专利名称：一种口服治疗糖尿病药物重组鲨肝肽的制备方法
一种口服治疗糖尿病药物重组鲨肝肽的制备方法本发明涉及到利用家蚕反应器表达鲨肝肽(Active Peptide from Shark Liver, APSL)的基因工程制备及其糖尿病药用活性研究。鲨肝肽(Active Peptide from Shark Liver, APSL)是从鲨鱼肝脏中分离纯化的一种活性多肽，这种活性肽化学性质较稳定，它可以通过调控各种细胞因子的水平来提高机体免疫功能，减缓细胞凋亡。目前，经各项研究得出其功能主要有以下两点1)胰岛修复功能。鲨肝肽具有促进损伤胰岛的修复，促进胰岛素分泌的特殊生物功能，从而达到治疗糖尿病的目的。2)保护急性肝损伤作用。其机理可能是通过稳定肝细胞膜，加强组织修复、清除自由基，抗脂质过氧化作用，从而解除CCl4对肝细胞造成的损害。家蚕杆状病毒表达系统是高等真核表达系统，自1983年创建以来，已有百余种外源基因在该系统表达，由于有家蚕淋巴血本身的大量蛋白的保护和一些未知机理的作用，使得利用该系统表达的蛋白具有极高的活性，利用家蚕反应器高效表达药用蛋白，可与天然药用蛋白具有同等的药用活性， 具有重大的研究应用前景。故本研究采用家蚕杆状病毒表达系统分别在家蚕幼虫及蚕蛹中高效表达具有极高药用价值的鲨肝肽，经动物试验表明对人的胰岛细胞具有显著的修复作用，成为一种制备治疗糖尿病药物的新型方法。本发明提供了含有鲨肝肽基因的大肠杆菌质粒pET28a_APSL，以从鲨鱼再生肝组织cDNA文库中的序列为模板，通过RT-PCR技术克隆得到鲨肝肽基因，弓丨入酶切位点BamH I 和Ml I，连接到pET28a载体中，构建克隆载体质粒pET28a-APSL，经测序验证无误。本发明还提供了含有鲨肝肽基因的家蚕杆状病毒转移载体质粒 pFastBac HTA-APSL。将含有鲨肝肽基因片段的克隆载体质粒pET28a_APSL经BamH I和 Sal I双酶切后与经BamH I和Ml I双酶切的转移载体pFastBacTMHTA连接，获得的重组转移载体质粒pFastBac HTA-APSL。本发明还提供了含有鲨肝肽基因重组家蚕杆状病毒an-Bac-APSL。将重组转移载体pFastBac HTA-APSL转化到含病毒DNA的大肠杆菌DHlOBac中通过定点转座获得重组 Bacmid DNA，由脂质体介导转染家蚕卵母细胞BmN，待出现明显的病毒感染症状后，取上清收获重组病毒Bm-Bac-APSL。本发明还提供了鲨肝肽基因在家蚕幼虫和蚕蛹中的表达产物。将重组家蚕杆状病毒Bm-Bac-APSL转染家蚕卵母细胞扩增病毒并提高其滴度，然后将扩增后的重组家蚕杆状病毒Bm-Bac-APSL接种至家蚕幼虫和蚕蛹体内，回收家蚕淋巴血及蛹体，分离纯化并冻干保存。本发明对利用家蚕反应器表达鲨肝肽基因进行了治疗糖尿病药理实验。利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕幼虫及蚕蛹中表达的鲨肝活性肽建立ICS小鼠糖尿病模型评价鲨肝肽口服治疗糖尿病药效学，表明鲨肝肽对胰岛细胞具有修复作用。综上，在家蚕幼虫和蚕蛹中的表达的鲨肝肽具有极高的药用用价值；家蚕是可以低成本大规模饲养经济昆虫，蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定，易于大规模高效生产，且在该系统表达的药用蛋白结构功能与天然药用蛋白相近，并具有很高的药用活性，研究及市场开发应用前景十分广阔。
图1附1 %琼脂糖电泳图，pFaStBaCTMHTA-APSL重组质粒鉴定图。Fig. 1 The identification of recombinant plasmidl. PCR 产物 2. PCR 阴性对照 3. BamH I/Sal I 酶切重组质粒Μ. Marker III。图 2 重组 Bacmid 的 PCR 鉴定图。Fig. 2 The identification of recombinant Bacmidl. PCR 阴性对照 2PCR 产物 M250bp DNA marker 1. PCR negative control 2. PCR product Μ. 250bp DNA ladder marker。图3感染重组病蚕蚕血DNA的PCR鉴定图。Fig. 3 The identification of recombinant plasmidl. PCR 产物 2. PCR 阴性对照 Μ. Marker III 1. PCR product2. PCR negative control Μ. Marker III。图4附重组Bacmid DNA转染家蚕细胞及扩增病毒的对比图重组Bacmid DNA转染家蚕细胞对比图。A图是阴性对照图(10X10) ；B图是转染五天后的细胞图片(10X10)， C图是阴性对照图(20X10) ；D图是传染五天后的细胞图片(20X10)。图5P1病毒感染家蚕细胞对比图。A图是阴性对照图(10X10) ；B图是转染五天后的细胞图片(10X10) ；C图是阴性对照图(20X10) ；D图是转染五天后的细胞图片 (20X10)。图6附质粒图含APSL基因重组克隆载体质粒pET28a_APSL图。图7含APSL基因的重组家蚕杆状病毒转移载体质粒pFastBacTMHTA-APSL图。 具体实施方案下面对本发明的实施例作详细说明本实例在以本发明技术方案为前提下进行实施的，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。实施例1重组转移载体质粒pFaStBaCTMHTA-APSL的筛选与鉴定挑取单克隆用无菌牙签从转化平板上挑取3个生长状态良好的白色单菌落，分别接种于含 Amp和Gen 50 μ g/mL的5mL LB液体培养基中，37°C，220rpm振荡培养8_10h。质粒的小量制备1.分别取 1. 5mL 培养液倒入 1. 5mLEppendorf 管中，4°C，12000rpm 离心 30sec ；2.弃尽上清，菌体沉淀重悬于预冷的100 μ L溶液I中，涡旋振荡混勻；冰浴IOmin3.加入新鲜配制的溶液II 200 μ L，温和地颠倒Eppendorf管5次，冰浴5min，使
溶液变澄清；4.加入150yL预冷的溶液III，并倒置离心管，振荡30sec，冰浴5min，4 °C， 12000rpm 离心 IOmin ；5.小心吸出上清液转入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇 (25 24 1)，颠倒混勻，4°C，12000rpm 离心 5min ；6.将上清液移入干净Eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的 3mol/L NaAc (pH5. 2)，颠倒混勻后室温放置5min ；
7. 40C, 12000rpm 离心 IOmin ；8.弃上清，加入ImL预冷的70%乙醇洗沉淀一次，真空干燥5min或室温干燥；9.将沉淀溶于 50 μ L 无菌 ddH20，加 RNaseA QO μ g/mL)，37°C 水浴 30_60min，分别取少量用琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的纯度，其它于-20°C保存。重组质粒根据不同的载体命名为pFastBac HTA-APSL。PCR 鉴定10.以提取的质粒作为模板，进行PCR鉴定。11. PCR反应体系为(MH2O10XPCR buffer25mmol/L MgCl22. 5mmol/L dNTPPrimerlPrimer 2Taq ploymeraseTempleTotalPCR的反应程序为94°C 预变性
94 "C 60 "C 72 "C72°C 延伸最后保存于4°C双酶切鉴定PCR鉴定为阳性的质粒，进一步用双酶切的方法来鉴定。在无菌的Eppendorf管中，依次加IOXBuffer2μ LpFastBac HTA-APSL 15. 5μ LBamHI1. 5μ LSal I1 μ LTotal20 μ L37°C温育4h后，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。实施例2重组Bacmid-APSL的筛选和鉴定挑取单克隆用无菌牙签从蓝白斑筛选平板上挑取4个生长状态良好的白色单菌落，分别接种于含 50 μ g/mLl Kan,7 μ g/mL Gen 和 10 μ g/mL Tet 的 5mL LB 液体培养基中，37°C，220rpm
5
17. 5μ L 2. 5μ L 1. 5μ L 0. 5μ L 1 μ L 1 μ L 0. 5μ L 0. 5μ L 25 μ L
5min
变性
退火
延伸 IOmin
45 sec 45 sec 45 sec
30 cycles振荡培养8-10h。等菌种稳定后放到4°C冰箱备用。重组Bacmid的小量制备1.分别取 1. 5mL 培养液倒入 1. 5mLEppendorf 管中，4°C，14000rpm 离心 Imin ；2.弃尽上清，菌体沉淀重悬于预冷的300yL溶液I中，用吸液枪反复轻轻吹打；3.加入新鲜配制的溶液II 300 μ L，轻轻吹打，使其混勻；4.缓慢加入300 μ L ρΗ值为5. 5的醋酸钾溶液，边加边轻轻混勻，冰浴5_10min ；5.在 4°C下，14000rpm 离心 IOmin ；6.将上清液轻轻转移到新的Eppendorf管中，加入800 μ L异丙醇，并且轻轻反复倒置，使液体充分混勻，然后冰浴5-lOmin。室温，HOOOrpm离心15min ；7.小心移除上清液，加入500 μ L 70%的乙醇，将Eppendorf管反复轻轻倒置几次，使液体充分混勻；8.在室温下HOOOrpm离心5min，使重组Bacmid DNA充分洗涤和沉淀。如果需要的话重复10-11步。9.将上清液充分移除并且小心以防重组Bacmid DNA的再度溶解，在室温下将沉淀出的DNA放置5-lOmin晾干。切忌过分干燥。10.将重组Bacmid DNA再次溶解于40 μ L ρΗ值为8. 0的1 X TE Buffer中，避免剧烈摇动以防DNA断裂。允许轻轻摇晃使位于Eppendorf管底部的DNA充分溶解。11.将重组Bacmid DNA储存在4°C环境下，用于分析或者用于转染到昆虫细胞中。
PCR鉴定
以提取的Bacmid作为模板，用M13上游引物和M13下游引物扩增目的片段进行PCR鉴定O
M13上游引物5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3‘
M13下游引物5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3‘
PCR反应体系为
(MH2O16 μ L
10XPCRBuffer
(含 Mg2+)2μ L
2. 5mmol/L dNTP0. 4μ L
Ml3上游引物0. 4μ L
Ml3下游引物0. 4μ L
Taq ploymerase0. 4μ L
Temple0. 4μ L
Total20 μ L
PCR的反应程序为:
93°C预变性3min
权利要求
1.本发明提供的鲨肝肽(ActivePeptide from Shark Liver，APSL)基因是通过 RT-PCR方法从鲨鱼再生肝组织cDNA文库中的获得基因序列，含ORF框长度为33!3bp，编码 110个氨基酸残基，分子量约12kD，等电点为6. 9，其序列为Ktg|ctggtggggccgatcggggcggcaaaggttgtatatgaacaagatggagtatttattcatgcatgctctGAAAGAATTGGTGAACAAGATACACTTCCAGGAATACTGAGGTTGTTTGATAAGGGTACTGGGGCTGTAGTGGATTG GTCACCAGTGGATGATTCTCTGGATTCTTCAAACATTTTTTGTGCAGGCAAGGATTCTAGTTCAGTTGTCGAATGGA ATCAATGTCCGAAAGAAAGATCTTCTAGGAGTACAATGCAACAAATCAGCTGTGAAGCTGAATGGGACATGGTTAAT ACCGTTACTTTCAAAAAGAAATCCTTTAAATGGTGA iTAAj编码氨基酸残基序列为MLVGPIGAAKVVYEQDGVFIHACSERIGEQDTLPGILRLFDKGTGAVVDWSPVDDSLDSSNIFCAGKDSSSVV EWNQCPKERSSRSTMQQISCEAEWDMVNTVTFKKKSFKW**
2.一种利用家蚕反应器杆状病毒表达系统表达鲨肝肽基因制备蛋白类药物的方法， 其特征在于通过基因工程方法获得含有鲨肝肽基因的重组家蚕杆状病毒(菌种保藏号为 CGMCC No. 3676)，并用该病毒接种家蚕幼虫及蚕蛹进行鲨肝肽的表达，所获得的表达产物经冷冻干燥保存，经糖尿病药理实验证明鲨肝肽基因在家蚕幼虫及蚕蛹中的表达产物能促进损伤胰岛的修复，促进胰岛素分泌的特殊生物功能，成为一种制备治疗糖尿病药物的新型方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的含有鲨肝肽基因的杆状病毒转移质粒pFastBaCTMHTA-APSL的构建是通过RT-PCR方法克隆鲨肝肽基因片段，引入酶切位点BamH I和Ml I，将鲨肝肽基因片段连接到转移载体pFastBac HTA中，获得的重组转移载体质粒 pFastBac HTA-APSL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的含有鲨肝肽基因的重组家蚕杆状病毒Bm-Bac-APSL的构建是通过将重组转移载体pFastBac HTA-APSL转化到含病毒DNA的大肠杆菌DHlOBac中通过定点转座获得重组BacmidDNA，由脂质体介导转染家蚕卵母细胞，待出现明显的病毒感染症状后，取上清回收获得。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的鲨肝肽基因在家蚕幼虫及蚕蛹中的表达产物是通过重组家蚕杆状病毒Bm-Bac-APSL接种到家蚕幼虫及家蚕蛹体内表达产生。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的在家蚕幼虫及家蚕蛹中表达的鲨肝肽对人的胰岛细胞具有显著的修复作用。
全文摘要
本发明属于生物技术制药工程中的基因工程生产蛋白类药物技术领域。利用家蚕杆状病毒表达系统高效表达鲨肝肽(Active Peptide from Shark Liver，APSL)，通过构建含有鲨肝肽基因的重组杆状病毒，并将该重组病毒接种家蚕蛹及幼虫进行鲨肝肽的表达，分离纯化冷冻干燥保存，经动物试验表明对四氧嘧啶糖尿病小鼠具有显著的治疗作用，成为一种制备治疗糖尿病药物的新型方法。原料易得，生产成本低，易于高效大规模生产，药效良好，具有十分广阔的市场开发应用前景。
文档编号A61P3/10GK102154299SQ201010585349
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者吕正兵, 吴梧桐, 张耀洲, 谷海涛, 陈莹, 高留根 申请人:杭州华津允上医药有限公司