专利名称：：诱导粘膜免疫应答的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于诱导哺乳动物中抵抗感染粘膜的病原生物体的保护性免疫应答的接种试剂盒。免疫性细胞可以在器官中集中，或者形成或多或少弥散的淋巴组织，这些组织和器官共同组成淋巴系统。初级淋巴器官为淋巴细胞生成的主要部位(胸腺，骨髓)，在二级淋巴器官和组织中淋巴细胞可相互作用或与抗原作用，这是被公认的。二级淋巴器官包括脾脏，淋巴结及与粘膜有关的淋巴样形成(MALT指粘膜相关的淋巴组织)，派伊尔结和腭扁桃体。除了组成MALT的淋巴组织外，在胃、小肠、结肠、气管及其它许多器官的粘膜中也发现大量的淋巴细胞。淋巴细胞在初级淋巴器官中分化后，迁移到二级淋巴器官。后者为系统免疫或粘膜免疫的诱导部位。因为它们也叫做“系统的”或“粘膜的”器官。在“系统”器官中，已公认脾脏与进入血液循环的抗原起反应；外周结节对进入其影响淋巴引流的解剖区域的抗原起防御作用。下表中列出相应于导流区域(诱导或效应部位)的不同结节。与粘膜相关的免疫系统保护机体抵御通过粘膜上皮表面进入并在此停留的抗原。这包括瓦尔代尔环并出现与呼吸道(BALT为支气管相关的淋巴组织)、消化道(GACT为肠相关的淋巴组织)和泌尿生殖道有关的淋巴组织。与粘膜(诱导部位)相关的免疫系统见下表一旦刺激二级诱导器官，淋巴细胞可通过淋巴运送迁移到效应部位，经过与效应部位相连的结节，在那儿适于通过较大的结节引流这些一级结节，流出的淋巴小静脉终止于胸导管。淋巴从后者加入血液循环，通过血液循环细胞去往靶器官或效应部位。而MALT的淋巴细胞，后者再循环到粘膜区域。例如，派氏结中激活的细胞穿过相连的淋巴结，然后进入血液停留在某些粘膜区域。这种选择性再循环应归因于淋巴部位识别特别是在粘膜毛细小静脉内皮细胞表达的粘附分子的能力。作为此机制的结果，粘膜区域的抗原刺激(诱导物)可诱导其它粘膜区域的反应(效应物)。迄今，科学文献中已报道了许多免疫方法。这些方法的主要特征一般来说为(i)免疫原本质，(ii)给予免疫原的途径，以及(iii)免疫原的组成。关于免疫原的本质，用实质为核酸(RNA，DNA)的免疫原替代实质为蛋白质的免疫原的可能性已经知道很久了。因此不必对这方面作详细说明。利于预防或治疗粘膜感染的免疫途径和方法已经作为一些研究的目标，但尽管如此，仍未遇到像种痘一样成功的对付系统感染的系统的方法。然而，这些研究共同表明当涉及到一种将自身固定在粘膜上的病原体，系统给予的免疫似乎不足以提供足够的防护。为了有效地抵御这种感染，除必须通过粘膜诱导免疫反应的外，加之系统诱导免疫，通常可得理想的结果。粘膜给予免疫刺激淋巴样组织引流病原体浸入的粘膜实质上为可能的，因而针对这/这些粘膜获得免疫应答。A型免疫球蛋白(IgA)是胃肠、呼吸、泌尿生殖或其它的粘膜表面上免疫球蛋白的主要组成部分。它们在这些粘膜中被分泌，并且被认为对影响这些部位的感染起保护作用。粘膜免疫应答通常在直接在效应物粘膜或在距预抵御的感染部位有一定距离的另一粘膜部位粘膜给予免疫后获得。能进入免疫的粘膜主要途径为口腔途径、胃内途径、鼻途径、泌尿生殖途径和直肠途径。而口腔途径由于其便于利用是优选的途径，无论是接种以抵御胃肠粘膜感染或者抵御其它粘膜的感染。为了解释这一点，现有技术的各种实例给出如下最近，Czinnetal.，Vaccine(1993)11637已推荐用以抵御幽门螺杆菌的接种方法概要，该菌为多数胃溃疡的病原物质。无菌小鼠通过胃内途径，以霍乱毒素作辅剂给予felis螺杆菌的sonicate(给予的sonicate直接通过插管进入胃内)。用felis螺杆菌免疫后，发现被免疫小鼠已被保护。为了方便起见，在论文剩余部分这个步骤叫作“口腔免疫”。本论文的相同物在Czinn&NedrudPatentApplicationWO93/20,843可找到。Jerbornetal.，Vacccine(1992)10130报道用一小组瑞典受试者完成的霍乱接种研究。给予两种剂量疫苗，以溶液形式吞咽。该疫苗证明有效并无危险性。通过鼻途径对流感接种已在儿童和成人身上成功地实现，报道见Andeersonetal.，J.Clin.Microbiol.(1992)302230和Treanoretal.，Ann.Iater.Med.(1992)117625.Gallichanetal.，J.Infect.Dis.(1993)168622报道鼻内给予表达单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白B的重组腺病毒后，可能引起粘膜和系统免疫反应。总之，作者们认为，一般说来，他们的方法可能获得抵御粘膜或性传播病毒的长期保护。有些研究，如Forestetal.，Voccine(1990)8:209提出直肠途径对整个粘膜免疫系统是一种进入途径，它应该可能诱导远离直肠粘膜部位的粘膜免疫应答，可被用作免疫原的进入途径。为获得一种理想应答的选择方式，几位作者描述不同免疫途径的组合。例如，粘膜给予和系统给予的组合在下列论文中有描述。Kerenetal.，Infect.Immun.(1988)56:910显示一种通过联合途径免疫的方法，胃肠外的及口服的，在抵御弗氏志贺氏菌的IgA反应方面比只通过一种途径的免疫效果好。实际上，小鼠在麻痹下肌肉注射及通过导管于胃内接受抗原。Yoshimuraetal.，Arch.Ptolaryngol.HeadNeckSurg.(1991)117889建议通过系统的和口服联合接种抵御肺炎球菌耳炎该免疫方法在豚鼠上进行试验。实际上，所说的口服给药是通过十二指肠或胃导管，或服用肠胶囊完成。作者们指出只有以胶囊的形式，将系统和口服给药联合应用才有好结果。Forest.etal.，Infect.Immun.(1992)60(2)465为了诱导IgA对伤寒沙门氏菌的反应，在人身上试验了几种免疫方式。口及皮下途径用法如下口；口/口；口/皮下及皮下/口。作者指出第一次口服几天后，再胃肠外注射一次，不足以进IgA反应。相反地，口服疫苗并重复一次有好结果。Hartmanetal.，Infect.Immun.(1994)62(2)412描述几种对志贺氏菌的免疫方法。其中之一特别地包含首次腹腔内或皮下注射，再通过目途径给予加强免疫剂。这种方法在对比组豚鼠的角膜结膜炎进行了试验。作者指出在首次动物实验中，粘膜给予免疫对诱导防护是必要的。通过胃肠外的和粘膜的两次免疫，增强了防御能力。Nedrudetal.，J.Immunol.(1987)1393484描述一种抗Sendai病毒感染(可能发展为支气管炎和肺炎的鼻咽感染)的免疫方法。通过实行该方法，寻找的免疫应答的效应部位是整个呼吸道。Nedrud等人的方法包含两个主要步骤首次口服免疫(胃内)和通过鼻途径的激活。一般来讲，口途径(胃内)不被认为是呼吸道里使诱导剂(在此处为Sendai病毒)到达免疫应答的诱导部位之一的理想途径。已经发现各种粘膜部位抗各种抗原的免疫应答，可通过补充结合几种途径的免疫方法大大加强。因此，本发明涉及一种药物组合物，它用于在粘膜效应部位诱导宿主哺乳动物抵御抗原的保护性免疫反应，它含有至少两种相同的或不同的组分，每种含有选自抗原的免疫反应诱导剂，而且假如抗原是蛋白质，还含有能表达该抗原的表达盒，用于伴随的或连续给药；一种产品为通过鼻口腔途径给药配制，使诱导剂靶向鼻-口咽或唾液腺中免疫应答的诱导部位，另一种产品为通过鼻途径以外的合适粘膜途径给药而配制，使诱导剂靶向免疫应答所寻找的免疫效应部位。根据本发明的药物任选地包含第三种产品，与前两种相同或不同，它含有选自抗原的免疫应答诱导剂，并且如果抗原本质为蛋白质，则有能表达该抗原的表达盒，优选在已说明的前两个产品之前，配制用系统给药。换句话说，本发明的目的为宿主哺乳动物中，在效应部位针对一种抗原，诱导粘膜免疫应答的试剂盒，它包含(i)优选的第一种免疫应答诱导剂任选自抗原，并且如果抗原为蛋白质，则选自能表达该抗原的表达盒，编码抗原的DNA或RNA片段；以及(ii)免疫应答的第二和第三种诱导剂，选自抗原，并且如果抗原本质上为蛋白质，选自能表达该抗原的表达盒，编码该抗原的DNA或RNA片段；以及(a)任选地，第一种诱导剂的系统给药指导，(b)第二种诱导剂的鼻口腔给药的指导，(c)第三种诱导剂通过合适的粘膜而非鼻途径的给药指导，以便抗原靶向效应物部位的免疫反应诱导部位，该效应部位是此免疫应答所寻找的，和(d)第一，第二和第三种诱导剂伴随或连续给药的指导。本发明还涉及在粘膜效应部位，诱导宿主哺乳动物对抗原的免疫应答方法，根据任意顺序排列如下(i)第一种免疫应答诱导剂任选地对宿主哺乳动物系统给药，选自抗原，并且如果抗原是蛋白质，选自能表达抗原的表达盒编码该抗原的DNA或RNA片段；(ii)第二种免疫应答诱导剂通过鼻和/或口腔(鼻口腔)途径给予宿主哺乳动物，选自抗原，并且如果抗原是蛋白质，选自能表达该抗原的表达盒，编码该抗原的DNA或RNA片段；和(iii)第三种免疫应答诱导剂通过合适的粘膜而非鼻途径给予宿主哺乳动物，以便抗原靶向免疫应答所寻找的免疫效应部位，选自抗原，并且如果抗原本质为蛋白质，选自能表达该抗原的表达盒，编码该抗原的DNA或RNA片段。第一种诱导剂的给药可以方便地以单剂量系统注射实行，如静脉、肌肉、真皮内或皮下注射。注射部位和途径的选择将特别依赖于欲靶向的淋巴结。可以指出，例如如果欲靶向腹腔的结节，则优选使用肌内途径(而非皮下途径)在背腰区域进行注射，这种诱导剂优选以颗粒的形式给药。诱导剂方便地通过沉淀或吸收而补以佐剂。佐剂可以是传统的磷酸铝、氢氧化物或磷酸钙型的佐剂，或者如磷酸钙型的佐剂，或者如polyphosphazene的佐剂。也可以是脂质体、微球体、ISCOM或类病毒颗粒(VLP)型佐剂，当欲靶向导流泌尿生殖器官区域的结节时，用后者特别有利。所有这些佐剂对本领域的技术人员是熟悉的。合适的剂量相应于某些参数而变化，如被处理的个体或诱导剂的本质。从应用角度讲，抗原的剂量可以在5-100μg间变化，优选25-50μg。相对本发明的目的，通过“鼻口腔途径”意思是该途径使免疫原基本到达瓦尔代尔氏环或其等同物，种类上为NALT而非人类种属。应该清楚鼻口腔(或口腔)途径不能与通常指的“口途径”混淆，应更恰当地命名为“胃内途径”。口途径，包括胃内途径应使诱导剂(抗原)主要到达下部区域的粘膜(消化道及主要为小肠和派尔氏节)，而口腔途径基本上运送诱导剂到达上部区域的粘膜。口腔途径和口途径的进入部位可以相同；在这种情况下进入部位为口。然而，途径从本质上说是不同的。相同的解释适用于肺途径，它使诱导剂达中部区域(支气管)的粘膜。为了优化目的免疫应答，免疫原的制剂也是重要的。一般来说，在诱导粘膜免疫应答方面微粒组合的抗原比可溶性抗原更有效。从同一进入部位开始的诱导剂遵循的途径依赖于多种因素；其中有作为诱导剂存在形式的颗粒的性质及大小，以及有利于喷雾式悬浮微粒的、以及用以推动颗粒的仪器设备，特别是其形状、喷口方向和推动速度。关于颗粒的性质，本领域的技术人员在其处理上有广泛选择；该选择虽然没有限制，但优选自两组脂质体和微球。制备这些颗粒的方法是常规的，并在本领域技术人员的能力之内根据自己的需要选择其中之一，并且确定颗粒的大小，根据所采用的路径，颗粒的大小必须适合于诱导剂，并理想地分布在靶粘膜上。因而，通过鼻或口腔途径给药的建议颗粒直径大于10μm；通过肺途径给药，粒径0.05-10μm，优选0.05-5μm；通过口途径给药，粒径0.05-10μm，优选0.05-5μm。可以找到的免疫主要效应物部位为呼吸系统(支气管，鼻咽，肺)，胃，肠和泌尿生殖系统。就呼吸系统而言，优选第三种诱导剂配制以利于通过肺途径给药(如脂质体，微球体等)。就胃或肠而言，优选第三种诱导剂以利于通过口途径，包括胃内途径给药的配制(如存在保护，脂质体，微球体，硫酸氢盐或明胶囊)。就肠或泌尿生殖系统而言，优选第三种诱导剂以利于泌尿系统途径给药的配制，如以阴道胶囊形式，或通过直肠途径，如以栓剂形式。第二或第三种诱导剂还可以补充无毒、脂质体或微球体之外的辅剂，及无毒些基或细菌毒素的去毒形式之外的辅剂。根据优选实施方案，细菌如大肠杆菌、明尼苏达沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌或弗氏志贺氏菌的主要脂多糖(MPLA主要脂多糖抗原)，可用作第二或第三种诱导剂的佐剂。这种类型的化合物现已发现具有良好的佐剂特性，可通过粘膜途径在此进行免疫。因此，本发明的另一方面覆盖MPLA用作制备制剂的粘膜佐剂，该制剂(i)含有一种抗原，如果抗原本质上为蛋白质，则为能表达该抗原的表达盒，编码该抗原的DNA或RNA片段，(ii)用于对抗原的粘膜免疫应答，以及(iii)用于通过粘膜途径给药。作为指导应指出，对第二种或第三种诱导剂，当后者为抗原时，可以每剂100μg-1mg比例给药。依据优选实施方案，给药时第一种诱导剂(系统给药)首先注射，允许在首次加强(给予第二或第三种诱导剂)前有7-45天期间，优选20-30天的时间间隔。依据另一个实施方案，第一种诱导剂也可以与第二或第三种诱导剂同时给予。第二种和第三种诱导剂可伴随或连续给予。当在一段时间内散布给药时，以7-45天间隔给药为好，优选28天。如果需要，也可能设想第一种和第二种诱导剂同时使用(也就是几乎在同一天)，并且在间隔几天后重复此操作一次。三种诱导剂中每一种的选择均不依赖于其它种。三者中至少一种的抗原是有利的。这三种诱导剂相同是很普通的，在这种情况下，选抗原是容易的。作为本质上是蛋白质的抗原的替代物，也可用(i)疫苗载体，如痘病毒或腺病毒类型，含有编码此抗原的DNA片段，并且位于一个合适的启动子控制之下，(ii)这一DNA片段(未被疫苗载体携带)被放入质粒形式(DNA片段优选插入质粒，而非保持在一种简单转录单位状态)，或存在于(阴离子或阳离子的)脂质体制剂中，(iii)或为相应的RNA片段。这种可能性已在文献中有描述。为了实施前面段落中提到的任一种不同的可能性，可使用能在哺乳动物细胞中诱导表达编码该抗原的DNA片段的启动子。由于疫苗通常指基于DNA(为了将它们区别于基于病毒载体的疫苗)，人类细胞肥大病毒(hCMV)早期启动子是一种可供选择的启动子。对于这种类型的接种，优选使用不能在哺乳动物中复制的质粒。基本上不整合的质粒也是合适的。根据优选实施方案，对宿主哺乳动物致病的细菌的抗原是一种幽门螺杆菌抗原，如幽门螺杆菌脲酶的脱辅基酶形式，或者同种脲酶的ureA或ureB亚基之一。更普遍地，从免疫方法的立场，并且同时更准确地从抗原的立场作为目标，可以指出本发明的主题也是将编码一种幽门螺杆菌抗原的DNA片段，用于预防或治疗幽门螺杆菌感染的一种组合物的制造，并用于鼻或鼻口腔给药。为此目的，用作接种剂的DNA片段符合上述标准。还发现为了诱导对感染胃或肠的病源生物体的粘膜免疫应答，不必在这些部位给予免疫原，而通过上部途径给予免疫是足够的，即通过鼻口腔途径，并适当地结合系统给药。因此，在另一方面，本发明涉及在宿主哺乳动物中诱导对一种抗原免疫应答的组合物，在胃或肠中，包含用于免疫应答的诱导剂，它选自能表达该抗原的表达盒，编码该抗原的DNA或RNA片段，配制用于通过鼻口腔途径给药的诱导剂。在此相同的方面，本发明还覆盖产品的应用，该产品选自一种抗原，并且如果抗原本质上为蛋白质，则选能表达该抗原的表达盒，编码该抗原的DNA或RNA片段，用于制备一种组合物，它在宿主哺乳动物胃或肠中诱导对产品的免疫应答，并用于通过鼻口腔途径给药。这种组合物当其包含一种感染胃或肠粘膜的病源生物体的抗原是有用的，特别是因为它保护宿主哺乳动物免受上述感染，尤其提供长时间持续的保护，伴生记忆T和B淋巴细胞。可能的感染是由幽门螺杆菌、霍乱弧菌、弗氏志贺氏菌、亲内氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、difficile梭状芽孢杆菌，小肠结肠耶尔森菌以及肠毒性的和肠病源性的大肠杆菌引起的。至于相关抗原，它本身可以是杀死、裂解或毒性减弱等形式的致病剂，或此病原体的抗原成分，如衣壳多糖、或纯化形式的膜抗原或此病原体的多肽性质，从病原体直接纯化或通过重组DNA技术获得。例如，就预防幽门螺杆菌感染的组合物而言，选择的抗原可以是脲酶的脱辅基酶，由A和B亚基组成，相应的DNA片段在如Labigne等，J.Bact.(1991)173(6)1920中所描述的，或者脱辅基酶的亚基之一，或细胞毒素(WO93/181850)，或粘附素家族(能结合到宿主细胞受体上的蛋白质，并能介导病原体与宿主细胞的连接，起始感染过程)的蛋白质，或铁调节的蛋白质。就霍乱疫苗而言，选择的抗原可以是文献中描述的霍乱毒素B亚基。本发明通过参考图1-5解释如下。图1描绘Elispot分析通过给予霍乱毒素B亚基(CTB)引起唾液腺(1A)和胃(1B)免疫应答。结果涉及三种免疫方法皮下/口(ScO)；皮下/鼻(ScN)；和皮下/口+鼻(Sc+N)。“口”当然理解为指“胃内”。亮背景上的深阴影对应IgA应答。暗背景上的浅阴影对应IgG2a应答。胃中的反应以一组5只小鼠中反应小鼠数量表示；每百万细胞的点的数目为9次方(order)。图2描绘根据皮下/皮下+口+鼻(Sc/Sc+O+N)方法，给予CTB诱导唾液腺(2A)和胃(2B)免疫应答的Elispot分析。“口”当然理解为指“胃内”。亮背景上的深阴影对应IgA应答。暗背景上的浅阴影对应IgG2a应答。胃中的反应以一组5只小鼠中反应小鼠数量表示；每百万细胞的点的数目为8.2次方。图3描绘根据皮下(明矾)/口+鼻(脂质体)方法，给予刀豆脲酶诱导唾液腺(3A)和胃(3B)免疫应答的Elispot分析。“口”当然理解为指“胃内”。亮背景上的深阴影对应IgA应答。暗背景上的浅阴影对应IgG2a应答。胃中的反应以一组5只小鼠中反应小鼠数量表示；每百万细胞的点的数目为620次方。图4描绘根据皮下(脂质体)/口+鼻(脂质体)方法，给予刀豆脲酶诱导唾液腺(4A)和胃(4B)免疫应答的Elispot分析。“口”当然理解为指“胃内”。亮背景上的深阴影对应IgA应答。暗背景上的浅阴影对应IgG2a应答。胃中的反应以一组5只小鼠中反应小鼠数量表示；每百万细胞点的数目为15次方。图5描绘用来生产幽门螺杆菌脲酶的脱辅基酶的质粒pTG8665。图6描绘质粒pCMC/E1a，其中HiadIII(1)-SacII(754)片段含有hCMV启动子，XhoI(771)-SmaI(2104)片段含有E1aORF，SmaI(2104)-EcoRI(2810)片段含有BGH3′端，并且EcoRI(2810)-HindIII(1)片段对应pUC19骨架。图7描绘质粒pCB-11。图8描绘质粒pCB-ureB，其中ureBORF从核苷酸777延伸至2487。图9以图式表示抗脲酶抗体在用质粒pCB-ureB免疫的Balb/c小鼠中记录的效价。连续的曲线描绘IgG效价，断续的曲线描绘IgA效价。■对应通过鼻内途径重复给药3次(DO，21和42；单独质粒或质粒+脂质体)。◆对应通过肌内途径首次免疫(只质粒)，再经鼻内途径在D21和42加强免疫两次(质粒+脂质体)。●对应通过真皮内途径首次免疫(只质粒)，再经鼻内途径在D21和42加强免疫2次(质粒+脂质体)。图10以图式表示免疫后小鼠胃介质的光密度，在那里适当地用幽门螺杆菌脲酶的脱辅基酶攻击。第一个柱未感染小鼠；第二个柱经皮下小鼠首次得到空脂质体的免疫，再经(鼻+胃内)途径两次加强免疫；第三个柱小鼠通过皮下首次得到含脲酶脂质体的免疫，再经(鼻+胃内)途径两次加强免疫；第四个柱小鼠经(鼻+胃内)途径给予含脲酶的脂质体三次。在所有情况下，使用的都是DC-Chol脂质体。实施例1抗霍乱毒素亚基B(CTB)的粘膜免疫应答的诱导1.A.免疫组合物的制备1.A.a)用于通过皮下途径给药1μl已纯化并浓缩至10mg/ml(相当于10μgCTB)的CTB制剂与100μl1％氢氧化铝制剂混合。混合液用PBS缓冲液稀释到终体积为500μl。这便组成一个单独剂量。1.A.b)用于通过口(胃内)途径给药取出3μl体积的乳胶珠(Polysciencescat.1734)，然后用PBS缓冲液洗3次(1000rpm离心三分钟)。这些乳胶珠再与已纯化并浓缩至10mg/ml的CTB制剂混合以便获得CTB被稀释到1/20(相当于终浓度为0.5mg/ml)的制剂。此制剂被搅拌2小时。最后用200μM碳酸盐缓冲液把此制剂稀释到1/25。1.A.c)用于通过鼻途径给药涂在乳胶珠上的CTB制剂用如1.A.b)节中所述的方法得到，只有最终用碳酸盐缓冲液稀释这一步骤省去。根据需要此制剂再用PBS缓冲液稀释。1.1.d)用于通过口+鼻途径给药通过如1.A.b)和1.A.c)所述的方法，口和鼻给药联合用来完成给药。1.B.免疫方法比较三种免疫方法。它们是1)皮下/口(胃内)2)皮下/鼻3)皮下/口(胃内)+鼻通过皮下途径，Balb/c小鼠接受500μl用如1.A.a)方法制得的用铝盐做佐剂的含10μgCTB的制剂。对照组小鼠皮下接受500μl的PBS。皮下注射28天后，受试小鼠被分成3组。第一组小鼠，经连有1ml注射器的插管，胃内接受如1.A.b)节描述的涂在乳胶珠上的含10μgCTB，体积500μl的制剂。通过同样的途径，对照组小鼠接受500μl碳酸盐缓冲液。第二组小鼠，经鼻途径接受如1.A.c)节描述的涂在乳胶珠上的含10μgCTB，体积20μl的制剂。全部20μl被滴入到鼻口中。通过同样的途径，对照组小鼠接受20μlPBS。第三组小鼠，同时经口(胃内)途径和鼻途径各接受10μgCTB。涂在乳胶珠上的CTB制剂用如1.A.d)节中描述的方法得到。部分小鼠被用作对照。加强免疫后15天，切除小鼠的胃和唾液腺；根据Mega等，J.ofImmunology(1992)1482030描述的方法提取细胞，并且根据Czerkinsky等在TheoreticalandtechnicalaspectsofELISAandotherSolidPhaseImmunoAssays(D.M.kennenyandS.J.ChalacombeEds)JohnWiley&Sons，Chichester，NY描述的方法，Elispot分析IgA应答。结果显示在图1，并且评论如下皮下/口(胃内)方法证明不能诱导强的粘膜免疫应答，而这样的应答在皮下/鼻和皮下/口(胃内)+鼻方法的情况可以观察到。后一种方法证明是最好的，因为通过IgA产生的好的局部应答在唾液腺和胃中均可获得。1.C.补充的免疫方法如1.B.部分所述，皮下注射CTB的小鼠，注射28天后，同时-通过口(胃内)途径，给予含40μg如1.A.d)部分制备的CTB，体积500μl的制剂。-通过鼻途径，给予含10μg如1.A.d)部分制备的CTB，体积20μl的制剂。-通过皮下途径，给予含10μg如1.A.a)部分制备的CTB，体积300μl的制剂。加强免疫后15天，切除小鼠的胃和唾液腺，提取细胞，并且IgA应答Elispot分析。结果见图2。获得了好的IgA型免疫应答(5/5小鼠响应)，这是粘膜局部免疫应答的一个指标。实施例2抗刀豆脲酶的粘膜免疫应答的诱导2.A.免疫组合物的制备2.A.a)用铝作佐剂的脲酶在PBS缓冲液中浓缩成4mg/ml的5μl刀豆脲酶制剂(Boehringer；ref737348)与100μl1％氢氧化铝制剂混合。此混合物用PBS缓冲液稀释得到500μl，其中含20μg脲酶。这组成一个单独剂量。2.A.b)脂质体中的脲酶采用如下三种技术1.注射乙醇胆甾醇(Sigma)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(Nattermann磷脂)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油醇钠盐以摩尔比5∶4∶1组成的16.4mg脂混合物，溶于50μl无水乙醇。此溶液通过Hamilton注射器注射到2ml含4mg/ml刀豆脲酶的水溶液中，用PBS缓冲液稀释到1/10。然后在45℃连续搅拌。与水接触中，脂自发地形成脂质体(主要为平均大小为50-100nm的单层状脂质体)，包住一定体积的脲酶溶液。用SepharoseCL-4B(Pharmacia)凝胶柱过滤，纯化这些脂质体(从过量游离脲酶分离)。用碘-125标记的脲酶(EnzymobeadsTM技术，Biorad)测得脲酶包裹量在3～6％。如果需要，脂质体悬液通过排阻限为10kD的NovacellTM小室(Filtron)超滤浓缩。2.挤压胆甾醇(Sigma)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(Nattermann磷脂)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油醇钠盐以摩尔比5∶4∶1组成的16.4mg脂混合物，溶于25ml圆底Pyrex烧瓶中的4ml氯仿。溶液蒸发(Buchi旋转蒸发器)，在烧瓶壁上形成薄的脂膜。脂膜高真空干燥2小时，然后用含8mg刀豆脲酶的2ml水溶解。45℃搅拌4小时后，悬液通过两个叠加孔隙度为400nm的聚碳酸酯膜(NucleoporeTM，Costar)挤压(ExtruderTM，LipexBiomembrancesInc.，Vancouver)5次，形成一均匀分布的主要为直径大约400nm，含有脲酶的单层状脂质体。用SepharoseCL-4B(Pharmacia)凝胶柱过滤，纯化这些脂质体(从过量游离脲酶分离)。用碘-125标记的脲酶(EnzymobeadsTM技术，Biorad)测得脲酶包裹量在5～10％。如果需要，脂质体悬液通过排阻限为10kD的NovacellTM小室(Filtron)超滤浓缩。3.微流化床方法通过乙醇溶液(D3F-France)冷冻干燥得到的，胆甾醇(Sigma)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(Nattermann磷脂)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油醇钠盐以摩尔比5∶4∶1组成的82mg脂混合物，用10ml含150mMNaCl，pH7.410mM的Hepes缓冲液溶解。Hepes缓冲液含有3.6mg/ml重组脱辅基酶形式的幽门螺杆菌脲酶。在45℃搅拌4小时后，得到的悬浮液用M110S微流体化仪(MicrofluidicsCo.)在500kPa进行5轮微流体化，形成主要为单层脂质体的均匀分布，该脂质体直径约为100nm并含有脲酶。这些脂质体由凝胶过滤纯化(SepharoseCL-4B，Pharmacia)。采用MicroBCA试剂盒(Pierce)，通过蛋白试验测得的脲酶包裹量为14.5％。如果需要，脂质体悬液通过排阻限为10kD的NovacellTM小室(Filtron)超滤浓缩。2.A.c)以MPLA作佐剂的脂质体中的脲酶当制备脂质体时，可向脂混合物中加入相对于脂量1，2或5％比例的MPLA(从大肠杆菌提取，Sigma)。2.B免疫方法试验了两种免疫方法。它们是1)皮下(铝)/[口(胃内)+鼻](脂质体)2)皮下(脂质体)/[口(胃内)+鼻](脂质体)OF1小鼠经皮下途径接受-或者是含20μg脲酶，象2.A.a)节中描述的那样用铝作为佐剂，终体积为500μl的制剂，-或者是在脂质体制剂中的含20μg脲酶，由2.A.b)节获得，体积为500μl的制剂。皮下注射28天后，小鼠同时接受-通过口(胃内)途径，由2.A.b)节获得的脂质体制剂中的含20μg脲酶，体积为500μl的制剂；以及-通过鼻途径，由2.A.b)节获得的脂质体制剂中的含20μg脲酶，体积为50μl的制剂。加强免疫15天后，切除小鼠的胃和唾液腺；根据在开始时对样品描述的方法提取细胞，并且根据在开始时描述的方法，Elispot分析IgA应答。结果见图3和4。图3显示，就皮下(铝)/[口(胃内)+鼻](脂质体)方法来说，在唾液腺的IgA应答虽然弱，但是主要的，而对于胃(3B)，5只小鼠中只有3只对免疫应答，具有高数量的点。图4显示，就皮下(脂质体)/[口(胃内)+鼻](脂质体)方法来说，应答在唾液腺(4A)很好，而胃中(4B)弱。这提示，除所用的方法之外，抗原的制剂是重要的。实施例3对幽门螺杆菌感染的接种试剂盒含幽门螺杆菌脲酶的脱辅基酶的三种制剂，每一种根据面对的服用方法以不同的方式配制，被装在一个试剂盒中。3.A.制备脱辅基酶从Labigne等(见上)描述的其中一种质粒(pILL914)，用引物OTG5973和OTG5974通过PCR产生编码UreA的N-端部分片断(直到HindIII内切位点)，并在UreA翻译起始密码子中含一个BspHI位点。BspHIOTG5973CCAAATCATGAAACTCACCCCAAAAGAGTTAMetLysLeuThrProLysGluLeuGATAAGTTGAspLysLeuHindIIIOTG5974GCTTCTACATAGTTAAGCTTAATGCCTT用BspHI和HindIII消化PCR产生的片断，并与带有UreA和UreB3′部分的pILL914的2.35kbHindIII片断同时插入用NcoI和HindIII消化的pTG3704载体，得到图5所示的质粒pTG8665。该质粒带有与araB启动子融合的UreA和UreB基团。pTG3704载体在发表于1994.3.9的欧洲专利申请EPT584,266中有描述。该载体来自用Klenow聚合酶处理、在SphI位点破坏的质粒para13(Cagnon等，Prot.Eng.(1991)4843)。大肠杆菌菌株Xac-I(Normandy等，PNAS(1986)836548)用质粒pTG8665转化。转化株在补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养。在指数生长期，加入0.2％阿拉伯糖，用来诱导ureA和ureB的表达。不同诱导时间(1～3小时)之后，UreA和UreB的产生水平很高(大约占总蛋白的10％)，细胞然后被除去。通过离心从2.51的培养基中回收220g细胞。这些细胞溶解在大约1升pH7.5含175mgPMSF(1mM)的20mM磷酸钠缓冲液中。然后向细胞悬液中加入4μl浓度为250U/μl(Merck；ref.1654)，相当于终浓度1单位/ml的苯甲酸酶溶液，以及1mlMMgCl2溶液。反应进行30分钟。悬液被引入到Rannie装置(高压匀浆器)并经受1000bars的压力1小时以破碎细胞。然后在两种纯化方法中作出选择。3.A.a)第一种方法细胞的破碎通过光密度监测。当OD是2.5-2的顺序时，从装置上取下悬液并补加1ml0.5MEDTA溶液。在10000rpm离心2小时，然后回收上清液并在100000×g离心1小时，以除去膜。根据类似于Hu等，Infect.Immun.(1992)602657描述的方法进行纯化。调节含有可溶性蛋白的上清液到pH6.8，然后以4ml/min的流速上样到离子交换柱(DEAE-Sepharose，Pharmacia)上，柱体积5cm×25cm，用含1mMPMSF(PO缓冲液)的pH6.8的20mM磷酸钾缓冲液平衡。柱子用从0到0.5M的KCl线性梯度洗脱。每次收集14ml并用SDS-PAGE分析。含最纯脲酶的级分被合并。KCl加入到由此得到的级分中，使得KCl终浓度为1M，此溶液被上样到苯基-Sepharose(Pharmacia)柱上。柱子用从1到0M的KCl线性梯度洗脱。同以前一样，部分收集并用SDS-PAGE分析。含最纯脲的级分被合并，对pH7.5的20mM磷酸钾缓冲液透析。得到的级分上样到用pH7.5的20mM磷酸钾缓冲液平衡的离子交换柱(Q-SepharoseFastFlow；Pharmacia)上；同以前一样，柱子用从0到0.5M的KCl线性梯度洗脱，收集组分并用SDS-PAGE分析。合并含有脲的级分并通过截断阈值(cut-offthreshold)为100kDa的膜浓缩，所得组分上到用pH7.5的20mM磷酸钠缓冲液平衡的凝胶过滤柱(Sephacryl400HR)上；在用SDS-PAGE分析了不同的组分后，收集那些含有脲酶的组分并通过截断阀值为100kDa的膜浓缩，并且透过孔隙度0.22μm的膜过滤。无菌蔗糖溶液加到脲酶溶液中，以得到2％的终浓度。然后冷冻干燥此溶液并以此形式储存，待用。3.A.b)第二种方法调节此上清液到pH7.5，然后以4ml/min的流速载到离子交换柱(Q-SepharoseFastFlow；Pharmacia；ref.17-0510-01)上，柱体积5cm×25cm，先用含1mMPMSF的pH7.5的20mM磷酸钾平衡缓冲液平衡柱子。柱子用从0到0.5M的KCl平衡缓冲液线性梯度洗脱(梯度体积2.251；流速4ml/min)。每次收集14ml级分并用SDS-PAGE分析。收集合并最纯净的组分(这些通常是从梯度开始的第82-121级分)。Q-Sepharose合并样以2ml/min的流速上样到体积为2.6cm×11cm的锌螯合的柱子(螯合SepharoseFastFlow；Pharmacia；ref.l7-0575-02)上。此柱按下列方法预先制备。柱子用2倍体积的0.2MZnCl2溶液金属上样，然后用3倍体积的0.5MNaCl溶液冲洗，随后再用3倍体积的含有0.5MNaCl、1mM咪唑和1mMPMSF，pH8的50mMTris-HCl平衡缓冲液冲洗。用1倍体积的含有10mM咪唑的平衡缓冲液洗柱子，然后再用3倍体积含有1mM咪唑的平衡缓冲液冲洗。当负载完成后，柱子用平衡缓冲液洗至洗出物回到基线值(以0.2ml/min的流速洗涤过夜)。柱子再用200ml含有7.5mM咪唑的平衡缓冲液冲洗，流速1ml/min。从咪唑为从7.5mM到30mM的线性梯度(梯度体积；250ml；流速1ml/min)平衡缓冲液，进行洗脱。每次收集10ml组分，用SDS-PAGE分析。收集并合并含有纯脲酶的组分(一般是从梯度开始的第19-30组分)。螯合Sepharose合并样经通过AmiconYM100膜的超滤再浓缩至25ml。然后此浓缩物上样到SephacrylS-300柱子(Pharmacia；ref.17-0599-01)上，柱体积2.6cm×96cm，该柱用pH7.5的20mM磷酸钾，0.15MNaCl缓冲液平衡。色谱以0.5ml/min的流速完成。每次收集10ml组分并用SDS-PAGE分析。含有纯脲酶的级分被合并(这些一般是上样结束后的21到27组分)，经通过AmiconYM100膜的超滤浓缩至约2.5mg/ml。脱辅基酶制剂用孔隙度0.22μm的膜过滤，冷冻储存在-20℃或在蔗糖存在下冷冻干燥。试剂盒的制备如下3.B.用于经皮下途径给药的以铝为佐剂的脱辅基酶一剂注射制备如下用250μl1mg/ml的氢氧化铝制剂(alhydrogel；Superfos)吸附3.A.得到的20μl脱辅基酶溶液(相当于50μg)；在+4℃吸附2小时后，通过加入PBS将体积调节到500μl。3.C.在脂质体中的脱辅基酶，以气溶胶的形式用于经鼻口腔途径给药幽门螺杆菌脲酶以脱辅基酶形式被包裹在脂质体中。这些脂质体的平均直径为100nm，蛋白含量为60μg/mg脂。总量为0.1mg的按配方制造的脲酶经鼻口腔途径给药。气溶胶的使用可以通过VALOIS公司(LePrieure，BPG，27110LeNeubourg)所销售型号的双喷口(鼻和嘴)泵依其类型允许释放有限的体积，及适合装有泵容器的可变大小的喷口(每次给药不多于300μl，可在选择的时间间隔这个剂量重复)。3.D.用于胃内给药的脂质体中的脱辅基酶通过胃内途径给予总量为0.5mg按配方制造的脲酶。脱辅基酶根据3.C部分所述的方法制备，然后冷冻干燥并用20ml的200mM碳酸氢钠溶液溶解。3.E.免疫方法成人皮下接受3.B.中制备的剂量。首次注射28天后，再通过鼻口腔途径接受3.C.中制备的剂量并且在同一天咽下3.D.中制备的剂量。实施例4用于幽门螺杆菌感染的疫苗试剂盒(编码脲酶ureB亚基的DNA，用作接种剂)4.A.质粒载体的构建真核细胞表达载体pCB-11从下列三种元件构建-预先用XbaI和EcoRI消化的质粒pUC19(可购买到)；-从质粒pCMV/E1a(图6)中分离的SepI-SacII片断，它含有如USP5,168,062所述的人细胞肥大病毒(hCMV)的早期启动子；以及-含有牛生长激素基因3′部分的SacII-EcoRI片断，包括mRNA聚腺苷酸化信号和mRNA稳定序列。该SacII-EcoRI片断从质粒pBS-BGH获得，通过将来自质粒pCMV/E1a的BamHI-EcoRI片断插入Bluescript质粒(可购买到)构建。这三个片断连接起来形成质粒pCB-11(图7)。UreB基因从质粒pILL914并用下列引物通过PCR扩增上游引物5′cgtctcgagccaccatgaaaaagattagcagaaaag下游引物5′atcgtcccgggcaggcctcttagaaaatgctaaagagttgcgccaagct.。上游引物使XhoI限制性位点和Kozak序列导入ureB可读框(ORF)的上游，而下游引物使SmaI位点导入ORF的下游。PCR产生的片断被消化，然后插入预先用XhoI和SmaI消化的质粒PCB-11产生质粒pCB-ureB(图8)。用这个质粒转化大肠杆菌XI1，然后根据常规技术培养。扩增的质粒用标准方式收集，即碱裂解然后等密度氯化铯梯度离心。DNA用蒸馏水或生理盐水(0.9％NaCl)溶解。4.B.制备一种脂质体/DNA组合物根据Kunitake等，J.Am.Chem.Soc.(1984)1061978所述的方法，生产溴化O，O′，O″-三-十二烷基-N-(ω-三甲基氨-十二烷基)三(羟甲基)氨乙烷(通常叫做TCI-12)。取10mg该产品然后溶于50μl乙醇。该制剂用Hamilton注射器快速注射到2ml在42℃搅拌的取离子水中。直径约为50nm的脂质体在乙醇溶于水的溶解过程里自发形成。从而获得含有5.3mMTC1-12的脂质体制剂。将100μl上面得到的制剂加入150μl蒸馏水稀释。然后加入250μl浓度为2μg/μl的质粒pCB-ureB的水溶性制剂。加样比例(TC1-12/核苷酸)为0.35。4.C.免疫方法6-8周龄的Balb/c小鼠预先注射xylazine+ketamine混合物麻醉。它们以三周为间隔分别给予三次50μg的pCB-ureB。在不同的免疫方法中，人们通常使用鼻内(IN)途径，肌内(IM)途径和真皮内(ID)途径。用于通过鼻内途径给药时，将50μl浓度为100μg/ml溶于生理盐水的DNA溶液或4.B.得到的脂质体/DNA混合物滴入鼻孔。用于通过肌内途径给药时，将50μl浓度为100μg/ml溶于生理盐水的DNA溶液用带有29#针头的Hamilton注射器注射入四头肌。用于通过真皮内途径给药时，将100μl浓度为500μg/ml的DNA溶液用气喷口注射器(MesoflashTM10)注射到五个预先背部刮毛的皮肤部位。各种免疫方法如下</tables>在14，35和56天，从每只小鼠中取血清样本。通过ELISA检测抗脲酶抗体的产生(用纯化的可溶性幽门螺杆菌提取物)。图9中归纳的结果显示各种免疫方法能诱导强的IgG应答和较弱的IgA应答。实施例5抗幽门螺杆菌脲酶的粘膜免疫应答的诱导5.A.免疫组合物的制备将0.8gDC-Chol及2.4g二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)加入到1升圆底烧瓶的20ml氯仿中。将该混合物真空蒸发，使烧瓶壁形成一层脂膜。该膜然后在高真空下干燥过夜。此膜用溶于20mMHepes缓冲液，pH6.2，浓度为1.5mg/ml的400ml脱辅基酶溶液(如实施例3.A.所述制备)溶解。混合物在室温搅拌6小时。得到的多层小泡悬浮液用M110S微流化床(MicrofluidicsCo.)在500kPa进行10轮微流体化，形成主要为单层脂质体的均匀分布，该脂质体直径约为100nm并含有脱辅基酶。将这些脂质体通过Stenivex-HV滤膜(0.45μ，Millipore)过滤，然后在加入20g蔗糖后冷冻干燥。通过光散射(Zetamaster，MalvernInstruments)测得脂质体的大小为148±52nm。脱辅基酶的包裹度为20％；总量的剩余部分以自由形式(未包裹的)存在。5.B.免疫方法6-8周龄Swiss小鼠分成四组(10小鼠/组)，在J0，J28，和J56通过各种途径得到上面获得的制剂的一个剂量。试验了两种免疫方法。它们是1)皮下/胃内+鼻/胃内+鼻；和2)胃内+鼻，重复三次。剂量如下用于通过鼻途径给药时，相当于10μg总的脱辅基酶(包裹的+未包裹的)的冷冻干燥物使用前溶于30μl生理盐水(0.9％NaCl)。用于通过皮下途径给药时，相同剂量的冷冻干燥物溶于300μl盐水中。用于通过胃内途径给药时相当于40μg总的脱辅基酶(包裹的+未包裹的)的冷冻干燥物使用前溶于300μl补充0.2MNaHCO3的盐水中。用连接有1ml注射器的插管给药。末次给药后15天，通过灌胃用108个适应小鼠的幽门螺杆菌微生物感染小鼠。感染后1个月，切除胃并测定1/4的胃的脲酶活性(JatroxND)。切除后4小时在550nm测量介质的光密度。结果见图10。这些结果表明，虽然在使用的DC-Chol剂量后，组织没有得到完全保护，但观察到与阳性对照(接受空脂质体的小鼠)相比，感染后脲酶活性显著降低。这些结果还证明，通过非肠道途径靶向背腰区域(皮下；也可用肌内途径，并将方便地使腹腔结节更特异地做为目标)的首次免疫的优点。序列表(1)一般资料(i)申请人(A)姓名PasteurMerieuxSerums&Vaccins(B)街道58，avenueLeclerc(C)城市里昂(E)国家法国(F)邮政编码69007(G)电话72737931(H)传真72737850(ii)发明名称诱导粘膜免疫应答的组合物(iii)序列数4(iv)计算机可读方式(A)介质类型磁带(B)计算机IBMPC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQIDNO1的说明(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO1CCCAAATCATGAAACTCACCCCAAAAGAGTTAGATAAGTTG41(2)SEQIDNO2的说明(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO2GCTTCTACATAGTTAAGCTTAATGCCTT28(2)SEQIDNO3说明(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO3CGTCTCGAGCCACCATGAAAAAGATTAGCAGAAAAG36(2)SEQIDNO4说明(i)序列特征(A)长度49碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQIDNO4ATCGTCCCGGGCAGGCCTCTTAGAAAATGCTAAAGAGTTGCGCCAAGCT49权利要求1.一种用于在宿主哺乳动物粘膜效应部位，诱导对一种抗原的保护性免疫应答的药物组合物，它包含用于伴随或连续给药的(i)任选的第一种产品和(ii)至少一个第二种和第三种产品这三种相同或不同的产品各含有一种免疫应答诱导剂，且选自抗原，并且如果抗原本质为蛋白质，则选能表达抗原的表达盒；第一种产品被配制用于系统给药，第二种产品被配制用于通过鼻口腔途径给药，以便诱导剂靶向鼻咽或唾液腺中的免疫应答诱导部位，第三种产品被配制用于不同于鼻途径通过合适的粘膜途径给药，以便诱导剂靶向免疫应答所寻找(recherchée)的效应部位的免疫应答诱导部位。2.权利要求1的组合物，其中第一种产品被配制用以通过非肠道途径给药。3.权利要求1或2的组合物，用于在宿主哺乳动物中，在呼吸系统(支气管，鼻咽，肺)诱导对一种抗原的免疫应答，其中第三种产品被配制用于通过肺途径给药。4.权利要求1或2的组合物，用于在宿主哺乳动物中，在选自肠和生殖器粘膜的粘膜效应部位，诱导对一种抗原的免疫应答，其中第三种产品被配制用于通过泌尿生殖途径给药。5.权利要求1或2的组合物，用于在宿主哺乳动物中，在胃或肠诱导对一种抗原的免疫应答，其中配制的第三种产品用于通过口途径，包括胃内途径给药。6.权利要求1-5之一的组合物，其中第一种产品还含有一种佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝或一种ISCOM型佐剂。7.权利要求1-6之一的组合物，其中第二种产品配制成颗粒形式，如脂质体或微球。8.权利要求7的组合物，其中第二种产品配制成直径为0.05-5μm的颗粒形式。9.权利要求1-8之一的组合物，其中第三种产品配制成颗粒形式，如脂质体或微球，用于通过肺途径或通过口途径包括胃内途径给药。10.权利要求9的组合物，其中第三种产品配制成直径为0.05-5μm的颗粒形式，用于通过肺途径给药。11.权利要求9的组合物，其中第三种产品配制成直径为0.05-5μm的颗粒形式，用于通过口途径包括胃内途径给药。12.权利要求10或11的组合物，其中第二种或第三种产品为喷剂或气溶胶。13.权利要求1-12之一的组合物，其中第三种产品为一种肠保护制剂。14.权利要求1-13之一的组合物，其中第二种或第三种产品还含有一种无毒性佐剂，是细菌毒素的无毒亚基或去毒形式以外的，亦是以及脂质体或微球以外的佐剂。15.权利要求1-14之一的组合物，其中第二种或第三种产品还含有MPLA。16.权利要求1-15之一的组合物，其中第一，第二或第三种产品含有的诱导剂为抗原。17.权利要求1-16之一的组合物，其中第二和第三种产品所含的诱导剂相同。18.权利要求17的组合物，其中第一，第二和第三种产品所含的诱导剂相同。19.权利要求2-18之一的组合物，其中第一种产品被配制用于通过皮下，真皮内或肌内途径给药。20.权利要求1-19之一的组合物，其中抗原是一种对宿主哺乳动物致病的细菌的抗原。21.权利要求5和20的组合物，其中抗原是一种幽门螺杆菌抗原。22.权利要求21的组合物，其中抗原为幽门螺杆菌脲酶的脱辅基酶形式。全文摘要本发明涉及一种试图在宿主哺乳动物中粘膜效应部位诱导对一种抗原的保护免疫应答，它包含至少两种相同或不同的产品，每一种含有一种免疫应答诱导剂，选自抗原，并且如果抗原本质为蛋白质，则选能表达该抗原的表达盒，用于伴随或连续给药；配制的产品之一用于通过鼻口腔途径给药，使诱导剂靶向鼻咽或唾液腺中的免疫应答诱导部位，配制的其它产品用于通过合适的粘膜途径而非鼻途径给药，以便诱导剂靶向免疫应答所寻找的效应部位的免疫应答诱导部位。这种组合物也可任意地包含第三种产品，与前两种相同或不同，配制用于系统给药。文档编号A61K39/02GK1155843SQ96190619公开日1997年7月30日申请日期1996年4月9日优先权日1996年4月9日发明者B·居伊,J·亨斯勒尔,M·J·康坦-米莱申请人:巴斯德梅里厄血清及疫苗公司