性zikv感染和可检测zikvrna的49个患者(寨卡)以及无已知zikv或denv感染史的50个患者(对照)。还显示了(b)具有可检测的zikvrna的49个患者(寨卡1)和临床上被诊断患有zikv感染的29个患者(寨卡2)的zikvigg亲合力水平。

图18显示了三组个体的zikvigg抗体含量的示例盒形图(a)：一组通过zikvdetecttmigm捕捉elisa(inbios)确定感染zikv的10个患者、一组10个慢性denv感染的患者(登革)和无任何先前zikv或denv感染的对照组(健康)。还显示了(b)相同的三组个体的zikvigm含量。

具体实施方式

除非上下文另外明确规定，否则如本文中所使用，单数形式“一”和“所述”包括多个参考物。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

术语“聚核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。这些术语是指任何长度的聚合形式核苷酸，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物的聚合形式。聚核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是聚核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由键联分析确定的基因座、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、短干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、核糖酶、cdna、重组聚核苷酸、分支聚核苷酸、质粒、载体、分离的具有任何序列的dna、分离的具有任何序列的rna、核酸探针及引物。聚核苷酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰，那么可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸序列可以间杂有非核苷酸组分。聚核苷酸可以在聚合之后进一步修饰，如通过与标记组分偶联进行修饰。核苷酸类似物可以是在主要核碱基(a、c、g、t和u)、脱氧核糖/核糖结构、一级核苷酸的磷酸酯基或其任何组合上具有修饰的一级核苷酸的类似物或模拟物。例如，核苷酸类似物可以具有天然存在的或人造的修饰碱基。修饰碱基的实例包括但不限于甲基化核碱基、修饰的嘌呤碱基(例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、isodg)、修饰的嘧啶碱基(例如5,6-二氢尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶、isodc)、通用碱基(例如3-硝基吡咯和5-硝基吲哚)、非结合碱基模拟物(例如4-甲基苯并咪唑和2,4-二氟甲苯或苯)及无碱基(无碱基核苷酸，其中核苷酸类似物不具有碱基)。具有修饰的脱氧核糖(例如双脱氧核苷，如双脱氧鸟苷、双脱氧腺苷、双脱氧胸苷和双脱氧胞苷)和/或磷酸酯结构(一起称为主链结构)的核苷酸类似物的实例包括但不限于乙二醇核苷酸、吗啉核苷酸(morpholinos)和锁核苷酸。

如本文所使用，术语“微生物”是指微观生物体，它可以是单细胞、多细胞或非细胞的。微生物的实例包括但不限于细菌、真菌、寄生虫(包括例如原虫、蠕虫和皮外寄生物)和病毒。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换地使用，意思指脊椎动物，优选地指哺乳动物，更优选地指人类。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农畜、运动动物以及宠物。

如本文所使用，术语“荧光”是指分子通过发射光子而从激发态弛豫至其基态的过程。如本文所使用，荧光也可以涵盖磷光。对于荧光，分子一般通过吸收紫外辐射、可见光辐射或近红外辐射而跃迁到电子激发态。接着，被激发的分子通过发射光而衰变回到基态，或衰变到低电子激发态。

如本文所使用，关于材料的术语“等离子体活性”是指材料支撑等离子体(例如表面等离子体)，由此展现等离子体特性。表面等离子体可以用于增大包括荧光、拉曼散射和二次谐波产生在内的若干光谱测量的表面灵敏度。

如本文所使用，术语“等离子体特性”是指由表面等离子体，或电荷在金属表面上集体振荡所展现的特性。就这一点来说，等离子体特性是指可测量的特性，如nagao等人“纳米级和原子级系统中的等离子体(plasmonsinnanoscaleandatomic-scalesystems)”,《先进材料科学与技术(sci.technol.adv.mater.)》11(2010)054506(12pp)中所描述的特性，其中描述了等离子体传感器，如用于表面增强ir吸收光谱(seira)、表面增强拉曼散射(sers)的等离子体传感器。另一等离子体特性是例如《传感器和执行器b(sensorsandactuatorsb)》107(2005)148-153中所描述的等离子增强荧光。

如本文所使用，术语“连续”是指等离子体金属膜中各纳米结构互相连接，产生导电通路，任选地在不处于导电通路中的一些纳米结构之间存在间隙。

如本文所使用，术语“不连续”是指在等离子体金属膜中存在一个或多个独立的纳米结构，其中这些纳米结构彼此分隔开并且不互相连接。

如本文所使用，术语“邻近”是指荧光分子与等离子体金属膜中纳米结构之间的距离，在所述距离内，荧光分子的荧光强度增加，如增加指定倍数。在一些情况下，邻近可以用埃(例如在1-1000埃内)、纳米(例如在1-1000nm内)或毫米(例如在1-10mm内)度量。在一些情况下，荧光团在膜表面的约1000nm内使荧光强度增大。

本公开提供了用于检测和诊断受试者的一种或多种病毒感染，如黄病毒或甲病毒感染的方法。在某些方面，本公开的方法可以提供优于先前诊断方法的优势，如关于诊断病毒感染的快速周转时间；高灵敏度，例如对于检测早期感染的高灵敏度；能够准确地区分一种病毒感染与另一种病毒感染，例如登革病毒感染与寨卡病毒感染；能够测试少量生物样品，例如微升体积的生物样品；以及对生物样品的便捷实时测试，无需运送到商业实验室。在某些实施方案中，本公开的方法是在基底上，如在本文所描述的等离子体基底上执行。

一方面，本公开的方法和系统涉及检测生物样品中结合至结合元件，例如黄病毒或甲病毒抗原，如寨卡病毒抗原的生物标记物，例如选自igg、igm、iga及其组合的抗体。样品中检测抗体的量可以与从具有或不具有病毒感染的参考群体获得的值相比较，以确定受试者是否感染病毒。在某些实施方案中，本公开提供了确定受试者是否近期感染病毒感染的方法。在某些实施方案中，本公开的用于检测生物标记物，例如选自igg、igm和iga或其组合的抗体的方法还包括亲合力洗涤步骤，如本文所描述的洗涤步骤，用以区分急性与慢性感染。

一般来说，生物标记物是与特定特征有关的可检测分析物，所述特定特征如包含所述生物标记物(例如，如在微生物聚核苷酸或微生物蛋白质中)的微生物的存在、与疾病或病况有关的一个或多个基因(例如致癌基因)的表达，或作为另一生物标记物的存在的间接指示剂(例如针对微生物蛋白质的宿主抗体)。生物标记物可以与生物体，如受试者的生物状态或状况有关。此类生物状态或状况的实例包括但不限于疾病、病症、非疾病状况、健康状况或对不同药物治疗和其它疗法的治疗反应。

在某些实施方案中，所述方法包括使生物样品与一种或多种黄病毒或甲病毒抗原接触。黄病毒或甲病毒抗原可以结合至一种或多种免疫球蛋白，例如选自iga、igg和igm或其组合的抗体。所述一种或多种免疫球蛋白如果存在于生物样品中，则可以通过检测结合至黄病毒或甲病毒抗原中每一种的一种或多种免疫球蛋白来进行检测。在一些情况下，所述检测包括检测生物样品中结合至黄病毒或甲病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白的含量。基于生物样品中结合至黄病毒或甲病毒抗原中每一种的一种或多种免疫球蛋白的存在、不存在或含量，可以诊断受试者患有一种或多种病毒感染。

在某些方面，本公开提供一种用于检测受试者的生物样品中选自iga和igg或其组合的抗体的方法，所述方法包括：(a)从所述受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品与一种或多种黄病毒或甲病毒抗原接触，其中所述黄病毒或甲病毒抗原结合至选自iga和igg或其组合的抗体；(c)通过检测与每一种所述黄病毒或甲病毒抗原结合的选自iga和igg的抗体来检测所述生物样品中选自iga和igg或其组合的抗体。在一些实施方案中，检测选自iga和igg或其组合的抗体包括检测生物样品中与黄病毒或甲病毒抗原结合的选自iga和igg的抗体的含量。在一些实施方案中，黄病毒或甲病毒抗原选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎病毒抗原、西尼罗病毒抗原、马亚罗病毒抗原及基孔肯雅病毒抗原。在一些实施方案中，黄病毒抗原选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原。在一些实施方案中，黄病毒抗原是寨卡病毒抗原。

多种物质可以作为样品的来源，例如寨卡血清样品。样品可以是流体，例如生物流体。流体样品可以包括但不限于，血液或血液成分(例如全血、血浆)、脐带血、唾液、尿液、汗液、血清、精液、阴道分泌物、胃液和消化液、脊髓液、胎盘液、腔液、眼部流体、血清、母乳、淋巴液或其组合。在阈值是基于一种类型样品(例如血清)的情况下，可以调整其它样品类型的阈值以考虑样品类型的差异(例如基于血清样品的值调整唾液样品阈值)。

样品体积可以变化。在一些情况下，样品的体积大于或等于约0.01μl(微升)、0.05μl、0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl或更高。在一些情况下，样品的体积小于或等于约1,000μl、800μl、600μl、400μl、200μl、100μl、80μl、60μl、40μl、20μl、10μl、8μl、6μl、4μl、2μl、1μl、0.9μl、0.7μl、0.5μl、0.3μl、0.1μl或更少。在一些情况下，样品的体积选自以上所述任何两个值的范围，例如从约0.5到约500μl、从约0.5到约20μl、从约0.5到约10μl或从约0.5到约10μl。在一些情况下，样品是来自刺伤样品的一滴血。样品在测试之前可以进行或可不进行加工。在一些情况下，样品在与病毒抗原接触之前可以被稀释。取决于用于执行本公开的方法的平台或分析，样品可以被稀释约1到10¹⁰倍。

在一些实施方案中，流体样品是在1-100μl或1-10μl之间。流体样品可以在稀释剂溶液(例如胎牛血清、不交叉反应的动物血清，或bsa于pbst中的溶液)中稀释，如达到500μl、250μl、100μl或更小的总体积。样品可以是固体，例如生物组织。样品可以包含正常健康组织。组织可以与各种类型的器官有关。器官的非限制性实例可以包括脑、乳房、肝、肺、肾、前列腺、卵巢、脾、淋巴结(包括扁桃体)、甲状腺、胰腺、心脏、骨骼肌、肠、喉、食道、胃或其组合。在某些实施方案中，使用了本公开的方法分析环境样品(例如来自农田、湖、河、储水槽、通气孔、墙壁、房顶、土壤样品、植物或游泳池的样品)或工业样品(例如来自洁净室、医院、食品加工区、食品制造区、食品原料、医学实验室、药店或药物配制中心的样品)。

样品可以包含肿瘤。肿瘤可以是良性的(非癌症)或恶性的(癌症)。肿瘤的非限制性实例包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肿瘤(ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃肠系统癌瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、泌尿生殖系统癌瘤、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯氏肿瘤(wilms'tumor)、子宫颈癌、内分泌系统癌瘤、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、神经管母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤或其组合。肿瘤可以与各种类型的器官有关。器官的非限制性实例可以包括脑、乳房、肝、肺、肾、前列腺、卵巢、脾、淋巴结(包括扁桃体)、甲状腺、胰腺、心脏、骨骼肌、肠、喉、食道、胃或其组合。

在一些情况下，样品包括多种细胞，包括但不限于：真核细胞、原核细胞、真菌细胞、心脏细胞、肺细胞、肾细胞、肝细胞、胰腺细胞、生殖细胞、干细胞、诱导多能干细胞、胃肠细胞、血细胞、癌细胞、细菌细胞、从人类微生物群系样品分离的细菌细胞，以及人血液中的循环细胞，其中一种或多种可以作为利用本公开的膜进行的检测方法的对象。在一些情况下，样品包括细胞内含物，例如单细胞的内含物或多细胞的内含物。

在某些实施方案中，使用了本文所描述的方法来筛查病毒感染，并由此预防疾病传播，例如当打算将生物样品移植或输注给受试者时。生物样品可以在受试者初始暴露于病毒之后或在病毒感染症状发作之后某一时间段内从受试者采集。例如，生物样品可以在受试者初始暴露于病毒或在病毒感染症状发作之后的200天内、150天内、100天内、90天内、80天内、70天内、60天内、50天内、40天内、30天内、20天内、18天内、16天内、14天内、12天内、10天内、9天内、8天内、7天内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内或1天内从受试者采集。初始暴露可以在受试者与受感染个体、受感染个体的受污染的血液或其它体液接触，例如性接触；旅行到有报导病毒感染病例的区域；消费可能含有致病病毒的受污染的食品或水；被携带病毒的昆虫如蚊子叮咬；或其任何组合时发生。例如，在一些情况下，生物样品是从旅行到有报导寨卡感染的区域的受试者获得，所述寨卡感染是在所述受试者到达该区域的90天内报导。

如本文所提供，症状发作可以指第一次发现与病毒感染有关的一种或多种症状和病征时的时间。例如，可以在一种或多种症状，包括发热、皮疹、关节疼痛、结膜炎(红眼病)、肌肉疼痛、头痛、眼后疼痛和呕吐变得显而易见的前50天内、前10天内或前7天内从受试者采集生物样品并测试寨卡感染。在一个示例性实施方案中，受试者展现病毒感染的一种或多种症状，并且生活在有报导寨卡病毒感染病例的区域或近期曾旅行到有报导寨卡病毒感染病例的区域。

生物样品可以使用各种方法从受试者获得。例如，可以通过进入循环系统(例如通过注射器、手指棒(fingerstick)、手指针(fingerprick)或其它器具经静脉内或动脉内进入)、收集分泌的生物样品(例如唾液、痰液、尿液、粪便等)、以手术方式(例如活组织检查)获取生物样品(例如术中样品、术后样品等)、擦拭(例如口腔拭子、口咽拭子)或用移液管移取，从受试者获得样品。这些方法可以用于从受试者获得大体上较小体积(例如小于或等于约5微升)的生物样品。在一些情况下，受试者可以采集并提供样品(例如唾液样品)进行测试。

生物样品可以被运送到分析设施。所述设施可以是现场或当地的设施，例如在采集样品的诊所或医院内的设施。所述设施还可以是非现场或偏远的设施，这可能需要运输样品。在一些情况下，样品在运送之前可以被干燥，例如干血样品。在某些实施方案中，生物样品是在不运送至实验室设施的情况下进行测试，例如在无法使用实验室的偏远地区。

受试者可以是例如小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、狗、猫、灵长类动物如猴或人类。在一些实施方案中，受试者是人类。受试者可以是成人、儿童或婴儿。受试者可以是男性或女性。受试者可以是女性，如怀孕、计划怀孕或育龄女性。受试者可以是任何年龄。受试者可以先前被诊断患有一种或多种病毒感染，可以展现一种或多种病毒感染的症状，或可以疑似患有一种或多种病毒感染。

在某些实施方案中，本公开的方法包括使病毒抗原，例如寨卡病毒抗原与生物样品接触至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟、至少约55分钟或至少约60分钟。在一些情况下，病毒抗原，例如与基底相联的病毒抗原，可以培育在本文所描述的任何两个值之间，例如在约30分钟到40分钟之间、在约40分钟到约60分钟之间或在约30分钟到约60分钟之间的持续时间。

在某些实施方案中，在本文所描述的方法中分析之前，本公开的生物样品，例如血清，可以稀释至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍、至少约350倍、至少约400倍、至少约450倍或至少约500倍。在某些实施方案中，在本文所描述的方法中分析之前，生物样品，例如血清，未进行处理或进行无关紧要的处理，例如通过添加抗凝血剂或防腐剂处理。

在某些方面，本公开提供了一种诊断受试者的寨卡病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品与寨卡病毒抗原接触，其中所述寨卡病毒抗原结合至选自iga和igg或其组合的抗体；(c)通过检测结合至寨卡病毒抗原的选自iga和igg或其组合的抗体来检测生物样品中选自iga和igg或其组合的抗体；并且(d)当检测到生物样品中存在选自iga和igg或其组合的抗体时，诊断受试者患有寨卡病毒感染。

在某些方面，本公开提供一种诊断和治疗有需要受试者的寨卡病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品与寨卡病毒抗原接触，其中所述寨卡病毒抗原结合至选自iga和igg或其组合的抗体；(c)通过检测结合至所述寨卡病毒抗原的选自iga和igg的抗体来检测所述生物样品中选自iga和igg或其组合的抗体；(d)当检测到生物样品中存在选自iga和igg或其组合的抗体时，诊断所述受试者患有寨卡病毒感染；并且(e)任选地，向所诊断的受试者施用有效量的抗病毒剂。

抗病毒剂是一类专用于治疗病毒感染的药物。与抗生素相同，特定抗病毒剂是针对特定病毒。这些抗病毒剂对于宿主相对无害，并因此可以用于治疗感染。抗病毒剂可以抑制病毒生命周期的各个阶段。例如，抗病毒剂可以包含抑制病毒附着到细胞受体的药剂。此类抗病毒剂可以模拟病毒相关蛋白质(vap)并结合至细胞受体。其它抗病毒剂可以抑制病毒进入、病毒脱壳(例如三环癸胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、普可那利(pleconaril))、病毒合成、病毒整合、病毒转录或病毒翻译(例如福米韦生(fomivirsen))。在一些实例中，抗病毒疗法是吗啉反义寡核苷酸(morpholinoantisense)。抗病毒剂可以有别于杀病毒剂，杀病毒剂有效地使身体外部的病毒粒子失活。

在一些实例中，抗病毒剂可以包含逆转录酶抑制剂。逆转录酶抑制剂可以是核苷逆转录酶抑制剂或非核苷逆转录酶抑制剂。核苷逆转录酶抑制剂可以包括但不限于可比韦(combivir)、恩曲他滨(emtriva)、艾培韦(epivir)、复方阿巴卡韦拉米夫定(epzicom)、哈维德(hivid)、利妥韦(retrovir)、三协唯(trizivir)、特鲁瓦达(truvada)、地达诺新缓释胶囊(videxec)、地达诺新(videx)、韦瑞德(viread)、泽瑞特(zerit)及扎艾格(ziagen)。非核苷逆转录酶抑制剂可以包含艾德伦特(edurant)、英特莱(intelence)、瑞斯普托(rescriptor)、萨斯迪瓦(sustiva)及维乐命(viramune)(立即释放或延长释放)。

蛋白酶抑制剂是抗病毒剂的另一个实例并且可以包括但不限于安格纳韦(agenerase)、安普替瓦(aptivus)、克瑞西凡(crixivan)、弗托瓦斯(fortovase)、因服雷(invirase)、克力芝(kaletra)、乐西瓦(lexiva)、诺韦(norvir)、普利泽他(prezista)、瑞亚塔(reyataz)及韦拉西普(viracept)。或者，抗病毒疗法可以包含融合抑制剂(例如恩夫韦地(enfuviride))或进入抑制剂(例如马拉维若(maraviroc))。

抗病毒剂的其它实例包括阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(acyclovir)、阿德福韦(adefovir)、三环癸胺、安普那韦(amprenavir)、阿普林津(ampligen)、阿比朵尔(arbidol)、阿扎那韦(atazanavir)、阿托伐他汀钙(atripla)、波昔普韦(boceprevir)、西多福韦(cidofovir)、可比韦、地瑞那韦(darunavir)、地拉韦啶(delavirdine)、地达诺新(didanosine)、多可沙诺(docosanol)、依度尿苷(edoxudine)、依法韦仑(efavirenz)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩夫韦地(enfuvirtide)、恩替卡韦(entecavir)、泛昔洛韦(famciclovir)、福米韦生(fomivirsen)、夫沙那韦(fosamprenavir)、膦甲酸(foscarnet)、膦乙醇(fosfonet)、融合抑制剂、苷昔洛韦(ganciclovir)、伊巴他滨(ibacitabine)、异丙肌苷(imunovir)、碘尿苷(idoxuridine)、咪喹莫特(imiquimod)、茚地那韦(indinavir)、肌苷、整合酶抑制剂、干扰素(例如i型、ii型、iii型干扰素)、拉米夫定(lamivudine)咯匹那韦(lopinavir)、洛韦胺(loviride)、马拉维若、吗啉胍(moroxydine)、美替沙腙(methisazone)、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平(nevirapine)、多吉美(nexavir)、核苷类似物、奥司他韦(oseltamivir)、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦(喷昔洛韦)、帕拉米韦(peramivir)、普可那利、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、蛋白酶抑制剂、雷特格韦(raltegravir)、逆转录酶抑制剂、利巴韦林(ribavirin)、金刚乙胺(rimantadine)、利托那韦(ritonavir)、嘧啶、沙奎那韦(saquinavir)、司他夫定(stavudine)、茶树油、替诺福韦(tenofovir)、替诺福韦酯(tenofovirdisoproxil)、替拉那韦(tipranavir)、曲氟尿苷(trifluridine)、三协唯、曲金刚胺(tromantadine)、特鲁瓦达、伐昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、维克韦罗(vicriviroc)、阿糖腺苷(vidarabine)、韦拉咪定(viramidine)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)及齐多夫定(zidovudine)。

在某些方面，本公开提供一种诊断雌性受试者的寨卡病毒感染并预防由于所述感染传播给胎儿而引起的疾病的方法，所述方法包括：(a)从雌性受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品与寨卡病毒抗原接触，其中所述寨卡病毒抗原结合至选自iga和igg或其组合的抗体；(c)通过检测结合至所述寨卡病毒抗原的选自iga和igg或其组合的抗体来检测所述生物样品中选自igaigg或其组合的抗体；(d)当检测到所述生物样品中存在选自iga和igg或其组合的抗体时，诊断所述受试者患有寨卡病毒感染；并且(e)任选地向所诊断的受试者施用避孕药，建议所述雌性受试者在感染寨卡病毒时避免怀孕，或告知怀孕的雌性受试者有所述寨卡病毒感染胎儿的风险。

在某些实施方案中，如当受试者怀孕、计划怀孕或处于育龄时，使用了本文所描述的方法来筛查病毒感染的受试者，并由此预防疾病传播。怀孕受试者，如生活在有报导寨卡病毒感染病例的区域的怀孕受试者，可以监测整个妊娠过程。例如，可以在妊娠过程中对怀孕受试者进行一次或多次测试，以便确定所述受试者是否感染寨卡病毒感染。如果怀孕受试者被诊断患有寨卡病毒感染，则所述受试者可以：获得有关寨卡病毒感染胎儿的风险的告知、寻求继续或终止妊娠的建议、接受抗病毒剂或针对寨卡病毒感染的其它疗法，或其任何组合。

黄病毒或甲病毒抗原可以包含具有多种抗原性的抗原，其中所述抗原可以具有病毒株特异性。黄病毒或甲病毒抗原可以选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎病毒抗原、西尼罗病毒抗原、马亚罗病毒抗原、日本脑炎病毒(jev)抗原及基孔肯雅病毒抗原。在一个实例中，所述抗原包含寨卡病毒抗原，如ns1或ns5抗原。ns1抗原可以是重组蛋白，如在人293细胞中产生的重组ns1抗原。重组ns1抗原可以包含来自寨卡病毒的乌干达mr766病毒株的ns1抗原。在某些实施方案中，黄病毒或甲病毒抗原是登革病毒抗原，如登革2型抗原。举例来说，在vero细胞中培养登革病毒株16681，并通过沉淀和超速离心法从组织培养上清液浓缩病毒粒子。可以通过蔗糖密度梯度离心纯化出抗原。通过超速离心法将病毒粒子从蔗糖分离，并使抗原再悬浮于培养基199中。

如果在从受试者采集的生物样品与结合选自igg和iga或其组合的抗体的寨卡病毒抗原接触时，在所述样品中检测到存在选自igg和iga或其组合的抗体，则受试者可以被诊断患有寨卡病毒感染。在某些实施方案中，检测选自igg和iga或其组合的抗体包括检测生物样品中结合至寨卡病毒抗原的选自igg和iga或其组合的抗体的含量。

在某些实施方案中，所述方法还包括使用对某一类型的免疫球蛋白具有选择性亲和力，例如对igg或iga具有选择性亲和力的一种或多种另外的抗体。可以使生物样品与所述一种或多种另外的抗体接触，其中所述一种或多种另外的抗体可以另外包括可检测标记。检测选自igg和iga或其组合的抗体可以包括检测第一可检测标记，其中所述第一可检测标记与第一抗体相联，所述第一抗体结合至与寨卡抗原结合的iga。第一抗体可以是抗人iga抗体。在某些实施方案中，第一可检测标记发射主波长的信号。检测选自igg和iga或其组合的抗体可以包括检测第二可检测标记，其中所述第二可检测标记与第二抗体相联，所述第二抗体结合至与寨卡抗原结合的igg。第二抗体可以是抗人igg抗体。在某些实施方案中，第二可检测标记发射次波长的信号。在某些实施方案中，主波长不同于次波长。

在某些实施方案中，第一抗体和第二抗体各自与不同的可检测标记相联，例如共价或非共价结合在一起，由此能够在单一分析中同时检测第一和第二抗体。另外或替代地，一种或多种抗体可以相对于其它抗体独立地检测(例如在多个分析中)，由此允许使用具有相同或类似可检测标记，例如发射相同或类似波长的光的标记的第一和第二抗体进行检测。在一些实施方案中，一定比例的第一或第二抗体包含相同或不同的可检测标记，由此在多于一种分析中检测一种或多种免疫球蛋白的存在、不存在或含量。例如，在一些情况下，至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的第一或第二抗体包含相同或不同的可检测标记。第一可检测标记可以与第一抗体相联，所述第一抗体结合至与寨卡抗原结合的iga(例如抗人iga抗体)，并且第二可检测标记可以与第二抗体相联，所述第二抗体结合至与寨卡抗原结合的igg(例如抗人igg抗体)。第一和第二可检测标记分别发射主波长的信号和次波长的信号。如上文和本文中其它地方所描述，主波长与次波长可以相同或不同。可以在同一分析中使用发射波长不重叠的不同可检测标记以标记不同种类的蛋白质或抗体，由此在同一分析中实现抗体同型如igg、igm或iga的多色差异。如本文所使用，如果各信号的峰值波长间隔足够远，使得例如通过人观察或通过机器可区分各光束，则发射波长重叠的可检测标记可以视为不同的。

多种荧光分子可以在本公开中用作可检测标记，例如荧光团、小分子、染料、荧光蛋白和量子点。荧光分子的非限制性实例可以包括：荧光原位杂交(fish)探针、1,5iaedans；1,8-ans；4-甲基伞形酮；5-羧基-2,7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-fam)；5-羧基萘荧光素；5-羧基四甲基罗丹明(5-carboxytetramethylrhodamine，5-tamra)；5-fam(5-羧基荧光素)；5-hat(羟基色胺)；5-羟基色胺(hat)；5-rox(羧基-x-罗丹明)；5-tamra(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6g；6-cr6g；6-joe；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放射菌素d(7-aad)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；abq；酸性品红(acidfuchsin)；acma(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄(acridineyellow)；吖啶黄素(acriflavin)；吖啶黄素福尔根sitsa(acriflavinfeulgensitsa)；水母发光蛋白(发光蛋白质)；afp，即自发荧光蛋白质(autofluorescentprotein；quantumbiotechnologies)；alexafluor350^tm；alexafluor430^tm；alexafluor488^tm；alexafluor532^tm；alexafluor546^tm；alexafluor568^tm；alexafluor594^tm；alexafluor633^tm；alexafluor647^tm；alexafluor660^tm；alexafluor680^tm；茜素氨羧络合剂(alizarincomplexion)；茜素红；别藻蓝蛋白(apc)；amc、amca-s；amca(氨基甲基香豆素)；amca-x；氨基放射菌素d；氨基香豆素；氨基甲基香豆素(amca)；苯胺蓝；硬脂酸蒽酯；apc(别藻蓝蛋白)；apc-cy7；aptra-btc；apts；astrazon亮红4g；astrazon橙r；astrazon红6b；astrazon黄7gll；atabrine；atto-tag^tmcbqca；atto-tag^tmfq；金胺(auramine)；aurophosphineg；aurophosphine；bao9(双氨基苯基噁二唑)；bcecf(高ph)；bcecf(低ph)；硫酸小蘖碱；β内酰胺酶；bimane；双苯甲酰胺；双苯甲酰亚胺(hoechst)；双btc；blancophorffg；blancophorsv；bobo^tm-1；bobo^tm-3；氟硼荧(bodipy)492/515；氟硼荧493/503；氟硼荧500/510；氟硼荧505/515；氟硼荧530/550；氟硼荧542/563；氟硼荧558/568；氟硼荧564/570；氟硼荧576/589；氟硼荧581/591；氟硼荧630/650-x；氟硼荧650/665-x；氟硼荧665/676；氟硼荧fi；氟硼荧flatp；氟硼荧fi-神经酰胺；氟硼荧r6gse；氟硼荧tmr；氟硼荧tmr-x偶联物；氟硼荧tmr-x，se；氟硼荧tr；氟硼荧tratp；氟硼荧tr-xse；bo-pro^tm-1；bo-pro^tm-3；亮磺化黄素(brilliantsulphoflavin)ff；btc；btc-sn；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；calciumcrimson^tm；calciumgreen；calciumgreen-1ca²⁺染料；calciumgreen-2ca²⁺；calciumgreen-snca²；calciumgreen-c18ca²；calciumorange；卡尔科弗卢尔荧光增白剂(calcofluorwhite)；羧基-x-罗丹明(5-rox)；cascadeblue^tm；cascadeyellow；儿茶酚胺；ccf2(geneblazer)；cfda；叶绿素；色霉素a；色霉素a；cl-nerf；cmfda；香豆素鬼笔环肽；c-藻蓝素；cpm甲基香豆素；ctc；ctc甲臜(formazan)；cy2^tm；cy3.18；cy3.5^tm；cy3^tm；cy5.18；cy5.5^tm；cy5^tm；cy7^tm；环状amp氟传感器(ficrhr)；dabcyl；丹磺酰；丹磺酰胺；丹磺酰基尸胺；丹磺酰氯；丹磺酰基dhpe；丹磺酰氟；dapi；dapoxyl；dapoxyl2；dapoxyl3′dcfda；dcfh(二乙酸二氯二氢荧光素)；ddao；dhr(二氢罗丹明123)；di-4-anepps；di-8-anepps(非比率)；dia(4-di-16-asp)；二乙酸二氯二氢荧光素(dcfh)；did-亲脂性示踪剂；did(diic18(5))；dids；二氢罗丹明123(dhr)；dil(diic18(3))；二硝基苯酚；dio(dioc18(3))；dir；dir(diic18(7))；dm-nerf(高ph)；dnp；多巴胺；dtaf；dy-630-nhs；dy-635-nhs；elf97；伊红；赤藓红；赤藓红itc；溴化乙啶；乙啶同二聚体-1(ethd-1)；euchrysin；eukolight；氯化铕(iii)；eyfp；快速蓝(fastblue)；fda；feulgen(副蔷薇苯胺)；fif(甲醛诱导的荧光)；fitc；flazo橙；fluo-3；fluo-4；荧光素(fitc)；二乙酸荧光素；fluoro-emerald；fluoro-gold(羟基芪脒)；fluor-ruby；fluorx；fm1-43^tm；fm4-46；furared^tm(高ph)；furared^tm/fluo-3；fura-2；fura-2/bcecf；genacryl亮红b；genacryl亮黄10gf；genacryl粉红3g；genacryl黄5gf；geneblazer(ccf2)；乙醛酸；粒蓝(granularblue)；血紫质；hoechst33258；hoechst33342；hoechst34580；hpts；羟基香豆素；羟基芪脒(fluorogold)；羟基色胺；indo-1，高钙；indo-1，低钙；吲哚二碳花青(did)；吲哚三碳花青(dir)；intrawhitecf；jc-1；jo-jo-1；jo-pro-1；laserpro；laurodan；lds751(dna)；lds751(rna)；leucophorpaf；leucophorsf；leucophorws；丽丝胺罗丹明(lissaminerhodamine)；丽丝胺罗丹明b；钙黄绿素/乙啶同二聚体；lolo-1；lo-pro-1；荧光黄；lysotracker蓝；lysotracker蓝-白；lysotracker绿；lysotracker红；lysotracker黄；lysosensor蓝；lysosensor绿；lysosensor黄/蓝；mag绿；magdala红(根皮红b)；mag-fura红；mag-fura-2；mag-fura-5；mag-indo-1；magnesiumgreen；magnesiumorange；孔雀绿；海洋蓝(marinablue)；maxilon亮黄素10gff；maxilon亮黄素8gff；份菁(merocyanin)；甲氧基香豆素；mitotracker绿fm；mitotracker橙；mitotracker红；米拉霉素(mitramycin)；单溴二胺；单溴二胺(mbbr-gsh)；单氯二胺；mps(甲基绿派洛宁芪(methylgreenpyroninestilbene))；nbd；nbd胺；尼罗红(尼罗红)；硝基苯并噁二唑；去甲肾上腺素；核固红(nuclearfastred)；核黄；nylosan亮黄素e8g；oregongreen；oregongreen488-x；oregongreen^tm；oregongreen^tm488；oregongreen^tm500；oregongreen^tm514；太平洋蓝(pacificblue)；副蔷薇苯胺(feulgen)；pbfi；pe-cy5；pe-cy7；percp；percp-cy5.5；pe-texasred[red613]；根皮红b(马格达拉红(magdalared))；phorwitear；phorwitebkl；phorwiterev；phorwiterpa；膦3r；photoresist；藻红蛋白b[pe]；藻红蛋白r[pe]；pkh26(sigma)；pkh67；pmia；桥铬黄蓝黑(pontochromeblueblack)；popo-1；popo-3；po-pro-1；po-pro-3；樱草素；procion黄；碘化丙啶(pl)；pympo；芘；派洛宁；派洛宁b；pyrozal亮黄素7gf；qsy7；氮芥喹丫因(quinacrinemustard)；red613[pe-texasred]；试卤灵(resorufin)；rh414；rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5gld；罗丹明6g；罗丹明b；罗丹明b200；罗丹明bextra；罗丹明bb；罗丹明bg；罗丹明绿；罗丹明鬼笔环肽；罗丹明鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明wt；孟加拉玫瑰红(rosebengal)；r-藻花青素；r-藻红蛋白(pe)；s65a；s65c；s65l；s65t；sbfi；血清素；sevron亮红2b；亮红4g；sevron亮红b；sevron橙；sevron黄l；sits；sits(樱草素)；sits(异硫磺酸芪)；snafl钙黄绿素；snafl-1；snafl-2；snarf钙黄绿素；snarf1；sodiumgreen；spectrumaqua；spectrumgreen；spectrumorange；spectrumred；spq(6-甲氧基-n-(3-磺丙基)喹啉鎓)；芪；磺酰罗丹明bcanc；磺酰罗丹明extra；syto11；syto12；syto13；syto14；syto15；syto16；syto17；syto18；syto20；syto21；syto22；syto23；syto24；syto25；syto40；syto41；syto42；syto43；syto44；syto45；syto59；syto60；syto61；syto62；syto63；syto64；syto80；syto81；syto82；syto83；syto84；syto85；sytox蓝；ir680；ir880；ir-26；ir-1051；ir-1061；sytox绿；sytox橙；四环素(tetracycline)；四甲基罗丹明(tritc)；texasred^tm；texasred-x^tm偶联物；硫杂二羰花青(thiadicarbocyanine)(disc3)；噻嗪红r；噻唑橙；硫代黄素5；硫代黄素s；硫代黄素tcn；thiolyte；噻唑橙；tinopolcbs(卡尔科弗卢尔荧光增白剂)tmr；to-pro-1；to-pro-3；to-pro-5；toto-1；toto-3；tricolor(pe-cy5)；tritc四甲基罗丹明异硫氰酸酯；trueblue；trured；ultralite；荧光素钠(uranine)b；uvitexsfc；ww781；x-罗丹明；xritc；二甲苯橙；y66f；y66h；y66w；yo-pro-1；yo-pro-3；yoyo-1；yoyo-3、sybr绿、噻唑橙(内螯合染料)；alexafluor染料系列(如alexafluor350、alexafluor405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700及750)；cy染料荧光团系列(如cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7)；oyster染料荧光团(如oyster-500、-550、-556、645、650、656)；dy标记系列(如dy-415、-495、-505、-547、-548、-549、-550、-554、-555、-556、-560、-590、-610、-615、-630、-631、-632、-633、-634、-635、-636、-647、-648、-649、-650、-651、-652、-675、-676、-677、-680、-681、-682、-700、-701、-730、-731、-732、-734、-750、-751、-752、-776、-780、-781、-782、-831、-480xl、-481xl、-485xl、-510xl、-520xl、-521xl)；atto荧光标记(如atto390、425、465、488、495、520、532、550、565、590、594、610、611x、620、633、635、637、647、647n、655、680、700、725、740)；calfluor和quasar染料(如calfluor金540、calfluor橙560、quasar570、calfluor红590、calfluor红610、calfluor红635、quasar670)；evitags或qdot系列量子点(如qdot525、qdot565、qdot585、qdot605、qdot655、qdot705、qdot800)；荧光素、罗丹明、藻红蛋白或其组合。

在一些实例中，荧光分子是近红外荧光团，如ir680或ir880。一般来说，术语“近红外”(nir)用于指电磁波谱的近红外区(例如从0.6到2.1μm)。nir荧光团的其它实例包括cy5、cy5.5和cy7，其各自购自gehealthcare；vivotag-680、vivotag-s680、vivotag-s750，其各自购自visenmedical；alexafluor660、alexafluor680、alexafluor700、alexafluor750和alexafluor790，各自购自invitrogen；dy677、dy676、dy682、dy752、dy780，其各自购自dyomics；dylight677，购自thermoscientific；hilytefluor647、hilytefluor680和hilytefluor750，其各自购自anaspec；irdye800、irdye800cw、irdye800rs、irdye680cw和irdye700dx、其各自购自li-cor；以及ads780ws、ads830ws和ads832ws，其各自购自americandyesource。另外，cdse、pbs、cuins2、稀土纳米粒子、碳纳米管的量子点属于在700-2100nm范围内发射的荧光剂。可以通过nir荧光增强(nir-fe)来增强nir标记，由此本公开的纳米结构有利地改变荧光团的光谱特性并缓解其部分较经典的光物理限制。

在一些实施方案中，荧光分子是可见光染料，如alexa488、cy3或cy5。一般来说，术语“可见光染料”和“可见光标记”用于指荧光发射波长在电磁波谱的可见光区(例如300nm到650nm)中的标记。可见光染料的其它实例包括购自gehealthcare的cy3；购自pierce的fitc；购自visenmedical的vivotag-645；alexafluor350、alexafluor405、alexafluor430、alexafluor488、alexafluor514、alexafluor532、alexafluor546、alexafluor555、alexafluor594、alexafluor610、alexafluor633和alexafluor647，其各自购自invitrogen；dy405、dy415、dy430、dy490、dy495、dy505、dy530、dy547、dy560、dy590、dy605、dy610、dy615、dy630和dy647，其各自购自dyomics；dylight547和dylight647，其各自购自thermoscientific；hilytefluor405、hilytefluor488、hilytefluor532、hilytefluor555和hilytefluor594，其各自购自anaspec。

生物样品中结合至黄病毒或甲病毒抗原中每一种的一种或多种免疫球蛋白的检测可以通过使用各种平台或分析执行。所述平台或分析的非限制性实例包括但不限于基于包括金属、玻璃、石英和硝化纤维素在内的等离子体和非等离子体基底的微阵列平台、elisa、数字式elisa、侧流分析、侧流免疫色谱、流式荧光检测术、化学发光分析、mesoscalediscovery(msd)电化学发光分析、基于珠粒的荧光分析、bectondickinson细胞计数珠粒阵列(cba)流式细胞分析，以及任何其它抗体捕捉分析、化学发光分析和电化学发光分析，或其组合。在某些实施方案中，本公开的用于检测生物样品中结合至黄病毒或甲病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白的方法是用等离子体基底执行以增大荧光信号。示例性等离子体基底可以见于美国专利公开第20160146799号和第20130172207号，各案全部内容以引用的方式并入本文中。

在一些情况下，本公开的方法还可以包括将生物样品中结合至黄病毒或甲病毒抗原中每一种的一种或多种免疫球蛋白的含量与截止值相比较，并基于结果作出诊断。截止值可以包含健康参考群体的对照截止值、感染了并非待诊断的病毒感染病毒的患者参考群体的截止值、曾感染待诊断的病毒感染的健康患者参考群体的截止值，或其任何组合。在检测到生物样品中结合至黄病毒或甲病毒抗原中每一种的至少两种免疫球蛋白的含量并与截止值相比较的情况下，如果至少一种免疫球蛋白的含量高于截止值，则受试者可以被诊断患有病毒感染。在一个实例中，受试者寨卡感染的诊断包括将结合至寨卡病毒抗原的igg的含量与登革感染患者参考群体的基于登革的截止值相比较，并且当结合至寨卡病毒抗原的igg的含量大于基于登革的截止值时，所述受试者被诊断患有寨卡病毒感染。基于登革的截止值可以比所测量的登革感染患者参考群体的生物样品中结合至寨卡病毒抗原的igg的含量的平均值高至少约1个标准差(sd)(例如至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个或至少约10个sd或在前述值的范围内，如从约2-5个sd)。另外或替代地，诊断可以包括将结合至寨卡病毒抗原的iga的含量与健康患者参考群体的健康对照截止值相比较，并且当结合至寨卡病毒抗原的iga的含量大于健康对照截止值时，所述受试者被诊断患有急性寨卡病毒感染。健康对照截止值可以比所测量的来自健康参考群体的生物样品中结合至所述寨卡病毒抗原的iga的含量的平均值高至少约1个sd(例如至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个或至少约10个sd或其间任何值，如自约2-5个sd)。

对照样品可以包含阳性对照样品、阴性对照样品和校准剂样品。阳性对照样品可以是确定呈zikvigg抗体和2型denvigg抗体阳性的患者血清样品。阳性对照样品可以由zikv和denv抗原两种引起荧光信号。阳性对照可以用于确定抗原特异性并且在分析程序期间可以与患者血清样品一起使用。阴性对照样品可以是确定呈zikvigg抗体和2型denvigg抗体阴性的样品。阴性对照样品可以由zikv和denv抗原引起可忽略的信号或不引起信号。阴性对照可以用于鉴别和减去与zikv和denv抗原的非特异性结合并且在分析程序期间可以与患者血清样品一起使用。校准剂样品可以是通过荧光信号证实的具有特定zikvigg和denvigg浓度的对zikv和denvigg抗体呈阳性的患者血清样品。校准剂可以用于定量患者血清样品的和denvigg含量并且在分析程序期间可以与血清样品一起使用。

如本文所使用，“参考群体”是指用于建立标准参考范围或截止值的个体的代表性样品。健康参考群体例如是由无疾病群体或未患所测试或待诊断病症或疾病的一组个体建立。在一些情况下，健康参考群体是在排除患所测试病症或疾病如病毒感染的风险较高的受试者之后，由无疾病群体建立。此类受试者可以包括孕妇、未出生的婴儿或在爆发病毒感染的国家生活或旅行的个体。举例来说，用于诊断黄病毒感染的健康患者参考群体可以是无先前或当前黄病毒感染，如无先前或当前寨卡病毒感染或登革病毒感染的健康群体。

登革感染参考群体是指参考群体或被诊断患有登革病毒感染的一组个体。患者参考群体可以基于临床表现、实验室测试、商业诊断和筛查测试、医疗记录、受试者调查或其组合诊断。用于诊断寨卡感染的登革感染参考群体可以是被诊断患有登革病毒感染但通过商业分析(例如trioplex实时rt-pcr分析、针对寨卡病毒的血清测试、寨卡igm抗体捕捉酶联免疫吸附分析法(zikamac-elisa)或噬菌斑减少中和测试(prnt))测试呈寨卡病毒感染阴性，基于医疗记录或健康调查未显示寨卡感染症状或先前未展现寨卡感染症状的一组个体。在一些情况下，登革感染参考群体也是在排除在蚊媒寨卡病毒传播活跃或寨卡感染风险较高的区域生活或旅行的受试者之后，由无寨卡群体建立。在一些情况下，登革感染患者参考群体无任何先前或当前寨卡病毒感染。在某些情况下，登革感染患者参考群体的特点是患慢性登革病毒感染的患者。

在一些情况下，可能需要对在受试者初始暴露于病毒之后或受试者的病毒感染症状发作之后的不同时间从受试者采集的两份或更多份生物样品执行本公开的方法。例如，所述方法可以在受试者初始暴露于病毒之后或受试者的病毒感染的症状发作之后的某一时间段(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、110天、120天、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间)内的不同时间(例如至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50个时间)从同一受试者采集2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100份或更多份样品。在某些实施方案中，当测试两份或更多份样品时，测试得到的结果可以提供有关疾病进展的信息。例如，在暴露于寨卡病毒感染之后不久，例如在暴露的10天内从受试者采集的样品相对于在第一次暴露于寨卡病毒感染之后20天或更长时间从同一受试者采集的样品可以显示出较高的iga含量。

在某些实施方案中，本公开的方法是根据表5中的流程图执行。在某些实施方案中，将用于检测生物样品中的病毒生物标记物，例如抗体的方法执行两次，在第一次执行测试时，受试者处于症状发作的18天内、14天内、12天内或甚至是10天内，或受试者初始暴露于病毒之后的18天内、14天内、12天内或甚至是10天内。在此类实施方案中，第二次测试可以在受试者初始暴露于第一病毒或第二病毒之后10天或更多天、12天或或更多天、14天或更多天、16天或更多天或者18天或更多天，或在病毒感染症状初始发作之后的10天或更多天、12天或或更多天、14天或更多天、16天或更多天或者18天或更多天执行。在某些实施方案中，所述第一次执行的测试包括测试人igg抗体，例如针对寨卡病毒抗原的人igg抗体、针对登革病毒抗原的人igg抗体、针对寨卡病毒抗原的人igg亲合力和针对登革病毒抗原的人igg亲合力。在某些实施方案中，所述第二次执行的测试包括测试针对寨卡病毒抗原的人igg抗体。尽管表5中的流程图提出检测和诊断寨卡病毒抗原，但本公开还包括遵循与表5中关于寨卡病毒所描述类似的方法检测其它病毒感染，例如黄病毒和甲病毒感染的方法。

在某些实施方案中，本公开的方法可以用于区分来自受试者的样品中的两种或更多种黄病毒或甲病毒感染。病毒的非限制性实例包括寨卡病毒(zikv)、黄热病病毒(yfv)、登革病毒(denv)血清型denv-1、denv-2、denv-3和denv-4、日本脑炎病毒(jev)、西尼罗病毒(wnv)、马亚罗病毒、基孔肯雅病毒、罗斯河病毒(rossrivervirus)、辛德毕斯病毒(sindbisvirus)及巴马森林病毒(barmahforestvirus)。利用本文中提供的方法，所述诊断可以准确地区分较高比例测试受试者的选定类型的病毒感染(例如寨卡病毒感染)与其它病毒感染(例如除寨卡感染外的黄病毒或甲病毒感染)。例如，所述诊断可以准确地区分至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更高百分比测试受试者的寨卡病毒感染与登革病毒感染。

用于检测第一和第二病毒感染的测试方法可以包括从先前被诊断患有第一或第二病毒感染、患第一或第二病毒感染的风险较高、展现第一或第二病毒感染的一种或多种症状或疑似患有第一或第二病毒感染的受试者获得生物样品。生物样品可以通过如本文所描述的方法中的任一种从受试者采集。接着，可以使采集的生物样品与第一病毒抗原和第二病毒抗原接触，所述第一病毒抗原和第二病毒抗原可以独立地选自如黄病毒抗原和甲病毒抗原之类病毒抗原。第一病毒抗原和第二病毒抗原可以被一种或多种免疫球蛋白，例如igg、iga、igm、igd和ige特异性且高亲和力结合。所述一种或多种免疫球蛋白，例如igg、iga、igm、igd和ige如果存在于生物样品中，则可以通过检测结合至所述第一和第二病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白进行检测。结合至第一和第二病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白的检测可以包括检测生物样品中结合至第一病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白和/或生物样品中结合至第二病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白的存在、不存在、含量或数量。在某些实施方案中，所述第一和第二病毒抗原独立地选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎病毒抗原、西尼罗病毒抗原、马亚罗病毒抗原及基孔肯雅病毒抗原。

基于检测到结合至第一和第二病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白的存在、不存在、含量或数量，所述方法还可以包括当检测到结合至第一病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白时，诊断受试者患有第一病毒感染，并且当检测到结合至第二病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白时，诊断受试者患有第二病毒感染。在一些情况下，第一病毒感染和第二病毒感染独立地选自黄病毒感染和甲病毒感染，如寨卡病毒感染、登革病毒感染、黄热病病毒感染、蜱传脑炎病毒感染、西尼罗病毒感染、马亚罗病毒感染及基孔肯雅病毒感染。

在某些方面，本公开提供一种诊断受试者的第一和第二病毒感染的方法，所述方法包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)使所述生物样品与独立地选自黄病毒抗原和甲病毒抗原的第一病毒抗原和第二病毒抗原接触；(c)通过检测结合至第一病毒抗原的选自iga和igg或其组合的抗体和结合至第二病毒抗原的选自iga和igg或其组合的抗体来检测生物样品中选自iga和igg或其组合的抗体；并且(d)当检测到结合至第一病毒抗原的选自iga和igg或其组合的抗体时，诊断受试者患有第一病毒感染，并且当检测到结合至第二病毒抗原的选自iga和igg或其组合的抗体时，诊断受试者患有第二病毒感染。

所述诊断可以准确地区分较高百分比(例如至少约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比测试受试者)的第一和第二病毒感染。举例来说，可以从疑似患有寨卡感染的一组个体采集多份生物样品，并针对寨卡病毒抗原和另一黄病毒或甲病毒抗原测试这些生物样品。利用本公开的方法，所述诊断可以准确地区分90％或超过90％的测试受试者的寨卡病毒感染与其它黄病毒或甲病毒感染。在一些情况下，第一和第二病毒抗原分别是寨卡病毒抗原和登革病毒抗原并且所述诊断准确地区分90％或超过90％测试受试者的寨卡病毒感染与登革病毒感染。

本文所描述的用于诊断病毒感染的系统和方法可以特异性并且灵敏地检测病毒感染。一种分析的灵敏度将度量如此正确地鉴别的阳性的比例，即如通过另一测试，例如对于寨卡病毒，zikamac-elisa、pnrt、rt-pcr或其组合所确定，正确地鉴别为患有所述病况的病人的百分比。相对于真阳性数量，本文所描述的系统或方法可以具有极少假阴性，并因此具有高灵敏度，例如对于检测样品中寨卡病毒感染的高灵敏度。相对于如由一种或多种其它测试所测定的真阳性的数量，例如对于寨卡病毒，所述测试可以是zikamac-elisa、pnrt、rt-pcr或其组合，本公开的系统和方法可以具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％或甚至99％或更高百分比的灵敏度。

特异性度量如此正确地鉴别的阴性样品的比例，即正确地鉴别为无所述病况的健康人的百分比。相对于健康个体的数量，本文所描述的系统或方法可以具有极少假阳性，并因此具有高特异性，例如对于检测群体中寨卡病毒感染的高特异性。相对于如由一种或多种其它测试所测定的群体中健康样品的数量，例如对于寨卡病毒，所述测试可以是zikamac-elisa、pnrt、rt-pcr或其组合，本公开的系统和方法可以具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％或甚至99％或更高百分比的特异性。

在一些情况下，所述方法还可以包括通过使从受试者采集的生物样品与第三、第四、第五、第六或其它病毒抗原(例如黄病毒或甲病毒抗原)接触并检测结合至所述第三、第四、第五、第六或其它病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白来诊断所述第三、第四、第五、第六或其它病毒感染。基于在生物样品中检测的结合至第三、第四、第五、第六或其它病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白的存在、不存在或含量，受试者可以被诊断患有第三、第四、第五、第六或其它病毒感染。

结合至各抗原的一种或多种免疫球蛋白的检测可以包括检测第一、第二、第三、第四、第五、第六或其它波长的光。例如，所述方法可以包括检测结合至第一和/或第二病毒抗原的选自iga和igg或其组合的抗体，其中检测结合至第一和/或第二病毒抗原的igg包括检测第一波长的光并且检测结合至第一或第二病毒抗原的iga包括检测第二波长的光。所检测到的波长的光可以彼此相同或不同。只要发射波长重叠的信号各自的峰值波长相隔足够远以使得各波长可以目测或使用仪表彼此相区分，这些信号就是不同的。

检测还可以包括使用一种或多种另外的抗体，所述抗体各自结合至与生物样品中黄病毒或甲病毒抗原中的每一种结合的选定类型的免疫球蛋白。所述另外的抗体可以包含可检测标记并且结合至病毒抗原的免疫球蛋白可以通过检测附接至二次抗体的可检测标记进行检测。结合至各病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白的检测可以同时或分开执行。通过使用具有不同可检测标记，例如产生可区分的光学信号的可检测标记的另外抗体可以有助于同时检测。在一种或多种二次抗体包含相同可检测标记的情况下，可以执行多于一种分析并且可以分别检测结合至各病毒抗原的免疫球蛋白。

结合元件(例如第一抗原、第二抗原、第三抗原等)各自可以或可以不彼此隔离。在所述抗原彼此隔离或分离的情况下，所述抗原可以隔离于独立的物理位置，如不同的分析板、药筒、管、盘、反应器或多孔板的孔中。

在一些情况下，所述方法可以包括使用多种病毒抗原进行测试，所述病毒抗原各自与基底上的不同位置，例如区域相联或偶合。所述多个结合元件，例如病毒抗原，可以呈微阵列，例如具有多行和多列的微阵列形式布置在基底上。各不同位置可以包含一个或多个选定类型的病毒抗原的抗原分子(例如至少约2、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000或更多个抗原分子)。如本文进一步描述，基底可以具有等离子体或许并且以光谱方式与其所联接的抗原和/或抗体上的可检测标记相互作用。基底可以包含贵金属膜和固体表面，如适合于支撑分析材料和所述贵金属膜的惰性表面。贵金属膜可以包含钌、铑、钯、银、锇、铱、铂、金或其组合。贵金属膜可以通过使近红外荧光相对于无所述贵金属膜的基底增强100倍或更高倍数的方式布置于基底上。在一些情况下，贵金属膜是不连续地布置于基底上并且包含表面暴露面积在约100nm²与40,000nm²之间的多个隔离的岛状区域，所述隔离的岛状区域通过约10到约60nm的间隙分隔开。如本文所使用，术语“隔离的岛状区域”是指纳米大小的贵金属岛，或不连续的贵金属纳米结构。这些岛可以具有各种形状和构造以提供通过不含此类材料的间隙分隔开的纳米大小的隆起材料(例如金)区域。隔离的岛状区域可以是正方形、圆形、矩形、三角形、六边形、粒状或杆状，或任何其它规则或不规则形状。

在一些情况下，使生物样品与病毒抗原接触到检测生物样品中结合至病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白的周转时间小于或等于约24小时、20小时、15小时、10小时、8小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1.5小时、1小时、0.5小时或更短。在一些情况下，整个诊断过程，即从使生物样品与一种或多种病毒抗原接触到诊断受试者患有一种或多种病毒感染，是在24小时或更短、20小时或更短、15小时或更短、10小时或更短、8小时或更短、6小时或更短、5小时或更短、4小时或更短、3小时或更短、2小时或更短、1.5小时或更短、1小时或更短或甚至是0.5小时或更短时间内执行。在一些情况下，所述方法的每个步骤，如从受试者获得样品、使样品与一种或多种病毒抗原接触、检测生物样品中结合至病毒抗原的一种或多种免疫球蛋白以及诊断受试者患有一种或多种病毒感染是在10小时或更短、8小时或更短、6小时或更短、5小时或更短、4小时或更短、3小时或更短、2小时或更短、1.5小时或更短、1小时或更短或甚至说0.5小时或更短时间内执行。

在某些实施方案中，本公开的系统和方法可以用于检测和诊断例如除黄病毒或甲病毒感染外的其它感染。感染典型地是指感染物在受试者身体组织中的侵袭和倍增，以及宿主组织对所述感染物和由所述感染物产生的任何毒素的反应。感染性疾病是由例如感染性微生物引起的疾病。感染性疾病包括但不限于细菌性疾病、病毒性疾病、真菌感染、寄生虫疾病等。通过检测样品中一种或多种微生物的存在、存在机率或含量，可以诊断与此类微生物有关的疾病和病况并采取适当医疗措施。同样，通过检测样品中一种或多种微生物的不存在或不存在机率，可以排除与此类微生物有关的疾病和病况。在一些实施方案中，检测微生物包括检测微生物的一种或多种生物标记物，如微生物抗原。

由感染性细菌引起的示例性疾病或病况包括但不限于医院内肺炎、与持续性非卧床腹膜透析(continuousambulatoryperitonealdialysis，capd)有关的感染，或导管相关细菌尿(鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumanii))；皮肤炭疽、肺炭疽和胃肠炭疽(炭疽杆菌(bacillusanthracis))；百日咳和继发性细菌性肺炎(百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis))；莱姆病(伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi))；布鲁氏杆茵病(牛种布鲁氏菌(brucellaabortus)、犬种布鲁氏菌(brucellacanis)、羊种布鲁氏菌(brucellamelitensis)、猪种布鲁氏菌(brucellasuis))；急性肠炎(空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni))；社区获得性呼吸道感染(肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae))；非淋菌性尿道炎(ngu)、性病淋巴肉芽肿(lgv)、砂眼、新生儿结膜炎(沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis))；鹦鹉热(鹦鹉热嗜衣原体(chlamydophilapsittaci))；肉毒中毒(肉毒梭菌(clostridiumbotulinum))；假膜性结肠炎(艰难梭菌(clostridiumdifficile))；气性坏疽、急性食物中毒、厌氧菌性蜂窝组织炎(产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens))；破伤风(破伤风杆菌(clostridiumtetani))；白喉(白喉杆菌(corynebacteriumdiphtheriae))；菌血症、下呼吸道感染、皮肤和软组织感染、泌尿道感染(uti)、心内膜炎、腹内感染、败血性关节炎、骨髓炎、眼部感染、伤口感染、医院内感染(阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes))；皮肤、呼吸和泌尿系统感染(阴沟肠球菌(enterococcuscloacae))；医院内感染(粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium))；泌尿道感染(uti)、腹泻、婴儿脑膜炎、出血性结肠炎、溶血性尿毒症综合症(大肠杆菌(escherichiacoli))；土拉伦斯菌病(土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis))；细菌性脑膜炎、上呼吸道感染、肺炎、支气管炎(流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae))；消化性溃疡(幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori))；肺炎、泌尿道感染、胆道和手术创伤(肺炎克雷伯氏杆菌(klebsiellapneumoniae))；军团病(legionnaire'sdisease)、庞提亚克热(pontiacfever)(嗜肺性退伍军人杆菌(legionellapneumophila))；钩端螺旋体病(钩端螺旋体(leptospirainterrogans))；李斯特菌病(listeriosis)(单核细胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes))；麻风(汉森氏病(hansen'sdisease))(麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae))；肺结核(结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis))；支原体肺炎(肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae))；皮肤病变和溃疡(溃疡分枝杆菌(mycobacteriumulcerans))；新生儿眼炎、败血性关节炎(淋病奈瑟菌(neisseriagonorrhoeae))；脑膜炎球菌病，包括脑膜炎、沃特豪斯-弗里德里克森二氏综合症(waterhouse-friderichsensyndrome)(脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)；假单胞菌感染(眼、耳、皮肤、泌尿系统、呼吸道或胃肠道或cns局部感染，或伴发菌血症、继发性肺炎骨和关节感染、心内膜炎、皮肤、软组织或cns感染的全身感染)(绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa))；落基山斑疹热(rockymountainspottedfever)(立氏立克次体(rickettsiarickettsii))；伤寒发热型沙门氏菌病(伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi))；伴发肠胃炎和小肠结肠炎的沙门氏菌病(鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium))；细菌性痢疾/志贺菌病(索氏志贺杆菌(shigellasonnei))；凝固酶阳性葡萄球菌感染，包括局部皮肤感染、弥散性皮肤感染(脓疱病)、深度、局部感染、急性感染性心内膜炎、败血症、坏死性肺炎、中毒症如中毒性休克综合症和葡萄球菌食物中毒(金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus))；植入假体感染，例如心脏瓣膜和导管(表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis))；女性膀胱炎(腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus))；新生儿脑膜炎和败血症、产后妇女子宫内膜炎、伴发败血症和肺炎的机会性感染(无乳链球菌(streptococcusagalactiae))；成年急性细菌性肺炎和脑膜炎、儿童中耳炎和鼻窦炎(肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae))；链球菌性咽炎、猩红热、风湿热、脓疱病和丹毒、产褥热、坏死性筋膜炎(酿脓链球菌(streptococcuspyogenes))；肺感染、假体材料如导管或气管内或气管切开管的定植、肺炎、泌尿道感染、菌血症、软组织感染、眼部感染、心内膜炎、脑膜炎(嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia))；梅毒(梅毒螺旋体(treponemapallidum))；霍乱(霍乱弧菌(vibriocholerae))；鼠疫，包括淋巴腺鼠疫和肺鼠疫(鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis))等。

病原菌的示例性属包括但不限于不动杆菌属(acinetobacter)、芽孢杆菌属(bacillus)、博德特氏菌属(bordetella)、疏螺旋体属(borrelia)、布鲁氏菌属(brucella)、弯曲杆菌属(campylobacter)、衣原体属(chlamydia)、嗜衣原体属(chlamydophila)、梭菌属(clostridium)、棒状杆菌属(corynebacterium)、肠杆菌属(enterobacter)、肠球菌属(enterococcus)、埃希氏菌属(escherichia)、弗朗西斯氏菌属(francisella)、嗜血杆菌属(haemophilus)、螺旋杆菌属(helicobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、军团杆菌属(legionella)、钩端螺旋体属(leptospira)、李斯特菌属(listeria)、分枝杆菌属(mycobacterium)、支原体属(mycoplasma)、奈瑟菌属(neisseria)、假单胞菌属(pseudomonas)、立克次体属(rickettsia)、沙门氏菌属(salmonella)、志贺杆菌属(shigella)、葡萄球菌属(staphylococcus)、链球菌属(streptococcus)、寡养单胞菌属(stenotrophomonas)、密螺旋体属(treponema)、弧菌属(vibrio)、耶尔森氏菌属(yersinia)等。示例性致病性物种包括但不限于鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumanii)、百日咳博德特氏菌、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、牛种布鲁氏菌、犬种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体、肉毒梭菌、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、破伤风杆菌、白喉杆菌、阪崎肠杆菌(enterobactersazakii)、聚团肠杆菌(enterobacteragglomerans)、阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)、粪肠球菌、屎肠球菌、大肠杆菌、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、流感嗜血杆菌、幽门螺旋杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、嗜肺性退伍军人杆菌、钩端螺旋体、单核细胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、肺炎支原体、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、绿脓杆菌、立氏立克次体、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠道沙门氏菌、索氏志贺杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、梅毒螺旋体、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌等。

人类和动物的真菌感染或霉菌病可以包括例如影响皮肤外层的浅表性真菌感染；包括口部(鹅口疮)、阴道和肛门区域在内的黏膜的真菌感染，如由白色念珠菌(candidaalbicans)引起的真菌感染；并且影响更深层皮肤和内脏的真菌感染能够引起严重，通常致命的疾病，毛霉病(mucormycosis)、蝇疫霉病(entomophthoromycosis)、曲霉病(aspergillosis)、隐球菌病(cryptococcosis)、念珠菌病(candidiasis)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)、球霉菌病(coccidiomycosis)、类球孢子菌病(paracoccidiomycosis)、镰刀菌病(透明丝孢霉病)(fusariosis(hyalohyphomycoses))、芽生菌病(blastomycosis)、青霉菌病(penicilliosis)或孢子丝菌病(sporotrichosis)。这些和其它真菌感染可以参见例如《默克手册(merckmanual)》,第十六版,1992和spellberg等人,《临床微生物学评论(clin.microbiol.rev.)》18:556-69(2005)中的描述。

致病性真菌的示例性属包括但不限于隐球菌属(cryptococcus)、组织胞浆菌属(histoplasma)、肺囊虫属(pneumocystis)和葡萄穗霉属(stachybotrys)、曲霉属(aspergillus)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)、念珠菌属、粗球孢子菌(coccidioidesimmitis)、新型隐球菌(cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)、巴西副球孢子菌(paracoccidioidesbrasiliensis)、申克氏孢子丝菌(sporothrixschenckii)、接合菌属(zygomycetesspp.)、轮枝犁头霉(absidiacorymbifera)、微小根毛霉(rhizomucorpusillus)或少根根霉菌(rhizopusarrhizus)。

由病毒引起的示例性疾病或病况(和相关病毒)包括但不限于寨卡病毒疾病(寨卡)、免疫缺陷综合症(aids)、虫媒(arbovirus)病毒感染、巴马森林(barmahforest)病毒、西尼罗病毒、马亚罗(mayaro)病毒、日本脑炎、库宁病毒(kunjinvirus)、墨累河谷脑炎病毒(murrayvalleyencephalitisvirus)、罗斯河(rossriver)病毒、水痘、基孔肯雅热、登革热、肠病毒71感染、汉坦病毒(hantavirus)感染、a型肝炎、b型肝炎、c型肝炎、d型肝炎、e型肝炎、hiv感染、a型流感(h2)、a型流感(h5)、a型流感(h7)、a型流感(h9)、狂犬病毒、麻疹、腮腺炎、脊髓灰质炎、风疹、天花、黄热病、病毒性出血热，包括沙粒病毒(arenavirus)(新世界型)、克里米亚-刚果出血热、登革出血热、病毒性脑炎，如委内瑞拉马脑炎病毒(veev)、东方马脑炎病毒(eeev)和西方马脑炎病毒(weev)。

示例性病毒可以是腺病毒科(adenoviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、乳头瘤病毒科(papillomaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)、微小病毒科(parvoviridae)、星状病毒科(astroviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、小rna病毒科(picornaviridae)、冠状病毒科(coronaviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、披膜病毒科(togaviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、正黏病毒科(orthomyxoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridaem)、丝状病毒科(filoviridae)、副黏病毒科(paramyxoviridae)、弹状病毒科(rhabdoviridae)或呼肠孤病毒科(reoviridae)的物种。

在一些情况下，病毒选自黄病毒科成员(例如黄病毒属、瘟病毒属(pestivirus)和丙型肝炎病毒属(hepacivirus)成员)，包括c型肝炎病毒、黄热病病毒；蜱传病毒，如加德格兹谷病毒(gadgetsgullyvirus)、凯丹姆病毒(kadamvirus)、夸赛纳森林病(kyasanurforestdisease)病毒、兰加特病毒(langatvirus)、鄂木斯克出血热(omskhemorrhagicfever)病毒、玻瓦桑病毒(powassanvirus)、皇家农场病毒(royalfarmvirus)、喀什病毒(karshivirus)、蜱传脑炎病毒、neudoerfl病毒、索夫吉病毒(sofjinvirus)、绵羊跳跃病(loupingill)病毒和根岸病毒(negishivirus)；海鸟蜱传(seabirdtick-borne)病毒，如米班病毒(meabanvirus)、索马里滋里夫病毒(saumarezreefvirus)和秋列尼病毒(tyuleniyvirus)；蚊媒病毒，如阿罗阿病毒(aroavirus)、登革病毒、凯杜古病毒(kedougouvirus)、卡西帕科利病毒(cacipacorevirus)、库坦戈病毒(koutangovirus)、日本脑炎病毒、墨累河谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎(st.louisencephalitis)病毒、乌苏图病毒(usutuvirus)、西尼罗病毒、雅温得病毒(yaoundevirus)、科科贝拉病毒(kokoberavirus)、巴加扎病毒(bagazavirus)、伊利乌斯病毒(ilheusvirus)、以色列火鸡脑膜脑炎-脊髓炎(israelturkeymeningoencephalo-myelitis)病毒、恩塔亚病毒(ntayavirus)、坦布苏病毒(tembusuvirus)、寨卡病毒、斑齐病毒(banzivirus)、博博衣病毒(boubouivirus)、埃杰山病毒(edgehillvirus)、朱格拉病毒(jugravirus)、萨博亚病毒(saboyavirus)、赛皮克病毒(sepikvirus)、乌干达s病毒、威塞尔斯布隆病毒(wesselsbronvirus)、黄热病病毒；以及不通过已知节肢动物传播的病毒，如恩特伯蝙蝠病毒(entebbebatvirus)、横瀬病毒(yokosevirus)、阿波伊病毒(apoivirus)、牛骨山脊病毒(cowboneridgevirus)、胡蒂亚帕病毒(jutiapavirus)、摩多克病毒(modocvirus)、萨尔别霍病毒(salviejavirus)、圣帕利塔病毒(sanperlitavirus)、布卡拉沙蝙蝠病毒(bukalasabatvirus)、凯里岛病毒(careyislandvirus)、达卡尔蝙蝠病毒(dakarbatvirus)、蒙大拿蝠白细胞脑炎(montanamyotisleukoencephalitis)病毒、金边蝙蝠病毒(phnompenhbatvirus)、里约布拉沃病毒(riobravovirus)、塔玛纳蝙蝠病毒(tamanabatvirus)，和细胞融合剂病毒(cellfusingagentvirus)。

在一些情况下，病毒选自沙粒病毒科成员，包括伊派病毒(ippyvirus)、拉沙病毒(lassavirus)(例如josiah、lp或ga391株)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、莫巴拉病毒(mobalavirus)、莫佩亚病毒(mopeiavirus)、大卡里孛病毒(amaparivirus)、弗莱克病毒(flexalvirus)、瓜纳里托病毒(guanaritovirus)、胡宁病毒(juninvirus)、拉蒂诺病毒(latinovirus)、马丘波病毒(machupovirus)、奥利华斯病毒(oliverosvirus)、巴拉那病毒(paranávirus)、皮钦德病毒(pichindevirus)、皮里陶病毒(piritalvirus)、萨比亚病毒(sabiávirus)、塔卡里伯病毒(tacaribevirus)、他米阿米病毒(tamiamivirus)、白水阿罗约病毒(whitewaterarroyovirus)、西埃尔病毒(chaparevirus)及卢约病毒(lujovirus)。在一些情况下，病毒选自布尼亚病毒科成员(例如汉坦病毒属、内罗病毒属、正布尼亚病毒属和白蛉病毒属成员)，包括汉他病毒(hantaanvirus)、辛诺柏病毒(sinnombrevirus)、道格比病毒(dugbevirus)、布尼亚韦拉病毒(bunyamweravirus)、裂谷热病毒(riftvalleyfevervirus)、拉克罗斯病毒(lacrossevirus)、潘塔托若病毒(puntatorovirus，ptv)、加利福尼亚脑炎病毒(californiaencephalitisvirus)及克里米亚-刚果出血热(cchf)病毒。

在一些情况下，病毒选自丝状病毒科成员，包括埃博拉病毒(ebolavirus)(例如扎伊尔(zaire)、苏丹(sudan)、象牙海岸(ivorycoast)、莱斯顿(reston)和乌干达株)和马堡病毒(marburgvirus)(例如安哥拉(angola)、ci67、穆索科(musoke)、波普(popp)、拉夫恩(ravn)和维多利亚湖(lakevictoria)株)；披膜病毒科成员(例如甲病毒属成员)，包括委内瑞拉马脑炎病毒(vee)、东方马脑炎病毒(eee)、西方马脑炎病毒(wee)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、胜利基森林病毒(semlikiforestvirus)、罗斯河病毒、巴马森林病毒、奥-奈氏病毒(o'nyong'nyongvirus)和基孔肯雅病毒；痘病毒科(poxyiridaefamily)成员(例如正痘病毒属(orthopoxvirusgenus)成员)，包括天花病毒、猴痘病毒和牛痘病毒；疱疹病毒科(herpesviridaefamily)成员，包括单纯疱疹病毒(hsv；1、2和6型)、人疱疹病毒(例如7和8型)、巨细胞病毒(cmv)、埃-巴二氏病毒(epstein-barrvirus，ebv)、水痘-带状疱疹病毒和卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(kaposi'ssarcomaassociated-herpesvirus，kshv)；正黏病毒科成员，包括流感病毒(a、b和c型)，如h5n1禽流感病毒或h1n1猪流感；冠状病毒科(coronaviridaefamily)成员，包括重度急性呼吸综合症(sars)病毒；弹状病毒科(rhabdoviridaefamily)成员，包括狂犬病病毒(rabiesvirus)和水泡性口炎病毒(vsv)；副黏病毒科(paramyxoviridaefamily)成员，包括人呼吸道合胞病毒(rsv)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus)、亨德拉病毒(hendravirus)、尼帕病毒(nipahvirus)、麻疹病毒、牛瘟病毒(rinderpestvirus)、犬瘟热病毒(caninedistempervirus)、仙台病毒(sendaivirus)、人副流感病毒(例如1、2、3和4型)、鼻病毒和腮腺炎病毒；小rna病毒科成员，包括脊髓灰质炎病毒、人肠病毒(a、b、c和d型)、a型肝炎病毒和柯萨奇病毒(coxsackievirus)；嗜肝dna病毒科成员，包括b型肝炎病毒；乳头瘤病毒科成员，包括人乳头瘤病毒；微小病毒科成员，包括腺相关病毒；星状病毒科成员，包括星状病毒；多瘤病毒科成员，包括jc病毒、bk病毒和sv40病毒；杯状病毒科成员，包括诺瓦克病毒(norwalkvirus)；呼肠孤病毒科成员，包括轮状病毒；以及逆转录病毒科成员，包括人免疫缺陷病毒(hiv；例如1和2型)及i和ii型人嗜t淋巴细胞病毒(分别为htlv-1和htlv-2)。在一些实施方案中，病毒是寨卡病毒。

由寄生虫引起的示例性疾病或病况包括但不限于棘阿米巴感染(acanthamoebainfection)、棘阿米巴角膜炎感染、非洲睡眠病(非洲锥虫病)、滤泡棘球蚴病(alveolarechinococcosis)(棘球蚴病、包虫病(hydatiddisease))、阿米巴病(amebiasis)(溶组织内阿米巴感染)、美洲锥虫病(americantrypanosomiasis)(却格司氏病(chagasdisease))、钩虫病(ancylostomiasis)(钩虫)、管圆线虫病(angiostrongyliasis)(管圆线虫感染)、异尖线虫病(anisakiasis)(异尖线虫感染、假新地线虫感染(pseudoterranovainfection))、蛔虫病(蛔虫感染、肠蛔虫)、焦虫病(巴倍虫感染)(babesiosis(babesiainfection))、肠袋虫病(balantidiasis)(肠袋虫感染)、巴拉姆西亚阿米巴(balamuthia)、贝蛔虫病(baylisascariasis)(贝蛔虫感染、浣熊蛔虫)、臭虫、血吸虫病(bilharzia/schistosomiasis)、人芽囊原虫感染(blastocystishominisinfection)、体虱感染(bodyliceinfestation)(虱病(pediculosis))、毛细线虫病(capillariasis)(毛细线虫感染)、尾蚴性皮炎(cercarialdermatitis)(游泳痒(swimmer'sitch))、却格司氏病(美洲锥虫病)、迈氏唇鞭毛虫感染(chilomastixmesniliinfection)(非致病性[无害]肠原虫)、支睾吸虫病(clonorchiasis)(支睾吸虫感染)、clm(皮肤幼虫移行症(cutaneouslarvamigrans)、钩虫病、钩虫)、“蟹虱(crabs)”(阴虱)、隐孢子虫病(cryptosporidiosis)(隐孢子虫感染)、皮肤幼虫移行症(clm、钩虫病、钩虫)、环孢子虫病(cyclosporiasis)(环孢子虫感染)、囊虫病(cysticercosis)(神经系统囊虫病(neurocysticercosis))、囊等孢虫感染(cystoisosporainfection)(囊等孢虫病，以前称为等孢子球虫感染(isosporainfection))、脆弱双核阿米巴感染(dientamoebafragilisinfection)、裂头绦虫病(diphyllobothriasis)(裂头绦虫感染)、犬复孔绦虫感染(dipylidiumcaninuminfection)(狗或猫绦虫感染)、恶丝虫病(dirofilariasis)(恶丝虫感染)、dpdx、龙线虫病(dracunculiasis)(几内亚虫病(guineawormdisease))、饮用水病、狗绦虫(犬复孔绦虫感染)、棘球蚴病(囊性、滤泡性包虫病)、象皮病(elephantiasis)(丝虫病(filariasis)、淋巴丝虫病)、微小内蜒阿米巴感染(endolimaxnanainfection)(非致病性[无害]肠原虫)、大肠内阿米巴感染(entamoebacoliinfection)(非致病性[无害]肠原虫)、溶组织内阿米巴感染(entamoebadisparinfection)(非致病性[无害]肠原虫)、哈门氏内阿米巴感染(entamoebahartmanniinfection)(非致病性[无害]肠原虫)、溶组织内阿米巴感染(阿米巴病)、波列基内阿米巴(entamoebapolecki)、蛲虫病(enterobiasis)(蛲虫感染)、片吸虫病(fascioliasis)(片吸虫感染)、姜片虫病(fasciolopsiasis)(姜片虫感染)、丝虫病(淋巴丝虫病、象皮病)、食源性疾病、贾第鞭毛虫病(giardiasis)(贾第鞭毛虫感染)、颚口线虫病(gnathostomiasis)(颚口线虫感染)、几内亚虫病(龙线虫病)、头虱感染(头虱病(pediculosis))、异形吸虫病(heterophyiasis)(异形吸虫感染)、钩虫感染、人钩虫感染、人畜共生病(zoonotic)(钩虫病、皮肤幼虫移行症[clm])、包虫病(囊性、滤泡性棘球蚴病)、膜壳绦虫病(hymenolepiasis)(膜壳绦虫感染)、肠蛔虫(蛔虫病、蛔虫感染)、嗜碘阿米巴感染(iodamoebabuetschliiinfection)(非致病性[无害]肠原虫)、等孢子球虫感染(囊等孢虫感染)、黑热病(kala-azar)(利什曼体病、利什曼原虫感染)、角膜炎(棘阿米巴感染)、利什曼体病(黑热病、利什曼原虫感染)、虱感染(体虱、头虱或阴虱、虱病、阴虱病(pthiriasis))、罗阿丝虫病(loiasis)(罗阿罗阿丝虫感染(loaloainfection))、淋巴丝虫病(丝虫病、象皮病)、疟疾(疟原虫感染)、微孢子虫病(microsporidiosis)(微孢子虫感染)、螨感染(疥疮)、蝇蛆病(myiasis)、纳氏虫感染(naegleriainfection)、神经系统囊虫病(囊虫病)、美国被忽略的寄生虫感染(neglectedparasiticinfections)、被忽略的热带疾病、非致病性(无害)肠原虫、眼幼虫移行症(ocularlarvamigrans)(弓蛔虫病(toxocariasis)、弓蛔虫感染、内脏幼虫移行症)、盘尾线虫病(onchocerciasis)(河盲症)、后睾吸虫病(opisthorchiasis)(后睾吸虫感染)、并殖吸虫病(paragonimiasis)(并殖吸虫感染)、虱病(头虱或体虱感染)、阴虱病(阴虱感染)、蛲虫感染(蛲虫病)、疟原虫感染(疟疾)、杰氏肺囊虫肺炎(pneumocystisjiroveciipneumonia)、假新地线虫感染(异尖线虫病、异尖线虫感染)、阴虱感染(“蟹虱”、阴虱病)、浣熊蛔虫感染(贝蛔虫病、贝蛔虫感染)、戏水病(recreationalwater)、河盲症(盘尾线虫病)、匀变阿米巴(sappinia)、疥疮、血吸虫病(血吸虫病(bilharzia))、睡眠病(非洲锥虫病；非洲睡眠病)、土壤传播的蠕虫病、类圆线虫病(strongyloidiasis)(类圆线虫感染)、游泳池游泳痒(尾蚴性皮炎)、绦虫病(taeniasis)(绦虫感染(taeniainfection/tapeworminfection))、绦虫感染(绦虫病、绦虫感染)、弓蛔虫病(弓蛔虫感染、眼幼虫移行症、内脏幼虫移行症)、弓形虫病(toxoplasmosis)(弓形虫感染)、旋毛虫病(trichinellosis)(旋毛虫病(trichinosis))、旋毛虫病(旋毛虫病(trichinellosis))、毛滴虫病(trichomoniasis)(毛滴虫感染)、鞭虫病(trichuriasis)(鞭虫感染(whipworminfection/trichurisinfection))、非洲锥虫病(非洲睡眠病、睡眠病)、美洲锥虫病(却格司氏病)、内脏幼虫移行症(弓蛔虫病、弓蛔虫感染、眼幼虫移行症)、水媒病、鞭虫感染(鞭虫病、鞭虫感染)、人畜共生病(由动物扩散到人的疾病)、人畜共生钩虫感染(钩虫病、皮肤幼虫移行症[clm])。

寄生虫的非限制性实例包括刚地弓形虫(toxoplasmagondii)、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(p.vivax)、卵形疟原虫(p.ovale)、三日疟原虫(p.malariae)、锥虫属和军团杆菌属、肉足虫纲(sarcodina)(例如内阿米巴属)、鞭毛亚门(mastigophora)(例如贾第鞭毛虫属、利什曼原虫属)、纤毛虫门(ciliophora)(例如肠袋虫属(balantidium))及孢子亚门(sporozoa)(例如疟原虫属、隐孢子虫属)。

检测微生物的存在或不存在可以包括检测针对一种或多种微生物抗原，如在呈阵列形式的基底上展示的抗原的抗体的存在或不存在。

亲合力分析

在某些实施方案中，本公开还提供了对黄病毒和甲病毒抗原的亲合力测量方法。本文所描述的用于检测免疫球蛋白的方法中的任一种还可以包括亲合力步骤，例如用尿素或其它变性剂进行的洗涤步骤，用于去除低亲合力抗体。在亲合力分析中，所述测量方法可以实现生物样品中抗体的定性或定量检测。在某些实施方案中，生物样品可以分成数部分，例如第一和第二部分，其中生物样品的第一部分使用本文所描述的用于检测免疫球蛋白的方法进行评价，并且第二部分用相同方法且还用附加的亲合力洗涤步骤，例如用蛋白质变性剂如尿素进行的洗涤步骤测试。存在的蛋白质变性剂的浓度可以足以使含有低亲合力抗体的免疫复合物不稳定，但不足以使含有高亲合力抗体的免疫复合物不稳定。可以比较所述两个部分的生物样品中的抗原-抗体结合以评价生物样品中抗体的亲合力，例如第二部分与第一部分的抗体-抗原结合结果的比率。抗原-抗体结合可以通过本领域中已知用于评价这些相互作用的多种方法测定。

在某些实施方案中，本文所描述的用于评价生物样品中抗体的亲合力的方法可以包括使生物样品与抗原接触以形成免疫复合物。抗原可以结合，例如非共价结合至基底。在某些实施方案中，基底选自本文所描述的基底中的任一种，例如等离子体基底、多孔基底、珠粒等。

在某些实施方案中，免疫复合物可以用亲合力洗涤剂，例如含有蛋白质变性剂的缓冲溶液洗涤。在某些实施方案中，亲合力洗涤可以包括将所述免疫复合物与蛋白质变性剂一起培育至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟、至少约15分钟、至少约16分钟、至少约17分钟、至少约18分钟、至少约19分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟或至少约40分钟。在某些实施方案中，蛋白质变性剂可以培育选自本文所描述的任何两个值的范围，例如从约5分钟到约10分钟、从约10分钟到约20分钟或从约1分钟到约25分钟的持续时间。培育之后可以是冲洗步骤，用以去除所述蛋白质变性剂，以及未结合的和低亲合力的抗体。蛋白质变性剂可以选自甲酰胺、胍、水杨酸钠、二甲亚砜、丙二醇、尿素及其组合。蛋白质变性剂可以是尿素。蛋白质变性剂可以是包含约1m到约20m尿素，如约5m到约15m尿素，如约8m到约12m尿素，以及缓冲液，如磷酸盐缓冲生理盐水吐温溶液-20(phosphatebufferedsalinetweensolution-20，pbst)的溶液。

用亲合力洗涤剂洗涤的免疫复合物可以与偶合至荧光团，例如irdye680或irdye800的抗人抗体一起培育。偶合至荧光团的抗人抗体可以是抗人igg-irdye680。经过洗涤的免疫复合物可以与偶合至荧光团的抗人抗体一起培育至少约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟或40分钟。在一些情况下，经过洗涤免疫复合物可以与偶合至荧光团的抗人抗体一起培育在本文所描述的任何两个值之间，例如在约5分钟到10分钟之间、在约10分钟到约20分钟之间或在约1分钟到约25分钟之间的持续时间。在每个培育程序之间可以用洗涤缓冲液洗涤各孔。此外，可以将参考样品施加于单独孔。参考样品可以是血清样品，即对抗原呈阳性的igg、igm、iga。参考样品还可以是具有阴性igg、igm和iga结合至抗原的血清样品。参考样品可以不用蛋白质变性剂处理。

可以用于本文所描述的方法中的检测抗体-抗原结合的方法包括例如酶免疫分析、放射免疫分析、蛋白质印迹或免疫荧光分析。在某些实施方案中，本文所描述的方法，如用于评价生物样品中抗体的亲合力的方法，可以包括检测结合至黄病毒或甲病毒抗原的抗体。

如所论述，生物样品中抗体的亲合力，例如针对寨卡抗原的igg亲合力，可以通过比较在无洗涤步骤的本公开的方法之后与在有亲合力洗涤步骤的相同方法之后所述抗体与抗原，例如igg与寨卡抗原的结合来测定。在某些实施方案中，将生物样品分成数部分，由此用本文所描述的方法测试第一部分中抗体与抗原的结合，例如igg与寨卡抗原的结合，并且遵循与第一部分相同的方法且另外包括用以去除低亲合力抗体的洗涤步骤，测试第二部分中抗体与抗原的结合，例如igg与寨卡抗原的结合。在某些实施方案中，第二部分与第一部分中抗原与抗体，例如igg与寨卡抗原的结合的比率是约0.1或更小、约0.2或更小、约0.3或更小、约0.4或更小，或约0.5或更小。亲合力值是约0.5或更小可以视为低亲合力。在某些实施方案中，第二部分与第一部分中抗原与抗体，例如igg与寨卡抗原的结合的比率大于约0.5、大于约0.6、大于约0.7、大于约0.8或大于约0.9。亲合力值大于约0.5可以视为高亲合力。亲合力值可以在0到1的范围内，或例如，亲合力值是0可以指示在蛋白质变性剂处理之后igg结合完全丧失。亲合力值是1可以指示在蛋白质变性剂处理之后igg结合无损失。

亲合力测量值可以用于诊断受试者患有急性感染还是慢性感染。当亲合力较低时，受试者可以被诊断患有急性感染，即近期感染。当亲合力较高时，受试者可以被诊断患有慢性感染，即旧有感染。被诊断患有近期感染的受试者可能已感染至多约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天或30天的时间。受试者可能已感染选自本文所描述的两个值的范围，例如从约1天到约7天、从约8天到约15天或从约1天到约15天的时间。被诊断患有慢性感染的受试者可能已感染至少约15天、20、天25、天30、天35、天40、天45、天50、天55、天60、天65、天70、天75、天80、天85、天90、天95、天100天或150天的时间。在某些实施方案中，受试者可能已感染选自本文所描述的两个值的范围，例如在约16天到约50天之间、约51天到约100天之间或约16天到约100天之间的时间。

基底

在某些方面，检测生物样品中的生物标记物可以用结合至基底，例如具有金属膜的基底的结合元件执行。在本发明方法中使用基底，如美国专利公开第20160146799号和第20130172207号中所描述的基底，使检测病毒感染具有高灵敏度和特异性并且能够测试少量(例如微升体积)生物样品并实现生物样品的便捷实时测试，而不需要运送到商业实验室。

在某些实施方案中，本公开提供了具有金属膜的基底。所述膜的特征还在于，所述膜的纳米结构包含银或金纳米粒子；各纳米结构通过间隙彼此分离；以及邻近所述膜的荧光团的荧光信号强度相对于在无所述膜存在下从邻近基底的荧光团获得的荧光信号有所增强。膜可以直接或间接地施加到基底。对于某些应用，纳米结构包含在第二金属的纳米粒子上的第一金属，其中所述第一和第二金属可以相同或不同(例如载金的金或载银的金)。纳米结构可以由至少一种类型的贵金属形成，例如钌(ru)、铑(rh)、钯(pd)、银(ag)、锇(os)、铱(ir)、铂(pt)和金(au)。纳米结构可以呈各种形状，例如球体、立方体、长方体、锥形、圆柱形、棱柱形、锥形、管状、板状、盘状、杆状或任何规则或不规则的形状。在一些情况下，纳米结构包含纳米粒子。在纳米结构中包括多于一种类型的金属的情况下，所述金属可以形成层状或核/壳结构，例如载银的金纳米粒子。在一些情况下，各纳米结构具有相同的形状。在一些情况下，具有不同形状(或不均匀)的纳米结构可以是优选的。

纳米结构的大小(例如长度、宽度、高度等)可以取决于使用所述纳米结构的应用而变化。例如，可能优选的是，具有比用于荧光激发和发射的光的波长小得多的纳米结构。在一些情况下，纳米结构的宽度、长度和/或高度可以小于或等于约1毫米(mm)，如小于或等于约750微米(μm)、500μm、250μm、100μm、75μm、50μm、25μm、10μm、5μm、1μm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、800皮米(pm)、600pm、400pm、200pm、100pm、75pm、50pm、25pm或10pm。在一些情况下，纳米结构的宽度、长度和/或高度可以大于或等于约1pm、5pm、10pm、25pm、50pm、75pm、100pm、250pm、500pm、750pm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、5μm、10μm、30μm、50μm、70μm、90μm、110μm、130μm、150μm、200μm、400μm、600μm、800μm或1mm。在一些情况下，纳米结构的宽度、长度和/或高度可以选自本文所描述的任何两个值的范围，例如，所述纳米结构可以具有约50nm到约500nm，或约100nm到约200nm的平均宽度和长度。

膜的高度可以是约5nm到500nm，如约30nm到约400nm、约5nm到约300nm、约5nm到约250nm、约5nm到约200nm、约5nm到约150nm、约5nm到约100nm。

所述纳米结构的截面积可以是至少约0.001nm²、0.005nm²、0.01nm²、0.05nm²、0.075nm²、0.1nm²、0.5nm²、0.75nm²、1nm²、10nm²、20nm²、40nm²、60nm²、80nm²、100nm²、250nm²、500nm²、750nm²、1,000nm²、2,500nm²、5,000nm²、7,500nm²、10,000nm²、25,000nm²、50,000nm²、75,000nm²、100,000nm²、200,000nm²、300,000nm²、400,000nm²、500,000nm²、600,000nm²、700,000nm²、800,000nm²、900,000nm²、1,000,000nm²、2,500,000nm²、5,000,000nm²、7,500,000nm²或10,000,000nm²。在一些情况下，所述纳米结构的截面积可以小于或等于约25,000,000nm²、10,000,000nm²、8,000,000nm²、6,000,000nm²、4,000,000nm²、2,000,000nm²、1,000,000nm²、800,000nm²、600,000nm²、500,000nm²、450,000nm²、400,000nm²、350,000nm²、300,000nm²、250,000nm²、200,000nm²、150,000nm²、100,000nm²、80,000nm²、60,000nm²、50,000nm²、40,000nm²、30,000nm²、20,000nm²、10,000nm²、8,000nm²、6,000nm²、4,000nm²、2,000nm²、1,800nm²、1,600nm²、1,400nm²、1,200nm²、1,000nm²、900nm²、800nm²、700nm²、600nm²、500nm²、400nm²、300nm²、200nm²、100nm²、90nm²、80nm²、70nm²、60nm²、50nm²、40nm²、30nm²、20nm²、10nm²、8nm²、6nm²、4nm²、2nm²、1nm²、0.75nm²、0.5nm²、0.25nm²、0.1nm²、0.075nm²、0.05nm²、0.025nm²、0.01nm²、0.0075nm²、0.005nm²、0.0025nm²、0.001nm²、0.0005nm²或0.0001nm²。在一些情况下，所述纳米结构的截面积可以选自本文所描述的任何两个值的范围，例如约100nm²到约250,000nm²、约1,000nm²到约250,000nm²、约100nm²到约40,000nm²、约100nm²到约35,000nm²、约100nm²到约30,000nm²或约500nm²到约40,000nm²。

所述纳米结构的表面积可以选自约100nm²到约250,000nm²、约1,000nm²到约250,000nm²、约100nm²到约40,000nm²、约100nm²到约35,000nm²、约100nm²到约30,000nm²或约500nm²到约40,000nm²。

在一些情况下，膜中包含的纳米结构各自可以具有相同的形状、结构和/或大小。在一些情况下，所述纳米结构可具有不同的大小、形状和/或结构。取决于应用，可能优选的是，一定百分比的纳米结构具有相同或不同的大小、形状和/或结构，例如约1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的纳米结构可以具有相同或不同的大小、形状和/或结构。

纳米结构可以或可以不彼此分隔开。在纳米结构彼此分隔开的情况下，其可以通过间隙分隔开。间隙距离，即纳米结构之间的距离可以变化。在一些情况下，可以产生较大的间隙距离。在其它情况下，可以使用较小的间隙距离。较大和较小的间隙可以在同一膜内的不同位置构造。在一些情况下，间隙距离或平均间隙距离可以小于或等于约1mm，如小于或等于约750μm、500μm、250μm、100μm、75μm、50μm、25μm、10μm、7.5μm、5μm、2.5μm、1μm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.75nm、0.5nm、0.25nm、0.1nm、0.075nm、0.05nm、0.025nm、0.01nm、0.0075nm、0.005nm、0.0025nm或0.001nm。在一些情况下，间隙距离可以是至少约0.0001nm、0.0005nm、0.001nm、0.005nm、0.01nm、0.05nm、0.1nm、0.5nm、1nm、5nm、7.5nm、10nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、25μm、50μm、75μm、100μm、500μm及750μm。在一些情况下，间隙距离可以选自本文所描述的两个值的范围，例如约1nm到约1,000nm、约10nm到约200nm、约10nm到约100nm或约10nm到约80nm。

间隙可以具有不同的宽度和/或长度。例如，间隙具有的宽度和/或长度可以小于或等于约5,000nm、4,000nm、3,000nm、2,000nm、1,000nm、800nm、600nm、400nm、200nm、100nm、80nm、60nm、40nm、20nm、10nm、7.5nm、5nm、1nm、0.75nm、0.5nm、0.25nm、0.1nm、0.05nm、0.01nm、0.005nm或0.001nm。在一些情况下，间隙的宽度和/或长度可以大于或等于约0.005nm、0.0075nm、0.01nm、0.05nm、0.075nm、0.1nm、0.5nm、0.75nm、1nm、2.5nm、5nm、7.5nm、10nm、30nm、50nm、70nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、750nm、1,000nm、2,500nm或5,000nm。在一些情况下，间隙的宽度和/或长度可以在选自本文所描述的任何两个值的范围内，例如，所述间隙可以具有约5nm到约50nm的宽度和约5nm到约200nm的长度。

如本文所提供，取决于膜中所包含的纳米结构的相互连接，膜可以是连续、准连续或不连续的。例如，所述膜可以是连续膜，由此其包含相互连接的隆起的纳米结构，产生导电路径，其中在一些纳米结构之间存在的间隙不在导电路径中。相比之下，膜可以是不连续的，由此纳米结构所包含的膜的至少一部分(例如至少10％、25％、50％、75％、90％或更高百分比)不是通过导电路径连接。

本公开中所提供的膜的特征(例如膜中所包含的纳米结构的大小、尺寸和/或结构)和特性(例如纳米结构的粗糙度、厚度、连续性、导电性和/或相互连接)可以通过各种技术，例如导电性测量和/或显微镜检查技术，包括标准光学显微镜检查、透射电子显微镜检查(tem)、共聚焦激光扫描显微镜检查、扫描电子显微镜检查(sem)和原子力显微镜检查(afm)测定和表征。例如，准连续穿过浸透路径和传导的膜可以基于电子显微镜检查成像和/或导电性测定。在一些实例中，不连续膜可以基于电子显微镜检查成像和导电性表征。

本公开的膜可以具有选自约500nm到约2μm、约600nm到约1000nm、约700nm到约1000nm或约700nm到约900nm的等离子体共振峰。

如本文所提供，可以使用各种材料制造基底。例如，所述材料可以是有机或无机、合成或天然、固体或半固体的。可以用于形成基底的材料的非限制性实例可以包含玻璃、银、石英、塑料、硝化纤维素、硅基材料(例如硅、二氧化硅)、聚合物(例如聚苯乙烯、尼龙、聚多巴胺(pda)、聚氯乙烯(pvc)、聚(二甲基硅氧烷)(pdms)、聚偏二氟乙烯等)、生物分析或任何多路复用平台，或其组合。

基底可以具有不同形状，例如3维或2维、规则或不规则、均匀或不均匀形状。在一些情况下，基底的侧面形状可以是圆形、正方形、矩形、多边形、椭圆形、细长棒状、多边形或任何其它规则或不规则形状，或其组合。例如，在一些情况下，所述基底是珠粒或条形码。基底可以是磁珠(例如包含磁性或顺磁性核的珠粒)，此可以有助于后续分离和检测程序。基底还可以包含平坦表面、弯曲表面、球状表面或三维多孔膜。在一些情况下，所述基底可以是在一些情况下，包含聚苯乙烯的多孔板的孔的内部。在一些情况下，所述基底可以是多孔板的所有孔。

在一些情况下，所述基底是珠粒。珠粒可以由多种材料中的任一种(例如本文所描述的基底材料)制造，并且一些种类是可商购的。在一些实施方案中，所述珠粒的平均直径是至少约0.001微米(例如0.005微米、0.01微米、0.05微米、0.1微米、1微米、10微米、50微米、100微米、250微米、500微米或更大)；小于约500微米(例如400微米、200微米、100微米、50微米、25微米、10微米、1微米或更小)；或在这些中的任一个之间(例如在约0.01微米到约10微米、约0.05微米到约500微米、约0.1微米到200微米或约0.1微米到约8微米的范围内)。珠粒可以提供于容器中，如在管或多孔板的孔中。与本文所描述的其它基底中的任一种相同，珠粒和/或珠粒上的膜可以偶联至一个或多个结合元件，如单一结合元件的多个拷贝，或多个不同的结合元件。在一些情况下，珠粒还被安置于支撑物如多孔基底材料中或所述支撑物上。多种多孔基底是可利用的，其选择可以取决于具体应用、珠粒的大小等。用作珠粒支撑物的多孔膜的非限制性实例包括硝化纤维素、水凝胶、3d聚合物、玻璃纤维、尼龙或乙酸纤维素。

利用本公开的膜，邻近膜的荧光分子(例如荧光团)的荧光信号强度相对于在无所述膜存在下获得的荧光信号可以有所增强。荧光信号的此类增强可以通过增强因子表征或定量，增强因子定义为在所述膜存在下获得的荧光信号与在无所述膜存在下获得的相同信号的比率。例如，如果在存在和不存在所述膜下，荧光信号分别是410和15，则增强因子是约27。借助于本文中提供的膜，在400nm到2100nm范围内的荧光信号可以取决于例如荧光信号的波长、膜的特征和特性等而增强变化的增强因子。例如，通过使用本公开的膜，可以使具有约700nm到约800nm的发射的近红外荧光信号的强度增强约30倍或更大倍数(例如至少50倍、100倍、250倍、500倍或更大倍数)。在一些实例中，具有约400nm到约700奈米的发射的可见光染料的荧光信号强度可以增强约3倍或更大倍数(例如至少5倍、10倍、25倍、50倍、100倍或更大倍数)。在一些情况下，所述膜的荧光信号的荧光增强至多约1,000倍、800倍、700倍、600倍、500倍、400倍、300倍、200倍、100倍、90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4倍、3倍或2倍。在一些情况下，通过利用本公开的膜，荧光信号的强度可以增强至少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍或1,000倍。在一些情况下，增强因子可以选自本文所描述的两个值的范围，例如约10到30倍或约100到200倍。在一些情况下，波长是至少300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1200nm、1400nm、1600nm、1800nm、2000nm或更大；小于2200nm、2000nm、1800nm、1600nm、1400nm、1200nm、1000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm或更短；或波长在这些值中任一个之间，如在300nm到2200nm、400nm到800nm、500nm到900nm或800nm到1400nm之间的范围内的荧光信号获得增强。

在一些情况下，荧光分子可以是荧光共振能量转移(fret)对的成员并且fret被用于产生可以与结合元件和分析物的结合相关的信号。fret是由某些荧光团的特性引起。此类由所述对的一个或两个成员产生的信号在如本文所提供的膜存在下可以得到增强。可以用于fret中的分子可以包括以上描述的荧光团，并且包括荧光素、5-羧基荧光素(fam)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(joe)、罗丹明、6-羧基罗丹明(r6g)、n,n,n',n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)、6-羧基-x-罗丹明(rox)、4-(4'-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(dabcyl)和5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(edans)。

在一些情况下，fret对的受体用于淬灭供体的荧光。在一些情况下，所述受体具有极少乃至无荧光。可用于淬灭的fret受体称为淬灭剂。可用于本发明的方法中的淬灭剂包括但不限于blackholequencher染料(biosearchtechnologies，如bhq-0、bhq-1、bhq-2、bhq-3、bhq-10；qsy染料荧光淬灭剂(来自molecularprobes/invitrogen)，如qsy7、qsy9、qsy21、qsy35，以及其它淬灭剂，如dabcyl和dabsyl；cy5q和cy7q及dark花青染料(gehealthcare)，这些淬灭剂可以例如与供体荧光团如cy3b、cy3或cy5结合使用；dy-quenchers(dyomics)，如dyq-660和dyq-661；以及atto荧光淬灭剂(atto-tecgmbh)，如atto540q、580q、612q。

在某些方面，本公开提供了用于检测生物样品中的抗体的结合至基底的结合元件，例如寨卡抗原。在某些实施方案中，除抗原结合元件外，本公开的基底可以包含另外的结合元件。所述多个结合元件可以是结合元件阵列。所述结合元件阵列可以是微阵列。在一些实施方案中，所述多个结合元件与膜直接或间接地接触，如借助于直接附接或间接附接至与所述膜附接的中间物。结合元件可以在膜的顶部上。结合元件可以在所述膜的下部。在一些情况下，结合元件可以附接至基底并且间接地接触所述膜。例如，基底可以在所述膜与结合元件之间包含抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素层。结合元件可以通过连接分子(或连接子)附接至基底。连接子可以是能够将结合元件与基底连接在一起的任何类型的分子(例如化学或生物分子)。在一些情况下，连接子是化学键。例如，结合元件可以共价附接至基底的表面。

可以将多种不同的化学表面改性剂添加至基底以将结合元件，例如寨卡抗原附接至基底。化学表面改性剂的实例可以包括但不限于n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)基团、胺、醛、环氧基、羧基、羟基、酰肼、疏水性基团、膜、顺丁烯二酰亚胺、生物素、抗生蛋白链菌素、硫醇基、镍螯合剂、光反应性基团、硼基、硫酯、半胱氨酸、二硫基、烷基及酰卤基、谷胱甘肽、麦芽糖、叠氮基、磷酸酯、膦及其组合。在一种情况下，可以利用对胺具有反应性的基底表面。此类表面的实例可以包括nhs-酯、醛、环氧化物、酰基卤化物和硫酯。具有游离氨基的分子(例如蛋白质、肽、糖肽)可以与此类表面反应以与表面形成共价键。还可以合成(例如由idt或操纵子)具有内部或末端氨基的核酸探针并使用类似化学试剂将其结合(例如共价或非共价)至表面。

在一些情况下，可以通过额外层，例如在所述膜上的自组装单层将大量捕捉剂或结合元件附接至膜。在一些实例中，将亲水性聚合物(例如聚乙二醇(peg))或葡聚糖连接至膜上的自组装单层，其中结合元件(例如生物分子)被连接至亲水性聚合物或葡聚糖。

取决于具体应用，本文所提供的结合元件，例如寨卡抗原可以被设计或选择成结合至一种或多种特定分析物，例如寨卡抗体，其结合亲和力大于它结合至样品中所含其它物质的亲和力。结合元件与分析物之间的结合可以通过不同类型的分子识别机制，例如杂交实现。结合强度可以称为“亲和力”。生物分子之间的亲和力可以受非共价分子间相互作用，包括例如氢键结、疏水性相互作用、静电相互作用和范德华力(vanderwaalsforce)影响。在一些情况下，例如对于多路复用分析，涉及多种分析物和结合元件。例如，实验可以涉及测试多个不同核酸分子之间或不同蛋白质之间的结合。在此类实验中，分析物可以优选结合至对其具有较高亲和力的结合元件。在一些情况下，多个结合元件可以被配置用于偶联至不同已知位置处的膜并且所述结合元件各自结合至不同分析物。例如，阵列可以包含至少2个(例如至少10、25、50、100、1000、5000、10000或更多个)不同结合元件，这些结合元件各自对不同分析物(例如不同聚核苷酸序列、不同蛋白质和/或不同抗体)具有结合特异性。基于检测到的荧光信号的位置，可以鉴别分析物。

结合可以例如是受体-配体、酶-底物、抗体-抗原或核酸杂交相互作用。结合元件/分析物结合对可以是核酸与核酸，例如dna/dna、dna/rna、rna/dna、rna/rna、rna。结合元件/分析物结合对可以是多肽和核酸，例如多肽/dna和多肽/rna，如序列特异性dna结合蛋白。结合元件/分析物结合对可以是能够进行序列特异性dna或rna识别的任何核酸，包括合成dna/rna结合配体(如聚酰胺)。结合元件/分析物结合对可以包含天然结合化合物，如天然酶和抗体，以及合成结合化合物。结合元件/分析物结合可以包含适体，适体是通常通过重复数轮体外选择或等效地通过指数式富集进行的配体系统进化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)工程改造成具有特异性结合特性的核酸或多肽物种。

本公开的基底可以包括用于检测样品中另外的生物标记物的另外的结合元件。本文所提供的结合元件可以是任何类型的有机或无机分子或化合物，例如生物分子。在一些情况下，结合元件和/或分析物包含蛋白质、肽、抗体、抗原结合抗体片段、多糖、酶、适体、核酸、抗原、细胞、组织或致病剂，如病毒、细菌、真菌、原虫和蠕虫。在一些情况下，所述蛋白质可以来源于细胞或组织溶解产物、体液或其它样品源，如在逆相蛋白质阵列分析的情况下。例如，结合元件和/或分析物可以是用于检测样品中的抗体的抗原。抗体的非限制性实例包括总人igg、igm、iga和ige；抗hla(人白细胞抗原)抗体；抗dsdna抗体；抗史密斯抗体(anti-smithantibody)；诊断全身性红斑性狼疮症(sle)、弓形虫病、风疹、狂犬病、疟疾、莱姆病(lymedisease)、非洲锥虫病、霍乱、隐孢子虫病、登革热、流感、日本脑炎、利什曼体病、麻疹、脑膜炎、盘尾线虫病、肺炎、肺结核、伤寒或黄热病的抗体；对巨细胞病毒(cmv)、刚地弓形虫、风疹病毒、单纯疱疹病毒1和2(hsv-1/2)、抗血红蛋白α(hba)、b型肝炎病毒(hbv)、c型肝炎病毒(hcv)、d型肝炎病毒(hdv)、人免疫缺陷病毒(hiv)、人乳头瘤病毒(hpv)、埃博拉病毒、轮状病毒、人白细胞抗原、促甲状腺激素受体(tshr)、甲状腺过氧化物酶、甲状腺球蛋白、组织型谷氨酰胺转氨酶(ttg)、肌内膜、脱酰胺麦胶蛋白肽具有特异性的抗体；对选自p53、ny-eso-1、magea4、hud、cage、gbu4-5和sox2的肿瘤相关抗原具有特异性的抗体；或其组合。如在torch分析的情况下，可以在单一分析中评估多种诊断抗体，如针对刚地弓形虫、风疹、巨细胞病毒(cmv)和单纯疱疹病毒(hsv)的抗体。torch感染是引起新生儿显著发病和死亡的一组先天性获得性感染。这些感染是从母体获得并且经胎盘或在出生过程中传播。尽管每种感染不同，但有关这些感染如何存在有许多相似性。重要的是，每当新生儿出现子宫内生长受限(iugr)、小头畸形、颅内钙化、结膜炎、听力损失、皮疹、肝脾肿大或血小板减少时，都应考虑torch感染。尽管以上提到五类经典感染，但也可以评估(例如通过相同结合反应)其它类别的感染，如人免疫缺陷病毒(hiv)、水痘带状疱疹病毒(vzv)、疱疹、梅毒、细小病毒b19、肠道病毒等。torch分析的抗体的实例可以包括但不限于刚地弓形虫抗体、免疫球蛋白g(igg)；风疹抗体、igg；1型和/或2型单纯疱疹病毒抗体、igg；巨细胞病毒抗体、igg；刚地弓形虫igm抗体、免疫球蛋白m(igm)；风疹抗体、igm；1型和/或2型单纯疱疹病毒抗体、igm；以及巨细胞病毒抗体、igm。在典型torch分析中，结合元件是抗原(例如一种或多种刚地弓形虫抗原、一种或多种风疹抗原、一种或多种cmv抗原和一种或多种hsv抗原)并且分析物是针对一种或多种抗原的抗体。

一般来说，诊断给定病况的抗体是结合与所述病况有关的分子的抗体。在感染的情况下，抗体可以是结合感染物的蛋白质，如病毒衣壳蛋白或细菌细胞表面蛋白的抗体。在一些情况下，抗原是感染物或其组分。在疾病是自体免疫病症的情况下，抗体可以是自身抗体，并且抗原是人蛋白质或其部分。

如本公开中所提供，结合元件和/或分析物中的任一种可以用一个或多个报导分子(或标记)标记。标记可以包含荧光分子。包含荧光分子的结合元件与分析物的结合可以产生荧光信号，所述荧光信号在本公开的膜存在下可以增强。在一些情况下，结合元件和/或分析物可以用一次抗体标记，所述一次抗体可以被包含至少一个荧光分子的二次抗体结合。接着，结合元件与分析物之间结合事件的发生可以产生荧光信号，所述荧光信号在膜存在下可以增强。

在一些情况下，结合元件是可以用于捕捉、标记或以其它方式检测分析物的抗体，例如抗人iga或抗人igg抗体。“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至目标，如碳水化合物、聚核苷酸、脂质、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文所使用，所述术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖其片段(如fab、fab′、f(ab′)2、fv)、单链(scfv)、其突变体、包含抗体部分(如结构域抗体)的融合蛋白以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰配置。抗体包括任何类别的抗体，如igg、iga或igm(或其子类)，并且抗体不必属于任何特定类别。取决于抗体重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同类别。免疫球蛋白存在五个主要类别：iga、igd、ige、igg和igm，并且这些类别中有几类可以进一步分成子类(同型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。

抗体可以是单克隆抗体。如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从大体上均质的抗体群获得的抗体，即，构成所述群体的个别抗体除了可能少量存在的可能天然存在的突变外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。此外，相对于典型地包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰语“单克隆”指示如从大体上均质的抗体群获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过最先由kohler和milstein,1975,《自然(nature)》,256:495所描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过如美国专利第4,816,567号中所描述的重组dna方法制备。单克隆抗体还可以从使用例如mccafferty等人,1990,《自然》,348:552-554中所描述的技术产生的噬菌体库分离。

本公开的基底可以适用于较宽的应用。利用荧光检测的任何方法或技术可以在如本文所提供的应用的范围内。应用的实例包括但不限于，利用或不利用多路复用，通过直接和间接荧光抗体技术进行检测的蛋白质、核酸和抗体的微阵列；基因测序；包括荧光原位杂交(fish)的体外诊断；免疫组织化学染色(ihc)；用于ihc染色和fish的核外体捕捉；无细胞dna捕捉和定量分析；化学成像(例如中红外化学成像、近红外化学成像、拉曼化学成像(ramanchemicalimaging)、荧光成像(紫外光、可见光和近红外区))；荧光强度衰减形状显微镜检查(fluorescenceintensitydecayshapemicroscopy，fidsam)；荧光各向异性；荧光相关光谱法(fluorescencecorrelationspectroscopy，fcs)；荧光图像引导式手术(fluorescenceimage-guidedsurgery，figs)；光漂白荧光损失(fluorescencelossinphotobleaching，flip)；晶格层光显微镜检查；免疫荧光分析(ifa)；单分子宽场成像；超分辩率成像技术，如受激发射损耗(stimulatedemissiondepletion，sted)和单分子定位(palm/storm)；通过宽场、共聚焦扫描仪和激光扫描细胞测量仪器进行的细胞和组织成像；酶连接免疫斑点(elispot)；基于荧光共振能量转移(fret)的成像；基于光漂白后的荧光恢复(frap)的成像；用于循环肿瘤细胞(ctc)的成像基质；用于单分子和单纳米粒子成像，以及用于基于荧光的抗原、抗体、肽、dna、rna、适体、组织、细胞微阵列和逆相微阵列的成像基质，或其组合。

本公开的一些方面提供了检测一种或多种分析物的方法。所述方法可以包括：(a)提供如本文中所描述的膜；(b)将分析物和所述分析物的标记施加于所述膜，其中所述标记可以包含荧光分子(例如荧光团)并且所述分析物可以或可以不结合至所述标记；并且(c)通过检测所述荧光分子的荧光信号来检测所述分析物，其中所述荧光信号的强度相对于在无所述膜存在下的荧光信号可以有所增强。可以使用各种方法和技术检测荧光信号，例如荧光光谱法(或荧光测定法、分光荧光法)、荧光显微镜、荧光扫描仪和流式细胞仪。在一些实例中，荧光信号的检测可以包括通过显微镜检查进行成像。一般来说，检测一种或多种分析物的方法还可以包括将受试者诊断为患有与所述一种或多种分析物的存在、不存在或含量有关的病况。例如，在检测到生物标记物以确定来自受试者的样品中感染物的存在之后可以是将受试者诊断为感染感染物或诊断为感染物携带者。同样，取决于所分析的一种或多种生物标记物，在检测到一种或多种癌症相关生物标记物之后可以是诊断癌症，诸如此类。本文中提供了此类生物标记物的多个实例。在一些情况下，方法还可以包括基于检测到一种或多种分析物和/或由此作出的诊断，采取医疗措施。医疗措施可以包括治疗性干预以及测试。检测可以包括检测包含结合元件、结合至所述结合元件的分析物和荧光标记的复合物的荧光信号，所有这些都可以复合到膜。所述膜、结合元件、分析物和荧光标记可以是本文所描述的那些中的任一种。

方法可以利用本文所描述的膜中的任一种。举例来说，可以用于所述方法中的膜可以具有一种或多种特性，包括例如(a)间隙的宽度在约5nm到约50nm之间并且长度在约5nm与约200nm之间；(b)纳米结构具有在约50nm到约500nm之间的平均宽度和长度；(c)膜具有在约1000nm²到约250,000nm²之间的纳米板大小；(d)膜的高度在约5nm与约500nm之间；(e)膜包含不规则特征和不均匀结构；(f)膜赋予约400nm到约2100nm的等离子体；(g)基底包含平坦表面、弯曲表面、球状表面或三维多孔膜；以及(h)基底是珠粒。膜可以包含载银的金纳米粒子。

在一些情况下，所述方法还可以包括基于所检测到的荧光信号，测定一种或多种分析物的存在、不存在、浓度、属性(例如细胞的表型，或样品源)和/或位置，或样品或样品源的其它特性。特性的实例包括样品源的属性(例如个别受试者或位置)、污染的存在或不存在、疾病或病况的存在或不存在、蛋白质的类型、核苷酸序列或其它鉴别特性。在一些情况下，所述方法包括鉴别样品的疾病或病况，或鉴别样品源(例如受试者)。这些的实例提供于上，并且包括疾病或病况如心血管疾病或病况、肾脏相关疾病或病况、产前或妊娠相关疾病或病况、神经或神经精神疾病或病况、自体免疫或免疫相关疾病或病况、癌症、感染性疾病或病况(例如微生物感染)、儿科疾病、病症或病况、线粒体病症、呼吸-胃肠道疾病或病况、生殖系统疾病或病况、眼科疾病或病况、肌肉-骨骼疾病或病况，或皮肤疾病或病况。其它疾病可以如通过鉴别一种或多种生物标记物的存在或与病况相关生物特征匹配的程度进行鉴别。生物标记物的实例提供于本文中。

通过荧光检测分析物的各种布置是可利用的。例如，包含分析物的样品可以直接施加于膜的表面，如通过将样品液体添加到具有涂布有膜的内表面的孔中来施加。在先使样品与样品表面，如载片接触之后，可以使样品直接地接触膜，由此可以将分析物包夹在样品表面与膜之间。在又另一实例中，使含有分析物的样品与样品基底接触，所述样品基底具有与样品接触的第一表面(如孔的内表面、载片的顶表面或微流体装置内的通道)和不接触样品的第二表面(如孔或载片的底表面)，并且与分析物有关的荧光信号的检测包括使第二表面邻近膜(例如与膜接触，或在膜的1000nm范围内)。分析物可以在前述检测邻近膜的分析物的任一时间，用荧光标记标记。当膜在珠粒的表面上时，通过使样品与珠粒接触来使膜邻近待检测的分析物。接着，可以检测荧光，如在样品容器中(例如，如在多孔板的孔中)检测。在一些情况下，通过流式细胞术、荧光成像显微镜或扫描仪分析已接触样品的涂有膜的珠粒。

在一些情况下，分析物可以在表面上。分析物可以直接或间接地附接至所述表面。分析物可以通过结合元件结合至所述表面。结合元件可以相同或不同，并且可以是多种结合元件中的任一个，其实例提供于本文中。微阵列可以包含dna微阵列、rna微阵列、mirna微阵列、肽微阵列、蛋白质微阵列、抗体微阵列或任何类型的生物或化学分子微阵列。在分析物结合至所述表面的情况下，本公开的膜可以被施加至在所述表面上的分析物。如上文和本文中其它地方所论述，所述膜可以包含多个结合元件或捕捉剂(例如结合元件阵列)。每个结合元件可以被配置用于结合至相同或不同类型的分析物。在利用包含多个不均匀和不规则纳米结构的不均匀膜的情况下，所述膜可以包含多个不连续并且隔离的位置。多个位置可以独立地定址并且每个位置可以包括能够结合至某一分析物的特定类型的结合元件。每对结合元件和分析物的结合可以产生荧光信号，所述荧光信号可以在膜存在下增强并且通过检测器捕捉。基于所检测到的信号的位置，可以测定或鉴别分析物。在一些实例中，结合元件是偶联至施加于基底(例如珠粒)的膜的寡核苷酸(例如引物)，并且分析物是可以通过序列互补与寡核苷酸杂交的目标聚核苷酸或其扩增产物。在目标聚核苷酸成功地与寡核苷酸杂交后，可以起始扩增反应以产生可检测的扩增产物(或扩增子)。由于所述膜可以制造成包括多个隔离的并且可独立定址的位置，并且每个位置可以仅含有单一分析物，故检测还可以包括单分子分析，例如单分子成像和跟踪，或单纳米粒子跟踪和成像。

在一些情况下，结合元件阵列是蛋白质阵列。蛋白质微阵列可以通过多种方式，如通过将所希望的蛋白质点样至膜上或点样至样品基底上来制备。用于制备蛋白质阵列的示例性方法描述于例如us2003/0013130、us2003/0108726、us2009/0088329和us2013/0172207中。在一些情况下，结合元件阵列是聚核苷酸阵列，如在膜或样品基底上的寡核苷酸探针阵列。用于制造聚核苷酸阵列的示例性方法包括在载玻片上使用尖头针、使用预制掩模进行的光刻、使用动态微镜装置进行的光刻、喷墨印刷或电化学方法。示例性方法描述于例如fodor等人,1991,《科学(science)》251:767-773；pease等人,1994,《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.u.s.a.)》91:5022-5026；lockhart等人,1996,《自然·生物技术(naturebiotechnology)》14:1675；美国专利第5,578,832号、第5,556,752号和第5,510,270号。

通过使用根据本公开的膜，可以增进利用荧光作为检测分析物的手段的多种结合分析中的任一种。在一些实施方案中，所述分析是基于受体的分析。一般来说，基于受体的分析包括检测两种结合搭配物，即分析物受体(又称结合元件)与分析物之间的相互作用。一般来说，给定结合搭配物对中的分析物受体和分析物是基于哪种已知(分析物受体)并且哪种要检测(分析物)进行区分。因此，本文所描述的示例性分析物受体在其它实施方案中可以作为分析物检测，并且本文中所描述的示例性分析物可以在其它实施方案中用作检测相应结合搭配物的分析物受体。在一些实施方案中，分析物受体、分析物或这两者包含蛋白质。分析物受体包括但不限于：天然或合成蛋白质、细胞受体蛋白质、抗体、酶、多肽、聚核苷酸(例如核酸探针、引物和适体)、脂质、小有机或无机分子、抗原(例如用于抗体检测)、金属结合配体以及对目标分析物具有结合亲和力的任何其它天然或合成分子。在一些实施方案中，分析物受体对分析物的结合亲和力是小于约5×10^-6m、1×10^-6m、5×10^-7m、1×10^-7m、5×10^-8m、1×10^-8m、5×10^-9m、1×10^-9m、5×10^-10m、1×10^-10m、5×10^-11、1×10^-11或更小的kd。多种分析物和分析物受体以及采用其的分析是可利用的。参见例如us8435738。在一些情况下，当阵列包含多个不同的结合元件时，可以通过单一反应检测相应的多种不同分析物。一般来说，通过增加与分析物的存在或不存在有关的标记的荧光信号，使得检测所述分析物的灵敏度增加，由此相较于在无本公开膜存在下可能的情形，较少量分析物可以检测到高于背景水平。

体外诊断成像可以由细胞和细胞囊泡粘附到基底，典型地表面改性的玻璃并使用偶联至荧光染料的互补抗体或抗原检测某些细胞膜分子组成。在此方法中，同时涉及来自细胞的自体萤光和染料的光漂白。细胞的内源性自发荧光在350-500nm的可见光区域中最高，朝向近红外区减弱。通过结合本公开的膜执行细胞成像，所选标记的荧光信号可以在极小自体萤光下增大(例如对于峰值激发波长在680nm和800nm区的荧光团)。通过将此区域中的荧光增大10-200倍，可以使用较低强度激发，由此减少光漂白。

在一些实施方案中，检测分析包括检测一种或多种目标聚核苷酸的扩增。扩增方法可以包括例如聚合酶链反应(pcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)，以及滚环扩增(rca)。扩增方法可以是温度循环或是等温的。扩增方法可以是指数或线性的。对于在温度循环下扩增，温度循环一般可以对应于扩增循环。在一些情况下，等温扩增可以具有扩增循环，如变性循环，并且在其它情况下，等温扩增反应将单调地发生，无需任何特定扩增循环。扩增方法可以用于扩增核酸分子的特定区域(即，目标区域)或核苷酸序列(例如dna、rna)。这一区域可以是例如单一基因、基因的一部分或非编码序列。

如本文所描述，膜可以涂布于基底上，其中所述基底是珠粒。在本实施方案的一个特定实施方案中，所述珠粒进一步用聚核苷酸探针涂布作为结合元件。可以提供多个珠粒，并且每个珠粒可以用同一聚核苷酸的多个拷贝或用多个不同的聚核苷酸涂布。探针可以包含与特定目标序列互补的序列，或可以包含用于检测多个不同的目标序列的随机或部分随机的序列。检测可以仅借助于杂交进行，如在带有荧光标记的目标聚核苷酸与珠粒杂交并检测荧光。或者，检测可以包括另外的操作步骤，如在扩增反应中，其中结合至珠粒的探针沿目标聚核苷酸延伸，所述目标聚核苷酸在扩增反应中用作模板。扩增产物可以在扩增期间和/或在完成扩增之后进行检测。用于检测扩增产物的多种标记是可利用的，如溴化乙啶、sybr绿、sybr蓝、dapi、吖啶黄、氟香豆素、玫瑰树碱、道诺霉素(daunomycin)、氯喹(chloroquine)、偏端霉素d(distamycind)、色霉素(chromomycin)、碘化丙啶、hoeste、sybr金、吖啶、普鲁黄(proflavine)、吖啶橙、乙菲啶(homidium)、光神霉素(mithramycin)、聚吡啶钌、安曲霉素(anthramycin)以及其它适合的试剂。

通过elisa进行的免疫分析检测被用于临床诊断中并作为生命科学研究工具，作为定量溶液中核酸、抗体或蛋白质浓度的方法。实际上，将给定浓度的捕捉抗体或抗原涂布于玻璃载片或96孔板的表面上，以便结合至溶液中的目标分子。在结合之后，培育检测抗体或抗原，并使用通过吸收或荧光光谱法得到的发光，典型地使用校准曲线作为参考，定量溶液中目标分析物的浓度。在无本公开的膜存在下执行的elisa典型地局限于<3log的动态范围，以及约1纳克分析物/毫升溶液的检测和定量下限。许多生物分子具有小于1ng/ml的临床相关浓度和覆盖6log或更多log的动态范围，如指示早期疾病状态的细胞因子和蛋白质。通过在邻近本公开的膜的标记存在下执行检测步骤，动态范围和检测限可以扩展到检测在此类范围并且甚至小于此类范围的分析物。例如，动态范围可以覆盖至少3、4、5、6、7log或更多。在此范围内，可以检测低至100fm、50fm、25fm、10fm、1fm或更低含量的生物标记物。

在一些实施方案中，本文所描述的膜可以与多种显微镜检查技术中的任一种结合使用，所述显微镜检查技术的实例在本文已有描述。标记选择将取决于目标分析物和检测技术。在某一情况下，检测方法是荧光原位杂交(fish)。在此技术的一个典型实施方案中，使与所关注序列互补的标记聚核苷酸(fish探针)与固定的染色体制剂粘接，并通过显微镜检查检测所关注序列的存在以及染色体定位。fish可以通过将所关注核酸固定于基底上来执行，所述基底包括但不限于玻璃、硅或纤维。fish还可以用于定量(q-fish)检测重复序列如端粒的存在和长度。这可以通过如利用显微镜检查测量，定量发射的荧光的强度来进行。利用目标荧光化合物的分析可以执行用于检测特定的dna分子或染色体区段。这些特征可以用于遗传咨询(例如产前筛查)、医学和物种鉴别。所述分析可以直接对膜或对下方放置膜的基底(例如载片)执行以增强荧光进行检测。

本文还提供通过使用本公开的系统和组合物对核酸分子测序的方法。在一个实施方案中，所述方法可以包括：(a)提供如本文所提供的膜(例如载银的金纳米粒子或载金的金纳米粒子)；(b)使寡核苷酸与目标聚核苷酸杂交；(c)在延伸方向上，利用与目标序列上的相应位置互补的一个或多个碱基使所述寡核苷酸延伸；并且(d)通过检测一个或多个荧光分子(例如荧光团)的荧光信号来鉴别步骤(c)中添加的一个或多个碱基，其中所述荧光信号的强度相对于在无所述膜存在下所述荧光分子的荧光信号有所增强。可以通过聚合酶或连接酶延伸寡核苷酸。用于延伸的四个碱基可以包含相同或不同类型的荧光分子。在一些情况下，所述四个碱基各自可以与不同的荧光分子相联以便并入每种类型的碱基产生可区分的可检测信号。通过检测荧光信号，可以测定核酸分子的序列。在一些情况下，所述膜是在多个珠粒上，这些珠粒可以流动穿过或偶联至流槽。测序可以通过多种测序方法中的任一种执行，包括新一代测序(next-generationsequencing，ngs)平台。ngs技术可以涉及以大规模平行方式对克隆扩增的dna模板或单个dna分子进行测序(例如，如volkerding等人,《临床化学(clinchem)》55:641-658[2009]；metzkerm,《自然评论(naturerev)》11:31-46[2010]中所描述)。新一代测序平台可以是可商购的平台。可商购的平台包括例如用于边合成边测序的平台、离子半导体测序、焦磷酸测序、可逆染料终止剂测序、连接测序、单分子测序、杂交测序及纳米孔测序。用于边合成边测序的平台可购自例如illumina、454lifesciences、helicosbiosciences和qiagen。illumina平台可以包括例如illumina的solexa平台、illumina的基因组分析仪(genomeanalyzer)并且描述于gudmundsson等人(《自然·遗传学(nat.genet.)》200941:1122-6)、out等人(《人类突变(hum.mutat.)》2009,30:1703-12)以及turner(《自然-方法(nat.methods)》2009,6:315-6)、美国专利申请公开第us20080160580号和第us20080286795号、美国专利第6,306,597号、第7,115,400号和第7232656号中。454lifescience平台包括例如gsflex和gsjunior，并且描述于美国专利第7,323,305号中。来自helicosbiosciences的平台包括true单分子测序平台。用于离子半导体测序的平台包括例如iontorrentpersonalgenomemachine(pgm)并且描述于美国专利第7,948,015号中。用于焦磷酸测序的平台包括gsflex454系统并且描述于美国专利第7,211,390号、第7,244,559号、第7264929号中。用于连接测序的平台和方法包括例如solid测序平台并且描述于美国专利第5,750,341号中。用于单分子测序的平台包括来自pacificbioscience的smrt系统和helicostrue单分子测序平台。

样品(例如体液、细胞、组织培养基或由其得到的样品)中的核外体可以通过固定的核外体特异性结合元件，如抗体(例如抗cd63、抗cd81和抗cd9)捕捉于涂布有荧光增强膜的表面(例如载片或珠粒)上，并且进一步经历基于荧光的标记分析。在一些实施方案中，所述标记分析用于鉴别和定量蛋白质生物标记物或包括dna和rna的核酸，或评估获得样品的受试者的信号传导路径或疾病状态。

核外体可以从生物样品分离，所述生物样品可以包括例如可以含有核外体的细胞培养基、组织、流体或任何样品。生物样品的非限制性实例包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(csf)、痰液、唾液、骨髓、滑液、水状液、羊膜液、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液(cowper'sfluid)或射精前液、雌性射精、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊肿液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽吸物或其它灌洗液。生物样品还可以包括来自可能具有胎儿或母体起源的囊胚腔、脐带血或母体循环的样品。在一些情况下，生物样品是可以获得核外体的组织样品或活检样品。例如，如果样品固体样品，则可以培养来自所述样品的细胞以诱导核外体产物。在一些情况下，样品是来自受试者的腹水，例如来自患有卵巢癌的人类受试者的腹水；来自人类原发黑素瘤细胞系的细胞培养基上清液；来自人类原发结肠癌细胞系的细胞培养基上清液；或鼠类巨噬细胞，例如感染肺结核的鼠类巨噬细胞。

在一些情况下，核外体是癌症核外体。癌症核外体可以包括从癌细胞和/或肿瘤细胞(原代细胞或细胞培养物)，如乳癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、增生性息肉、腺瘤、结肠直肠癌(如crcdukesb或dukesc-d)、高度发育不良、低度发育不良、前列腺增生、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、脑癌(如成胶质细胞瘤)、血液恶性病(如b细胞慢性淋巴细胞性白血病、b细胞淋巴瘤-dlbcl、b细胞淋巴瘤-dlbcl-生发中心样、b细胞淋巴瘤-dlbcl-活化b细胞样和伯基特氏淋巴瘤(burkitt'slymphoma))、肝细胞癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食道癌、胃肠道间质瘤(gist)、肾细胞癌(rcc)或胃癌获得或得到的核外体。癌症核外体还可以从癌前病况，例如但不限于巴雷特食管(barrett'sesophagus)得到。

来自样品(例如体液)的无细胞聚核苷酸(例如无细胞dna或cfdna)可以通过固定的dna特异性抗体(例如抗dsdna、抗ssdna和抗dna/rna复合物)或互补聚核苷酸捕捉于涂布有荧光增强膜的表面(例如载片或珠粒)上，并且进一步经历基于荧光的标记分析以鉴别和定量cfdna，从而评估得到所述样品的受试者的生物或疾病状态。一般来说，无细胞聚核苷酸是样品中存在的细胞外聚核苷酸(例如去除了细胞的样品、未经历溶解步骤的样品，或经过处理以将细胞聚核苷酸与细胞外聚核苷酸分离的样品)。例如，无细胞聚核苷酸包括在细胞死亡时释放至循环中的聚核苷酸，并且以无细胞聚核苷酸形式从血液样品的血浆组分分离。

无细胞聚核苷酸可以从多种来源，包括人类、哺乳动物、非人类哺乳动物、猿、猴、黑猩猩、爬行动物、两栖动物或禽类来源得到。另外，样品可以从含有无细胞序列的多种动物流体提取，包括但不限于血液、血清、血浆、玻璃体、痰液、尿液、泪液、汗液、唾液、精液、粘膜排泄物、粘液、脊髓液、羊膜液、淋巴液等。无细胞聚核苷酸可以是胎儿起源的(通过从怀孕受试者得到的流体)，或者可以从受试者本身的组织得到。无细胞聚核苷酸的分离和提取可以通过使用多种技术采集体液执行。在一些情况下，采集可以包括使用注射器从受试者抽吸体液。在一些情况下，采集可以包括将流体用移液管移或直接采集至采集容器中。

采集体液之后，可以使用多种技术分离并提取无细胞聚核苷酸。在一些情况下，可以使用可商购的试剂盒，如qiagen循环核酸试剂盒方案分离、提取和制备无细胞聚核苷酸。在一些实例中，可以使用qiagenqubit^tmdsdnahs分析试剂盒方案、agilent^tmdna1000试剂盒或truseq^tm测序文库制备、低通量(lt)方案。

一般来说，通过分配步骤从体液提取和分离无细胞聚核苷酸，在所述步骤中，将无细胞dna，如在溶液中发现的无细胞dna，与细胞和体液中的其它不可溶组分分离。分配可以包括但不限于如离心或过滤等技术。在一些情况下，不是先将细胞与无细胞dna分开，而是将细胞溶解。在这一实例中，完整细胞的基因组dna是通过选择性沉淀分配。无细胞聚核苷酸，包括dna，可以保持可溶性并且可以与不溶性基因组dna分离并进行提取。一般来说，在缓冲剂添加和不同试剂盒特有的其它洗涤步骤之后，可以使用异丙醇沉淀使dna沉淀。另外，可以使用清除步骤，如基于二氧化硅的柱，以去除污染物或盐。可以针对具体应用优化通用步骤。在整个反应中，可以例如添加非特异性块状载体聚核苷酸以优化所述程序的某些方面，如产率。

在一些实施方案中，检测荧光信号的方法中的一个或多个，或所有步骤都是自动的，如通过使用一个或多个自动化装置执行。一般来说，自动化装置是能够在无人类指导下操作的装置，即，自动系统可以在人类结束采取促进功能的任何活动，例如通过将指令输入计算机中之后一段时间期间执行所述功能，之后，自动化装置执行一个或多个步骤，无需人类进一步操作。软件和程序，包括实施本文所公开的方法中的任一种的代码，可以被存储在某种类型的数据存储媒体上，如cd-rom、dvd-rom、磁带、快闪驱动器或磁盘，或其它适当的计算机可读媒体，其可以由一个或多个处理器，如可以作为计算机系统的一部分的处理器执行。本发明的各种实施方案也可以仅仅在硬件中或在软硬件的组合中实施。例如，在一个实施方案中，使用可编程逻辑控制器(plc)而非常规的个人计算机。plc常常被用于多种工艺控制应用程序中，在此情况下，不必使用通用计算机。plc可以被配置用于执行一个或多个控制程序，并且能够以与个人计算机类似的方式从用户或另一装置接收输入和/或向用户或另一装置提供输出。自动化系统可以包括液体处置器。液体处置器的实例包括来自perkin-elmer、beckmancoulter、caliperlifesciences、tecan、eppendorf的液体处置器。

利用荧光检测的多种分析和技术将得益于本公开的方法和组合物。此类分析的实例包括但不限于微阵列检测方法(例如蛋白质、核酸和抗体的微阵列检测方法)、基因测序、荧光原位杂交(fish)分析、免疫组织化学染色(ihc)、基于荧光共振能量转移(fret)的成像及酶联免疫吸附分析(elisa)。由于信号强度增强，使得检测灵敏度增加，由此提供大量益处。典型的分析包括使分析物与结合至所述分析物的结合元件接触。使用荧光标签检测复合物的形成。这可以通过多种方式进行。例如，结合元件可以包含荧光标记。或者(或另外)，可以使用结合至初始结合元件并且包含荧光标记的第二结合元件。作为另一个实例，可以使用识别复合物的荧光标记，如用于识别探针聚核苷酸与互补样品聚核苷酸之间的结合的荧光dna嵌入剂。不管具体标记方法如何，可以通过检测邻近本公开的膜的标记的荧光信号来增进分析物的检测。如本文中所描述，所述膜可以呈多种形式。在一些情况下，所述膜包含在所述膜的表面上的结合元件，所述结合元件结合目标分析物，且随后，通过施加荧光标签来检测结合，所述荧光标签结合由结合元件和分析物所形成的复合物。

作为示意性实例，本公开的膜被安置在基底的表面上。在膜表面上的不连续位置处复合的是多个不同的结合元件，如病毒抗原。接着，将可能包含目标分析物的样品施加至膜，所述目标分析物将结合至结合元件，如在结合元件是抗原的情况下为抗体。如果存在目标分析物，则这些目标分析物结合至结合元件，而样品的其余组分被洗掉。接着，将标记施加至结合的分析物。在分析物是抗体的情况下，标记可以是针对样品中偶联至荧光标签的一类抗体(例如特定同型的抗体)的抗体。还可以使用多个不同的标记(例如针对多种不同抗体同型中的每一个的不同检测抗体)。由此得到的复合物包含包夹在结合元件与标记之间的目标分析物，所述目标分析物、结合元件和标记都紧密邻近膜。接着，激发波长的光激发荧光标签，并且由此引起的荧光信号因邻近膜而增强。利用光检测器检测增强的荧光信号，由此指示一个或多个结合元件的一个或多个目标分析物的存在(和任何相关病况的存在)。由于检测灵敏度增加(例如高约10倍的信号/背景比率)，这也使得置信度增加，其中信号的不存在指示分析物的不存在，且因此指示任何相关病况的不存在。多种分析物中的任一种的存在或不存在可以通过此方式评估。本文中提供了用于增强荧光信号的组合物的实例，以及宜采用这些组合物的多种分析。

一方面，本公开提供了一种检测和/或区分样品中的不同病毒的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测量受试者的样品(例如血液样品或血液成分如血浆)中一种或多种抗体的含量，其中所述一种或多种抗体是针对一种或多种病毒(例如1、2、3、4、5、10或更多种病毒)的一种或多种抗原(例如1、2、3、4、5或更多种抗原)的抗体，并且所述抗体选自一种或多种不同的抗体同型(例如igg、igm和iga)。示例寨卡病毒抗原包括但不限于ns1抗原、病毒粒子和包含寨卡病毒抗原的重组蛋白。示例登革病毒抗原包括但不限于登革病毒1-4抗原、病毒粒子和包含寨卡病毒抗原的重组蛋白。检测不同抗体可以单独地执行，如对不同样品或样品的不同等分试样执行。在一些实施方案中，同时检测(例如，如在单一反应中)多种抗体(例如针对不同病毒的抗原的抗体，和/或不同的同型的抗体)。在一些实施方案中，所述方法包括区分样品中的不同黄病毒。例如，可以区分寨卡病毒引起的急性感染与登革病毒感染。在一些实施方案中，所述方法包括检测样品中针对一种或多种黄病毒抗原，如来自寨卡病毒、登革病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒和黄热病病毒的一种或多种抗原的igg抗体(和任选地igm抗体)的存在或不存在。在一些实施方案中，所述一种或多种抗原包含一种或多种寨卡病毒抗原，其可以任选地与一种或多种其它病毒感染，如其它黄病毒感染相区分。在一些情况下，样品是在受试者感染症状发作的24周内(例如20周、15周、10周、5周、4周、3周周2周、1周、5天、4天、3天、2天或1天内)从受试者获得的样品，和/或从先前未被诊断患有寨卡感染的受试者得到的样品。在一些实施方案中，样品是在症状发作的4周内或1周内获得的样品。典型的症状包括以下一种或多种：发热、头痛、眼眶后疼痛、结膜炎、斑丘疹、肌痛和关节痛。在一些实施方案中，所述方法包括基于所述检测，鉴别所述受试者是否患有寨卡病毒感染。在一些实施方案中，如果结合寨卡病毒抗原的igg的含量高于阈值水平，则所述受试者被鉴别为患有寨卡病毒感染(和任选地，未患登革病毒感染)。在一些实施方案中，如果结合寨卡病毒抗原的igg的含量高于阈值水平并且结合寨卡病毒抗原的igm的含量高于阈值水平，则所述受试者被诊断为患有寨卡病毒感染(和任选地，未患登革病毒感染)。抗体结合寨卡病毒抗原的阈值水平可以设置成统计上显著高于关于患有登革病毒感染且无寨卡病毒感染的样品所观察到的水平的水平。在一些实施方案中，如果结合寨卡病毒抗原的igg的含量高于阈值水平并且结合登革病毒抗原的igg的含量高于阈值水平，则所述受试者被诊断为患有寨卡病毒感染(和任选地，未患登革病毒感染)。在一些实施方案中，所述方法包括(a)测量受试者的样品中针对寨卡病毒抗原的igg、针对寨卡病毒抗原的igm、针对登革病毒抗原的igg和针对登革病毒抗原的igm的含量，并且(b)基于(a)中测量的含量，鉴别受试者是否患有感染，其中所述感染选自：(i)寨卡病毒且非登革病毒、(ii)登革病毒且非寨卡病毒或(iii)寨卡病毒和登革病毒。鉴别是否存在感染可以在受试者感染症状发作的24周内(例如20周、15周、10周、5周、4周、3周、2周、1周、5天、4天、3天、2天或1天内)进行。在一些情况下，受试者无寨卡病毒感染和/或登革病毒感染诊断史。在一些实施方案中，针对寨卡病毒和登革病毒的igg和igm抗体的存在或不存在都作为多路复用分析的一部分同时检测。或者，目标抗体可以单独地或以各种其它组合形式检测。本文中提供了用于检测结合元件，如抗体的各种方法和组合物。在一些实施方案中，检测包括根据本发明的各个方面中的任一个，使用基底上包含隆起的纳米结构的膜以增强检测信号。在一些实施方案中，分析不使用基底上包含隆起的纳米结构的膜。用于检测抗体的分析的实例包括elisa和其它抗体捕捉分析(例如在珠粒上进行的夹心分析，如在流式荧光检测术所提供的分析中)、化学发光分析、基于珠粒的荧光分析和电化学发光分析。在一个示例分析中，将一种或多种抗原提供于固体基底上，所述固体基底与可能包含针对所述抗原的抗体(样品抗体)的测试样品反应，且接着添加包含可检测标记的二次抗体，其中所述二次抗体特异性结合所选类型的样品抗体(例如特定同型的人类抗体)。接着，可以将所得到的信号与内标和/或参考水平(例如阈值水平，高于阈值水平可诊断感染)相比较。在一些实施方案中，基于本文所描述的方法的结果，选择并且任选地采取医疗措施。例如，如果检测到寨卡感染，则可以开具避孕措施以避免寨卡感染不利地影响可能存在的胎儿。对于涉及阳性诊断阈值的分析，如果信号(或信号组合)低于指定阈值，则受试者可以被诊断为未患指定感染。

膜制造

一方面，本公开提供了用于在本文所描述的基底上制备膜的方法。在某些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)将纳米粒子种子，如金纳米粒子种子吸附于基底上，或使溶液中或呈气相的纳米粒子种子在基底上生长；并且(b)使纳米结构，如银纳米结构在纳米粒子种子周围生长。纳米粒子种子和在纳米粒子种子周围生长的纳米结构可以由各种类型的材料，例如小分子、化合物、聚合物或金属制造。在接种程序之前，基底可以或可以不进行处理或改性。用于制备本公开的膜的示例方法可以包括：(a)将含有金属离子的第一溶液施加至基底上；(b)使用碱性溶液，使所述溶液中的金属离子沉淀至基底上；(c)使步骤(b)中沉淀至基底上的金属离子还原以在基底上产生种子粒子；并且(d)将包含金属离子的第二溶液添加至来自步骤(c)的种子粒子上以在膜中生长隔离区域。如本文中其它地方所论述，膜可以是连续的、准连续的或不连续的。在制备好膜后，在一些情况下，可以将用作捕捉剂或结合元件的生物或化学分子阵列施加至所述膜，所述生物或化学分子阵列可以特异性结合至一种或多种分析物。分子阵列可以作为不同分子物种安置在膜上的不连续位置并且与膜偶合，由此由结合元件与分析物之间的捕捉事件所产生的荧光信号可以因所述膜而增强。应了解，第一和第二金属离子溶液可以包含相同类型的金属或不同类型的金属以形成金属复合物。例如，在一些情况下，第一溶液包含多个au离子并因此在基底上产生au(0)种子粒子。所提供的第二溶液可以包含au或ag离子，这些离子可以在au(0)种子周围生长au或ag纳米结构。取决于所产生的纳米结构的相互连接，可以产生连续、不连续或准连续的ag/au或au/au膜。

膜的高度或厚度可以变化。在一些情况下，膜的高度小于或等于约5,000nm、4,000nm、3,000nm、2,000nm、1,000nm、900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm、100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm、0.5nm、0.1nm、0.05nm、0.01nm、0.005nm或0.001nm。在一些情况下，膜的高度可以大于或等于约0.0001nm、0.00025nm、0.0005nm、0.00075nm、0.001nm、0.0025nm、0.005nm、0.0075nm、0.01nm、0.025nm、0.05nm、0.075nm、0.1nm、0.25nm、0.5nm、0.75nm、1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm或3,000nm。在一些情况下，膜的高度可以选自本文所描述的两个值的范围，例如从约5nm到约500nm、从约5nm到约300nm、从约5nm到约200nm或从约5nm到约100nm。

利用本公开的膜，可以增强在距膜表面一定距离内产生的荧光信号，并且增强因子随包括此类距离在内的多种因素而变化。荧光信号可以在约400nm到约2100nm范围内。可能影响荧光信号的增强因子的因素的其它非限制性实例可以包括膜特性和/或特征(膜厚度、间隙大小、隆起的纳米结构的大小、基底的类型、基底的形状、膜表面的粗糙度、基底表面的粗糙度)、荧光分子的类型、光源或其组合。例如，给定某一膜，可以增强在距膜表面的1,000nm内的荧光团的荧光信号。在一些实例中，荧光团是具有约700nm到约800nm的发射的近红外荧光团，并且荧光信号的强度增强至少30倍。在一些实例中，荧光团是具有约400nm到约700nm的发射的可见光染料，并且荧光信号的强度增强至少约3倍。

在通过使金属离子溶液沉淀来制备种子粒子的情况下，可以通过调节所述溶液的初始浓度和/或ph值来改变接种密度。接种密度又可以确定膜密度和形态(例如间隙大小、粒子间的间距、纳米粒子大小等)。在一些情况下，可能需要高接种密度。在一些情况下，低接种密度可能优选的。在一些情况下，接种密度可以小于或等于约1×10⁹个种子/平方毫米、5×10⁸个种子/平方毫米、1×10⁸个种子/平方毫米、5×10⁷个种子/平方毫米、2.5×10⁷个种子/平方毫米、1×10⁷个种子/平方毫米、5×10⁶个种子/平方毫米、1×10⁶个种子/平方毫米、5×10⁵个种子/平方毫米、1×10⁵个种子/平方毫米、5×10⁴个种子/平方毫米、或1×10⁴个种子/平方毫米。在一些情况下，接种密度可以大于或等于约1×10⁴个种子/平方毫米、5×10⁴个种子/平方毫米、1×10⁵个种子/平方毫米、510⁵个种子/平方毫米、1×10⁶个种子/平方毫米、5×10⁶个种子/平方毫米、1×10⁷个种子/平方毫米、5×10⁷个种子/平方毫米、1×10⁸个种子/平方毫米、5×10⁸个种子/平方毫米、1×10⁹个种子/平方毫米或5×10⁹个种子/平方毫米。在一些情况下，接种密度可以在本文所描述的任何两个值之间，例如约4.3×10⁷个种子/平方毫米。

在一些实施方案中，所述方法和材料采用金上等离子体不连续银(dag/au)和金上连续银(cag/au)膜的溶液相生长，其方法是以通过将au³⁺离子沉积/沉淀至未改性表面上，随后将所述离子溶液相还原成au⁰来快速、原位“接种”金纳米粒子开始。对于ag/au结构，在还原步骤之后，通过葡萄糖还原ag¹⁺，在膜中生长金种子，并且由此得到的具有不同生长程度的膜称为载连续银的金(cag/au)或载不连续银的金(dag/au)膜。在一些实施方案中，这涉及制备本发明纳米级cag/au和dag/au膜的三步骤程序：

(1)通过使au³⁺离子溶液沉淀，将金接种至基底上。通过用含氮的碱，如用nh4oh、尿素等升高其ph值，使所述离子自haucl4沉淀析出；

(2)利用还原剂如肼、nabh4；加热；h2；或光还原，在基底上将步骤(1)中沉淀的离子还原成au⁰簇；并且

(3)通过还原第二溶液中的ag¹⁺卤化物，将银选择性添加到初始种子，使来自步骤(2)的种子生长，以形成纳米板和隆起的结构。这可以通过在富含氢气的氛围中，用还原剂如光还原、d-葡萄糖或超声波处理来进行。典型地，步骤(3)中的银仅附着到先前沉积的种子，产生所谓的“cag/au”和“dag/au”构造。

初始接种(沉淀)步骤可以在多种基底上，通过将基底浸没于金离子溶液中来进行。基底无需但可以通过任何方式预处理以增加金粘附。选择的金盐的离子浓度可控制“种子”的大小和间距。不希望受理论所束缚，相信纳米板的最终大小和各纳米板之间的距离影响基底的荧光增强特性并且可以被优化以使可见光和近红外区域的荧光增强达到最大。如下所述，通过将以数纳米到数十纳米间隙间隔开的cag/au纳米-纳米板的大小控制在约数百纳米，使来自红外荧光团(irdye800)的近红外荧光增加10-200倍。如下所述，通过将cag/au隆起的纳米结构的大小控制在具有在5nm到100nm之间的平均特征宽度和1到20nm的间隙宽度，使来自可见光荧光团(cy5)和近红外荧光团(irdye800)的可见光荧光相较于裸玻璃基底增加2-100倍。

由于可以容易地调节如本文中所描述的膜的均匀性和形态，故可以在很大程度上多路复用利用所述膜捕捉或检测荧光信号的分析或方法。可以将不同类型的捕捉剂(或结合元件)沉积于膜的不同位置上，其中每个位置可以具有不同的形态或特性(例如纳米结构的大小、形状和密度、间隙大小、膜表面的粗糙度等)。它能够以高灵敏度、特异性和信噪比多路复用检测一个阵列中具有大体上检测下限(例如低至约0.01pg/ml(约1-10fm)最低可检测浓度)的多达数百种或数千种分析物(例如细胞因子其它蛋白质)。在所述分析中可以使用发射波长不重叠的不同荧光分子标记不同种类的分析物(例如蛋白质或抗体)以在同一分析中实现如igg、igm、iga等分析物亚型的多色区别。例如，可以利用膜构造能够测量人血清中具有低和高丰度的不同亚型抗体的多色微阵列，其中增强最大的荧光团报导丰度最低的分子。

如本文所提供，信噪比(例如其振幅比率)可以是任何适当地高值(即，适当地高到以达到某一准确度)。例如，信噪比可以是至少约2比1、约3比1、约4比1、约5比1、约6比1、约7比1、约8比1、约9比1、约10比1、约100比1、约1,000比1、约10,000比1或更高比率。

第一和/或第二溶液中所含离子的还原可以通过各种方法，例如通过热或光诱导的还原，或借助于化学试剂如还原剂实现。还原剂的非限制性实例可以包括抗坏血酸、肼、羟胺、氢硼化铵或氢硼化钠、甲酸、d-葡萄糖、氢气氛围、氢化锂铝(lialh4)、初生态(原子)氢、钠汞齐、二硼烷、硼氢化钠(nabh4)、含有sn²⁺离子的化合物(如氯化锡(ii))、亚硫酸盐化合物、肼(wolff-kishner还原)、锌汞齐(zn(hg))(clemmensen还原)、二异丁基氢化铝(dibal-h)、lindlar催化剂、草酸(c2h2o4)、亚磷酸盐、次磷酸盐以及亚磷酸、生物化学实验室中用以避免s-s键的二硫苏糖醇(dtt)、含有fe²⁺离子的化合物(如硫酸铁(ii))、一氧化碳(co)、碳(c)、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(tcep)或其组合。

试剂盒

在某些方面，本公开提供了一种用于检测受试者的病毒感染的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含具有结合元件，例如抗体或抗原的基底。在某些实施方案中，基底可以选自等离子体基底用于信号放大。试剂盒另外可以包含有关使用所述试剂盒分析受试者感染的存在的说明书。基底可以包括含一个或多个孔的一个或多个载片。所述一个或多个孔可以包含相同的zikv和denv抗原阵列。

在某些实施方案中，试剂盒包含一种或多种病毒抗原，其中所述病毒抗原可以被固定于基底上。所述一种或多种病毒抗原可以选自黄病毒抗原或甲病毒抗原。所述一种或多种病毒抗原可以选自寨卡病毒抗原、登革病毒抗原、黄热病病毒抗原、蜱传脑炎病毒抗原、日本脑炎病毒(jev)、西尼罗病毒抗原、马亚罗病毒抗原及基孔肯雅病毒抗原。所述一种或多种病毒抗原可以选自寨卡病毒抗原和登革病毒抗原。寨卡病毒抗原可以是重组寨卡病毒抗原。重组寨卡病毒抗原可以是寨卡病毒ns1蛋白质或寨卡病毒ns5蛋白质。重组寨卡病毒抗原可以是乌干达mr766和苏里南z1106033。在某些实施方案中，所述试剂盒还包含蛋白质变性剂。蛋白质变性剂可以选自尿素、甲酰胺、胍、水杨酸钠、二甲亚砜、丙二醇及其组合。蛋白质变性剂可以包含尿素。

在其它实施方案中，试剂盒包含与抗人iga或抗人igg抗体相联的一种或多种可检测标记。试剂盒还可以包含额外组分，如稀释剂缓冲剂、洗涤缓冲剂、校准剂、阳性对照、阴性对照、ir荧光扫描仪、载片支架、培育室、去离子水、涡流计(vortex)、移液器、离心管、孔板、试剂储集器以及小瓶。培育室可以具有至少约6个孔、至少约8个孔、至少约10个孔、至少约12个孔、至少约14个孔、至少约16个孔、至少约18个孔、至少约20个孔、至少约40个孔、至少约60个孔或至少约80个孔。移液器可以是单道或多道移液器。多道移液器可以保持至少约1μl、至少约2μl、至少约3μl、至少约4μl、至少约5μl、至少约6μl、至少约7μl、至少约8μl、至少约9μl、至少约10μl、至少约20μl、至少约30μl、至少约40μl、至少约50μl、至少约60μl、至少约70μl、至少约80μl、至少约90μl、至少约100μl、至少约150μl、至少约200μl、至少约250μl或至少约300μl样品。玻璃小瓶可以保持至少约1ml、至少约5ml、至少约10ml、至少约20ml、至少约30ml或至少约40ml样品混合物。孔板可以是96孔板、384孔板或1536孔板。

本文所描述的试剂盒的等离子体基底可以是本文所描述或以引用之方式并入本文中的任何等离子体基底。当至多在约8℃、4℃、0℃、-2℃、-4℃、-6℃、-8℃、-10℃、-20℃或-40℃下储存时，试剂盒可以稳定。例如，试剂盒可以在4℃(或-20℃)储存至少约1天、1周、2周、1个月、2个月、4个月、6个月。还可以执行加速稳定性测试，所述测试可以包括放大的环境条件，例如光、温度、湿度。

实例

提供以下实例以达到说明根据本公开的各种实施方案的目的，但不打算以任何方式限制本发明。本发明实例以及本文所描述的方法是目前优选实施方案的代表，是示例性的并且不打算限制本发明的范围。本领域的普通技术人员将想到其中的改变和其它用途，所述改变和其它用途都涵盖在由权利要求书的范围限定的本发明的主旨内。

实例1：用于诊断寨卡感染的寨卡和登革igg和igm同型的多路复用分析

寨卡病毒(zikv)和登革病毒(denv)是在许多热带和亚热带西半球区域共传播的蚊媒黄病毒。zikv曾是仅在非洲和东南亚引起偶发性人类感染的一种不确定的蚊媒黄病毒。在2007年密克罗尼西亚雅浦岛(yapislands,micronesia)爆发之后，zikv扩散跨过太平洋诸岛并扩散到西半球，在2015年出现在巴西(brazil)。zikv现与denv和基孔肯雅病毒一起在整个热带和亚热带美洲共传播。可能最重要的是，妊娠期间感染zikv与小头畸形和重度先天缺陷相关联，引起了对于zikv诊断以及区分zikv与denv感染的重要性的广泛关注。

患有急性zikv感染的有症状患者的临床表现典型地包括发热、头痛、眼眶后疼痛、结膜炎、斑丘疹、肌痛和关节痛的组合。然而，仅基于临床标准，很难可靠地区分zikv与引起未分化全身发热性疾病的其它病原体感染。出现寨卡热的患者可能疑似具有登革或具有基孔肯雅的轻度表现。临床表现的这一重叠以及潜在的重度胎儿后果，包括先天性神经系统畸形和流产，以及非胎儿表现，如吉兰-巴雷综合症(guillain-barrésyndrome)，强调了准确zikv诊断的重要性。

用于临床用途的pgold寨卡和登革igg分析可以提供快速的患者诊断方法，能够更快地进行干预。真阳性测试结果可以为诊断寨卡病毒感染提供支持。这些结果可以与临床和流行病信息结合使用以指导患者管理。就孕妇来说，所述测试的阳性寨卡结果有益于患者和胎儿，可以指示对于进一步超声波监测先天缺陷如小头畸形的需求。就男性来说，潜在近期寨卡感染的鉴别可以允许进行干预以预防性传播给怀孕的伴侣。

已开发出对在芯片上的病毒抗原阵列进行的多路复用黄病毒抗体测试以同时检测和定量针对寨卡和登革病毒的igg和igm同型。首先确定的是，在pgold芯片上进行的多路复用分析产生与由fda批准的商业试剂盒得到的登革igg和igm分析数据一致的结果(比较图1a-1b和图2a-2b)。针对抗原阵列的抗体结合信号(例如在当前情况下是igg和igm特异性二次抗体上的荧光)的模式可以用于区别各特定黄病毒感染并诊断急性/慢性感染。

生物芯片的构建：在等离子体金基底上，通过微阵列印刷构建蛋白质微阵列芯片。在每个等离子体金基底(25mm×75mm表面尺寸，1mm厚度)上存在14-16个相同的微阵列。每个微阵列包含3个寨卡ns1抗原斑点(英国的nativeantigencompany)、9个登革抗原斑点(3种类型，每种类型各3个斑点，来自加拿大的microbixbiosystemsinc.)以及由人igg/m混合物构成的12个对照斑点。微阵列斑点的直径是300-700微米。

人igg/igm抗体的捕捉：将生物芯片整合于模块中，在所述模块中，各微阵列彼此分离，并且可以用于捕捉一种试样中的人igg/igm抗体。在生物培养基中稀释人类试样并施加至微阵列上，其中针对寨卡或登革抗原的igg/igm抗体(如果存在)将通过特异性抗原-抗体相互作用捕捉在相应寨卡/登革抗原上。通过洗涤步骤洗掉人类试样中的非特异性蛋白质。

用近红外荧光团标记人igg/igm抗体：洗涤步骤之后，将分别标记特定近红外荧光团并且发射光谱不重叠的抗人igg和抗人igm(美国的vectorlaboratories)二次抗体的混合物施加至各微阵列上以标记捕捉的对各抗原具有特异性的人igg/igm抗体(如果存在)。确切地说，用irdye680(美国的li-cor)标记抗人igg并且用irdye800(美国的li-cor)标记抗人igm。通过洗涤步骤洗掉未结合的荧光团偶联二次抗体。

数据读出和分析：用对所述两个荧光团具有特异性的近红外荧光扫描仪扫描荧光团标记的生物芯片。测量并计算各微阵列中各抗原的3个斑点的平均荧光强度以反映各试样中针对抗原的igg/igm的丰度。将所述强度针对标准归一化，得到各试样中针对各抗原的igg/igm抗体的归一化丰度。

样品：从三组患者获得血清样品：1)29位来自哥伦比亚(columbia)的临床诊断有寨卡病毒(zikv)感染并且无登革病毒(denv)感染史的患者(20位女性、9位男性，年龄在18-82岁之间，购自medicalresearchnetworx,llc)；2)34位来自哥伦比亚、厄瓜多尔(ecuador)、洪都拉斯(honduras)和斯里兰卡(srilanka)的临床诊断有denv感染的患者；以及3)42位无zikv或denv感染史的个体。将各血清样品施加至在等离子体金基底上的多路复用zikv/denv抗原阵列上，进行针对zikv和denv抗原的igg和igm抗体的多路复用检测。对于一小组denv感染的患者，也分别用商业试剂盒focusdenguevirusiggdxselect和panbiodengueigmcaptureelisa测量针对denv抗原的igg和igm含量。在等离子体金基底上进行的denv抗体检测展示与商业分析的良好相关性。

这些实验的结果示于图1-7中并于下文描述。当有指示时，测量值是以任意单位(au)报导。寨卡感染受试者的血清样品中的igg抗体针对登革抗原显示出高阳性结合信号(图5)，这些信号可以用于区别寨卡病毒感染与登革病毒感染，不管igg抗体交叉反应的程度如何。寨卡感染受试者和登革感染受试者的血清样品中的igm抗体针对寨卡抗原显示出高阳性结合信号，但由于交叉反应的程度，使得差异不足以充分地区别寨卡病毒感染与登革病毒感染(图4)。可能由于交叉反应性，一些寨卡感染样品也显示出较高的结合至登革抗原的igm抗体含量(图6)。寨卡感染受试者的血清样品中的igg抗体针对寨卡抗原显示出高阳性结合信号(图3和图4)，即使对于急性感染也是如此，急性感染的血清样品是在症状的首个病征之后的1-2天内采集(图8a)。结合寨卡病毒抗原的igg抗体的含量在样品于患病的16-50天之间采集的患者小组中达到峰值，并且保持阳性，但之后逐渐降低(图8a)。结合寨卡病毒抗原的igm抗体的含量在1-7天之后仍呈阳性并且在16-50天时达到峰值，但迅速降低，在距疾病发作约70天之后变成阴性。重要的是，在大部分测试样品中，寨卡特异性igg信号比针对登革抗原的非特异性igg信号要高得多(图4)，由此允许区别寨卡与登革感染。这一结果出人意料，因为该结果表明，尽管igm信号缺乏特异性，但相对于登革，高寨卡igg信号是大部分寨卡感染样品特有的。它还表明，血液中针对寨卡的igg含量在寨卡感染时极快地升高，并且可以用作急性寨卡感染的重要标记物，以及区别寨卡与登革感染的标记物。寨卡样品不仅展现高寨卡igg信号，而且还展现超过高阈值的登革igg信号，在一些情况下甚至高于登革感染样品的信号(图7)。一些寨卡感染样品对寨卡igm呈阴性(低于igm截止值)，由此可以指示对应受试者曾处于寨卡感染的急性期。一些寨卡样品中寨卡igg较低，但寨卡igm较高，由此可以指示急性期寨卡感染。许多样品中寨卡igg和寨卡igm都较高。也可以随时间监测寨卡感染的过程，因为针对寨卡抗原的igg抗体的含量随症状发作之后经历的时间而增加。此外，可以使用寨卡igg含量确定寨卡感染的阶段。综合而言，结果指示仅测量针对寨卡抗原的igm抗体可能不足以区分寨卡感染与登革感染，而测量针对寨卡抗原的igg抗体(单独或与针对寨卡抗原的igm抗体的组合，和/或针对登革抗原的igg/igm抗体)明显增加区分这两种感染的能力。

结果指示，同时检测不同抗体同型(例如igg、igm和iga)可以用于区分不同类型的黄病毒感染。结果还验证了使用等离子体膜作为可以用于此类分析中的灵敏检测平台的实例。结果还指示，少量流体足以灵敏地检测感染，如少于1μl血清或全血(如从手指刺伤得到)，或唾液样品。加工时间也相对较快，且在约2小时内获得结果。

实例2：分析截止标准

zikvigg截止值(zikvigg＝0.02)是基于无先前黄病毒感染的一组健康样品的平均zikvigg含量并且通过对确定呈寨卡阳性的样品(利用临床参考结果)和健康对照样品的zikvigg含量进行roc分析确定。

zikvigg截止值(zikvigg＝0.14)是基于来自有过往denv感染的denv地方性流行区的一组样品的平均zikvigg含量并且通过对来自慢性denv感染患者的确定呈寨卡阳性的样品(利用临床参考结果)的zikvigg含量进行roc分析确定。

denvigg截止值(denvigg＝0.08)是基于健康对照样品的平均denvigg含量并且通过对确定感染denv的样品(利用临床参考结果)和无先前黄病毒感染的健康对照样品进行roc分析确定。

zikvigg或denvigg亲合力截止值(对于近期感染，igg亲合力<0.5；并且对于先前感染，igg亲合力>0.6)是通过用10m尿素溶液处理后血清样品上残留的zikv或denvigg含量限定并且利用有登革感染且无zikv感染的样品和有寨卡感染且有先前denv感染的样品测定。

实例3：在纳米技术平台上进行的寨卡病毒感染的多路复用测试

已开发出在纳米结构型等离子体金(pgold)平台上进行的用于检测血清中的zikv和denvigg/igm/iga的多路复用分析。等离子体金平台能够使近红外(nir)荧光放大多达约100倍，允许在6-7log动态范围内(图14)且以高信/噪比分析和/或定量多种蛋白质或抗体。pgold能够使用约1μl的血清样品体积，在单一分析中同时检测多达三种抗体亚型。由于纳米科学实现可见光到nir范围的荧光增强，故经历单一分析方案的单次稀释的样品可以在>6log动态范围内准确地检测针对多种抗原的igg/igm/iga以匹配参考数据16。

等离子体金(pgold)载片上多路复用抗原微阵列的制造：制备0.2mg/mlzikvns1抗原(英国的nativeantigencompany)、0.33mg/ml登革2抗原(纯化的登革2病毒粒子，来自加拿大的microbixbiosystemsinc.)并使用gesimnano-plotter2.1递送到pgold载片。每个微阵列由zikvns1抗原的3个微阵列斑点和登革2抗原的3个微阵列斑点组成。将约3.2nl抗原溶液递送到各斑点。微阵列遵循2×3布置，其中斑点直径是约400μm并且斑点之间的距离是1,000μm。在各pgold载片上形成16个相同的微阵列。制造的生物芯片用真空密封并在-20℃下储存待用。

多路复用分析程序：将制造的生物芯片整合于模块中，在所述模块中，将各生物芯片上的16个相同的微阵列分入16个孔中以加工总计16份样品。用阻断缓冲液阻断各生物芯片10分钟，随后培育人血清(300-400倍稀释)40分钟到一小时，并培育抗人igg-irdye680偶联物和抗人iga-irdye800偶联物的混合物15分钟(在单独分析中，施加抗人igg-irdye680和抗人igm-irdye800以标记捕捉的igg和igm抗体)。在各培育程序之前，用洗涤缓冲液洗涤各孔。将14份样品连同两份参考样品(一份血清样品是对zikvns1抗原和denv抗原呈阳性的igg、igm和iga，并且一份血清样品对结合至zikvns1抗原和denv抗原的igg、igm和iga呈阴性)施加至各生物芯片。分别通过irdye680和irdye800的荧光强度分析结合至各抗原的igg和iga的量。在单独分析中，通过以相同方式检测igg，同时用抗人igm-irdye800标记捕捉的人igm，同时检测igg和igm抗体。

多路复用分析程序：将制造的生物芯片整合于模块中，在所述模块中，将各生物芯片上的16个相同的微阵列分入16个孔中以加工16份样品。将各孔与人血清(400倍稀释)一起培育40分钟，随后培育10m尿素/pbst溶液10分钟。接着，将抗人igg-irdye680偶联物施加至各孔中并培育15分钟。在各培育程序之间用洗涤缓冲液洗涤各孔。将两份参考样品(一份血清样品是对zikvns1抗原和denv抗原呈阳性的igg、igm和iga，并且一份血清样品是对zikvns1抗原和denv抗原呈阴性的igg、igm和iga)施加至各生物芯片，但不用10m尿素/pbst溶液处理。

定性rt-pcr测试：从bocabiolistics获得zikvrt-pcr结果。根据供应商，利用在cobasz480或lightcycler2.0系统上并通过临床参考实验室执行的lightmix模块式寨卡病毒实时pcr分析获得zikvrt-pcr结果。利用cdcdenv-1-4实时rt-pcr试剂盒获得denvrt-pcr结果。如包装说明书中所描述，在rotor-geneq仪器上以多路复用方式执行所述分析。

数据分析：在分析程序之后，用midascan-ir^tm近红外扫描仪扫描各生物芯片。生成irdye680和irdye800荧光图像并通过midascan软件定量在各微阵列斑点上各通道的中值荧光信号。对于各样品、抗原和通道，计算3个斑点的3个中值荧光信号的平均值并利用参考样品，通过两点校准归一化。zikvigg截止值是由denv感染样品的平均zikvigg含量+3个标准差(3sd)限定。zikvigm截止值是由对照样品的平均zikvigm含量+3sd限定。zikviga截止值是由对照样品的平均zikviga含量+3sd限定。denvigg截止值是由对照样品的平均denvigg含量+3sd限定。denvigm截止值是由对照样品的平均denvigm含量+3sd限定。denviga截止值是由对照样品的平均denviga含量+3sd限定。由平均值+3sd方法确定的截止值产生在pgold上进行的zikv/denvigg/iga分析的最佳灵敏度和特异性组合。

在pgoldtm载片(美国的nirmidasbiotech,inc.)上构造包含zikvns1重组抗原(序列病毒株：乌干达mr766，在293人类细胞中产生；来自英国的nativeantigencompany)和登革2抗原(纯化的登革2病毒粒子，病毒株：16681，在vero细胞中培养；来自加拿大的microbixbiosystemsinc.)的微阵列(图12)。还研究了登革血清型1、3和4的抗原。使用pgold载片制造微阵列生物芯片，其中将pgold整合于具有16个孔的框架中，各孔含有由zikv抗原和denv抗原构成的2×3微阵列(图12)。将每份稀释的人血清样品施加至生物芯片的一个孔中，其中对zikv和denv抗原具有亲和力的人类抗体被捕捉于相应抗原斑点上。随后，将抗人igg-irdye680偶联物和抗人iga-irdye800偶联物的混合物施加至各孔中以标记捕捉的人igg和iga抗体(图12)。洗涤之后，利用荧光读取器读取pgold芯片并且分别通过irdye680和irdye800的荧光强度分析结合至各抗原的igg和iga的量。整个程序的周转时间是约2小时。在单独分析中，通过以相同方式检测igg，同时用抗人igm-irdye800标记捕捉的人igm，同时检测igg和igm抗体。

从六组患者获得血清样品并使用pgoldzikv和denvigg和igg亲合力分析进行研究：

1_z组：29位来自denv地方性流行的哥伦比亚的患者(购自medicalresearchnetworx,llc)，这些患者在哥伦比亚近期爆发期间在症状发作后2-93天被临床诊断患有zikv感染(在有zikv传播的区域生活或旅行并通过rt-pcr确定的显示zikv症状的人)(在2015年末到2016初期间采集的样品；表1a和表1b)；

2_d组：64位来自哥伦比亚、厄瓜多尔和洪都拉斯的临床诊断有denv感染的患者，在zikv引入美洲之前以及无已知zikv病例的斯里兰卡采集(表2)；

3_h组：50位无zikv或denv感染史的对照个体。

4_z组：49位来自denv地方性流行的多米尼加共和国的通过实验室zikvrt-pcr测试确定有急性zikv感染(症状发作后2-6天)的患者(购自bocabiolistics)。

5_dd组：8位来自斯里兰卡的患继发性denv感染(通过实验室denvrt-pcr测试确定有急性denv感染且先前患有高denvigg亲合力的denv感染)的患者。

6_zs组：从先前感染denv的2位zikv感染个体连续采集的2组血清样品(购自bocabiolistics)(表3a-c)。

如本文所使用，“阳性”、“pos”、“+”和“+ive”是指阳性测试。“阴性”、“neg”、“-”和“-ive”是指阴性测试。

表1a来自denv地方性流行的哥伦比亚的在症状发作后2-93天被临床诊断患有zikv感染的患者

表1b来自denv地方性流行的哥伦比亚的在症状发作后2-93天被临床诊断患有zikv感染的患者

***注释：y＝是；n＝否

表2.有关64位denv感染患者的临床和测试信息，包括患者人口统计信息、临床史和denvigg/igm/pcr参考测试结果(denvelisaigg试剂盒和panbiodenvigm捕捉elisa)

表3a.有关在感染过程期间的不同时间点从两位zikv感染患者采集的血清样品的临床信息和参考测试结果

表3b.有关在感染过程期间的不同时间点从两位zikv感染患者采集的血清样品的临床信息和参考测试结果

表3c.有关在感染过程期间的不同时间点从两位zikv感染患者采集的血清样品的临床信息和参考测试结果

表4a.来自三组患者的血清样品

表4b.来自三组患者的血清样品

***注释：y＝是；n＝否

从三组患者获得血清样品(表4a和4b)：(1)29位来自哥伦比亚的在哥伦比亚近期爆发期间被临床诊断患有zikv感染的患者(购自medicalresearchnetworx,llc)(在2015年末到2016年初期间采集且无denv感染史的样品)；(2)34位来自哥伦比亚、厄瓜多尔和洪都拉斯的临床诊断有denv感染的患者，在zikv引入美洲之前以及曾经无已知zikv病例的斯里兰卡采集；以及(3)42位无zikv或denv感染史的对照个体。对于多路复用检测针对zikv和denv抗原的抗体亚型，将各血清样品施加至zikv/denv抗原阵列。来自zikv感染患者的样品在6-log内稀释10²到10⁷倍并且观察到超过45log的nir荧光信号变化，优于常规平台，如平面玻璃(图14)。为了验证本公开的分析质量，用pgold基底执行针对denv抗原的igg和igm测试并与商业试剂盒(分别是focusdenguevirusiggdxselect和panbio登革igm捕捉elisa)相比较。如上文所描述并且如图1a-b和2a-b中所示，在pgold芯片上进行的多路复用分析得到与可商购的分析相当的测试结果。

在来自患有zikv感染和denv感染的患者的血清中zikvns1igm抗体含量重叠(图4图b，与通过cdc观察到的高igm交叉反应性相符)。然而，zikv感染患者血清中针对zikvns1抗原的igg抗体(图4图a)和iga抗体(图4图c)的含量明显高于denv感染患者和对照患者的血清中的含量。尽管一些denv感染个体显示的血清zikvigg信号高于对照组(图4图a，表明有限但较小的igg交叉反应性)，但0.14的zikvigg截止值能够区别约90％(29位中的26位)的zikv感染个体与denv感染个体(图4图a)。即使是在患病前七天期间从zikv感染患者采集的血清(即，在第一次报导症状与样品采集之间的1-7天)中，zikvigg含量也较高(图4图d以及表4a和4b)，在患病16-50天之间采集的样品中达到峰值，并且逐渐降低，但在疾病发作之后约100天仍保持阳性(图8图a)。

应注意，在来自zikv感染患者的样品中检测到的zikviga含量大体上高于在来自denv感染组和对照组的样品中检测到的含量(图4图c)。相较于zikv感染的临床诊断，针对zikvns1抗原的iga抗体含量的截止值0.25提供较高的阴性百分比符合率(npa是约98％，64位中有63位)和良好的阳性百分比符合率(ppa是约69％，29位中有20位)(图4图c)。在疾病发作之后1到65天，从zikv感染患者采集的血清中检测到阳性zikviga含量(图8图c)。可在比zikvigg短的时间段内检测到阳性zikviga，因为>65天时，iga变成阴性(图8图a对比图c)。在疾病发作之后1到65天采集的血清中还检测到阳性zikvigm抗体(图8图b)。

在来自对zikvigg抗体呈阴性的zikv感染患者的三份样品之一(图3图a中的开口圆，远低于igg截止值)中，检测到远高于截止值的zikviga含量(图3图a，空心圆)，表明近期zikv感染。因此，组合zikviga和igg测试可以改善急性zikv感染的诊断灵敏度。在zikv与denvigm抗体之间的交叉反应性可能妨碍使用igm区别这些感染(图4图b和图11)的情况下，zikvigg和iga抗体都是zikv感染个体特有的。

仔细检查揭示，50％(20份中有10份)的zikviga阳性样品是在症状发作后1-7天采集并且75％(20份中有15份)的zikviga阳性样品也呈zikvigm阳性(图3图b以及表4a和4b)，表明zikviga可以作为针对近期zikv感染的特异性生物标记物。在大多数情况下，zikviga阳性样品也呈zikvigg阳性(表4a和4b)，表明抗体亚型和除初始igg阴性时期以外的zikvigg连续测量值对于鉴别zikv感染的特异性(图8图a和图3图a)。

接下来分析来自zikv感染患者的血清，检测到针对denv2抗原的igg信号并观察到高抗体含量(图7图a和图10)。鉴于denv在哥伦比亚地方性流行并且所有这些患者都超过18岁，故他们先前可能曾暴露于denv。大部分(29份中有27份)来自zikv感染患者的样品所显示的结合至denv2抗原的igg含量都高于从近期感染denv的患者采集的样品的中值(图7图a)。由此可以反映哥伦比亚组针对黄病毒感染的二次反应。另外，使用登革1、3和4抗原(纯化的登革1、3和4病毒粒子，分别是西太平洋74、ch53489和tvp-360病毒株，全部在来自加拿大microbixbiosystemsinc.的vero细胞中培养)进行igg/igm/iga分析，并在zikv感染样品中观察到针对这些抗原的类似高igg信号结果(图10)。

从denv感染患者采集的血清样品中针对denv2抗原的iga抗体展示的信号强度变化与denv感染的阶段相关(图7图b)。不过，来自denv感染患者的样品中针对zikv抗原的iga含量较低(图7图b)，表明针对zikv感染有较高zikviga特异性。另外，对于denv感染组，88％的denv2iga阳性血清样品展现出高denv2igm含量(图7图c)，对应于处于急性期的denv感染。

在来自哥伦比亚的zikv感染患者的血清中，观察到针对denv2抗原(图15图a)以及denv血清型1、3和4抗原(纯化的denv1、3和4病毒粒子，分别是西太平洋74、ch53489和tvp-360病毒株)的较高igg抗体含量。鉴于denv在哥伦比亚地方性流行并且所有这些患者都超过18岁，故他们先前可能曾暴露于denv。在自哥伦比亚的所有zikv感染患者中检测到较高(大于0.6)的denvigg亲合力水平(图15图b)，证实这些患者有过往denv感染。哥伦比亚的所有zikv感染患者都展示较低(<0.5)的zikvigg亲合力水平(图15图c)，证实哥伦比亚患者近期首次感染zikv的事实。zikvigg亲合力随疾病发作后天数的增加而增加的趋向(图15图c)揭示有可能使用zikvigg亲合力测试区别近期与过往zikv感染。结果还表明，在登革地方性流行区，由于存在针对zikv和denv的有限但较小的igg抗体交叉反应性，应当使用参照先前曾感染denv的群体的zikvigg截止值。如在哥伦比亚组中所观察到的，这一方法允许对症状发作后数天的zikv感染进行高度特异性血清诊断。

在症状发作数天内采集的哥伦比亚样品中有一部分具有高zikvigg含量，使得能使用来自多米尼加共和国的通过rt-pcr确定呈zikvrna阳性的一组49份样品进一步调查针对极早期急性期感染的zikvigg。为作比较，测试了具有急性继发性denv感染的8份denv血清样品，这些样品通过rt-pcr确定呈denvrna阳性并且显示高denvigg亲合力。阳性denvigg含量(图16图c)和高(大于0.6)denvigg亲合力(图16图d)表明，所有这些来自登革地方性流行区的患者都具有过往denv感染。

与由哥伦比亚组得到的发现相符，在来自zikv感染患者的样品中有约47％检测到高阳性zikvigg和/或iga含量，所述患者通过rt-pcr测定全部对zikvrna呈阳性(图16图a和图16图e)。由于这一组中的全部49位患者都患有急性zikv感染并且在症状发作后2-6天采集试样，故针对这一组的zikvigg和iga测试的灵敏度低于来自哥伦比亚组的zikv感染患者的灵敏度。来自多米尼加共和国的所有zikvigg阳性样品都显示出低(<0.2)zikvigg亲合力(图16图b)。值得关注的是，这些值小于由哥伦比亚zikv感染组的试样得到的值，所述试样中有许多是在恢复期采集。由此进一步证实，早期的原发性急性zikv感染可通过rt-pcr检测。

来自患有急性期继发性denv感染且由于过往denv感染而在血液中可检测到denvrna并具有高denvigg亲合力的患者的样品显示出阳性denvigg和iga含量(图16图c和图16图f)，和阴性zikvigg和zikviga含量(图16图a和图16图e)，表明利用来自denv地方性流行区的两个zikv组观察到的阳性zikvigg和iga含量不是因为预先存在的交叉反应性抗denv抗体，而是初生的特异性抗zikv抗体。

在从哥伦比亚获得并在症状发作的1-7天内采集的一些样品中的高zikvigg含量情况下引起针对极早期急性期感染的zikvigg的进一步调查。测试来自多米尼加共和国的rt-pcr测定针对zikvrna呈阳性的一组49份急性zikv感染患者的血清样品。为作比较，还对通过rt-pcr鉴别为denvrna阳性(由于急性denv感染)的来自处于急性继发性denv感染期的患者的8份denv血清样品进行测试。同时，结果显示高denvigg亲合力(由于过往denv感染)。与由哥伦比亚组得到的发现相符，在通过rt-pcr测定对zikvrna呈阳性的来自多米尼加共和国的许多样品中检测到较高的阳性zikvigg含量(图17图a)。来自多米尼加共和国的所有zikvigg阳性样品都显示出较低(小于约0.2)的zikvigg亲合力(图17图b)，并且平均亲合力值低于来自哥伦比亚的处于zikv感染恢复期的试样的平均亲合力值(寨卡1，图17图b)。这些结果证实了在极早期pcr+期间原发性、急性zikv感染样品中存在可检测的zikvigg含量和低igg亲合力。

此外，当参照无先前黄病毒感染的健康组时，在通过rt-pcr测定呈zikvrna阳性的49份急性zikv感染患者的血清样品组中检测到96％的阳性zikvigg含量(寨卡，图17图a)。特异性达到约96％，确定在登革地方性流行区中患有急性zikv感染的人体内zikvigg迅速地升高。

比zikvigg通常在疾病发作数天内出现要早可能是因为来自登革地方性流行区的zikv感染组的继发性感染性质。这些区域是使几乎所有的成年人先前都暴露于denv的区域。先前的研究表明，稳定的igg和iga反应可能在继发感染事件期间早期发生。

已开发出多色多路复用纳米平台，使用约1μl的人血清样品，同时检测针对zikvns1和denv-2完整病毒抗原的igg和iga抗体以区别zikv感染与denv感染。已发现，对于在疾病发作之后4天或更多天采集的pcr阴性样品，在原初群体中进行zikvigg测试可以允许准确地诊断zikv感染患者。zikviga的添加可以进一步增加测试灵敏度并确定近期zikv感染。连续检测zikvigg含量可以进一步改善zikv诊断的准确性。

在疾病发作的数天内高zikvns1igg和iga抗体含量的检测对zikv感染具有特异性，这一发现不同于在zikv情形中通常实行的受交叉反应性问题困扰的igm测试。相较于常规的单重方法(即，elisa、prnt)，在本文所提供的pgold上进行多路复用和多抗体同型检测明显有助于检测并且可以急剧减少将来诊断应用所需的测试次数，由此增强在大流行性疾病爆发期间筛查大量样品的能力。此外，组合igg/zikv/denv分析仅使用约1μl的人血清并且在约2小时内获得定量结果，这对于其它免疫分析平台来说是一项颇具挑战的任务。因此，在pgold平台上检测抗zikvns1igg和iga抗体可以有助于在zikv感染大流行性扩散到美洲的原初群体期间筛查近期寨卡热。zikvigg/iga测试还可以用作孕早期血清学筛查，用以鉴别有血清反应阴性风险的妇女并监测妊娠期间的感染。

通过测量由zikvdetecttmigm捕捉elisa(inbiosinternational,inc.)诊断为寨卡阳性的10份样品中zikvigg抗体的含量，测试pgoldzikvigg分析的稳健性。zikvdetecttmigm捕捉elisa是由美国食品和药物管理局(fda)授权的基于igm的分析。对于其它组的zikv感染患者，观察到所有zikv感染患者的zikvigg含量增加(图18)。利用参照慢性denv感染患者的高igg截止值，pgoldigg分析以针对10份的小型样品规模90％的灵敏度和100％特异性检测到阳性zikv感染(图18图a)。此外，利用参照无先前黄病毒感染的健康群体的igg截止值，用inbiosigm+样品，以100％灵敏度和100％特异性检测到zikv感染(图18图a)。

另外，通过基于igm的elisa分析确定测试的所有zikv感染样品(inbiosigm+)为igm阳性。然而，当测试同一组样品的zikvigm含量时，利用参照慢性denv感染患者的igm截止值，观察到灵敏度明显降低(50％)(图18图b)。基于这些igg/igm结果和基于igm的测试在文献中有充分记载的交叉反应性问题，可以得出结论，使用pgoldzikv分析进行基于igg抗体的检测以比zikvigm高的特异性实现针对zikv感染的高灵敏度测试。特别推荐在登革地方性流行区中包括zikvigg测试，以使zikv诊断具有比igm测试高的特异性。

在大部分成年人先前有denv感染的登革地方性流行区中，可以通过pgoldzikvigg和igg亲合力测试对zikv感染进行高灵敏度和特异性血清诊断。当使用参照无先前黄病毒感染的健康人的截止值时，在症状发作时，zikvigg测试可以达到针对急性zikv感染的100％灵敏度，和超过90％的特异性。亲合力测试可以检测近期zikv感染。作为约一个月(或2-3周，类似于恢复期哥伦比亚样品)的跟踪测试，推荐使用参照先前denv感染群体的截止值，用pgoldzikvigg分析进行再测试。阳性结果可以通过大于95％的灵敏度和特异性确定zikv感染。还可以再测试zikvigg亲合力以评估zikv感染的恢复程度。

使用pgold寨卡和登革igg分析，寨卡感染患者体内的zikv特异性igg抗体含量(1_z组：主要处于恢复期)明显高于无黄病毒对照组的血清和慢性登革感染患者(2_d组)中的含量。pgold寨卡igg分析以100％灵敏度和100％特异性鉴别处于感染恢复期的zikv感染患者与无黄病毒对照组(截止值是约0.02)，并且以>93％灵敏度和约98％特异性检测慢性denv感染组的zikv感染(zikvigg含量截止值是0.14)。由于先前denvigg与zikvns1抗原存在一定交叉反应性，使得对于有过往denv感染的患者体内的zikvigg可以使用略微高于无黄病毒组的截止值。使用pgold寨卡和登革igg分析对来自哥伦比亚的zikv感染患者进行亲合力测试；低zikvigg亲合力(≤0.4)表明近期zikv感染。观察到这一患者组有高denvigg含量并且denvigg亲合力>0.5，表明在denv地方性流行的哥伦比亚先前暴露于登革。

来自继发性denv感染急性期的患者的样品(5_dd组)揭示阳性denvigg含量，但较低的zikvigg含量。由此表明，在来自登革地方性流行区的zikv感染组中观察到的阳性zikvigg含量不是由预先存在的交叉反应性抗denv抗体引起，而是由初生的特异性抗zikv抗体引起。

当测试一组49位急性zikv感染患者(4_z组；通过rt-pcr测定呈zikvrna阳性，样品在症状发作后2-7天采集)时，pgold寨卡和登革igg分析检测到大部分样品的zikvigg含量高于相对于无黄病毒对照组的截止值0.02。在疾病症状发作的7天内出现zikvigg可以是来自登革地方性流行区的zikv感染组的继发感染性质的结果。在这些区域中，大部分成年人先前曾暴露于denv。其它结果表明，稳定的igg反应可以在继发感染事件期间早期发生。

使用pgold寨卡和登革igg和igg亲合力分析，测试在症状发作之后的各个时间点连续采集的两组血清样品(即，连续抽吸样品；6_zs组)。在患者1中，早在症状发作后2天和5天就检测到阳性zikvigg含量>0.14，并且在症状发作后13天，zikvigg含量增加到高得多的水平。在患者2中，在症状发作后第7天，检测到zikvigg含量>0.02但小于0.14，但在症状发作后第11天，增加到远高于0.14的较高截止值。这些结果指示，在疾病发作时使用pgoldzikvigg测试，以及在症状发作后2周使用演算法跟踪测量，zikvigg是具有高灵敏度和特异性的诊断标记物。此外，6_zs组中的两位患者在所有时间点采集的血清样品具有小于0.5的zikvigg亲合力水平(低亲合力)，表明近期感染。然而，在所有时间点测试两位患者的denvigg亲合力水平>0.6(高亲合力)，确定其过往denv感染史。pgold寨卡和登革igg和igg亲合力分析可以使用1μl血清样品，在约2小时分析时间内得到高灵敏度和特异性zikv诊断。

实例4：对照样品测试

可以在各生物芯片上测试zikvigg的阳性和阴性对照物以及人血清样品。如果分析结果针对阳性对照样品显示阴性结果或针对阴性对照样品显示阳性结果，则无法报导分析结果。在解释患者结果之前，可以检查所有对照样品。如果对照物无效，则无法解释患者结果。在检查过阳性和阴性对照物并确定这些对照物有效且可接受之后，可以对临床试样测试结果执行评估。

已提出两种测试。测试1可以在疾病发作期执行以测量：(a)针对寨卡病毒ns1抗原的人igg抗体；(b)针对2型登革病毒抗原的人igg抗体；(c)针对寨卡病毒ns1抗原的人igg亲合力；以及(d)针对2型登革病毒抗原的人igg亲合力。测试2可以在疾病发作后14天执行以测量对寨卡病毒ns1抗原具有特异性的人igg抗体。

表5说明，在测试1期间，测试所有血清样品中针对zikvns1的igg、针对denv2的igg、寨卡igg亲合力和登革igg亲合力。此外，如果在测试1中，在症状发作后14天之前采集样品，则可以对在症状发作后第14天采集的血清样品执行跟踪测试(测试2)。在测试2期间，检测针对寨卡ns1的igg。

表5.分析针对患者进行的用于检测和诊断寨卡的两种测试.

表5：(1)在测试1期间，检测所有血清样品中针对zikvns1的igg、针对denv2的igg以及寨卡igg亲合力和登革igg亲合力；(2)如果在测试1中，在症状发作后14天之前采集样品，则将对在症状发作后第14天采集的血清样品执行跟踪测试(测试2)。在测试2中，检测针对寨卡ns1的igg

针对在症状发作后14天或更长时间采集的血清样品进行的测试1存在四种实验情形。在情形1中，如果denvigg呈阴性(denvigg<0.08)，则患者无先前denv感染。如果zikvigg>0.02，则患者感染zikv。而且无需跟踪测试(即，测试2)。zikvigg亲合力可以判定是近期感染(亲合力<0.5)还是过往感染(亲合力>0.6)。在情形2中，如果denvigg呈阴性(denvigg<0.08)，则患者无先前denv感染。如果zikvigg<0.02，则患者未感染zikv。而且，无需跟踪测试(即，测试2)。在情形3中，如果denvigg呈阳性(denvigg>0.08)并且denv亲合力>0.6，则患者先前患有慢性denv感染。如果zikvigg>0.14，则患者感染zikv。无需跟踪测试(即，测试2)。zikvigg亲合力可以判定是近期感染(亲合力<0.5)还是过往感染(亲合力>0.6)。在情形4中，如果denvigg呈阳性(denvigg>0.08)并且denv亲合力>0.6，则患者先前患有慢性denv感染。如果zikvigg<0.14，则患者未感染zikv。无需跟踪测试(即，测试2)。

此外，针对在症状发作后14天之前采集的血清样品进行的测试1存在四种实验情形。在情形1中，如果denvigg呈阴性(denvigg<0.08)，则患者无先前denv感染。如果zikvigg>0.02，则患者可能感染zikv。如果zikvigg保持阳性(zikvigg>0.02)或正值增加，由此证实zikv感染，则可能需要在症状发作后14天进行测试2。在测试1中测试的zikvigg亲合力可以判定是近期感染(亲合力<0.5)还是过往感染(亲合力>0.6)。在情形2中，如果denvigg呈阴性(denvigg<0.08)，则患者无先前denv感染。如果zikvigg<0.02，则在症状发作后14天可能需要进行测试2。如果zikvigg变成阳性(zikvigg>0.02)，则确定近期zikv感染。如果zikvigg保持阴性(zikvigg<0.02)，则患者未患zikv感染。在情形3中，如果denvigg呈阳性(denvigg>0.08)并且denvigg亲合力>0.6，则患者先前患有慢性denv感染。如果zikvigg>0.14，则患者感染zikv。可能需要测试2。在症状发作后14天，如果zikvigg保持阳性(zikvigg>0.14)或正值增加，则确定患者感染zikv。在测试1中测试的zikvigg亲合力可以判定是近期感染(亲合力<0.5)还是过往感染(亲合力>0.6)。在情形4中，如果denvigg呈阳性(denvigg>0.08)并且denvigg亲合力>0.6，则患者先前患有慢性denv感染。如果zikvigg<0.14，则可能需要测试2。在症状发作后14天，如果zikvigg变成阳性(zikvigg>0.14)，则确定患者感染zikv。如果zikvigg<0.14，则样品对zikv感染呈阴性。

实例5：交叉反应性和干扰物质测试

可以通过用针对其它微生物的抗体和可能引起假阳性结果的自身抗体测试患者试样来评价交叉反应性。除已知与寨卡igm血清学分析交叉反应的其它黄病毒外，可以对表6中所列各感染物的最少3-5份样品进行测试。在此情形中，应当测试大量的试样(≥10份)。

可以通过用可能引起假阳性结果的确定的针对其它微生物的igg抗体测试患者试样，评价可能存在的与针对其它疾病的igg的交叉反应性。这一交叉反应性评价包含针对感染产生的症状类似于寨卡病毒感染发作时所观察到的症状的生物体以及由于与寨卡病毒具有基因相似性而很可能具有交叉反应性的病毒株的igg阳性血清。还包括针对在当前受感染且地方性流行区(即，巴西和南美)中可能观察到的生物体和病毒株的igg阳性血清，因为这些生物体和病毒株可以是鉴别诊断寨卡病毒感染与来自其它疾病状态的血清的重要部分。

表6.用于交叉反应性研究的针对感染物的参考测试结果

*本研究中使用的阳性血清应当来自处于感染早期的感染个体，其中igm含量将占优势。

^可能时，请包括试样中igm抗体的浓度/效价。

^$由于已知这些试剂与寨卡igm血清学分析具有交叉反应性，应当测试大量的试样(≥10份)。

^#为了评价自体免疫病况干扰寨卡igm血清学的可能性，应当测试大量的试样(≥10份)

获得阳性血清样品(利用临床参考数据；表7基孔肯雅igg、埃-巴二氏病毒igg、细小病毒igg、水痘带状疱疹病毒igg、西尼罗病毒igg、巨细胞病毒igg和抗核抗体，来自尼斯索菲亚安蒂波利斯大学(universitiedenice-sophiaantipolis)的病变和真菌学实验室(laboratoryofpathologyandmycology)(法国；补充表4))。在pgold寨卡和登革igg分析平台上测试所有样品并评价其与印刷于pgold生物芯片上的zikv和denv抗原的反应性。所有非denv样品(denvigg<0.08，即无先前denv感染的患者)均显示zikvigg<0.02，表明基孔肯雅、埃-巴二氏病毒、细小病毒、水痘带状疱疹病毒、西尼罗病毒、巨细胞感染的血清样品中的抗体，或自体免疫患者中的其它抗核抗体与zikv无igg交叉反应性。

此外，还在pgold寨卡和登革分析上测试对其它感染性疾病呈阳性的部分样品对denvigg呈阳性。对于这些样品(denvigg含量≥0.08，即鉴别为先前患denv感染的患者)，zikvigg<0.14，表明这些患者不具有zikv感染及先前denv感染。演算法中略微较高的截止值消除了由交叉反应性引起的问题。

表7.用于交叉反应性研究的血清样品的参考测试结果

在另一组实验中，评价可能存在的干扰物质对pgold寨卡/登革igg分析的影响。所述评价展示，可能存在的干扰物不会在已知阴性试样中产生假阳性结果，并且不会在已知阳性试样中引起假阴性结果。

利用pgold寨卡igg分析评价通常存在于血清中的可能的干扰物质。干扰物质包括胆红素(0.2mg/ml)、血红蛋白(160mg/ml)和白蛋白(150mg/ml)。将这些干扰物质掺加在低反应性(n＝3)和正常人血清样品(n＝3)中以评价其对分析性能的影响。所述干扰物质不会在所评价的低反应性样品或正常人血清样品中引起zikvigg含量的统计显著变化，并且不会改变解释结果。

可以在潜在干扰物质的预期临床范围内评价干扰物质的影响。内源性干扰的可能来源包括但不限于表8a和8b中所列的物质。干扰的评价和假阴性结果的产生可以使用在分析截止值处或附近的样品进行，并且制备设计样品(即，在阴性临床基质中稀释的高效价阳性临床试样)以达到分析截止值是可接受的。如果在这些研究期间观察到干扰，则应当通过连续稀释测试干扰物以测定提供干扰的最低浓度。分析限制可以添加至使用说明书以解决任何观察到的干扰。

表8a干扰物质：pgold寨卡和登革igg分析。评价干扰物质产生假阳性结果的能力：

表8b干扰物质：pgold寨卡和登革igg分析。下表是评价干扰物质产生假阴性结果的能力的实例：

如果在这些研究期间观察到干扰，则应当通过连续稀释测试干扰物以测定提供干扰的最低浓度。分析限制可以添加至使用说明书以解决任何观察到的干扰。

实例6：临床灵敏度和特异性

pgold寨卡和登革igg分析(测试1和2组合，测试2在症状发作后14天完成)检测症状发作后≥14天的zikv感染患者，且参照无黄病毒对照组，灵敏度是100％(截止值是约0.02)。本研究中使用来自1_z组(14份样品)和3_h组(50份样品)的样品。此外，pgold寨卡和登革igg分析检测症状发作后≥14天的zikv感染患者，且对于慢性denv感染组，灵敏度是93％(zikvigg含量截止值是0.14)。本研究中使用来自1_z组(14份样品)、6_zs组(2份样品)、2_d组(64份样品)和3_h组(50份样品)的样品。最后，pgold寨卡和登革igg分析检测症状发作后≥14天的zikv感染患者，且对于慢性denv感染组，灵敏度是95％(zikvigg含量截止值是0.14)。本研究中使用来自1_z组(14份样品)、6_zs组(10份样品)、2_d组(64份样品)和3_h组(50份样品)的样品。在症状发作后≥14天从zikv感染患者采集的连续抽吸的血清样品(6_zs组)被视为个体样品。在用于过往denv感染患者的演算法中需要的zikvigg截止值略高于无黄病毒组，因为denvigg与zikvns1抗原存在轻微交叉反应性。

pgold寨卡和登革igg分析(测试1和2组合，测试2在疾病发作后14天进行)检测处于感染恢复期(≥14天)的zikv感染患者，且相对于无黄病毒对照组，具有100％特异性(截止值是约0.02)。本研究中使用来自1_z组(14份样品)和3_h组(50份样品)的样品。此外，pgold寨卡和登革igg分析检测处于感染恢复期(≥14天)的zikv感染患者，并且相对于慢性denv感染组，具有98％特异性(zikvigg含量截止值是0.14)。本研究中使用来自1_z组(14份样品)、6_zs组(2份样品)、2_d组(64份样品)和3_h组(50份样品)的样品。在用于过往denv感染患者的演算法中需要的zikvigg截止值略高于无黄病毒组，因为denvigg与zikvns1抗原存在轻微交叉反应性。

实例7：临床真据(clinicaltruth)评价

在使用阳性试样确定寨卡病毒igm分析的临床灵敏度的情况下，从最初通过euarrt-pcr寨卡病毒分析测试呈阳性的连续个体血液获得的试样表示最有说服力的临床真据。基于cdc提供的信息，预期由rrt-pcr测定最初针对寨卡病毒呈阳性结果之后是同时或后续连续试样在较短时间段内对寨卡病毒igm呈阳性结果。这些试样中igm的存在可以通过eua血清学igm分析表征。理想的情况是，利用分子方法，患者还可以对其它黄病毒，即登革、西尼罗和黄热病(感染或疫苗接种)，以及甲病毒基孔肯雅病毒的急性感染呈阴性。此外，使用验证的测试演算法测试的临床试样也可以用于临床真据评价中，所述测试演算法包括针对用于阳性和阴性样品的eua血清学igm分析的测试。

实例8：临床样品测试

起初，通过测试从来自登革地方性流行区的10位确定对寨卡病毒呈阳性的患者连续采集的血清样品展示了所述方法的可行性。还可以获得在疾病症状发作时和之后一个月连续采集的样品。

可以获取从个体(在denv地方性流行区中)连续采血获得的试样，这些试样起初通过eua或fda批准的rrt-pcr寨卡病毒分析测试呈阳性。相对于参照无任何先前黄病毒感染的健康人的截止值，有可能利用这些样品观察到阳性zikvigg结果，并且之后一个月，使用高于有先前慢性denv感染的群体的截止值，观察到阳性zikvigg含量。还可以依序测量zikvigg亲合力，并且可以观察到连续采血起初较低的亲合力和亲合力递增的趋向。大于0.5的高zikv亲合力可以表明慢性zikv感染。在当前的一些zikv地方性流行区，情形就是如此。

可以从通过cdcmac-elisa(eua)或inbioszikvdetectigm捕捉elisa(eua)确定对寨卡病毒感染呈阴性的10位患者采集试样。在这10位临床呈阴性的患者中，约50％可以来自非黄病毒地方性流行区的个体，并且约50％可以来自其它黄病毒感染有较大发生率的区域的个体。可以预期这些样品在疾病症状发作时和一个月跟踪测试时的阴性zikvigg测试结果。

在可行性测试之后，可以使用来自50位rrt-pcr确定处于急性疾病发作期和发作后1个月的zikv感染患者的血清样品，以及100份阴性样品进行最终临床验证，所有人都来自denv地方性流行区。阴性样品是临床上(无寨卡症状)，或通过cdcmac-elisa(eua)或inbioszikvdetectigm捕捉elisa(eua)确定。

处于急性pcr+期的五十份zikv感染患者样品与pgoldzikvigg分析的组合可以完全确定参照健康的未感染群体，zikvigg测试的灵敏度和特异性是约100％。对于患有慢性登革感染的成年群体，在感染后一个月的恢复期依序测试的50份zikv感染患者样品可以确定对于登革地方性流行区中zikv感染诊断大于约95％的灵敏度和特异性。因此，依序对这些样品进行的zikvigg亲合力分析可以揭示igg亲合力随时间增加，进一步确定近期zikv感染；或检测到高zikvigg亲合力，指示先前zikv感染。

zikv感染样品也可以从非登革地方性流行区，例如在美国或欧洲的无先前黄病毒感染的人获得。可以使用相对于健康未感染群体的zikvigg截止值检查急性期的zikvigg含量以及之后一个月的zikvigg含量。可以确定zikvigg是否与登革地方性流行区的群体同样迅速地升高。两个阶段的igg和亲合力测试可以在接近100％灵敏度和特异性下诊断zikv感染。还可以执行igm测试以确定zikvigm分析是否对无任何先前登革感染的个体中的zikv具有较高特异性。

虽然在本文中已经显示和描述本发明的优选实施方案，但本领域的技术人员应显而易见，此类实施方案只是作为举例而提供。本领域的技术人员现将在不脱离本发明的情况下想到众多变型、变化和取代。应理解，本文所描述的本发明的实施方案的各个替代方案都可以用于实践本发明。预期随附权利要求书界定本发明的范围，并因此涵盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。