专利名称：一种制备β-淀粉样多肽1-42纯品的方法
一种制备P -淀粉样多肽1-42纯品的方法技术领域-本发明涉及一种多肽的制备方法，特别涉及一种利用高效液相色谱制备e-淀粉样多肽1-42纯品的方法。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer' sDisease, AD)是一种发病率高、危害极大的中枢 神经系统退行性疾病，主要临床症状是智力进行性减退，特征性病理学改变是老年斑，神经元纤维缠结，以海马、皮层区域为主的神经元数目减少。e-淀粉样多肽1-42 (Amyloid 0 1-42 p印tide，简称A P 42)是存在于阿尔茨海默病患者脑组 织中的特异病理改变之物，同时它在AD患者的脑积液及血浆中有所改变。研究表 明Amyloid e 1-42 p印tide在脑内的沉积是阿尔茨海默病的主要原因，因此纯品 Amyloide 1-42 p印tide对阿尔茨海默病的病理研究有非常重要的作用。目前对Amyloid P卜42 p印tide粗品的制备方法报道的很少，而使用高效液 相色谱方法进行制备的报道仅有一篇(Vydac Advance, 1997)，且要求有柱温箱， 使用的流动相体系比较繁琐，不利于用于生产工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种用高效液相色谱方法制备Amyloid e 1-42 p印tide 纯品的方法。以解决现有高效液相色谱方法进行制备存在的设备要求高、使用的 流动相体系比较繁琐的技术问题。本发明的技术方案如下一种制备e-淀粉样多肽1-42纯品的方法，采用高效液相色谱方法。包括以 下步骤1、 e-淀粉样多肽1-42粗品的溶解在乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤, 取滤液待用。2、 以高效液相色谱仪对过滤后粗品进行制备，通过制备色谱柱采用紫外检 测器对样品进行监测，分段收集需要的目标产物，制备色谱条件为色谱柱PLRP-S (刚性聚合物填料)，10-15um， 21. 2X250mra(L D)，流动相A: 100%水/0. 1-0.2%三氟乙酸 B: 100%乙腈/0. 1-0.2%三氟乙酸时间(min) A B0. 01 90-70% 10-30%25 10-30% 70-90%30 90-70% 10-30%流速15ml/min 波长220nm3、 以分析高效液相色谱仪对收集到的目标产物进行检测，将含量95%以上部 分合并为合格产品。4、 将合格产品进行浓縮、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格 即为最终产品。按照本发明，所述的Amyloide 1-42 p印tide的高效液相色谱制备方法，色 谱柱是使用聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料。本发明所述的流动相体系为水、乙腈体系，加入O. 1-0. 2%三氟乙酸作为离子 对试剂。本发明所用的样品溶解条件为体积比乙腈水=30-50 : 70-50。 本发明所述的样品上样量为21. 2咖内径的制备柱每针上样品100-200mg。 本发明的有益效果解决了现有Amyloid P 1-42 p印tide的纯品制备方法使 用的流动相都比较繁琐，而且要使用柱温箱，增加了仪器的生产成本，也不利于 放大生产的技术问题，本发明所述的制备方法，使用的流动相是在高效液相色谱 中非常常用的试剂，除了高效液相色谱仪不再需要别的仪器，既节省成本又能够 简单、快速地得到需要的纯品。
图1为PLRP-S填料色谱柱的粗品色谱图；图2为C18键合相填料色谱柱的粗品色谱图；图3为三氟乙酸乙腈由30%到50%的制备色谱图；图4为三氟乙酸乙腈由10-30%到90_70%的制备色谱图；图5为合格产品的检测色谱图。
具体实施例方式6-淀粉样多肽1-42粗品的溶解，过滤称取100-200mge-淀 粉样多肽1-42粗品溶于10ml的乙腈水溶液中，乙腈水溶液由30-50%乙腈与 70-50%水的混配，超声处理，待样品完全澄清，用0.45 y有机相滤膜(上海亚 东核级树脂有限公司)过滤，取滤液待用。 色谱条件北京创新通恒科技有限公司的LC3000制备型高液相色谱仪(高压双泵，紫 外检测器)，CXTH-3000色谱工作站。流动相A:浓度为0. 1-0.2%三氟乙酸的水 溶液，B:浓度为O. 1-0.2%三氟乙酸的乙腈溶液，0到25分钟A:B由90-70:10-30 到10-30:90-70;流速15ml/min;波长220nm;色谱柱:PLRP-S， 10-15线21.2 X250mm(I.D);进样量100-200mg/10ml。色谱条件的选择1. 1色谱柱的选择AmyloidP1-42 p印tide的性质及序列使它在色谱柱中极易造成峰形扩散， 出现在色谱图中找不到目标峰的现象，而且我们需要的目标峰并不是色谱图中的 主峰，因此我们的色谱条件必须使目标峰尽可能的明显，这样才能很好的收集到 需要的目标物。分别对以硅胶为基质的C18键合相填料和以聚苯乙烯-聚乙烯基 苯为基质的聚合物树脂填料进行比较分析，发现聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的 聚合物树脂填料(Varian公司的PLRP-S柱)做样的峰形虽有扩散，但有明显的 峰形，能收到合格的产品(见图1)，而另一种C18键合相填料己找不到需要的 目标峰的位置，峰形完全扩散，无法收到目标物(见图2)，故选择聚苯乙烯-聚 乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料作为色谱柱的填料。1.2流动相的选择分别选用制备多肽常用的乙腈、水加三氟乙酸体系及乙腈、醋酸胺缓冲液体 系，发现两种体系分离效果基本一样，没有什么区别，故选用更易配制的乙腈、 水加三氟乙酸体系。1.3梯度的选择分别用极宽的梯度乙腈由10-30%到90-70%和较窄的梯度乙腈由30%到50%来 做样，发现窄梯度下样品扩散厉害，不能形成一个明显的峰(见图3)，根本无 法判断目标峰的具体保留时间，因此收不到合格的产品，而用宽梯度做样，可以形成一个明显的目标峰(见图4)，能够很容易的收到需要的目标产物，经检测 产品也能合格(见图5)，故选用宽梯度做为色谱条件。上样量的选择样品的溶解性不太好，以流动相试剂水和乙腈溶解(比例为乙腈水 =30-50:70-50)，根据制备柱内径及长度(21. 2X250mm(I. D))分别上不同的样 品量，结果发现，100-200mg的上样量比较合适，样品量太低虽然峰形更好些但 从制备成本上考虑不合算，成倍太高，而样品量太高分离度降低了，收不到合格 的，故经过不同上样量的实验发现100-200mg是这根柱子(21.2X250mra(I.D)) 的最佳上样量。样品含量的检测以分析高效液相色谱仪对收集到的产品进行含量检测，检测器为紫外检测 器，色谱柱为PLRP-S， 5线4.6X250mm(I.D),流动相A:浓度为0.1-0. 2%三 氟乙酸的水溶液，B:浓度为O. 1-0.2%三氟乙酸的乙腈溶液，0到25分钟A:B由 90-70:10-30到10-30:90-70,流速1. Oml/min,波长220nm,进样量20n 1。由于 样品的峰形扩散极为严重，只能以这种宽梯度来进行分析检测，否则就不能形成 一个明显的峰而变成一个很宽的鼓包从而无法判断产品是否合格。最终冻干的成 品也以此法进行检测。实施例1:上样量为100mg，流动相A:浓度为0. 1%三氟乙酸的水溶液， B:浓度为0.1%三氟乙酸的乙腈溶液，样品溶解条件为体积比乙腈水=30: 70， 0到25分钟A:B由90:10到10:90，其余同上。实施例2，上样量为150rag，流动相A:浓度为0.15%三氟乙酸的水溶液， B:浓度为0.15%三氟乙酸的乙腈溶液，样品溶解条件为体积比乙腈水=40: 60， 0到25分钟A:B由80:20到20:80,其余同上。^施例3，上样量为200mg，流动相A:浓度为0.2%三氟乙酸的水溶液， B:浓度为0.2%三氟乙酸的乙腈溶液，样品溶解条件为体积比乙腈水=50: 50， 0到25分钟A:B由70:30到30:70，其余同上。
权利要求
1、一种制备β-淀粉样多肽1-42纯品的方法，采用高效液相色谱方法，其特征是包括以下步骤a、β-淀粉样多肽1-42粗品的溶解在乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤，取滤液待用；b、以高效液相色谱仪对过滤后粗品进行制备，通过制备色谱柱采用紫外检测器对样品进行监测，分段收集需要的目标产物，制备色谱条件为色谱柱PLRP-S，10-15μm，21.2×250mm(I.D)，流动相A浓度为0.1-0.2％三氟乙酸的水溶液，B浓度为0.1-0.2％三氟乙酸的乙腈溶液时间 A B0.01min90-70％10-30％25min 10-30％70-90％30min 90-70％10-30％流速15ml/min波长220nm；c、以分析高效液相色谱仪对收集到的目标产物进行检测，将含量95％以上部分合并为合格产品；d、将合格产品进行浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格即为最终产品。
2、 根据权利要求1所述的一种制备3 -淀粉样多肽1-42纯品的方法，其特 征是乙腈水溶液配置时体积比乙腈水=30_50:70-50。
3、 根据权利要求1所述的一种制备e-淀粉样多肽1-42纯品的方法，其特 征是所述的色谱柱内装填聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料。
4、 根据权利要求1所述的一种制备e-淀粉样多肽卜42纯品的方法，其特 征是步骤b中的流动相梯度选择0到25分钟A:B由90-70:10-30到 10-30:90-70。
全文摘要
本发明涉及一种多肽的制备方法，特别涉及一种利用高效液相色谱制备β-淀粉样多肽1-42纯品的方法。以解决现有高效液相色谱方法进行制备存在的设备要求高、使用的流动相体系比较繁琐的技术问题。其制备条件为色谱柱PLRP-S，10-15μm，21.2×250mm(I.D)，流动相A0.1-0.2％三氟乙酸水，B0.1-0.2％三氟乙酸乙腈，0到25分钟A∶B由90-70∶10-30到10-30∶90-70，流速15ml/min，波长220nm，样品浓度100-200mg/10ml，上样量100-200mg。本发明所述的制备方法，使用的流动相是在高效液相色谱中非常常用的试剂，除了高效液相色谱仪不再需要别的仪器，既节省成本又能够简单、快速地得到需要的纯品。
文档编号C07K1/16GK101235076SQ20081004314
公开日2008年8月6日 申请日期2008年2月22日 优先权日2008年2月22日
发明者任丽萍, 徐红岩, 李冬冬 申请人:吉尔生化(上海)有限公司