本发明涉及对淀粉样蛋白球体(aspd)与神经细胞的结合具有的结合抑制能力的肽、以及其评价方法及其筛选方法。
背景技术
淀粉样蛋白球体(amylospheroids(aspd))是约30个淀粉样蛋白β蛋白(aβ)聚集而成的直径为约10nm的球状的aβ集合体,其被认为是在阿尔兹海默病发病的不可逆阶段发挥重要作用的结构体。
aspd最初作为显示强神经毒性的体外合成的aβ集合体(即合成aspd)而被分离(非专利文献1)。已制作了针对该合成aspd的特异性抗体(专利文献1及2),并使用该抗体从阿尔兹海默病的人患者的脑中实际分离到在生物体内形成的aspd(即天然aspd)(非专利文献1)。
天然aspd以及合成aspd同样地选择性地诱导成熟神经细胞发生细胞死亡。发现该神经细胞死亡中的aspd的靶是对神经的生存和功能发挥极为重要的作用的突触蛋白“na+,k+-atpase泵的α3亚单位(以下称为nakα3)”,并清楚了通过aspd的结合,nakα3的功能降低,神经细胞过度兴奋,由此导致神经细胞死亡(专利文献3、非专利文献2)。另外,还报告了能够抑制aspd与nakα3相互作用的肽(专利文献3、非专利文献2)。
与阿尔兹海默病的临床症状最为相关的是神经细胞的脱落。清楚了可见神经细胞脱落的阿尔兹海默病患者的大脑皮层中的天然aspd量与阿尔兹海默病的重症度相关地增加,而未明确可见神经细胞脱落的阿尔兹海默病患者的小脑中的天然aspd量仅微量存在(非专利文献3)。因此认为aspd在阿尔兹海默病发病的不可逆阶段发挥重要的作用。此外,从路易体痴呆症患者的脑中也检测到天然aspd(非专利文献3),认为对于路易体痴呆症,天然aspd也在其发病中发挥重要的作用。
被认为与天然aspd等价的合成aspd可通过缓慢搅拌含有aβ的液体来制造(非专利文献1、专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:wo2006/016644
专利文献2:wo2009/057664
专利文献3:wo2013/099806
专利文献4:wo2013/094614
非专利文献
非专利文献1:hoshietal.,sphericalaggregatesofβ-amyloid(amylospheroid)showhighneurotoxicityandactivatetauproteinkinasei/glycogensynthasekinase-3β,pnasmay27,2003vol.100no.116370-6375
非专利文献2:ohinishietal.,na,k-atpaseα3isadeathtargetofalzheimerpatientamyloid-βassembly,pnasaugust11,2015vol.112no.32e4465-e4474
非专利文献3:noguchietal.,isolationandcharacterizationofpatient-derived,toxic,highmassamyloidbeta-protein(abeta)assemblyfromalzheimerdiseasebrains,jbiolchem.2009nov20;284(47):32895-905
技术实现要素:
发明所要解决的课题
考虑如果能够抑制aspd与神经细胞结合,则能够抑制aspd与神经细胞的相互作用,从而能够避免由aspd引起的神经细胞死亡。另外,认为如果可得到能够抑制aspd与神经细胞结合的物质,则能够有助于针对阿尔兹海默病或路易体痴呆症等的治疗方法的开发。
因此,本发明在一个方式中提供一种能够抑制aspd与神经细胞结合的肽。
用于解决课题的手段
本发明在一个方式中涉及一种经合成、分离或纯化的多肽,其包含由下述式(i)表示的氨基酸序列,
x1x2x3x4(i)(序列号1)
x1为r、h或k,
x2为r、k、d、h、w、q、y或t,
x3为任意的氨基酸,
x4为w、f或y。
本发明在一个方式中涉及一种经合成、分离或纯化的多肽,其包含由下述式(ii)表示的氨基酸序列,
x1x2x3x4(ii)(序列号2)
x1为r、h或k,
x2为任意的氨基酸,
x3为l、g、i、w、r、m、d、e、a、v或k,
x4为w、f或y。
本发明在一个方式中涉及一种经合成、分离或纯化的多肽,其具有由hanw、hvnw、hfhw或hfyw表示的氨基酸序列。
本发明在一个方式中涉及具有模拟本发明的多肽结构的结构的模拟肽,其对aspd与神经细胞结合具有结合抑制能力。
本发明在一个方式中涉及一种用于表达上述多肽的载体,其包含编码本发明的多肽的多核苷酸。另外,在另一方式中,涉及一种组合物,其含有本发明的多肽或本发明的模拟肽。
本发明在另一个方式中涉及一种评价抑制aspd与神经细胞结合的物质的方法,其包含下述工序:
使含有评价对象物质和aspd的混合液与培养神经细胞接触,或者使aspd与评价对象物质存在下的培养神经细胞接触,
在所述接触后,分别对aspd及神经细胞进行不同的标记并进行成像,和
根据所述成像数据得到aspd与神经细胞结合的指标,使用所述指标对评价对象物质进行评价。
本发明在另一个方式中涉及一种筛选抑制aspd产生的神经毒性的物质的方法,其包含下述工序:
使含有候选物质和aspd的混合液与培养神经细胞接触,或者使aspd与候选物质存在下的培养神经细胞接触,
在所述接触后,分别对aspd及神经细胞进行不同的标记并进行成像,和
根据所述成像数据得到aspd与神经细胞结合的指标,使用所述指标选择候选物质。
附图说明
图1是对神经细胞和aspd进行荧光免疫染色并进行荧光显微镜观察的结果的一个例子。在使aspd单独与神经细胞接触的情况和在用特定的肽对aspd进行前处理的情况下,使所添加的aspd的浓度发生变化、进行比较。
图2表示可根据显微镜观察的结果制作的、表示所添加的aspd浓度与结合于神经细胞的aspd量的关系的图表的一个例子。
图3表示评价横轴所示的肽对aspd与神经细胞结合的结合抑制能力的图表的一个例子。
图4表示评价横轴所示的肽对aspd与神经细胞结合的结合抑制能力的图表的一个例子。
图5表示评价横轴所示的肽对aspd与神经细胞结合的结合抑制能力的图表的一个例子。
具体实施方式
本发明在一个方式中涉及下述的第1及第2肽。即,本发明在一个方式中涉及具有下述式(i)或(ii)所示的氨基酸序列的肽。
[第1肽]
本发明在一个方式中涉及一种经合成、分离或纯化的多肽(以下也称为“第1肽”),其包含由下述式(i)表示的氨基酸序列。
x1x2x3x4(i)(序列号1)
式(i)中,
x1为精氨酸(r)、组氨酸(h)或赖氨酸(k),
x2为精氨酸(r)、天冬氨酸(d)、谷氨酰胺(q)、组氨酸(h)、赖氨酸(k)、苏氨酸(t)、色氨酸(w)或酪氨酸(y),
x3是任意的氨基酸,
x4是色氨酸(w)、苯丙氨酸(f)或酪氨酸(y)。
式(i)中,x1在一个或多个实施方式中,从抑制aspd与神经细胞结合的观点出发,优选为r或h,更优选为h。
式(i)中,x2在一个或多个实施方式中,从同样的观点出发,
优选为h、w、q、y或t,
更优选为h或t。
式(i)中,x3在一个或多个实施方式中,从同样的观点出发,
优选为丙氨酸(a)、精氨酸(r)、天冬酰胺(n)、天冬氨酸(d)、半胱氨酸(c)、谷氨酰胺(q)、谷氨酸(e)、甘氨酸(g)、组氨酸(h)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、赖氨酸(k)、蛋氨酸(m)、脯氨酸(p)、丝氨酸(s)、苏氨酸(t)、色氨酸(w)、酪氨酸(y)或缬氨酸(v),
更优选n、l、g、i、w、r、m、d、e、a、v、k、h或y,
进一步优选为n、l、i、w、r、d、k、h或y,
更进一步优选为n、r、k、h或y。
式(i)中,x4在一个或多个实施方式中,从同样的观点出发,优选为w。
作为式(i)所示的氨基酸序列的一个或多个实施方式,可以举出下述表1的肽02~11的氨基酸序列,可以举出hhnw、hwnw、hqnw、hynw和htnw,或者可以举出hhnw和htnw。
[第2肽]
本发明在一个方式中涉及经合成、分离或纯化的多肽(以下也称为“第2肽”),其包含由下述式(ii)表示的氨基酸序列。
x1x2x3x4(ii)(序列号2)
式(ii)中,
x1为精氨酸(r)、组氨酸(h)或赖氨酸(k),
x2为任意的氨基酸,
x3为亮氨酸(l)、甘氨酸(g)、异亮氨酸(i)、色氨酸(w)、精氨酸(r)、蛋氨酸(m)、天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)、丙氨酸(a)、缬氨酸(v)或赖氨酸(k),
x4为苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)或酪氨酸(y)。
式(ii)中,x1在一个或多个实施方式中,从抑制aspd与神经细胞结合的观点出发,优选为r或h,更优选为h。
式(ii)中,x2在一个或多个实施方式中,从同样的观点出发,
优选为丙氨酸(a)、精氨酸(r)、天冬氨酸(d)、谷氨酰胺(q)、甘氨酸(g)、组氨酸(h)、异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、赖氨酸(k)、蛋氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、脯氨酸(p)、苏氨酸(t)、色氨酸(w)、酪氨酸(y)或缬氨酸(v),
更优选为f、r、k、d、h、w、q、y、t、a或v,
进一步优选为f、h、w、q、y、t、a或v,
更进一步优选为f、h、t、a或v。
式(ii)中,x3在一个或多个实施方式中,从同样的观点出发,
更优选为l、i、w、r、d或k,
进一步优选为r或k。
式(ii)中,x4在一个或多个实施方式中,从同样的观点出发,优选为w。
作为式(ii)所示的氨基酸序列的一个或多个实施方式,可以举出下述表2的肽12~24的氨基酸序列,可以举出hflw、hfiw、hfww、hfrw、hfdw和hfkw,或者可以举出hfrw和hfkw。
[第3肽]
本发明在另一方式中涉及一种经合成、分离或纯化的多肽(以下也称为“第3肽”),其包含由hanw、hvnw、hfhw或hfyw表示的氨基酸序列。
本发明的第1~第3肽在一个或多个实施方式中,优选能够抑制aspd与神经细胞的结合。
本发明的第1~第3肽在一个或多个实施方式中,优选对aspd与nakα3的相互作用具有抑制能力。
本发明的第1~第3肽在一个或多个实施方式中,优选对aspd具有结合能力。
本发明的第1~第3肽在一个或多个实施方式中,优选能够抑制aspd诱导的神经细胞的细胞死亡。
另外,本发明中,仅记载为淀粉样蛋白球体(aspd)时,可包含天然aspd及合成aspd。
本发明的第1~第3肽在一个或多个实施方式中,从抑制aspd与神经细胞结合的观点出发,优选在n末端具有由所述式(i)或(ii)、或hanw、hvnw、hfhw或hfyw表示的氨基酸序列,即n末端的起始氨基酸为x1或h。
本发明的第1~第3肽的长度在一个或多个实施方式中,为4个以上,另外,可以举出为50个以下、25个以下、20个以下、15个以下、10个以下或5个以下。因此,作为肽的长度,可以举出4~50、4~25、4~20、4~15、4~10或4~5。
本发明的第1~第3肽在一个或多个实施方式中,可以举出由上述式(i)或(ii)、或者hanw、hvnw、hfhw或hfyw表示的氨基酸序列与脑穿透性肽(brainpenetratingpeptide)直接或经由连接肽键的方式。通过结合脑穿透性肽,能够提高本发明的多肽越过血脑屏障转移至脑的效率。作为脑穿透性肽,可以利用以往公知的肽。
本发明的第1~第3肽也可以包含修饰了该肽的方式的肽。在一个或多个实施方式中,也可以包括修饰了该肽的末端和/或肽键的方式。作为末端修饰,可以举出c末端的羧基的除去或酰胺化、n末端的氨基的除去或乙酰化。作为肽键的修饰,可列举n-烷基化。
本发明的第1~第3肽在一个或多个实施方式中,从抑制aspd与神经细胞结合的观点出发,优选将c末端的羧基除去或酰胺化,更优选除去。作为c末端的羧基的酰胺化,可以举出-conh2、-conhr、及-conrr’(r、r’为烃基),优选为-conh2。
n末端的氨基可以直接使用,或者也可以乙酰化或除去,从抑制aspd与神经细胞结合的观点出发,优选直接使用。
本发明的第1~第3肽在一个或多个实施方式中,从促进该肽与aspd结合的观点出发,肽键中的至少1个可以被n-烷基化。作为n-烷基化,可以举出n-甲基化、n-乙基化、n-环丙基化等。
本发明的第1~第3肽可以通过利用通常的合成方法适当合成、精制来制备。
[模拟肽]
本发明在另一方式中涉及一种模拟肽,其具有模拟本发明的第1~第3肽的结构的结构。
作为本发明的“模拟肽”的一个或多个实施方式,可以举出肽样化合物,或者可以举出不具有肽键结构及经修饰的肽键结构的合成化合物。
作为肽样化合物的一种或多种实施方式,可以举出peptoid(s.m.miller,r.j.simon,s.ng,r.n.zuckermann,j.s.kerr,w.h.moos,bioorg.med.chemlett.,4,2657(1994))、模拟蛋白的β/γ转角结构的非肽化合物(m.kahntetrahedron,49,3433(1993)、《コンビナトリアルケミストリー》出版:化学同人、p44-64,1997)等。
本发明的模拟肽在一个或多个实施方式中,优选能够抑制aspd与神经细胞的结合。本发明的模拟肽优选在一个或多个实施方式中,优选对aspd与nakα3的相互作用具有抑制能力。本发明的模拟肽优选在一个或多个实施方式中对aspd具有结合能力。本发明的模拟肽在一个或多个实施方式中,优选能够抑制aspd诱导的神经细胞的细胞死亡。
[多核苷酸及载体]
本发明在另一方式中涉及一种编码本发明的多肽的多核苷酸,本发明还涉及一种用于表达上述多肽的载体,其包含编码本发明的多肽的多核苷酸。所述载体优选具有包含能够表达本发明的多核苷酸的调节序列等的表达盒。作为所述载体,只要能够基因导入所述多核苷酸即可,没有特别限定,从安全性的观点出发,优选avv(腺相关病毒)载体。作为本发明的载体的优选实施方式,可以举出与脑穿透性肽键的方式。通过结合脑穿透性肽,能够提高本发明的载体越过血脑屏障转移至脑的效率。作为脑穿透性肽,可以利用以往公知的肽。
[组合物]
本发明作为另一方式,涉及一种组合物,其含有本发明的肽、本发明的模拟肽或本发明的载体。所述组合物在一个或多个实施方式中为医药组合物。
[医药组合物]
本发明为医药组合物时,其剂型可以根据给药方法适当选择,可以举出例如注射剂、液体制剂、胶囊剂、咀嚼剂、片剂、悬浮剂、霜剂、软膏等。另外,给药方法也没有特别限制,可以举出经口给药、非经口给药。本发明的医药组合物可以含有与给药方式或剂型相应的以往公知的添加物(例如赋形剂或稀释剂)。
作为适于经口给药的剂型,可以举出片剂、颗粒、含有液体或粉末的胶囊、锭片(troche)、咀嚼剂、多颗粒和纳米颗粒、凝胶、薄膜等固体制剂;悬浮液、溶液、糖浆以及酏剂等液体制剂。作为上述赋形剂,可以举出纤维素、碳酸钙、磷酸氢钙、甘露醇和柠檬酸钠等载体;聚乙烯基吡咯烷、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和明胶等造粒粘合剂;羧甲基淀粉钠和硅酸盐等崩解剂;硬脂酸镁和硬脂酸等润滑剂;月桂基硫酸钠等润湿剂;防腐剂、抗氧化剂、矫味矫臭剂及着色剂。
作为本发明的医药组合物的非经口给药,可以举出向血流中、肌肉中或内部器官中直接给药。非口服给药包括静脉内、动脉内、腹腔内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内及皮下的给药。非口服给药例如可以通过针注射器、无针注射器及其他注入技术进行。另外,作为适合非口服给药的剂型,可以举出例如含有赋形剂和/或缓冲剂的水溶液。
[预防、改善和/或治疗方法]
本发明的医药组合物在一个或多个实施方式中,可以用于阿尔兹海默病和/或路易体痴呆症的预防、改善和/或治疗。
本发明中,阿尔茨海默病和/或路易体痴呆症的预防包括抑制阿尔茨海默病和/或路易体痴呆症的发病、或者使病态不会进展至比可逆性的轻度的认知障碍严重的程度。另外,本发明中,阿尔茨海默病和/或路易体痴呆症的改善包括阿尔茨海默病和/或路易体痴呆症的可逆性的轻度的认知障碍的病态的进展停止、或者病态变为轻度。此外,本发明中,阿尔茨海默病和/或路易体痴呆症的治疗包括使病态的进展延迟或几乎停止。
[评价方法]
本发明在另一个方式中涉及一种评价抑制aspd与神经细胞结合的物质的方法。
作为第1评价方法,可以包括:使含有评价对象物质和aspd的混合液与培养神经细胞接触;在上述接触后分别对aspd和神经细胞进行不同的标记并进行成像;以及根据上述成像数据得到aspd与神经细胞的结合量的指标,使用上述指标对评价对象物质进行评价。
作为第2评价方法,可以包括:使aspd与评价对象物质存在下的培养神经细胞接触;在上述接触后对aspd和神经细胞分别进行不同的标记并进行成像;以及根据上述成像数据得到aspd与神经细胞的结合量的指标,使用上述指标对评价对象物质进行评价。
根据第1评价方法,能够评价与aspd结合或相互作用的物质对aspd与神经细胞的结合的结合抑制能力。
根据第2评价方法,能够评价与神经细胞结合或相互作用的物质对aspd与神经细胞的结合的结合抑制能力。
所述神经细胞优选为成熟神经细胞。成熟神经细胞在一个或多个实施方式中,可以举出具有至少一个轴突以及至少一个树突的神经细胞。
上述成像方法在一个或多个实施方式中,可以举出荧光免疫染色及荧光显微镜观察。在一个或多个实施方式中,也可以在所述接触后、进行标记前固定神经细胞和aspd。
本方式在计算aspd的结合量或其指标的情况下,容易从成像数据中排除apsd的大凝聚体的信息和/或不与神经细胞结合的非特异性aspd的信息。由此,在一个或多个实施方式中,能够提高定量性和/或提高评价的灵敏度。
aspd的结合量的指标在一个或多个实施方式中,可以是aspd与神经细胞的结合量本身,也可以是实施例中记载的ed50或它的比。例如,评价物质与aspd共存时的ed50越高,则能够评价为抑制aspd与神经细胞结合的能力越高。
[筛选方法]
本发明在另一个方式中涉及一种筛选抑制aspd产生的神经毒性的物质的方法。
作为第1筛选方法,可以包括:使含有候选物质和aspd的混合液与培养神经细胞接触;在所述接触后分别对aspd和神经细胞进行不同的标记并进行成像;以及根据上述成像数据得到aspd与神经细胞的结合的指标,使用上述指标选择候补化合物。
作为第2筛选方法,可以包括:使aspd与候选物质存在下的培养神经细胞接触;在上述接触后对aspd以及神经细胞分别进行不同的标记并进行成像,以及根据上述成像数据得到aspd与神经细胞的结合的指标,并使用上述指标选择候选物质。
根据第1筛选方法,能够选择与aspd结合或发生相互作用的物质、即对aspd与神经细胞的结合具有结合抑制能力的物质作为抑制aspd产生的神经毒性的物质的候选物质。
根据第2筛选方法,能够选择与神经细胞结合或发生相互作用的物质、即对aspd与神经细胞的结合具有结合抑制能力的物质作为抑制aspd产生的神经毒性的物质的候选物质。
对于上述神经细胞和成像方法,可以与本发明的评价方法同样地进行。另外,aspd的结合量的指标在一个或多个实施方式中,也可以是aspd与神经细胞的结合量本身,也可以是ed50或它的比。例如,候选物质与aspd共存时的ed50越高,则能够评价为抑制aspd的神经毒性的能力越高。
本方式在计算aspd的结合量或其指标的情况下,容易从成像数据中排除apsd的大凝聚体的信息和/或不与神经细胞结合的非特异性aspd的信息。由此,在一个或多个实施方式中,能够提高定量性和/或提高筛选的灵敏度。
本发明在一个或多个实施方式中可以涉及以下方案;
[1]一种经合成、分离或纯化的多肽,其包含由下述式(i)表示的氨基酸序列,
x1x2x3x4(i)(序列号1)
x1为精氨酸(arg)、组氨酸(his)或赖氨酸(lys),
x2为精氨酸(arg)、赖氨酸(lys)、天冬氨酸(asp)、组氨酸(his)、色氨酸(trp)、谷氨酰胺(gln)、酪氨酸(tyr)或苏氨酸(thr),
x3是任意的氨基酸,
x4是色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)或酪氨酸(tyr)。
[2]根据[1]所述的多肽,其中,x3是丙氨酸(ala)、精氨酸(arg)、天冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、半胱氨酸(cys)、谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)、蛋氨酸(met)、脯氨酸(pro)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)或缬氨酸(val)。
[3]根据[1]或[2]所述的多肽,其中,x2为组氨酸(his)、色氨酸(trp)、谷氨酰胺(gln)、酪氨酸(tyr)或苏氨酸(thr)。
[4]一种经合成、分离或纯化的多肽,其包含由下述式(ii)表示的氨基酸序列,
x1x2x3x4(ii)(序列号2)
x1为精氨酸(arg)、组氨酸(his)或赖氨酸(lys),
x2为任意的氨基酸,
x3为亮氨酸(leu)、甘氨酸(gly)、异亮氨酸(ile)、色氨酸(trp),精氨酸(arg)、蛋氨酸(met)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)或赖氨酸(lys),
x4为色氨酸(trp)、苯丙氨酸(phe)或酪氨酸(tyr)。
[5]根据[4]所述的多肽,其中,x2为丙氨酸(ala)、精氨酸(arg)、天冬氨酸(asp)、谷氨酰胺(gln)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)、蛋氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、脯氨酸(pro)、苏氨酸(thr)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)或缬氨酸(val)。
[6]根据[4]或[5]所述的多肽,其中,x3为亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、色氨酸(trp)、精氨酸(arg)、天冬氨酸(asp)或赖氨酸(lys)。
[7]一种经合成、分离或纯化的多肽,其具有由hanw、hvnw、hfhw或hfyw表示的氨基酸序列。
[8]根据[1]~[7]中任一项所述的多肽,其中,在n末端具有由所述式(i)或(ii)、或hanw、hvnw、hfhw或hfyw表示的氨基酸序列。
[9]根据[1]~[8]中任一项所述的多肽,其中,氨基酸序列的长度为4~50个氨基酸。
[10]根据[1]~[9]中任一项所述的多肽,其中,c末端的羧基被除去或酰胺化。
[11]根据[1]~[10]中任一项所述的多肽,其中,肽键的至少1个被n-烷基化。
[12]根据[1]至[11]中任一项所述的多肽,其中,所述多肽对aspd与神经细胞结合具有结合抑制能力
[13]一种模拟肽,其具有模拟[1]至[12]中任一项所述的多肽的结构的结构,其对aspd与神经细胞的结合具有结合抑制能力。
[14]一种用于表达[1]~[12]中任一项所述的多肽的载体,其包含编码所述多肽的多核苷酸。
[15]一种组合物,其包含[1]至[12]中任一项所述的多肽或[13]所述的模拟肽。
[16]一种评价抑制淀粉样蛋白球体(aspd)与神经细胞结合的物质的方法,其包含下述工序:
使含有评价对象物质和aspd的混合液与培养神经细胞接触,或者使aspd与评价对象物质存在下的培养神经细胞接触,
在所述接触后,分别对aspd及神经细胞进行不同的标记并进行成像,和
根据所述成像数据得到aspd与神经细胞结合的指标,使用所述指标对评价对象物质进行评价。
[17]一种筛选抑制aspd产生的神经毒性的物质的方法,其包含下述工序:
使含有候选物质和aspd的混合液与培养神经细胞接触,或者使aspd与候选物质存在下的培养神经细胞接触,
在所述接触后,分别对aspd及神经细胞进行不同的标记并进行成像,和
根据所述成像数据得到aspd与神经细胞结合的指标,使用所述指标选择候选物质。
以下,使用实施例进一步说明本发明的一个或多个实施方式。
实施例
1.aspd抑制肽的评价
通过以下方法进行抑制aspd与神经细胞结合的肽的评价。
工序1:将混合肽和aspd并进行孵育得到的混合液添加到培养的成熟神经细胞中。
工序2:对所述神经细胞进行改性(固定)。
工序3:分别对神经细胞和aspd进行免疫染色并进行成像。
工序4:分析图像,对与神经细胞结合的aspd进行定量。
工序5:使用aspd结合量和/或由此得到的分析值对肽进行评价。
工序1~3如下进行。
将肽与合成aspd的混合液在4℃下孵育15分钟,进行aspd的前处理,将该混合液添加到在96孔板中培养的原代培养大鼠海马神经细胞中。
用co2培养器在37℃下进行15分钟的孵育,用pbs清洗孔后,加入2%多聚甲醛(50μl/孔),在37℃下固定20分钟后,进一步加入4%多聚甲醛(50μl/孔),在37℃下固定20分钟。
清洗、封闭后,添加含有抗aspd抗体(masd3)和抗map2抗体(商品名:sc-20172、santacruz制)的一次抗体溶液,过夜。清洗后,添加含有alexafluoro(商标)568抗小鼠抗体(商品名:a11031,lifetechnologies制)、alexafluoro(商标)488抗兔抗体(商品名:a11034,lifetechnologies制)以及dapi(商品名:d523,dojindo制)的二次抗体溶液,进行荧光显微镜观察。
将通过显微镜观察得到的图像的结果的一个例子示于图1。图1中,在单独aspd与神经细胞接触的情况下和用肽对aspd进行预处理的情况下,改变所添加的aspd的浓度进行比较。图1中,大圆形图像(蓝色)是核,细长图像(绿色)是神经细胞的轴突和树突,小圆形图像(红色)是aspd。如该图所示,在aspd单独的情况下,随着提高所添加的aspd的浓度,aspd在神经细胞的周边增加,与此相对,在用上述肽处理过的aspd的情况下,即使提高所添加的aspd的浓度,aspd也不增加。即显示,利用所述肽抑制了aspd与神经细胞的结合。
接着,如下进行工序4~5。
根据显微镜观察数据绘制如图2那样的标准曲线,制作在维持直线性的范围内的近似曲线,计算ed50。将由用肽处理过的aspd的ed50与aspd单独的ed50之比定义的“效价”为指标,评价肽的aspd结合抑制能力。将表1中所示的肽01~11的结果示于图3。将表2中所示的肽01及12~24的结果示于图4。
效价=ed50[aspd+肽]/ed50[aspd]
表1
表2
如图3所示,肽02~11的aspd结合抑制能力(效价)分别显示为1.5以上。其中,肽05(hhnw)、09(htnw)、10(hanw)及11(hvnw)显示与公知的aspd中和肽01(hfnw)具有同等程度的aspd结合抑制能力(效价)。
另外,如图4所示,肽12~24的aspd结合抑制能力(效价)分别显示为1.5以上。其中,肽16(hfrw)和肽22(hfkw)显示比公知的aspd中和肽01(hfnw)更为优异的aspd结合抑制能力(效价)。
2.spr(表面等离子体共振)
将合成aspd固相化在芯片上,流过作为分析物的下述表3中所示的肽,通过表面等离子体共振(spr)求出解离常数(kd)。
所使用的肽是图3和4的肽01、05、08、09、15和18,均为显示aspd与神经细胞结合的抑制效果的肽。作为阴性对照,使用在上述1的评价中无法抑制aspd与神经细胞结合的2个肽(hnnw(序列号27)、hpnw(序列号28))。
将其结果示于下述表3中。
表3
如上述表3所示,显示在上述1的评价中可见aspd与神经细胞结合的抑制效果的肽对aspd具有结合能力。
3.肽末端的处理
使用将肽22(hfkw)的c末端的cooh酰胺化(-conh2)或除去的肽及除去了n末端的氨基的肽,与上述同样地算出aspd结合抑制能力(效价)。将其结果示于图5。如图5所示,显示当进行c末端的处理(酰胺化或cooh除去)时,肽的aspd抑制能力提高。
另外,当对除了肽22以外的其他肽也进行c末端的处理(酰胺化或cooh除去)时,也显示肽的aspd抑制能力提高的倾向。
4.肽键的n-甲基化
将肽22(hfkw)的肽键的1个或2个n-甲基化,与上述2同样地利用表面等离子体共振(spr)求出解离常数(kd)。其结果,经n-甲基化的肽22均可见对aspd的结合能力。
序列表
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<120>淀粉样蛋白球体(aspd)结合抑制肽以及评价和筛选方法
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