用淀粉样肽激动剂治疗ii型糖尿病的制作方法

专利名称：用淀粉样肽激动剂治疗ii型糖尿病的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学，特别是涉及淀粉样肽激动剂，以及服用淀粉样肽(Amylin)激动剂治疗II型糖尿病的方法。
背景技术：
用来说明本说明书的出版物和包括专利及专利申请书的其它材料，在这里引入作为参考。淀粉样肽淀粉样肽是一种含37个氨基酸的蛋白激素。它是作为沉积于II型糖尿病患者胰岛上的淀粉状物质中的主要成分，被分离，纯化和测定其化学特性的(Cooper等，Proc Natl Acad Sci USA 848628-8632，1987)。淀粉样肽分子具有两个重要的易位后限制其C端是酰胺化的，以及在2位和7位上的半胱氨酸交联形成N端环。淀粉样肽是英国专利申请序号8709871的主题，于1987年4月27日提交的，以及相应的美国专利号5,367,052的主题，于1994年11月22日发布。
淀粉样肽是一类包括CGRP和降钙素相关肽家族中的成员(Rink等，Trends Pharmacol Sci 14113-118，1993)。为应答营养刺激素如葡萄糖和精氨酸，淀粉样肽主要从胰腺β细胞合成并分泌。Moore等，Biochem Biophys Res Commun 1791-9，1991；Kanatsuka等，FEBSLett 259199-201，1989；Ogawa等，J Clin Invest 85973976，1990；Gedulin等，Biochem Biophys Res Commun 180782-789，1991。
对正常人，禁食时淀粉样肽水平为从1至10pM，膳食后水平为5至20pM已有报道。(例如Hamer等，Diabetologia 3452-54，1991)；(Sanke等，Diabetologia 34129-132，1991；Koda等，The Lancet 3391179-1180，1992)。但对肥胖人和抗胰岛素个体，膳食后淀粉样肽水平可上升很高，例如可达约50pM。为比较起见，健康人禁食及膳食后胰岛素水平分别为20至50pM和100至300pM，可能比抗胰岛素人高3至4倍。在I型糖尿病人上，其β细胞被破坏了，淀粉样肽水平等于或低于测定的水平，为应答葡萄糖刺激，其水平并不上升(Koda等，The Lancet 3391179-1180，1992)。对正常大鼠和小鼠，据报道其基础水平为30至100pM，而在某些抗胰岛素的糖尿病啮齿动物系上，已测到高达600pM的值(例如Huang等，Hypertension 19I-101～I-109，1991；Gill等，Life Sciences 48703-710，1991)。
首先在大鼠骨骼肌上发现淀粉样肽具有减少因刺激胰岛素而将葡萄糖结合成糖元的作用。(Leighton等，Nature 335632-635，1988)；该肌肉具“抗胰岛素”性。以后的工作用大鼠比目鱼肌进行体外和试管内实验，结果表明，淀粉样肽具有降低糖元合成酶的活性，促进糖元磷酸化酶从非活性的b形转变成活性的a形，促进糖元的净丧失(在有或无胰岛素存在下)，增加葡萄糖-6-磷酸酯的水平，以及增加乳酸酯的生成(见Deems等，Biochem Biophys Res Commun 181116-120，1991；Young等，FEBS Letters 281149-151，1991)。
据认为，淀粉样肽是通过存在于血浆膜上的受体而作用的。Beaumont等，Mol Pharmacol 44493-497，1993。在1993年11月23日出版的美国专利5,264,372号中，描述了淀粉样肽及其应用于筛选与测试淀粉样肽拮抗剂与激动剂化合物的各种方法。
涉及淀粉样肽能量代谢的生物学作用，见Young等，J Cell Biochem55512-18，1994中描述。而淀粉样肽在体内肝能量代谢，具有显著的作用，而在离体肝细胞或灌流肝脏上该肽的作用是怎样，尚无一致意见。已有的数据并不支持该肽能促进肝糖元分解作用这一设想，即它的作用不会类似血糖素(例如Stephens等，Diabetes 40395-400，1991；Gomez-Foix等，Biochem J 276607-610，1991)。据认为，淀粉样肽可能作用于肝脏，促进乳酸酯转化成葡萄糖，以及增强血糖素释放葡萄糖的量(见Roden等，Diabetologia 35116-120，1992)。这样，淀粉样肽可能是作用为肝脏中胰岛素的同化配体，这与其在肌肉中作为降解代谢作用是相反的。
在脂肪细胞中，与其在肌肉中的作用相反，淀粉样肽对于促胰岛素葡萄糖摄取，将葡萄糖结合至甘油三酯，以及二氧化碳的生成，未测出有作用(Cooper等，Proc Natl Acad Sci 857763-7766，1988)，对促肾上腺素脂肪分解，或抑制胰岛素的脂肪分解也无作用(Lupien和Young，Diabetes Nutrition and Metabolism-Clinical andExperimental，Vol6(1)，13-18页，1993)。因此该肽具有组织特异性作用，直接作用于骨骼肌，显著的间接作用(通过供应底物)以及可能亦为直接作用于肝脏，而脂肪细胞看来对于该肽的存在与否是“看不见”的。该肽对于肾组织的直接作用尚未见报道。
淀粉样肽对胰岛素的分泌具有显著的作用，这已有报道。在离体胰岛上(Ohsawa等，Biochem Biophys Res Commun 160961-967，1989)，在灌流胰腺(Silvestre等，Reg Dept 3123-31，1991)，以及在整体大鼠动物上(Young等，Mol Cell Endocrinol 84R1-R5，1992)，各种实验表明，淀粉样肽能下调胰岛素的分泌。灌流胰腺实验表明，能选择性地下调为应答葡萄糖响应而致的分泌，而缺乏对精氨酸的应答。但另有作者未能测出该肽对于离体β细胞，对离体胰岛，以及在整体动物上有作用(见Broderick等，Biochem Biophys Res Commun177932-938，1991及其所引参考文献)。
在啮齿动物上淀粉样肽于体内药理剂量下的一个显著的作用，是促进血浆乳酸酯水平的急剧升高，继而升高血浆葡萄糖的量(Young等，FEBS Letts 281149-151，1991)。有证据表明，乳酸酯的增加能为葡萄糖的生成提供底物，淀粉样肽的作用与胰岛素或糖元的变化无关。在“葡萄糖钳(Clamp)”试验中，该肽的灌流能引起“抗胰岛素”，其途径是既可通过降低外周葡萄糖的供应，也可通过限制由于胰岛素介导的肝脏葡萄糖生成的抑制作用(例如Frontoni等，Diabetes 40568-573，1991；Koopmans等，Diabetologia 34218-224，1991)。
曾发现淀粉样肽激动剂，能减缓胃排空作用(Young等，Diabetologia，June 1995，印刷中)，据认为这是因为它们能降低膳食后高血糖(Moyses及Kolterman，Drugs of the Futcere，May 1995)。服用一种淀粉样肽激动剂(包括淀粉样肽)来降低胃蠕动和减慢胃排空的方法，是于1993年9月7日提交的，美国专利申请序号08/118,381的主题(以及1995年3月16日公开的相应PCT申请书，其公开号为WO95/07098)。
淀粉样肽的非代谢作用，包括扩血管作用，该作用可受CGRP血管受体相互作用的调节。(Brain等，Eur J Pharmacol 1832221，1990)。据报道，在完整大鼠动物上，以避免血压干扰经皮下给药，淀粉样肽能显著增加血浆肾素的活性。用淀粉样肽拮抗剂，治疗肾素有关的疾病，见1994年12月17日发布的美国专利5,376,638号中所述。
将该肽注射入大脑，能抑制食物的摄入。(例如Chance等，Brain Res539352-354，1991)，这一作用由CGRP和降钙素分担。在细胞内调节这一作用的有效浓度尚未知。据报道淀粉样肽还具有对能引起细胞休眠期的破骨细胞具有作用，而且在大鼠，兔和患佩吉特氏病(Paget′sdisease)的病人，它还能降低血浆钙达20％的作用(见例如Zaidi等，JBone Miheral Res5，Suppl 2576，1990)。已有的数据表明，对这些作用，淀粉样肽似乎比人降钙素弱10至30倍。有趣的是，据报道该肽似乎能增加破骨细胞内CAMP的生成，但并不能增加细胞液钙离子的浓度，而降钙素则对两者均有作用(Alam等，Biochem Biophys ResCommun 179134-139，1991)。虽未证实，但据认为降钙素可能通过两种类型的受体起作用，而淀粉样肽可能仅与其中之一种受体作用。糖尿病糖尿病是一种严重的代谢疾病，慢性血糖水平升高是其特征。成人糖尿病的一般症状是尿频，烦渴，酮尿症，体重迅速下降，并伴随着血糖水平的升高。正常人禁食时血糖浓度为小于每分升115毫克。而糖尿病人禁食时血糖浓度超过每分升140毫克。一般来说，为应答胰腺β细胞的损害，糖尿病逐渐发展。这种损害发生于原发性糖尿病，β细胞通过自身免疫系统被破坏，或者为应答其它的原发性疾病而作为继发的糖尿病，例如胰腺病，非缺乏胰岛素作用的激素水平异常疾病，药物或化学诱导，胰岛素受体功能异常，遗传性综合征等。原发性糖尿病可分为I型糖尿病(亦称为胰岛素依赖性糖尿病或称IDDM)和II型糖尿病(亦称为非胰岛素依赖型糖尿病或简称NIDDM)。
I型(青少年开始或胰岛素依赖型)糖尿病，是熟知的激素缺乏状态，其胰腺β细胞看来已被其自身免疫防御机制所破坏。患I型糖尿病的患者无内源性胰素分泌能力。这些患者患极度高血糖症。在引入胰岛素取代疗法即约70年前，I型糖尿病是致命的。取代疗法即首先使用来自于动物的胰岛素，近来使用利用重组DNA技术制备的人胰岛素。正如上述所讨论，现在已清楚，I型糖尿病β细胞的损害，致使两种激素均缺乏，即胰岛素和淀粉样肽。当胰腺细胞被破坏时，分泌胰岛素和淀粉样肽的能力丧失了。据报道I型糖尿病患者淀粉样肽的水平，或检测不到，或处于可检测的下限，因此不能增加对葡萄糖需求的应答。Koda，The Lancet3391179，1992。
在II型糖尿病中胰腺β细胞损伤的性质，目前尚不清楚。不象I型糖尿病中胰腺β细胞，在II型糖尿病中β细胞保留了合成与分泌胰岛素和淀粉样肽的能力。
II型糖尿病的特征是抗胰岛素，即外周组织对胰岛素应答的正常代谢功能丧失。换句话说，抗胰岛素是一种疾病状况，其体内循环的胰岛素产生低于正常的生物学反应。按用临床术语，抗胰岛素即处于正常或升高的胰岛素水平时，存在着正常或升高的血糖水平。通过饮食或降低体重，以恢复外周组织对胰岛素的敏感性，与II型糖尿病相关的高血糖有时能被逆转或得到改善。确实，II型糖尿病的特征常常是存在高于正常血浆胰岛素水平的高血糖症。II型糖尿病的进展，与血糖浓度的升高有关，并伴随着葡萄糖诱导的胰岛素分泌速率的相对减少。这样，在II型糖尿病的晚期，可能存在胰岛素缺乏。
治疗各种类型糖尿病的首要目的是相同的，即尽可能将血糖浓度降至接近正常，因此减少了短期与长期的并发疾病。Tchobroutsky，Diabetologia 15143-152，1978。糖尿病高血糖的程度与接着发生的长期并发症之间的联系，在近来的由国立卫生研究院所开展的完全糖尿病控制与并发症试验(DCCT)课题所进一步证实。见DCCT研究小组，N Eng J Med 329977，1993。DCCT课题持续10年，在美国和加拿大的29个临床中心进行，结果表明，在I型糖尿病上，平均血糖浓度的降低，可减少终末器官的并发症。视网膜病的发生减少了76％，该病的进程降低了54％，并且肾病(蛋白尿)也有改善。显著的神经疾病变化的发生也减少了。
治疗I型糖尿病，需经肠胃外服用替代量的胰岛素。再结合正确的饮食和自己控制血糖，大部分I型糖尿病可达到使血糖控制至某一水平。
与I型糖尿病相比，II型糖尿病的治疗常不需使用胰岛素。治疗II型糖尿的准则通常是在最初的6-12周，试验饮食疗法以及改变生活方式。糖尿病患者饮食的特点包括，适量而不是过量地摄入总卡路里，有规则的膳食，限制饱和脂肪的量，同时增加多不饱和脂肪酸的量，以及增加食用纤维的摄入。生活方式的改变包括，维持有规律的锻炼，以帮助控制体重以及降低抗胰岛素的程度。如果经适当地饮食试验以及改变生活方式，禁食前高血糖仍存在，那么可作出“首先经饮食疗法失败”的诊断，那么将需要试验口服降血糖治疗或直接用胰岛素替代治疗，以控制血糖，由此降低了并发的疾病。饮食疗法和减少体重失败的II型糖尿病患者，可服用例如磺酰脲或双胍类的口服降血糖药进行治疗。但是，胰岛素治疗被用来治疗其它类型的II型糖尿病患者，特别是那些最初饮食疗法失败而又不肥胖的患者，或者那些最初饮食疗法失败，并且其后口服降糖治疗又失败的患者。
利用淀粉样肽激动剂治疗糖尿病，已由美国专利5,124,314和5,175,145号所描述。过量淀粉样肽的作用模拟了II型糖尿病的关键特征，因此已提出阻断该肽，以作为一种新的治疗策略。1993年11月30日发布的美国专利第5,266,561号和1994年1月25日发布的美国专利第5,281,581号，披露了用淀粉样肽拮抗剂治疗II型糖尿病以及抗胰岛素的方法。
以前曾报道，输注淀粉样肽激动剂25，28，29Pro-h-淀粉样肽，能降低I型糖尿病患者膳食后葡萄糖浓度。见Moyses及Kolterman，Drugs ofthe Future(1995年5月)。在对6个男性I型糖尿病患者进行单盲交叉研究，于150μg/hr速率，2小时输注拮抗剂25，28，29Pro-h-淀粉样肽，据报道能显著减少膳食后摄入混合食物的高血糖症。这一结果在使用9个I型糖尿病患者，于50μg/hr速率，5小时输注进行的研究得到了证实。所给的营养需求量可以是口服的(Sustacal型食物，也可以是静注葡萄糖300mg/kg负荷。据报道服用25，28，29Pro-h-淀粉样肽，在口服Sustacal膳食后，而不是在静注葡萄糖后，可致使膳食后葡萄糖水平产生显著下降，这与延缓胃排空作用和从胃肠道吸收营养作用是一致的。进一步双盲法与安慰剂对照研究，表明膳食前注射25，28，29Pro-h-淀粉样肽每日三次，也能降低膳食后葡萄糖水平。病人可继续进行其通常的胰岛素摄入补充。在第三个研究中，服用30μg剂量的淀粉样肽激动剂，可见到有统计意义的显著作用。
本发明概要我们意外地发现了通过服用淀粉样肽激动剂，可治疗非胰岛素依赖的II型糖尿病患者，降低其血糖浓度。我们也发现，用该肽激动剂治疗非胰岛素依赖的II型糖尿病患者，对于那些HbAlc值高于正常值的病人也特别有益。
一方面，本发明包括了一种通过服用治疗有效量的淀粉样肽激动剂，治疗非胰岛素依赖的II型糖尿病患者的方法。非胰岛素依赖的II型糖尿病患者，系指其患II型糖尿病，但目前不用胰岛素处理，而是通过例如用结合所有饮食疗法，锻炼，改变生活方式，或利用口服降糖药，例如双胍或磺酰脲等方法来处理。II型糖尿病的诊断，是本领域技术人员所熟知的知识与能力达到的。例如，年龄超过35岁，具有烦渴，尿频，多食(无或有体重减轻)，且合并有血糖升高，而无酮酸中毒历史的人，一般认为符合II型糖尿病的诊断。存在肥胖，阳性II型糖尿病家族史，禁食血浆胰岛素及C-肽浓度升高，是大多数II型糖尿病的另一特征。“治疗有效量”的含义系指，剂量不管是单次或多次，对II型糖尿病患者血糖浓度的降低都是有益的。
在优选的实施中，本发明指向一种治疗非胰岛素依赖的II型糖尿病的方法，其中病人HbAlc值高于正常人正常范围的上限，治疗方法包括服用一种治疗有效量的淀粉样肽激动剂。HbAlc系指血红蛋白的转化后变化，即葡萄糖经非酶过程与血红蛋白A结合，它典型地反映了前120天的平均血糖浓度，和血红细胞的平均寿命。正常范围HbAlc上限，即指无糖尿病正常人范围的上限，一般约为6.0％至约7.5％。在另一个优选的实施中，病人的HbAlc值至少为8％。
另一方面，本发明涉及降低非依赖胰岛素的II型糖尿病人的血糖的方法，包括服用所述的具有降血糖剂量的淀粉样肽激动剂。优选的降糖量的淀粉样肽激动剂的范围，约为0.05μg/kg/天至约10μg/kg/天，较优选的为0.05μg/kg/天至约6μg/kg/天，更为优选的为1.0μg/kg/天至约4μg/kg/天。例如，降糖有效的25，28，29Pro-h-淀粉样肽(AC137)，一般为约0.05μg/kg/天至约10μg/kg/天，优选0.1μg/kg/天至6.0μg/kg/天。从约1.0μg/kg/天至约4.0μg/kg/天的剂量是优选的。在一个优选的实施中，受试者HbAlc值为高于正常范围值的上限。在本发明另一个优选的实施中，受试者HbAlc值至少为约8％。
在本发明优选的实施中，淀粉肽激动剂选择25，28，29Pro-h-淀粉样肽(AC137)，s-降钙素和h-淀粉样肽。特别优选的是25，28，29Pro-h-淀粉样肽(AC137)。
可通过各种途径服用淀粉样肽激动剂，包括皮下，肌肉内，经鼻或经皮给药。
附图的简要说明通过附图进一步描述本发明，其中

图1表明在经胰岛素处理和不经胰岛素处理的病人，其AC137诱导的膳食后高血糖的降低与HbAlc状况之间的关系。病人的HbAlc水平按序排列。在不经胰岛素处理的病人上r2相关为0.56，在经胰岛素处理的病人上为0.10，在总包括的病人上为0.33。
本发明的详细描述通过下面介绍的受体结合活性与比目鱼肌试验，评价淀粉样肽激动剂。化合物所具有的淀粉样肽激动剂的活性，也可通过这里所介绍的诱导哺乳动物高血钙以及/或高血糖的能力，或降低膳食后血糖的水平来评价。
用于本发明中各种淀粉样肽激动剂化合物，其命名系指肽的序列，以及淀粉样肽序列的任一肽的变化，例如人淀粉样肽。氨基酸前面上标数字系指，用所指明的氨基酸取代了处于上标位置的原序列的氨基酸。例如“18Arg25，28，Pro-h-amylin”代表，基于“h-amylin”或“人-amylin”序列的肽，具有下列取代Arg取代了18位的His残基，Pro取代了25位的Ala残基，Pro取代了28位的Ser残基。“des-1Lys-h-淀粉样肽”系指基于人的淀粉样肽的序列，其第一个或N-端氨基酸缺省。
优选的淀粉样肽激动剂化合物des-1Lys-h-淀粉样肽，28Pro-h-淀粉样肽，25，28，29Pro-h-淀粉样肽，18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽，以及des-1Lys18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽，在所测试动物上均显示出体内具有淀粉样肽活性，能引起显著的高血糖后的高血乳酸症。除具有淀粉样肽的活性特征外，某些优选的化合物比人淀粉样肽具有更好的溶解度和稳定性特点。这些优选的化合物包括25Pro26Val28，29Pro-h-淀粉样肽，25，28，29Pro-h-淀粉样肽(亦称为“AC-0137”)和18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽。
本发明方法中所使用的淀粉样肽激动剂，包括淀粉样肽及淀粉样肽激动剂类似物，例如淀粉样肽受体激动剂类似物，如18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽，des-1Lys-18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽，18Arg25-28， 29Pro-h-淀粉样肽，des-1Lys-18Arg25，28，29Pro-h-淀粉样肽，25，28，29Pro-h-淀粉样肽，des-1Lys-25，28，29Pro-h-淀粉样肽，以及25Pro26Val25，28-Pro-h-淀粉样肽。其它的-些适宜的淀粉样肽激动剂类似物的例子，包括23Leu25Pro26Val28，29Pro-h-淀粉样肽；23Leu25Pro26Val28Pro-h-淀粉样肽；des-1Lys23Leu25Pro26Val28Pro-h-淀粉样肽；18Arg23Leu25Pro26Val28Pro-h-淀粉样肽；18Arg23Leu25，28，29Pro-h-淀粉样肽；18Arg22Leu25，28Pro-h-淀粉样肽；17Ile23Leu25，28，29Pro-h-淀粉样肽；17Ile25，28，29Pro-h-淀粉样肽；des-1Lys17Ile23Leu25，28，29Pro-h-淀粉样肽；17Ile18Arg23Leu-h-淀粉样肽；17Ile18Arg23Leu26Val29Pro-h-淀粉样肽；17Ile18Arg23Leu25Pro26Val26，29Pro-h-淀粉样肽；13Thr21His23Leu26Ala28Leu29Pro31Asp-h-淀粉样肽；13Thr21His23Leu26Ala29Pro31Asp-h-淀粉样肽；des-1Lys13Thr21His23Leu26Ala28Pro31Asp-h-淀粉样肽；13Thr18Arg21His23Leu26Ala29Pro31Asp-h-淀粉样肽；13Thr18Arg21His23Leu28，29pro31Asp-h-淀粉样肽；及13Thr18Arg21His23Leu25Pro26Ala28，29Pro31Asp-h-淀粉样肽。
某些淀粉样肽激动剂，包括淀粉样肽激动剂类似物，已有披露报道，制备和利用淀粉样肽激动剂的方法，已于美国专利申请书“新的淀粉样肽激动剂肽及其用途”，其于1995年5月30日提交(文件号213/080)以及相应的于1993年5月27日公开的PCT申请出版物WO93/10146号中作了详细说明，披露的内容在此引入作为参考。这些激动剂用于降低非胰岛素依赖的II型糖尿病患者的血糖浓度。
用这里介绍的一些生物学试验方法，可评价淀粉样肽激动剂的活性。受体结合试验可用来区别候选的淀粉样肽的激动剂和拮抗剂，并可用来评价结合试验，而比目鱼肌肉试验可用来区别淀粉样肽激动剂与拮抗剂。在受体结合试验中，优选的激动剂化合物的活性低至1到5nM，较优选的是低于1nM，更为优选的是低于50pM。在比目鱼肌肉试验中，这些化合物优选地显示出低至1到10微摩尔的EC50值。
在1993年11月23日发布的美国专利第5,264,372号中描述了受体结合试验，其中披露的内容在此作为参考。受体结合试验是一种竞争性试验，它是测定化合物特异性地与同膜结合的淀粉样肽受体亲合力。用于试验中的膜制剂的优选的来源是前脑基底，它包括听神经核中的膜及其周围组织区域。试验的化合物，系以125I大鼠(Bolton Hunter类)淀粉样肽，与受体制剂进行竞争性结合试验。利用四参数逻辑方程非线性回归分析法，以计算机分析竞争性曲线，其中将结合量(B)作为配基浓度log的函数作图(作图程序Graph PAD软件，圣迭亚戈，加利福尼亚)。或利用Delean等ALLFIT程序(ALLFIT2.7版本(NIH，Bethesda，MD20892))分析竞争曲线。见Munson P及Rodbard D.，Anal Biochem 107220-239(1980)。
利用以前描述的方法在比目鱼肌上进行淀粉样肽激动剂的生物活性试验，包括淀粉样肽激动剂类似物制剂(Leighton B和Cooper GJSNature 335632-635(1988)；Cooper GJS等，Proc Natl Acad Sci，USA 857763-7766(1988))。总之，通过测量比目鱼肌上促胰岛素糖元合成的抑制作用，评价淀粉样肽激动剂的活性。在100nM大鼠淀粉样肽及淀粉样肽拮抗剂存在下，测定促胰岛素糖元合成的恢复，评价淀粉样肽拮抗剂的活性。用描述的定量氨基酸分析法，测定溶解于无载体缓冲液中的肽的浓度。通过测量EC50值，来测定试验中的化合物作用激动剂的活性。利用四参数逻辑方程，通过测量S形(Sigmoidal)剂量响应曲线的吻合程度来测定标准差(De Lean，A，Munson PJ，Guardabasso V和Rodbard D.(1988)ALLFIT，2.7版本，国立儿童卫生及人类发展研究院，NIH，Bethesda，MD，磁带一盘)。利用这些生物试验，表征了一系列淀粉样肽激动剂。在受体竞争试验中，发现18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽，des1Lys18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽，18Arg25，28，29Pro-h-淀粉样肽，des1Lys18Arg25，28，29Pro-h-淀粉样肽，25，28，29Pro-h-淀粉样肽，des1Lys25，28，29Pro-h-淀粉样肽，以及25Pro26Val25，28Pro-h-淀粉样肽，这类化合物均能与淀粉样肽竞争受体。用比目鱼肌试验测定时，发现这些化合物的拮抗活性可略不计，而表现为淀粉样肽激动剂作用。
利用1993年9月7日提交的美国专利申请序号08/118,381和1994年9月7日提交的美国专利申请序号08/302,069中描述的方法，区别、评价或筛选淀粉样肽或其激动剂对胃蠕动的作用(见相应的PCT申请，公开号WO95/07098)，这些专利申请中披露的方法在此作为参考，或用其它已知的技术或等价的方法测定胃蠕动作用。在区别或评价化合物减缓胃蠕动能力所用的这一方法，包括(a)将测试的样品和测试系统结合起来。所述的测试样品包括一个或多个测试的化合物，所述的测试系统包括评选胃蠕动的系统，所述系统其特征在于，例如，为应答所引入的葡萄糖或膳食，该系统显出血浆葡萄糖浓度的升高。以及(b)测定在所述系统中血浆葡萄糖的存在或升高量。也可以用正和/或负对照实验。或者，也可以将已测定量的淀粉样拮抗剂(例如8-32鲑鱼降钙素)，加入至测试系统中。
利用标准固相肽合成技术制备上述描述的淀粉样激动剂，优选自动或半自动化肽合成仪。典型的例子为，将连结于生长肽链树脂上的氨基酸与α-N-氨甲酸酯保护的氨基酸偶联，条件为室温，在如二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷的惰性溶剂中，在如二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑为偶合剂以及在如二异丙基乙胺的碱存在下进行。利用如三氟乙酸或哌啶作为试剂，将所得肽树脂从α-N-氨甲酸酯保护基团中除去，用另一个所需的N-保护氨基酸重复偶联反应，以增加肽链。适宜的N-保护基是本专业人员所熟知的，这里优选叔丁氧羰基(tBoc)和芴甲基氧基羰基(Fmoc)。
除非另有指明，用于肽合成仪中的溶剂，氨基酸衍生物以及4-甲基二苯甲基胺树脂系购于应用生物系统公司(Foster市，CA)。侧链保护氨基酸购于应用生物系统公司，包括以下Boc-Arg(Mts)，Fmoc-Arg(Pmc)，Boc-Thr(Bzl)，Fmoc-Thr(t-Bu)，Boc-Ser(Bzl)，Fmoc-Ser(t-Bu)，Boc-Tyr(BrZ)，Fmoc-Tyr(t-Bu)，Boc-Lys(Clz)，Fmoc-Lys(Boc)，Boc-Glu(Bzl)，Fmoc-Glu(t-Bu)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，以及Fmoc-Gln(Trt)。Boc-His(BOM)购于应用生物系统公司或Bachem公司(Torrance，CA)。苯甲醚，二甲硫醚，苯酚，乙二硫醇，及硫代苯甲醚购自于Aldrich化学公司(Milwaakee，WI)。空气产品及化学品公司(Allentown，PA)提供HF，乙醚，乙酸和甲醇购自于Fisher科学公司(Pittsburgh，PA)。
用自动肽合成仪(Model 430A，应用生物系统公司，Foster市，CA)进行固相肽合成，用NMP/HOBt(选择1)系统和Tboc或Fmoc化学策略为反应条件(见应用生物系统公司的ABI430A肽合成仪用户手册，1.3B版本，1988年1月1日，第6部分，49-70页，应用生物系统公司，Foster市，CA)。用HF裂解Boc-肽树脂(-5℃至0℃，1小时)。用水和乙酸从树脂提取肽，将滤液进行冻干。按标准方法，将Fmoc肽树脂进行裂解(见“Introduction to Cleawage Techniques”，应用生物系统公司，1990，6-12页)。利用Advanced Chem Tech合成仪(Model MPS 350，Louisville，Kentucky)也可组装某些肽。用Waters Delta Prep 3000系统经RP-HPLC(制备与分析型)纯化肽。C4，C8或C18制备柱(10μ，2.2×25cm；Vydac，Hesperia，CA)用来分离肽，纯度用C4，C8，或C18分析柱测定(5μ，0.46×25cm，Vydac)。溶剂(A＝0.1％ TFA/水，B＝0.1％ TFA/CH3CN)流过分析柱的流速为1.0ml/min，流过制备柱的流速为15ml/min。用Waters PicoTag系统进行氨基酸分析，用Maxima程序进行处理。用气相酸水解法，水解肽(115℃，20-24小时)。水解产物经衍生化后，用标准方法分析(Cohen，SA，Mey M和Tarrin TL。(1989)，“The Pico Tag MethodA Manual of Advanced Techniques forAmino Acid Analysis”PP11-52，Millipore，Comoration，Milford，MA)。用M扫描法进行快原子轰击分析(West Chester，PA)。用碘化铯或碘化铯/甘油法进行质量测定。在一台应用生物系统公司Bio-Ion 20质谱仪上，以飞行时间测定法进行血浆解吸离子化分析。
也可以用目前本领域已知的重组DNA技术制备权利要求方法中有用的肽化合物。见Sambrook等，“Molecular CloningA LaboratoryManual，2d.Ed.Cold Spring Harbor 1989”。
上述化合物也涉及用各种无机、有机酸和碱所制备的盐的形式，该类盐包括从有机和无机酸制备的盐，例如HCl，HBr，H2SO4，H3PO4，三氟乙酸，乙酸，甲酸，甲磺酸，甲苯磺酸，马来酸，富马酸及樟脑磺酸。用碱制备的盐包括铵盐，碱金属盐，如钙和镁盐。乙酸盐，盐酸盐和三氟乙酸盐是优选的。可以用通常的方法制备盐，即将产物的酸或碱式，与等量或过量碱或酸反应制备盐，所用的溶剂或介质是盐在其中是不溶的，或在如水的溶剂中反应，再通过真空或冰冷干燥除去溶剂，或在一个适宜的交换树脂上，将一种已有的盐的离子交换成另一种离子。
用于本发明的组合物可方便地以适用于非胃肠道的(包括肌内和皮下)，或经鼻或经皮，以及/或适宜的胶囊化的配方形式供应，或按其它已知的方法制备供口服用。对于一个具体病人，最好由医生确定适宜的服用形式。适宜的可作为药用的载体及其配方，见标准的配方专集中所述，例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，EW Martin。亦参见Wang YJ和Hanson MA“Darenteral Formulations of Proteins andPeptidesStability and Stabilizers”，Journal of Parenteral Science andTechonlogy，Technical Report No.10，Supp.422S(1988)。
本发明中的化合物可制成非胃肠道的组合物供注射或输注用。优选的是将它们溶于水溶性载体中，在pH约为4.3至7.4的等渗缓冲溶液中。这些组合物可按常规消毒技术消毒，或按过滤消毒。这些组合物可含所需的药用辅料物质，以稳定配方，例如pH缓冲剂。有用的缓冲剂，包括如乙酸钠/乙酸缓冲剂。贮藏或贮存形缓释制剂也可使用，使得在经皮注射或释放后，治疗有效量的制剂于数小时或数天，释放于血流之中。
利用氯化钠或其它可作为药用的试剂，如右旋糖，硼酸，酒石酸钠，丙二醇，多元醇(如甘露醇和山梨醇)或其它无机或有机溶质，制成所需的等渗度。特别优选氯化钠，作为含钠离子的缓冲剂。如需要，上述组合物的溶液可用如甲基纤维素等增稠剂来增稠。
按照一般的步骤，将各种成分混合，以制备本发明中的组合物。例如，将所选的成分在一个混合器或其它标准装置中混合，制备浓缩混合物，再加入水或增稠剂调整最终浓度和粘度，以及加入缓冲剂以控制pH，或加入等溶质以控制张力。
为便于医生使用，以剂型提供该组合物，它包含一定量的淀粉样肽激动剂，使用一种或多剂量能有效将血糖控制至所需水平。治疗有效量的淀粉样肽激动剂，能使膳食后血糖浓度降低至优选的不低于5至6mM或所需水平。在糖尿病或葡萄糖耐受病人个体上，血糖浓度比正常人高。在这些个体上，可以获得膳食后血糖水平的有益或平稳降低。正如该领域所知的那样，在测量特殊个体的有效剂量时，应该考虑多种因素，包括不能局限于病人的体重，年龄和一般健康状况，涉及疾病的严重程度，病人具体的反应，所服用的特殊化合物，服用方式，所服用制剂的生物利用度特点，所选的剂量范围，以及同时所采用的医疗措施。
淀粉样肽激动剂的包括18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽，des-1Lys-18Arg25，28Pro-h-淀粉样肽，18Arg25，28，29Pro-h-淀粉样肽，des1Lys18Arg25，28，29Pro-h-淀粉样肽，25，28，29-Pro-h-淀粉样肽，des1Lys-25，28，29Pro-h-淀粉样肽和25Pro26Val25，28Pro-h-淀粉样肽，其有效日剂量典型地在0.05μg/kg/天至约10μg/kg/天，优选约0.05μg/kg/天至约6.0μg/kg/天，更为优选的是约1.0μg/kg/天至约4.0μg/kg/天，以单剂量或分次服用。服用的精确量由临床医生决定，并依赖于特殊的化合物在上述的哪一范围的量，以及年龄，体重以及个人状况。应该在一有症状或诊断为糖尿病后就服用。可通过注射给药，优选为皮下或肌内给药。也可以经鼻或经皮给药。口服有效的化合物应当经口服给药，但是应基于效价以及生物利用度调整剂量。
肽类的淀粉样肽激动剂，如25，28，29Pro-h-淀粉样肽，可单或多剂量给药，例如每天二次(BID)，三次(TID)，和/或四次(QID)。优选的BID剂量范围为约30μg BID至约150μg BID，更为优选的是为约50μg BID至约60μg BID。优选的TID剂量为约30μg TID至约150μg TID，更为优选的是为约60μg TID。优选的QID剂量为约30μg QID至约60μgQID。更为优选的是30μg QID。这些优选的剂量在各种临床试验中是有效的，它们经皮下给药。
下面的例子是例示说明性的，但不局限制本发明的方法。其它经改性或采用于权利要求方法中的适合的淀粉样激动剂化合物，也是适宜的，并且包含在本发明的构思与范围之内。实例进行单盲，安慰剂对照的，随机的，两期交叉临床试验，以评价II型糖尿病人口服标准测试膳食后使用淀粉肽激动剂25，28，29Pro-h-淀粉样肽(AC137)后的微输注(microinfusion)效果。
满足筛选要求的病人，随机参予由适应期(研究天1)和接下来两个治疗期(研究天2和3)所组成的研究阶段。试验中选定14个男性和10个女性病人。病人随机分为12个病人以安慰剂/AC137给药，另12个病人以AC137/安慰剂给药。每个所研究的给药组均有6个用胰岛素治疗的病人和6个未用胰岛素治疗的病人。在12个用胰岛素治疗的病人中，有10个单独接受胰岛素治疗，2个接受口服降血糖药。在12个未用胰岛素治疗的病人中，7个用口服降糖药。因此，得含六个病人一组，共四组。在1组和2组，病人接受胰岛素治疗。在3组和4组，病人不用胰岛素。1组和3组病人，在研究天2经5小时输注100μg/h AC137治疗，再于研究天3经15小时灌注期和5小时输注安慰剂处理。2组和4组病人在研究天2经5小时输注安慰剂，再于研究天3经5小时灌洗期和5小时输注100μg/h AC137处理。AC137和安慰剂，均以微输泵静注给药。所有病人在药物输注的两个治疗天，研究开始后60分钟给予标准的Sustacal试验膳食(7Kcal/Kg)。该Sustacal试验膳食是可市售获得的营养补充物，含有1.01Kcal/ml热量组合物，有24％蛋白质，21％脂肪和55％碳水化合物。酪蛋白酸钠和钙，以及大豆蛋白，提供蛋白质热量；部分氢化的大豆油提供脂肪热量；蔗糖和玉米糖浆提供碳水化合物热量。
每个病人通常的胰岛素和/或口服降糖药以及热量的摄入，正如在随访中所记录证明的，在24小时适应期内(研究天1)是稳定的。病人于上午8点进早餐，中午12点进午餐，下午6点进晚餐。在膳食前30分钟，病人服用通常量的胰岛素和/或降糖药。按病人的常用量，供给晚间小吃。按需供应水。在整个研究时期内所有的病人均遵从胰岛素/口服降糖药以及膳食规定。
在Sustacal试验膳食进餐后1小时至5小时的平均血糖水平，见表1所示。表1 Sustacal试验膳食进餐后1至5小时平均血糖水平亚组平均±SEM(mg/dl)AC137 安慰剂 p值a胰岛素处理的病人 183.1±13.4 243.0±16.50.0035(N＝12)非胰岛素处理的病 169.8±15.7183.2±19.9 NS人 (N＝12)aP值为二期交叉ANOVA。NS为无统计意义与用胰岛素治疗病人接受安慰剂处理相比，用胰岛素治疗病人接受AC137处理后，给予Sustacal试验膳食，1小时至5小时平均血糖水平降低，具有统计学意义。在经AC137输注的用胰岛素治疗的病人，其血糖水平平均降低23％。
与安慰剂处理的病人相比，输注AC137的未用胰岛素治疗的病人，其平均血糖水平无统计学显著差别。
给予Sustacal试验膳食后，用胰岛素治疗和未用胰岛素治疗病人，其血糖(最大血糖浓度)的零小时AUC葡萄糖(1-5)(用斜形规则(trapezoidal rule)计算的1至5小时试验期，高于或低于血糖浓度基质的曲线下的面积)与零小时C最大值，见表2中所总结。表2 Sustacal试验膳食后零小时AUC(1-5)至Cmax血糖亚组/参数AC137 安慰剂 p值a(平均±SEM)(平均±SEM)经胰岛素处理的病人(N＝12)AUC(1-5)(mg-h/dl) 51.2±52.0 284.4±52.3 0.0012Cmax(mg/dl) 42.0±15.0 118.1±17.1 0.0007未用胰岛素处理的病人(N＝12)AUC(1-5)(mg-h/dl) 53.3±27.4 124.3±28.3 NSCmax(mg/dl) 40.1±10.2 66.9±7.7 0.038a二期交叉ANOVA p值。NS无统计意义经Sustacal试验膳食后，经胰岛素处理的病人与未用胰岛素处理的病人，其血糖AUC(1-5)和Cmax，见表3中所总结。表3 Sustacal试验膳食后AUC(1-5)和Cmax血糖亚组/参数AC137安慰剂 p值a(平均±SEM)(平均±SEM)经胰岛素治疗的病人(N＝12)AUC(1-5)(mg-h/dl) 736.2±54.1 984.7±67.60,0031Cmax(mg/dl) 213.3±14.9 293.2±21.90.0017未经胰岛素治疗的病人(N＝12)AUC(1-5)(mg-h/d1) 681.3±62.8 738.3±80.0 NSCmax(mg/dl) 197.1±17.1 220.4±20.00.048a为二期交叉ANOVA p值。NS为无统计意义与经胰岛素治疗病人再接受安慰剂处理相比较，经胰岛素治疗病人接受AC137处理后，葡萄糖零小时AUC(1-5)，零小时Cmax，AUC(2-5)和Cmax降低均有统计学意义。零小时参数的作用是非常深远的。经胰岛素治疗的病人接受AC137处理后，零小时AUC(1-5)平均降低93％，而零小时Cmax平均降低66％。
在未经胰岛素治疗的病人上，虽然其零小时AUC(1-5)的降低看来是有临床意义的，但是接受AC137输注后仅葡萄糖零小时Cmax和Cmax的降低，具有统计学意义。
将经胰岛素处理的病人的结果，与未经胰岛素处理的病人的结果，进行了比较(ANOVA)。经安慰剂输注后，经胰岛素处理的病人其葡萄糖零小时AUC(1-5)，比未经胰岛素处理的病人高(p=0.013)2.3倍。经胰岛素处理的病人接受安慰剂后，其葡萄糖零小时Cmax，比未经胰岛素处理的病人接受安慰剂后，高(p＝0.012)1.8倍。在经胰岛素处理的病人接受安慰剂后，其葡萄糖AUC(1-5)和Cmax也升高(p分别为0.028和0.023)。输注AC137后，将经胰岛素治疗的病人与未经胰岛素治疗的病人结果进行比较，其葡萄糖零小时AUC(1-5)，零小时Cmax，AUC(1-5)和Cmax，均无统计学显著差异。
选择病人的标准包括系II型糖尿病人，其糖化红血球(HbAlc)水平升高至13％，并测定了AC137诱导的膳食后高血糖的降低与起始HbAlc水平之间的相关关系。从输注安慰剂后的葡萄糖零小时AUC(1-5)值减去输注AC137后葡萄糖零小时AUC(1-5)值，可计算膳食后高血糖的降低。该结果按病人HbAlc水平的排列顺序，列于图1中。
在未经胰岛素处理的病人上，其膳食后高血糖的降低，看来是随HbAlc水平而增加。在亚组病人，其相关值(r2)为0.56，在经胰岛素处理的病人为0.10，而对所有病人为0.33。
为进一步评价膳食后高血糖的降低与HbAlc水平之间的相关关系，在HbAlc水平≥8％和＜8％的经胰岛素处理和未经胰岛素处理的病人上，对其Sustacal试验膳食后的葡萄糖零小时AUC(1-5)，零小时Cmax，AUC(1-5)和Cmax进行了评价。
对于经胰岛素和未经胰岛素处理的病人，其HbAlc水平≥8％时，Sustacal试验膳食后的血糖零小时AUC(1-5)和零小时Cmax，见表4中所总结。表4 Sustacal试验膳食后零小时AUC(1-5)和零小时Cmax病人HbAlc水平≥8％的血糖亚组/参数 AC137 安慰剂 p值a
(平均±SEM) (平均±SEM)经胰岛素处理的病人(N＝9)AUC(1-5)(mg-h/dl) 63.1±69.4314.8±67.30.0080Cmax(mg/dl)48.8±19.4127.1±21.40.0055未经胰岛素处理的病人(N＝5)AUC(1-5)(mg-h/dl) -7.9±32.8189.8±41.20.0323Cmax(mg/dl)20.6±12.079.4±11.2 0.0238a为二期交叉ANOVA值。NS无统计意义对经胰岛素和未经胰岛素处理的病人，其HbAlc水平≥8％时，Sustacal试验膳食后的血糖AUC(1-5)和Cmax，见表5中所总结。表5 Sustacal试验膳食后AUC(1-5)和Cmax病人HbAlc水平≥8％的血糖亚组/参数 AC137 安慰剂 p值a(平均±SEM)(平均±SEM)经胰岛素处理的病人(N＝9)AUC(1-5)(mg-h/dl) 747.9±68.6987.7±75.40.0337Cmax(mg/dl)220.0±18.6295.3±23.60.0153未经胰岛素处理的病人(N＝5)AUC(1-5)(mg-h/dl) 871.4±49.81033.8±34.3 0.0369Cmax(mg/dl)240.4±16.4290.4±11.40.0362a为二期交叉ANOVA值。NS无统计意义与接受安慰剂病人相比，HbA1c水平≥8％的经胰岛素和未经胰岛素治疗病人，当接受AC137后，其葡萄糖零小时AUC(1-5)，零小时Cmax，AUC(1-5)及Cmax降低，均有统计学意义。未经胰岛素处理的HbAlc水平≥8％的病人，这些差异具有统计学意义，并且大于所有不考虑其HbAlc水平高低的未经胰岛素处理的病人的差异。
对经胰岛素处理和未经胰岛素处理的，其HbAlc水平＜8％的那些病人，Sustacal试验膳食后，血糖的零小时AUC(1-5)和零小时Cmax值见表6中所总结。表6 Sustacal试验膳食后零小时AUC(1-5)和零小时Cmax病人HbAlc水平＜8％的血糖亚组/参数 AC137安慰剂 p值a(平均±SEM) (平均±SEM)经胰岛素处理的病人(N＝3)AUC(1-5)(mg-h/dl) 15.5±30.4193.1±14.40.0324Cmax(mg/dl)21.7±10.891.0±20.6NS未经胰岛素处理的病人(N＝7)AUC(1-5)(mg-h/dl) 96.9±32.877.6±29.0NSCmax(mg/dl)54.0±13.458.0±9.8 NSa二期交叉ANOVA值。NS为无统计意义对经胰岛素处理和未经胰岛素处理的，其HbAlc水平＜8％的那些病人，Sustacal试验膳食后，血糖AUC(1-5)和Cmax值，见表7中所总结。表7 Sustacal试验膳食后AUC(1-5)和Cmax病人HbAlc水平＜8％血糖亚组/参数 AC137 安慰剂 p值a(平均±SEM)(平均±SEM)经胰岛素处理的病人(N＝3)AUC(1-5)(mg-h/dl) 700.8±84.2975.8±179.7 NSCmax(mg/dl)193.0±22.1286.7±61.9 NS未经胰岛素处理的病人(N＝7)AUC(1-5)(mg-h/dl) 545.5±61.9527.3±41.8 NSCmax(mg/dl) 166.1±20.3170.4±13.9NSa二期交叉ANOVA值。NS为无统计意义与接受安慰剂的病人相比较，虽然葡萄糖零小时Cmax，AUC(1-5)和Cmax可能有临床意义，但是对HbAlc水平＜8％的经胰岛素处理的，接受AC137的病人，仅其葡萄糖零小时AUC(1-5)降低具有统计学意义。对所有经胰岛素处理的病人，不论其HbAlc水平高低，将其中接受AC137的病人与接受安慰剂的病人相比较，葡萄糖零小时AUC(1-5)，零小时Cmax，AUC(1-5)和Cmax降低均有统计学意义。对于未经胰岛素处理的HbAlc水平＜8％的病人，将其中接受AC137的病人与接受安慰剂的病人相比较，其葡萄糖零小时AUC(1-5)，零小时Cmax，AUC(1-5)和Cmax值均无统计学差异。
因此，II型糖尿病人即使未服用过胰岛素，也就是说，例如当病人首次饮食疗法未失败，特别是那些具有高于HbAlc正常值的II型糖尿病人，当服用淀粉样肽激动剂后，能有效地降低其血糖浓度。
权利要求
1.-种治疗非胰岛素依赖的II型糖尿病的方法，包括给所述的病人服用治疗有效量的淀粉样肽激动剂。
2.一种降低非胰岛素依赖的II型糖尿病患者血糖的方法，包括给所述的病人服用治疗有效量的淀粉样肽激动剂。
3.权利要求1的一种方法，其中所述的病人系HbAlc值高于正常人HbAlc值上限。
4.权利要求2的一种方法，其中所述的病人，其HbAlc值高于正常人HbAlc的上限。
5.权利要求1的一种方法，其中所述的病人HbAlc值约为8％或更高。
6.权利要求2的一种方法，其中所述的病人HbAlc值约为8％或更高。
7.权利要求1至6中的任一方法，其中所述的淀粉样肽激动剂为25，28，29Pro-h-淀粉样肽。
8.权利要求1至6中的任一方法，其中所述的淀粉样肽激动剂为s-降钙素。
9.权利要求1至6中的任一方法，其中所述的淀粉样肽激动剂为h-淀粉样肽。
10.权利要求1的一种方法，其中所述的淀粉样肽激动剂，是经肌内或经皮下给药。
11.权利要求2的一种方法，其中所述的淀粉样肽激动剂，是经肌内或经皮下给药。
12.权利要求7的一种方法，其中所述的淀粉样肽激动剂，是经肌内或经皮下给药。
全文摘要
治疗非胰岛素依赖性II型糖尿病的方法，包括服用治疗有效量的淀粉样肽激动剂。
文档编号A61K38/23GK1163572SQ96190855
公开日1997年10月29日 申请日期1996年6月7日 优先权日1996年6月7日
发明者O·G·科特曼, R·G·汤普森, J·F·马伦 申请人:安米林药品公司