三苯甲基-单-GalNAc化合物及其用途的制作方法

概括而言，本发明涉及亚磷酰胺衍生物领域。具体而言，本发明涉及n-乙酰基半乳糖胺(galnac)化合物、特别是具有单galnac部分的亚磷酰胺或phosphonoamidite化合物，并且涉及核酸分子与这类含有n-乙酰基半乳糖胺的分子的缀合物。还提供了制备这类分子的方法及其可能的用途、特别是在医药中的用途。发明背景近年来，已经开发了在疗法中使用核酸分子的途径。为了有利地影响药学上相关的性质，已经将核酸分子缀合至某些配体如肽、脂质、甾醇和碳水化合物。已经全面地评价了核酸缀合物在sirna中的应用，其中它们被视为是获得足够的体内效力所必需的。例如，通过含有末端半乳糖或其衍生物的缀合部分与核酸连接，由此使核酸分子经由键合至脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)而靶向于肝细胞。使用与脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)键合的缀合部分来递送治疗性双链核酸分子如sirna至肝脏中的肝细胞中已经例如在wo2008/131419、wo2009/073809和wo2011/104169中有描述。更新的治疗性单链核酸分子如反义寡核苷酸也已经显示得益于与脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)靶向部分的缀合，参见例如wo2014/118267和wo2014/179620。脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)靶向部分、例如含n-乙酰基-半乳糖胺(galnac)的部分和核酸分子经常是分别产生的和然后缀合，或者采用在固体载体上制备的惯例将缀合部分连接至核酸分子。很少有这样的公开文献：其中，含galnac的部分已经与核酸分子的固相合成一起被并入核酸分子中。wo2002/094185和matulic-adamic等人,2002(bioconjugatechemistry第13(5)卷,第1071-1078页)描述了可用于将核酶靶向于asgp受体的galnac缀合物的固相合成以及用于该缀合中的galnac亚磷酰胺的合成。wo2015/006740和rajeev等人,2015(chembiochem第16卷,第903-908页)描述了采用单价galnac单元进行的三价galnac缀合物至sirna有义链的3'端的固相合成。yamamoto等人,2016(bioorganic&medicinalchemistry第24(1)卷,第26-32页)描述了采用单价galnac单元进行的单价、三价和五价galnac缀合物至lna反义寡核苷酸的3'和5'端的固相合成。其中有指出，一些分子引起肝毒性。照惯例，由于将缀合物加至文库中的每个成员可能构成数百种核酸分子的劳动，因此在不进行缀合(裸)的情况下对核酸分子文库进行筛选。然后，一旦已经选出少数一些有效化合物就进行缀合。但是，已知缀合可改变分子的效力，参见例如wo2015/071388，因此该途径可能导致潜在有效分子的取消选择。发明目的本发明的目的是提供容易生产和纯化并且就设计而言具有灵活性的新的缀合部分。当产生治疗性核酸分子的筛选文库时，这是特别相关的。而且，采用这种新的单-galnac缀合部分获得的核酸缀合物不引起肝毒性。现在，本发明人已经发现：通过采用新的单-galnac化合物、特别是亚磷酰胺或phosphonoamidites，极大地促进了碳水化合物核酸缀合物的合成。这些化合物含有具有连接基和基于三苯甲基的羟基保护基如4,4'-二甲氧基三苯甲基(dmt)的单galnac部分。这使得能够采用固相亚磷酰胺化学和标准载体灵活地将多个或仅一个galnac部分并入核酸分子、特别是反义寡核苷酸或sirna的5'-或3'-末端(或两端)。采用三苯甲基-单-galnac亚磷酰胺获得的核酸缀合物在分子的5'端始终含有三苯甲基基团如三苯基甲基、甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基。这允许类似于非缀合核酸分子的合成后纯化，例如在短柱上。这对于制备用于体内筛选的galnac缀合核酸分子的小规模(多种化合物，所述化合物的量少)文库是尤其有价值的。这对于galnac-寡核苷酸的较大规模合成(少数化合物，所述化合物的量大)也可能是优点，因为避免了单独产生的galnac簇的后缀合(参见例如ep申请号15194811.4)。采用本发明，仅需要获得三苯甲基-单-galnac亚磷酰胺，其以比目前使用的三价galnac簇少的步骤产生。数据已经显示：当与三价galnac簇相比时，用通过在核苷酸合成中并入dmt-单-galnac亚磷酰胺所获得的三价构建体能够获得相当的对mrna敲减的活性。发明概述在一个方面，本发明涉及单-n-乙酰基半乳糖胺(galnac)化合物，例如亚磷酰胺或phosphonoamidites。在另一个方面，本发明涉及galnac-生物分子缀合物、特别是galnac-核酸缀合物，即，包含一个或多个(例如多个)已经采用亚磷酰胺化学共价结合至生物分子、特别是核酸分子的galnac缀合部分的分子。通过将单-galnac化合物(缀合部分)连续结合至指定生物分子，能够产生包含2、3或更多个galnac缀合部分的簇。优选地，已经将三个单-galnac化合物并入核酸分子的3'端或5'端。在另一方面，本发明涉及三苯甲基-单-galnac化合物、例如亚磷酰胺或phosphonoamidites的制备方法。在另一方面，本发明涉及所述的新的三苯甲基-单-galnac化合物的用途。根据另一方面，本发明提供了本发明的化合物、特别是galnac-核酸缀合物的医药用途。还提供了治疗方法，该方法包括给需要其的个体施用治疗或诊断有效量的本发明的化合物、特别是galnac-核酸缀合物。附图简述图1：(a)单剂量0.1mg/kg和(b)单剂量0.25mg/kg注射不同寡核苷酸缀合物后10天小鼠中的总血清胆固醇。图2：以单剂量0.1mg/kg注射不同寡核苷酸缀合物后14天小鼠的总血清胆固醇。图3：在a)4小时寡核苷酸化合物治疗和总共72小时孵育或者b)72小时寡核苷酸化合物治疗后在原代小鼠肝细胞中的相对apobmrna水平。j寡核苷酸化合物包含立体限定的galnac部分，g和f分别是gn2缀合的和裸的对照化合物。寡核苷酸化合物浓度为0.004μμ至9μμ(3倍稀释)；对于裸化合物，加入27μμ的添加浓度。定义生物分子本发明上下文中的生物分子是由糖、脂质、肽、蛋白质或核酸或这些物质的组合组成的分子。生物分子可以从多种天然来源(人、动物或微生物)分离或者可以通过发酵或合成来产生。生物分子的实例有核酸、特别是反义寡核苷酸、sirna分子或核酶；肽或较大的蛋白质如抗体或其片段；激素；类固醇；维生素；多糖如透明质酸。生物分子适合作为药物，在本发明的上下文中特别适合用于治疗肝脏疾病。缀合物如本文所用的术语缀合物指与非核苷酸部分(缀合部分或c区或第三区)共价连接的生物分子(a区或第一区)。本发明的特定缀合物是其中核酸分子(a区或第一区)如寡核苷酸或sirna与非核苷酸部分(缀合部分或c区或第三区)、例如本发明的galnac缀合部分共价连接的核酸缀合物。在本发明中，寡核苷酸缀合物通过在寡核苷酸合成的开始或结尾并入一个或多个单-galnac缀合部分而实现。核酸分子如本文所用的术语“核酸分子”如本领域技术人员通常理解的那样进行定义，为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子，例如dna(脱氧核糖核酸)、rna(核糖核酸)或经修饰核苷。核酸分子可以是单链或双链的，或者它们可以形成各种亚结构如发夹结构。核酸分子可以是dna、rna或者可以包含含有dna和/或rna核苷以及同时含有经修饰核苷的核苷酸序列。特别地，调节细胞内的rna的经修饰核酸是期望的。调节可以例如是促进mrna的降解、mrna转录的阻断、剪接位点的修复、微rna的剪接或阻断的阻止。寡核苷酸如本文所用的术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样进行定义，为分子包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。这类共价连接的核苷还可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成、然后纯化进行制备。当提及寡核苷酸的序列时，该称谓指共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分的序列或顺序或其变通形式。本发明的寡核苷酸是人工制备的和化学合成的，通常是纯化的或分离的。本发明的寡核苷酸可以包含一个或多个经修饰核苷或核苷酸。反义寡核苷酸如本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸杂交、特别是与靶核酸上的邻接序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是sirna。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。在一些实施方案中，反义寡核苷酸不包含rna(单元)。优选地，本发明的化合物是线性分子或者合成为线性分子。反义寡核苷酸的长度通常为7至50个核苷酸，例如10至30个核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的长度包含总共10-22、例如10-16、例如10-14、例如11-20、例如12-18、例如12-16、例如13-17或例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个邻接核苷酸或由它们组成。干扰rna(rnai)，如本文所用的术语“干扰rna”或“短干扰rna”或“沉默rna”定义为双链rna-样分子，通常具有15至50个核苷酸、例如20至30个核苷酸的长度。rnai聚核苷酸可以选自：sirna、微rna、双链rna(dsrna)、短发夹rna(shrna)和编码能够引起rna干扰的rna的表达盒。sirna可以由两个捏合的聚核苷酸或形成发夹结构的单个聚核苷酸组成。本发明的sirna分子包含有义区和反义区。反义区具有与靶核酸等同(完全互补)或近似等同(部分互补)的核苷酸序列。rnai分子基本上是合成的人工分子，在rna干扰(rnai)途径内操作，其中其通过在转录后使mrna降解来干扰具有互补核苷酸序列的靶核酸，导致没有翻译。sirna经由称为dicer的蛋白质络合物相互作用，所述dicer将sirna切成较小的片段。这些片段的一条链、在大多数情况下是反义链被装载到另一种称为rna诱导沉默络合物(risc)的蛋白质络合物中。然后，通过risc键合的链通过碱基配对将络合物连接到靶核酸。靶核酸被裂解和破坏，从而不能合成蛋白质。邻接核苷酸序列术语"邻接核苷酸序列"指与靶核酸互补的核酸分子的区。在一些实施方案中，核酸分子的所有核苷酸构成了邻接核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含邻接核苷酸序列和可以任选地包含其它核苷酸，例如可用于将官能团连接至邻接核苷酸序列的核苷酸连接基区。核苷酸连接基区可以与靶核酸互补或不互补。核苷酸核苷酸是核酸分子的结构单元，例如单链寡核苷酸、双链核苷酸和聚核苷酸，对于本发明的目的包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。在性质上，核苷酸如dna和rna核苷酸包含核糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(其在核苷中不存在)。核苷和核苷酸还可以互换地称作“单元”或“单体”。将认识到，当提及核苷酸或单体的序列时，所提及的是碱基如a、t、g、c或u或其类似物的序列。经修饰核苷如本文所用的术语“经修饰核苷”或“核苷修饰”指与等同dna或rna核苷相比通过引入糖部分或(核)碱基部分的一个或多个修饰进行修饰的核苷。在优选的实施方案中，经修饰核苷包含经修饰的糖部分。术语经修饰核苷在本文中还可以与术语“核苷类似物”或经修饰“单元”或经修饰“单体”互换使用。经修饰核苷间链接术语“经修饰核苷间链接”如本领域技术人员通常理解的那样定义为将两个核苷共价偶联在一起的除磷酸二酯(po)链接之外的链接。具有经修饰核苷间链接的核苷酸还称为“经修饰核苷酸”。在一些实施方案中，经修饰核苷间链接与磷酸二酯链接相比增加了核酸分子的核酸酶抵抗。对于天然存在的核酸分子，核苷间链接包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。经修饰核苷间链接可特别用于稳定核酸分子、特别是用于体内用途的核酸分子，并且可以用于保护核酸分子中的dna或rna核苷区、例如在gapmer寡核苷酸的gap区以及在经修饰核苷的区免于核酸酶裂解。在一个实施方案中，核酸分子包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰为例如对核酸酶攻击更具抗性的链接的核苷间链接。核酸酶抗性可以通过在血浆中孵育核酸分子或通过采用核酸酶抗性分析(例如蛇毒磷酸二酯酶(svpd))来确定，这两种方法均是本领域熟知的。能够增强核酸分子的核酸酶抗性的核苷间链接称为核酸酶抗性核苷间链接。在一些实施方案中，核酸分子或其邻接核苷酸序列中至少50％的核苷间链接是经修饰的，例如核酸分子或其邻接核苷酸序列中至少60％、例如至少70％、例如至少80或例如至少90％的核苷间链接是经修饰的。在一些实施方案中，核酸分子或其邻接核苷酸序列中所有核苷间链接是经修饰的。将认识到，在一些实施方案中，将核酸分子与非核苷酸官能团部分如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸分子或其邻接核苷酸序列中所有核苷间链接是核酸酶抗性核苷间链接。经修饰核苷间链接可以选自硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(diphosphorothioate)和硼烷磷酸酯(boranophosphate)。在一些实施方案中，经修饰核苷间链接与本发明的寡核苷酸的rnaseh募集相容，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。在一些实施方案中，核苷间链接包含硫(s)，例如硫代磷酸酯核苷间链接。硫代磷酸酯核苷间链接由于核酸酶抗性、有益的药物动力学和生产容易性而是特别有用的。在一些实施方案中，核酸分子或其邻接核苷酸序列中至少50％的核苷间链接是硫代磷酸酯，例如核酸分子或其邻接核苷酸序列中至少60％、例如至少70％、例如至少80％或如至少90％的核苷间链接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，核酸分子或其邻接核苷酸序列中所有核苷间链接是硫代磷酸酯。在一些实施方案中，核酸分子包含一个或多个天然的核苷间链接，特别是选自磷酸三酯、甲基膦酸酯、mmi、酰胺-3、formacetal或thioformacetal的核苷间链接。其它核苷间链接公开于wo2009/124238(并入本文作为参考)。在一个实施方案中，核苷间链接选自wo2007/031091(并入本文作为参考)中公开的连接基。特别地，核苷间链接可以选自-o-p(o)2-o-、-o-p(o,s)-o-、-o-p(s)2-o-、-s-p(o)2-o-、-s-p(o,s)-o-、-s-p(s)2-o-、-o-p(o)2-s-、-o-p(o,s)-s-、-s-p(o)2-s-、-o-po(rh)-o-、o-po(och3)-o-、-o-po(nrh)-o-、-o-po(och2ch2s-r)-o-、-o-po(bh3)-o-、-o-po(nhrh)-o-、-o-p(o)2-nrh-、-nrh-p(o)2-o-、-nrh-co-o-、-nrh-co-nrh-，和/或核苷间连接基可以选自-o-co-o-、-o-co-nrh-、-nrh-co-ch2-、-o-ch2-co-nrh-、-o-ch2-ch2-nrh-、-co-nrh-ch2-、-ch2-nrhco-、-o-ch2-ch2-s-、-s-ch2-ch2-o-、-s-ch2-ch2-s-、-ch2-so2-ch2-、-ch2-co-nrh-、-o-ch2-ch2-nrh-co-、-ch2-nch3-o-ch2-，其中rh选自氢和c1-4-烷基。核酸酶抗性链接、例如硫代磷酸酯链接(ps链接)可特别用于当与靶核酸形成二聚体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区，例如对于gapmers而言的g区，或headmers和tailmers的未经修饰核苷区。然而，硫代磷酸酯链接还可用于非核酸酶募集区和/或亲和性增强区，例如对gapmers而言的f和f'区，或headmers和tailmers的经修饰核苷区。然而，设计区各自可以包含不是硫代磷酸酯的核苷间链接，例如磷酸二酯链接，特别是在其中经修饰核苷如lna保护链接对抗核酸酶降解的区中。包含磷酸二酯链接、例如一个或两个链接、特别是在经修饰核苷单元(通常在非核酸酶募集区中)之间或与之相邻包含所述链接可以修饰寡核苷酸的生物利用度和/或生物分布—参见wo2008/113832，并入本文作为参考。在实施方案中，核酸分子中的所有核苷间链接是硫代磷酸酯和/或硼烷磷酸酯链接。优选地，核酸分子中的所有核苷间链接是硫代磷酸酯链接。核碱基术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，它们在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还囊括经修饰的核碱基，其可以与天然存在的核碱基不同，但是在核酸杂交期间是有用的。在本文中，“核碱基”指天然存在的核碱基如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤以及非天然存在的变体。这类变体例如记载于hirao等人(2012)accountsofchemicalresearch,第45卷第2055页和bergstrom(2009)currentprotocolsinnucleicacidchemistry增刊371.4.1中。在一些实施方案中，核碱基部分通过改变嘌呤或嘧啶为经修饰的嘌呤或嘧啶如被取代的嘌呤或被取代的嘧啶来进行修饰，例如选自异胞嘧啶、伪异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、2-硫-尿嘧啶、2'硫-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。核碱基部分可以通过每个相应核碱基的字母代码来指出，例如a、t、g、c或u，其中每个字母可以任选地包括具有等同功能的经修饰核碱基。例如，在示例性的核酸分子中，核碱基部分选自a、t、g、c和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于lnagapmers，可以使用5-甲基胞嘧啶lna核苷。经修饰核酸分子术语经修饰核酸分子描述了包含一个或多个糖经修饰的核苷和/或经修饰核苷间链接的核酸分子。术语嵌合"寡核苷酸是已经在文献中用于描述具有经修饰核苷的寡核苷酸的术语。互补术语"互补"指核苷/核苷酸的watson-crick碱基配对的能力。watson-crick碱基配对是鸟嘌呤(g)-胞嘧啶(c)和腺嘌呤(a)-胸腺嘧啶(t)/尿嘧啶(u)。可以理解，核酸分子可以包含具有经修饰核碱基的核苷，例如5-甲基胞嘧啶常用于代替胞嘧啶，照此术语互补囊括未经修饰和经修饰核碱基之间的watsoncrick碱基配对(参见例如hirao等人,(2012)accountsofchemicalresearch第45卷第2055页和bergstrom(2009)currentprotocolsinnucleicacidchemistry增刊,371.4.1)。如本文所用的术语"％互补"指核酸分子(例如寡核苷酸或sirna)中邻接核苷酸序列的核苷酸数目的百分比，其在给定位置与分开的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置的邻接核苷酸序列互补(即，形成watsoncrick碱基配对)。百分比通过在两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目除以核酸分子中的核苷酸总数并乘以100来计算。在这种比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称为错配。术语"完全互补"指100％互补。同一性如本文所用的术语"同一性"指核酸分子(例如寡核苷酸或者sirna的有义或反义链)中邻接核苷酸序列的核苷酸数目的百分比，其在给定位置与分开的核酸分子(例如靶核酸)的给定位置的邻接核苷酸序列等同(即，与互补核苷形成watsoncrick碱基配对的能力)。百分比通过在两个序列之间等同的对齐碱基的数目除以核酸分子中的核苷酸总数并乘以100来计算。同一性百分比＝(匹配数x100)/对齐区长度(具有gaps)。杂交如本文所用的术语"杂交"理解为两个核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸或者具有靶核酸的sirna反义链)在相反链上在碱基对之间形成氢键，由此形成二聚体。两个核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常就解链温度(tm)进行描述，tm定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成二聚体的温度。在生理条件下，tm不与亲和性严格地成正比(mergny和lacroix,2003,oligonucleotides13：515-537)。标准态吉布斯自由能ag°是结合亲和性的更准确的表征，通过ag°＝-rtin(kd)与反应的解离常数(kd)相关，其中r是气体常数且t是绝对温度。因此，寡核苷酸和靶核酸之间的反应具有非常低的ag°反映了寡核苷酸和靶核酸之间的强的杂交。ag°是与反应相关的能量，其中水溶液浓度为1m、ph是7且温度是37℃。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，ag°对于自发反应而言低于0。ag°可以通过实验来确定，例如通过使用如hansen等人.,1965,chem.comm.36-38和holdgate等人.,2005,drugdiscovtoday中所述的等温滴定量热(itc)法。本领域技术人员将知晓，可以获得商业设备来测定ag°。ag°还可以通过采用如santalucia,1998,procnatlacadsciusa.95：1460-1465所述的最近邻模型、采用sugimoto等人.,1995,biochemistry34：11211-11216和mctigue等人.,2004,biochemistry43：5388-5405所述的适当衍生的热力学参数在数字上进行估计。为了具有通过杂交调节预期核酸靶的可能性，本发明的寡核苷酸杂交至具有预期ag°值的靶核酸，所述ag°值对于10-30个核苷酸长度的寡核苷酸而言为低于-10kcal。在一些实施方案中，杂交的程度和强度通过标准态吉布斯自由能ag°来测定。寡核苷酸可以以估计ag°值杂交至靶核酸，所述ag°值对于8-30个核苷酸长度的寡核苷酸而言为低于-10kcal，例如低于-15kcal，例如低于-20kcal和例如低于-25kcal。在一些实施方案中，寡核苷酸以估计ag°值杂交至靶核酸，所述ag°值为-10至-60kcal，例如-12至-40，例如-15至-30kcal或-16至-27kcal如-18至-25kcal。靶核酸根据本发明，靶核酸表示期望调节细胞系或哺乳动物中功能的核酸。在优选的实施方案中，靶核酸的调节改变了感兴趣的病理学情况。靶核酸可以是编码哺乳动物靶多肽、例如人靶多肽的dna或rna或者发挥对细胞内机制、例如病毒感染机制的调节作用、rna沉默或基因表达的转录后调控的非编码dna或rna分子。非编码rna分子可以例如是微rnasnrna、snorna或长的非编码rna's。在优选的实施方案中，靶核酸是体外或体内细胞、例如哺乳动物细胞、特别是人细胞中存在的基因、病毒rna、mrna和pre-mrna、成熟mrna或cdna序列或微rna(mirna)。靶细胞如本文所用的术语"靶细胞"指表达靶核酸的细胞。在一些实施方案中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞，例如啮齿动物细胞，例如小鼠细胞或大鼠细胞，或者灵长类细胞如猴细胞或人细胞。在优选的实施方案中，靶细胞在表面上具有脱唾液酸糖蛋白受体(aspgr)，例如肝脏细胞和睾丸细胞，特别是肝细胞和莱迪希细胞。表达的调节如本文所用的术语"表达的调节"理解为当与施用核酸分子前靶核酸的量相比时核酸分子改变靶核酸的量的能力的综合术语。或者，表达的调节可以通过参考对照实验来确定。通常理解，对照是用盐水组合物处理的个体或靶细胞或者是用非靶核酸分子处理的个体或靶细胞(模拟)。然而，其还可以是用标准护理处理的个体。一种调节类型是核酸分子抑制、下调、降低、抑制、移出、停止、阻断、阻止、减轻、下降、避免或终止靶核酸表达的能力，例如通过mrna的降解或转录的阻断。另一种调节类型是核酸分子恢复、增加或增强靶核酸表达的能力，例如通过剪接位点的修复或者剪接的抑制或者抑制机制如微rna抑制的除去或阻断。高亲和性经修饰核苷高亲和性经修饰核苷是当并入核酸分子中时增强核酸分子对其互补靶标的亲和性的经修饰核苷酸，例如通过解链温度(tm)来测定。本发明的高亲和性经修饰核苷优选导致+0.5至+12℃的解链温度增加，更优选+1.5至+10℃和最优选+3至+8℃，就每个经修饰核苷而言。本领域已知多种高亲和性经修饰核苷，包括例如多种2'取代的核苷以及锁核酸(lna)(参见例如freier&altmann；nucl.acidres.,1997,25,4429-4443和uhlmann；curr.opinionindrugdevelopment,2000,3(2),293-213)。糖修饰本发明的寡聚物可以包含一个或多个具有经修饰糖部分、即当与在dna和rna中发现的核糖糖部分相比时对糖部分的修饰的核苷。已经制备了多种具有核糖糖部分修饰的核苷，主要是为了改善核酸分子的某些特性，例如亲和性和/或核酸酶抗性。这类修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些，例如通过用己糖环(hna)或通常在核糖环(lna)上的c2和c4碳之间具有双基团桥的双环或通常在c2和c3碳之间没有价键的未连接核糖环(例如una)代替进行修饰。其它糖修饰核苷包括例如双环己糖核酸(wo2011/017521)或三环核酸(wo2013/154798)。经修饰核苷还包括其中糖部分被非糖部分代替的核苷，例如在肽核酸(pna)或吗啉代基核酸的情况中。糖修饰还包括经由改变核糖环上的取代基为不是氢或在dna和rna核苷中天然存在的2'-oh基团的基团来进行。可以例如在2'、3'、4'或5'位引入取代基。具有经修饰糖部分的核苷还包括2'经修饰核苷，例如2'取代的核苷。确实，已经更多地关注了开发2'取代的核苷，已经发现了很多2'取代的核苷当并入核酸分子中时具有有益的性质，例如增强的核苷抗性和增强的亲和性。2'经修饰核苷2'糖修饰核苷是在2'位具有不是h或-oh的取代基(2'取代的核苷)或包含2'连接的双基团的核苷，其包括2'取代的核苷和lna(2'-4'双基团桥)核苷。例如，2'经修饰糖可以给核酸分子提供增强的结合亲和性和/或增加的核酸酶抗性。2'取代的经修饰核苷的实例有2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧基乙基-rna(moe)、2'-氨基-dna、2'-氟-rna和2'-f-ana核苷。对于其它实例，请参见例如freier&altmann；nucl.acidres.,1997,25,4429-4443和uhlmann；curr.opinionindrugdevelopment,2000,3(2),293-213和deleavey和damha,chemistryandbiology2012,19,937。下文说明了一些2'取代的经修饰核苷。锁核酸核苷(lna)lna核苷是一种经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖糖环的c2’和c4’之间包含连接基基团(称为双基团或桥)。这些核苷在文献中还称为桥连核酸或双环核酸(bna)。在一些实施方案中，本发明的寡聚物的经修饰核苷或lna核苷具有式i或ii的通式结构：或其中w选自-o-、-s-、-n(ra)-、-c(rarb)-，例如在一些实施方案中为-o-；b指核碱基或经修饰的核碱基部分；z指与相邻核苷连接的核苷间链接或5'-末端基团；z*指与相邻核苷连接的核苷间链接或3'-末端基团；x指选自-c(rarb)-、-c(ra)＝c(rb)、-c(ra)＝n-、-o-、-si(ra)2-、-s-、-so2-、-n(ra)-和>c＝z的基团；在一些实施方案中，x选自：-o-、-s-、nh-、nrarb、-ch2-、crarb、-c(＝ch2)-和-c(＝crarb)-；在一些实施方案中，x是-o-；y指选自-c(rarb)-、-c(ra)＝c(rb)-、-c(ra)＝n-、-o-、-si(ra)2-、-s-、-so2-、-n(ra)-和>c＝z的基团；在一些实施方案中，y选自：-ch2-、-c(rarb)-、-ch2ch2-、-c(rarb)-c(rarb)-、-ch2ch2ch2-、-c(rarb)c(rarb)c(rarb)-、-c(ra)＝c(rb)-和-c(ra)＝n-；在一些实施方案中，y选自：-ch2-、-chra-、-chch3-、crarb-或者-x-y-一起指二价连接基基团(还称为原子团)，一起指由1、2、3或4个选自-c(rarb)-、-c(ra)＝c(rb)-、-c(ra)＝n-、-o-、-si(ra)2-、-s-、-so2-、-n(ra)-和>c＝z的基团/原子组成的二价连接基基团；在一些实施方案中，-x-y-指选自如下的双基团：-x-ch2-、-x-crarb-、-x-chra-、-x-c(hch3)-、-o-y-、-o-ch2-、-s-ch2-、-nh-ch2-、-o-chch3-、-ch2-o-ch2、-o-ch(ch3ch3)-、-o-ch2-ch2-、och2-ch2-ch2-、-o-ch2och2-、-o-nch2-、-c(＝ch2)-ch2-、-nra-ch2-、n-o-ch2、-s-crarb-和-s-chra-；在一些实施方案中，-x-y-指-o-ch2-或-o-ch(ch3)-；其中z选自-o-、-s-和-n(ra)-；和ra和当存在时rb各自独立地选自氢、任选被取代的c1-6-烷基、任选被取代的c2-6-链烯基、任选被取代的c2-6-炔基、羟基、任选被取代的c1-6-烷氧基、c2-6-烷氧基烷基、c2-6-链烯基氧基、羧基、c1-6-烷氧基羰基、c1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(c1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和二(c1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-c1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(c1-6-烷基)氨基-c1-6-烷基-氨基羰基、c1-6-烷基-羰基氨基、脲基、c1-6-烷酰基氧基、磺基(sulphono)、c1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、c1-6-烷基硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选被取代的，并且其中两个孪位取代基ra和rb一起可以指任选被取代的亚甲基(＝ch2)，其中对于所有手性中心而言，可以发现r或s定向的不对称基团；其中r1、r2、r3、r5和r5*独立地选自：氢、任选被取代的c1-6-烷基、任选被取代的c2-6-链烯基、任选被取代的c2-6-炔基、羟基、c1-6-烷氧基、c2-6-烷氧基烷基、c2-6-链烯基氧基、羧基、c1-6-烷氧基羰基、c1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单-和二(c1-6-烷基)氨基、氨甲酰基、单-和二(c1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-c1-6-烷基-氨基羰基、单-和二(c1-6-烷基)氨基-c1-6-烷基-氨基羰基、c1-6-烷基-羰基氨基、脲基、c1-6-烷酰基氧基、磺基(sulphono)、c1-6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、c1-6-烷基硫基、卤素，其中芳基和杂芳基可以是任选被取代的，并且其中两个孪位取代基一起可以指氧代基、硫代基、亚氨基或任选被取代的亚甲基。在一些实施方案中，r1、r2、r3、r5和r5*独立地选自c1-6烷基如甲基和氢。在一些实施方案中，r1、r2、r3、r5和r5*均为氢。在一些实施方案中，r1、r2、r3均为氢，r5和r5*之一也是氢且r5和r5*中的另一个不是氢、例如c1-6烷基如甲基。在一些实施方案中，ra是氢或甲基。在一些实施方案中，当存在时，rb是氢或甲基。在一些实施方案中，ra和rb中的一个或两个是氢。在一些实施方案中，ra和rb中的一个是氢，且另一个不是氢。在一些实施方案中，ra和rb中的一个是甲基，且另一个是氢。在一些实施方案中，ra和rb两个均为甲基。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-o-ch2-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类lna核苷公开于wo99/014226、wo00/66604、wo98/039352和wo2004/046160中，它们均引入本文作为参考，包括常称为β-d-氧基lna和α-l-氧基lna核苷的那些。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-s-ch2-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类硫基lna核苷公开于wo99/014226和wo2004/046160中，它们引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-nh-ch2-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类氨基lna核苷公开于wo99/014226和wo2004/046160中，它们引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-o-ch2-ch2-或-o-ch2-ch2-ch2-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类lna核苷公开于wo00/047599和morita等人,bioorganic&med.chem.lett.1273-76中，它们引入本文作为参考，包括常称为2’-o-4’c-亚乙基桥连核酸(ena)的那些。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-o-ch2-，w是o，且r1、r2、r3全部以及r5和r5*之一为氢，且r5和r5*中的另一个不是氢，例如c1-6烷基如甲基。这类5’取代的lna核苷公开于wo2007/134181，其引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-o-crarb-，其中ra和rb中的一个或两个不是氢，例如甲基，w是o，且r1、r2、r3全部以及r5和r5*之一为氢，且r5和r5*中的另一个不是氢，例如c1-6烷基如甲基。这类双修饰lna核苷公开于wo2010/077578，其引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-x-y-指二价连接基基团-o-ch(ch2och3)-(2’o-甲氧基乙基双环核酸-seth等人,2010,j.org.chem.,2010,75(5),第1569-1581页)。在一些实施方案中，双基团-x-y-指二价连接基基团-o-ch(ch2ch3)-(2’o-乙基双环核酸-seth等人,2010,j.org.chem.,2010,75(5),第1569-1581页)。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-o-chra-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类6’取代的lna核苷公开于wo10036698和wo07090071中，两者均引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-o-ch(ch2och3)-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类lna核苷在本领域还称为环状moes(cmoe)，其公开于wo07090071中。在一些实施方案中，双基团-x-y-指二价连接基基团-o-ch(ch3)-，为r-或s-构型。在一些实施方案中，双基团-x-y-一起指二价连接基基团-o-ch2-o-ch2-(seth等人,2010,j.org.chem)。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-o-ch(ch3)-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类6’甲基lna核苷在本领域还称为cet核苷，其可以是(s)cet或(r)cet立体异构体，如wo07090071(β-d)和wo2010/036698(α-l)中所公开，两者均引入本文作为参考)。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-o-crarb-，其中ra或rb均不是氢，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。在一些实施方案中，ra和rb均为甲基。这类6’二取代的lna核苷公开于wo2009006478中，其引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-s-chra-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类6’取代的硫基lna核苷公开于wo11156202中，其引入本文作为参考。在一些6’取代的硫基lna实施方案中，ra是甲基。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-c(＝ch2)-c(rarb)-，例如-c(＝ch2)-ch2-或-c(＝ch2)-ch(ch3)-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。这类乙烯基碳lna核苷公开于wo08154401和wo09067647中，两者均引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-n(-ora)-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。在一些实施方案中，ra是c1-6烷基如甲基。这类lna核苷还称为n取代的lnas，公开于wo2008/150729中，其引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团-x-y-一起指二价连接基基团-o-nra-ch3-(seth等人,2010,j.org.chem)。在一些实施方案中，双基团-x-y-是-n(ra)-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。在一些实施方案中，ra是c1-6烷基如甲基。在一些实施方案中，r5和r5*中的一个或两个是氢和当被取代时r5和r5*中的另一个是c1-6烷基如甲基。在这类实施方案中，r1、r2、r3可以均为氢，双基团-x-y-可以选自-o-ch2-或-o-c(hcra)-如-o-c(hch3)-。在一些实施方案中，双基团是-crarb-o-crarb-、例如ch2-o-ch2-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。在一些实施方案中，ra是c1-6烷基如甲基。这类lna核苷还称为构象限制性核苷酸(crns)，公开于wo2013036868中，其引入本文作为参考。在一些实施方案中，双基团是-o-crarb-o-crarb-、例如o-ch2-o-ch2-，w是o，且r1、r2、r3、r5和r5*全部均为氢。在一些实施方案中，ra是c1-6烷基如甲基。这类lna核苷还已知为coc核苷酸，公开于mitsuoka等人,nucleicacidsresearch200937(4),1225-1238，其引入本文作为参考。除非具体说明，否则可以理解，lna核苷可以是β-d或α-l立体同工型。方案1中给出了lna核苷的一些实例。方案1如实施例中所解释的那样，在本发明的一些实施方案中，核酸分子中的lna核苷是β-d-氧基-lna核苷。核酸酶介导的降解核酸酶介导的降解指当与互补核苷酸序列形成二聚体时能够介导该序列的降解的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸可以经由核酸酶介导的靶核酸降解来发挥功能，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶、特别是内切核酸酶、优选内切核糖核酸酶(rnase)、例如rnaseh。经由核酸酶介导的机制操作的寡核苷酸设计的实例是通常包含至少5或6个dna核苷寡的区和一侧或两侧的侧翼是增强亲和性的核苷的核苷酸，例如gapmers、headmers和tailmers。rnaseh活性和募集反义寡核苷酸的rnaseh活性指当在与互补rna分子形成的二聚体中能够募集rnaseh的能力。wo01/23613提供了用于确定rnaseh活性的体外方法，其可用于确定募集rnaseh的能力。通常，如果寡核苷酸当被提供有互补靶核酸序列时所具有的初始速率(以pmol/l/min测定)是当采用具有与待测试经修饰寡核苷酸相同的碱基序列、但是仅含有dna单体和在寡核苷酸的所有单体之间的硫代磷酸酯链接的寡核苷酸和采用wo01/23613(引入本文作为参考)的实施例91-95中提供的方法时确定的初始速率的至少5％、例如至少10％或高于20％，则寡核苷酸被认为能够募集rnaseh。gapmer如本文所用的术语gapmer指包含募集rnaseh的寡核苷酸区(gap)的反义寡核苷酸，它的5’和3’侧翼是包含一个或多个增强亲和性的经修饰核苷的区(侧翼)。本文描述了各种gapmer设计。headmers和tailmers是其中侧翼之一缺失的能够募集rnaseh的寡核苷酸，即，寡核苷酸的仅一个末端包含增强亲和性的经修饰核苷。对于headmers，3’侧翼缺失(即，5’侧翼包含增强亲和性的经修饰核苷)；对于tailmers，5’侧翼缺失(即，3’侧翼包含增强亲和性的经修饰核苷)。lnagapmer术语lnagapmer是其中至少一个增强亲和性的经修饰核苷是lna核苷的gapmer寡核苷酸。混合翼gapmer(mixedwinggapmer)术语混合翼gapmer指如下定义的lnagapmer：其中侧翼区中的至少一个包含至少一个lna核苷和至少一个非-lna的经修饰核苷、例如至少一个2’取代的经修饰核苷如2’-o-烷基-rna、2’-o-甲基-rna、2’-烷氧基-rna、2’-o-甲氧基乙基-rna(moe)、2’-氨基-dna、2’-氟-dna和2’-f-ana核苷。在一些实施方案中，混合翼gapmer具有一个仅包含lna核苷的侧翼(例如5’或3’)，另一个侧翼(分别为3’或5’)包含2’取代的经修饰核苷和任选的lna核苷。gapbreaker术语"gapbreaker寡核苷酸"用于能够维持rnaseh募集的gapmer，即使gap区被非rnaseh募集核苷(一种gap-breaker核苷,e)所破坏，从而gap区包含少于5个连续dna核苷。非rnaseh募集核苷例如是3'内构象的核苷，例如其中在核苷的核糖环的c2'和c4'之间的桥是β构象的lna，例如β-d-氧基lna或scet核苷。gapbreaker寡核苷酸募集rnaseh的能力通常是序列或甚至是化合物特异性的，参见rukov等人.2015nucl.acidsres.第43卷第8476-8487页，其公开了募集rnaseh的"gapbreaker"寡核苷酸，其在一些情况中提供了更特异性的靶rna裂解。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸是gapbreaker寡核苷酸。在一些实施方案中，gapbreaker寡核苷酸包含5'-侧翼(f)、gap(g)和3'-侧翼(f')，其中gap被非rnaseh募集核苷(gap-breaker核苷,e)所破坏，从而gap含有至少3或4个连续dna核苷。在一些实施方案中，gapbreaker核苷(e)是其中在核苷的核糖环的c2'和c4'之间的桥是β构象的lna核苷，其位于gap区内，从而gap-breakerlna核苷在5'和3'处的侧翼是至少3(5')和3(3')或至少3(5')和4(3')或至少4(5')和3(3')个dna核苷，其中寡核苷酸能够募集rnaseh。gapbreaker寡核苷酸可以以下式表示：f-g-e-g-f'；特别是f1-7-g3-4-e1-g3-4-f'1-7d'-f-g-f'，特别是d'1-3-f1-7-g3-4-e1-g3-4-f'1-7f-g-f'-d"，特别是f1-7-g3-4-e1-g3-4-f'1-7-d"1-3d'-f-g-f'-d"，特别是d'1-3-f1-7-g3-4-e1-g3-4-f'1-7-d"1-3其中d'和d"区如"gapmer设计"一节中所述。在一些实施方案中，gapbreaker核苷(e)是β-d-氧基lna或scet或方案1)中所示的其它β-lna核苷。可生物裂解的连接基本发明的"可生物裂解的连接基"包含生理学上不稳定的价键或由其组成，所述价键在哺乳动物体内常遇到的条件或与之类似的条件下可裂解。生理学上不稳定的连接基经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件如ph、温度、氧化或还原条件或物质和在哺乳动物细胞中发现的盐浓度或与之类似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括哺乳动物细胞中常存在的酶活性的存在，例如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶。在一个实施方案中，可生物裂解的连接基对s1核酸酶裂解敏感。在优选的实施方案中，对核酸酶敏感的连接基包含1至10个核苷，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷，更优选2至6个核苷和最优选2至4个连接的核苷，所述连接的核苷包含至少两个连续磷酸二酯链接，例如至少3或4或5个连续磷酸二酯链接。优选地，核苷是dna或rna。含磷酸二酯的可生物裂解的连接基更详细地公开于wo2014/076195(引入本文作为参考)。在一些实施方案中，galnac缀合部分之间的链接是可生物裂解的磷酸二酯链接(参见例如式(vii)或(viii))，除了该磷酸二酯链接外，另外的磷酸二酯链接可以通过在与靶互补的反义寡核苷酸和galnac部分之间插入例如磷酸二酯连接的核苷、二核苷酸或三核苷酸来引入。在优选的实施方案中，磷酸二酯连接的二核苷酸是脱氧胞苷-脱氧腺苷(ca)二核苷酸。治疗如本文所用的术语“治疗”指存在疾病(例如如本文所述的疾病或障碍)的治疗或疾病的阻止、即预防。因此，可以认识到，本文所述的治疗在一些实施方案中可以是预防性的。发明详述三苯甲基-单-galnac化合物在一个方面，本发明涉及新的单-n-乙酰基半乳糖胺(galnac)化合物。因此，本发明提供了具有通式(i)的化合物、包括其盐，其中所述化合物以下式表示：其中r1是h或c1-6烷基；r2是基于三苯基甲基的羟基保护基，r3是含磷基团，特别是亚磷酰胺或phosphonoamidite基团，且k以通式(ii)表示其中a1是羟基保护基，其在每次出现时可以相同或不同，且l是连接基。式(i)化合物是手性的，具有至少一个不对称碳原子或对映异构中心。本发明包括式(i)化合物的所有对映异构体及其所有可能的混合物。l是连接基，特别是具有2-30个原子的链长度，所述原子选自碳原子和任选的杂原子如n和/或o原子。l根据galnac化合物的预期应用进行选择。在pct/ep2015/073331中已经证明，连接基长度就产生官能性galnac簇而言出人意料地具有灵活性。在一些实施方案中，链可以含有一个或多个-nh-co-、-co-nh-基团和/或杂原子、特别是o。应当修改替换的数目，以便连接基的总长度在替换后不超过30个原子，并且在-nh-co-、-co-nh的情况中保持至少一个与替换相邻的原子为碳原子和在杂原子替换的情况中保持至少两个相邻的碳原子。在一些实施方案中，替换的数目小于5，并且与替换相邻的原子是碳原子。在一些实施方案中，在链中进行不超过一个或两个替换，并且与替换相邻的原子是碳原子。例如，galnac和亚磷酰胺之间的连接基可以衍生自简单的二元醇。原则上，任何对称或非对称二元醇可以用作本发明的galnac亚磷酰胺中的连接基，条件是其不含有其它亲核基团。在一些实施方案中，链中的碳原子被氧原子替换以形成-(ch2ch2o)-基团的排列。在一些实施方案中，l选自c2-c30-亚烷基、c2-c30-亚链烯基和-(ch2)0-8(ch2ch2o)0-8-(ch2)0-4-(其中选择各基团以便l含有至少2个c原子)，各自连接至羰基(-c(o)-)。更特别地，连接基l可以选自-(ch2)m-c(o)-,其中m＝2-12，特别是4、5或11；-(ch2-ch2-o)n-ch2-c(o)-，其中n＝1-5，特别是2、3或4和更特别是3；-(ch2)m1-co-nh-(ch2)m2-nh-c(o)-，其中ml和m2各自独立地是1-5，特别是3、4或5；-(ch2)m3-co-nh-(ch2)m4-c(o)-，其中m3和m4各自独立地是1-5，特别是3、4或5；-(ch2)m6-nh-c(o)-，其中m6是2-12，特别是12；和其中在每种情况下c(o)-与nr1连接。特别地，连接基l可以选自：-(ch2)4-c(o)-、-(ch2)5-c(o)-、-(ch2)11-c(o)-、-(ch2)6-nh-c(o)-、-(ch2)12-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)5-c(o)-、-(ch2)4-co-nh-(ch2)3-nh-c(o)-、-(ch2)4-co-nh-(ch2)4-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)3-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)4-nh-c(o)-、-(ch2)6-nh-co-ch2-nh-c(o)-、-(ch2ch2o)2-(ch2)2-nh-c(o)-，其中在每种情况下c(o)-与nr1连接。根据一个优选的实施方案中，l是式(ch2ch2o)3-ch2-c(o)-所示的三甘醇(teg)-乙酸酯连接基，其中c(o)-与nr1连接。galnac部分可以是α或β构型。在优选的实施方案中，galnac部分是β构型。如本文所用的术语"galnac部分"是包含galnac的结构的n-乙酰基半乳糖胺(galnac)部分。例如，在式(ii)中，galnac部分是不包括l的分子部分。如本文所用的术语"galnac缀合部分"指包含至少一个galnac部分且可以缀合至生物分子、特别是核酸的分子，其可以用作药物用于治疗一些疾病。优选地，galnac缀合部分具有针对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力。式(i)中的r1选自氢和c1-c6-烷基，特别是选自氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。在一些优选的实施方案中，r1是氢。式(i)中的r2是基于三苯基甲基的羟基保护基。特别地，r2选自三苯基甲基、甲氧基三苯甲基和二甲氧基三苯甲基。在一些优选的实施方案中，r2是二甲氧基三苯甲基(dmt)。式(i)中的r3是含磷基团。如本文所用的术语“含磷基团”或“亚磷酰胺”指含有与至少一个氮原子共价键合的处于iii氧化态的磷原子的任意化合物。优选的本发明的亚磷酰胺是含有与至少一个氮原子和两个氧原子共价键合的处于iii氧化态的磷原子的化合物(“严格意义的亚磷酰胺”)。或者，本发明的亚磷酰胺是含有与至少一个氮原子和一个氧原子共价键合并且具有硫原子(“硫代亚磷酰胺”)或c1-c6-烷基(“phosphonoamidites”)代替第二个氧原子的处于iii氧化态的磷原子的化合物。在一些实施方案中，r3以通式(iii)表示：其中r4和r5独立地选自c1-6烷基，或者r4和r5一起形成5-或6-元环，其可以是被取代的和其可以含有一个另外的选自n和o的杂原子；x是o或s；n是0或1；且r6是任选被硫基或硫代基(thio)、氧代基、卤素和/或cn取代的c1-8烷基。在一些实施方案中，式(iii)中的氨基基团-nr4r5的r4和r5独立地选自c1-c6-烷基，特别是选自甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基。在特定的实施方案中，r4与r5相同，继而-nr4r5优选选自二甲基氨基、二乙基氨基、二异丙基氨基和二丁基氨基。在优选的实施方案中，r4和r5各自是异丙基。在其它实施方案中，r4和r5一起形成5-或6-元环，其可以是被取代的和其可以含有一个另外的选自n和o的杂原子。在一些实施方案中，r4和r5形成未取代的5-元环；在其它实施方案中，它们形成未取代的6-元环。在另一个实施方案中，5-元或6-元环在一个或多个碳原子处被取代。例如，环可以在一个、两个、三个或四个碳原子处、优选在一个或两个碳原子处被取代。优选的取代基是甲基和乙基。更具体地，环选自吡咯烷子基、哌啶子基、2,6-二甲基哌啶子基、吗啉代基、咪唑基和4-甲基咪唑基。根据一些实施方案，式(iii)中的部分xr6选自c1-c6-烷基，特别是选自甲基和乙基。在进一步实施方案中，xr6是被保护的羟基(-oh)或被保护的硫醇基(-sh)。示例性的非限制性的被保护的羟基基团是醚基团，示例性的非限制性的被保护的硫醇基是硫醚基团。特别地，以xr6表示的被保护的-oh或-sh基团选自2-氰基乙氧基、2-氰基乙基硫基、甲氧基、乙氧基、s-异丁酰基-2-(2-巯基-乙氧基)乙氧基、s-新戊酰基-2-(2-巯基-乙氧基)乙氧基和s-新戊酰基-2-巯基乙氧基。在优选的实施方案中，xr6是2-氰基乙氧基。在一些优选的实施方案中，nr4r5选自二甲基氨基、二乙基氨基、二正丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、吡咯烷子基、哌啶子基、2,6-二甲基哌啶子基、吗啉代基、咪唑基和4-甲基咪唑基，和xr6选自甲基、乙基、2-氰基乙基氧基、2-氰基乙基硫基、甲氧基、乙氧基、s-异丁酰基-2-(2-巯基乙氧基)乙氧基、s-新戊酰基-2-(2-巯基乙氧基)乙氧基和s-新戊酰基-2-巯基乙氧基。根据一个实施方案，nr4r5是二异丙基氨基和xr6是2-氰基乙氧基。对于式(ii)中的羟基保护基a1，大量不同的可能性是可获得的。本领域技术人员将知晓如何选择适于用于制备亚磷酰胺的方法的反应条件以及寡核苷酸合成方法的偶联和氧化步骤的保护基。作为式(ii)的适宜的羟基保护基a1的实例，可以提及酰基基团和甲硅烷基基团。优选地，保护基a1选自乙酰基、苯甲酰基、苯氧基-乙酰基、二甲氧基三苯甲基(dmt)、新戊酰基、异丁酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和异丙基二甲基甲硅烷基。在一些实施方案中，乙酰基用作保护基a1。当在核酸缀合物的合成中使用式(i)的galnac亚磷酰胺时，乙酰基可以在例如lna合成中常用的裂解和脱保护步骤中与核酸如lna或dna的保护基一起除去。在一些实施方案中，二甲氧基三苯甲基(dmt)在galnac部分的碳原子6处用作保护基a1。在此位置采用dmt的益处是其允许在纯化期间容易地分离失败的序列(例如其中合成的失败已经导致galnac部分未被添加的非完整构建体)。在一些实施方案中，本发明的三苯甲基-单-galnac亚磷酰胺以式(xvi)表示其中l是连接基，选自-(ch2)4-c(o)-、-(ch2)5-c(o)-、-(ch2)11c(o)-、-(ch2)6-nh-c(o)-、-(ch2)12-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)5-c(o)-、-(ch2)4-co-nh-(ch2)3-nh-c(o)-、-(ch2)4-co-nh-(ch2)4-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)3-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)4-nh-c(o)-、-(ch2)6-nh-co-ch2-nh-c(o)-、-(ch2ch2o)2-(ch2)2-nh-c(o)-，其中在每种情况下c(o)-与n连接。根据一个优选的实施方案，l是式(ch2ch2o)3-ch2-c(o)-表示的三甘醇(teg)-乙酸酯连接基，其中c(o)-与n连接。在本发明的特定实施方案中，化合物具有通式(i)，其中r1是h，r2是4,4'-二甲氧基三苯甲基，r3以式(iii)表示，其中nr4r5是二异丙基氨基和xr6是2-氰基乙氧基，和k以式(ii)表示，其中l是teg-乙酸酯和a1是乙酰基。在一个实施方案中，本发明的三苯甲基-单-galnac亚磷酰胺以式(xv)表示在一个实施方案中，本发明的三苯甲基-单-galnac亚磷酰胺是二乙酸(2r,3r,4r,5r,6r)-5-乙酰氨基-2-(乙酰氧基甲基)-6-((4-((((2-氰基乙氧基)(二异丙基氨基)膦基)氧基)甲基)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-6-氧代-1-苯基-2,8,11,14-四氧杂-5-氮杂十六碳-16-基)氧基)四氢-2h-吡喃-3,4-二基酯。galnac缀合物在另一方面，本发明涉及新的galnac缀合物，例如生物分子-galnac缀合物，特别是galnac-核酸缀合物。上述单-galnac化合物可用于产生单-galnac部分与生物分子的缀合物。galnac缀合部分可以修饰或增强所连接生物分子、特别是所连接核酸的药物动力学和药效学性质。当本发明的单-galnac化合物的偶联主要就此处的核酸分子而述及时，可以理解，与其它生物分子的类似偶联也是可能的。根据本发明，关注了权利要求1-11任一项的通式(i)化合物作为并入生物分子、特别是核酸分子中的结构单元的用途。在一些实施方案中，该用途可以具有如下效用：已经合并了通式(i)化合物的生物分子具有增加的效力。特别地，经修饰生物分子显示出增强的药物动力学和药效学性质。例如，当与不具有galnac化合物的生物分子相比时，化合物增强了生物分子在肝脏、特别是在肝细胞中的效应。如上所示，核酸分子是根据本发明特别感兴趣的生物分子。因此，本发明在一个方面涉及具有与其5'-末端和/或3'-末端连接的至少一个衍生自如上文所定义的通式(i)化合物的结构单元的核酸分子。在一些实施方案中，所述至少一个衍生自通式(i)化合物、即衍生自三苯甲基-单-galnac亚磷酰胺的结构单元与核酸分子的5'-末端连接，例如与核酸分子的5'端连接的2galnac化合物、例如3galnac化合物、例如4galnac化合物、例如5galnac化合物。在其它实施方案中，所述至少一个衍生自通式(i)化合物的结构单元与核酸分子的3'-末端连接。在其它实施方案中，至少一个衍生自通式(i)化合物的结构单元与核酸分子的5'-末端连接和至少一个衍生自通式(i)化合物的结构单元与核酸分子的3'-末端连接，例如与核酸分子的5'端连接的2galnac化合物、例如3galnac化合物、例如4galnac化合物、例如5galnac化合物。在一些实施方案中，核酸分子和galnac化合物之间的链接是磷酸二酯链接。在其中多个galnac化合物与核酸分子缀合的实施方案中，第一个galnac化合物和第二个galnac化合物(当从核酸分子的末端计数时)之间的链接是磷酸二酯链接。在进一步实施方案中，在第一个和第二个和第二个和第三个galnac化合物之间的链接是磷酸二酯链接。在一些实施方案中，galnac化合物之间的所有链接均是磷酸二酯链接。特别地，这类5'-和/或3'-末端经修饰的核酸分子包括通式(iv)化合物、包括其任意盐，其中式(iv)化合物以下式表示：5′-r7o-(y1)p-na-(y2)q-or8-3′(iv)在式(iv)中，na是核酸分子；p和q是0至6的整数；特别是0至4，条件是p+q至少是1。这意味着核酸分子用至少一个本发明的单-galnac缀合部分进行了修饰。可能的是，存在至多12个单-galnac缀合部分，即在两个末端具有最多6个。下文给出了含单-galnac部分的优选数目。式(iv)中的r7选自h、基于三苯基甲基的羟基保护基或5'-羟基封端基团；和r8选自h或3'-羟基封端基团。而且，y1在每种情况下独立地以通式(v)化合物表示：其中r1是h或c1-6烷基，k'以通式(ιi')表示且z1和z2在每种情况下独立地选自o和s。而且，y2在每种情况下独立地以通式(vi)化合物表示：其中r1是h或c1-6烷基，k'以通式(ιi')表示且z1和z2在每种情况下独立地选自o和s。在式(ιi')的每次出现时，l独立地是连接基，特别是具有2-30个原子的链长度的连接基，如上文所定义，且z1和z2在每种情况下独立地选自o和s。在一些实施方案中，式(ιi')中的连接基l选自-(ch2)m-c(o)-，其中m＝2-12，特别是4、5或11；-(ch2-ch2-o)n-ch2-c(o)-，其中n＝1-5，特别是2、3或4和更特别是3；-(ch2)m1-co-nh-(ch2)m2-nh-c(o)-，其中ml和m2各自独立地是1-5，特别是3、4或5；-(ch2)m3-co-nh-(ch2)m4-c(o)-，其中m3和m4各自独立地是1-5，特别是3、4或5；-(ch2)m6-nh-c(o)-，其中m6是2-12，特别是12；和其中在每种情况下c(o)-与nr1连接。特别地，式(ιi')中的连接基l可以选自：-(ch2)4-c(o)-、-(ch2)5-c(o)-、-(ch2)11c(o)-、-(ch2)6-nh-c(o)-、-(ch2)12-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)5-c(o)-、-(ch2)4-co-nh-(ch2)3-nh-c(o)-、-(ch2)4-co-nh-(ch2)4-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)3-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)4-nh-c(o)-、-(ch2)6-nh-co-ch2-nh-c(o)-、-(ch2ch2o)2-(ch2)2-nh-c(o)-，其中在每种情况下c(o)-与nr1连接。根据一个优选的实施方案，l是以式(ch2ch2o)3-ch2-c(o)-表示的三甘醇(teg)-乙酸酯连接基，其中c(o)-与nr1连接。在核酸分子的一些实施方案中，z1是s且z2是o，或者z1和z2均是o。当z1和z2在一个核酸分子中出现多于一次时，在每次出现时独立地z1是s且z2是o，或者z1和z2均是o。在一些优选的实施方案，核酸分子在5'-末端或3'-末端处进行修饰，即在通式(iv)中，p或q是0。因此，在一些实施方案中，q是0。在一些优选的实施方案中，p是1且q是0；或p是2且q是0；或p是3且q是0；或p是4且q是0。在其它实施方案中，p是0。在一些优选的实施方案中，p是0且q是1；或p是0且q是2；或p是0且q是3；或p是0且q是4。在一个优选的特定实施方案中，p是3且q是0。在另一个优选的特定实施方案中，p是0且q是3。在进一步的特定实施方案中，5'-末端经修饰的核酸分子以下式(vii-xy)表示：其中n是0-6的整数，且y和x独立地选自s和o。在进一步的特定实施方案中，5'-末端经修饰的核酸分子以下式(vii-oo)表示：其中n是0-6的整数，例如1-5的整数，例如2-4的整数，例如1、2或3。在进一步的特定实施方案中，5'-末端经修饰的核酸分子以下式(vii)表示：其中n是0-6的整数，例如1-5的整数，例如2-4的整数，例如1、2或3。在进一步的特定实施方案中，3'-末端经修饰的核酸分子以下式(viii-xy)表示：其中n是0-6的整数，且y和x独立地选自s和o。在进一步的特定实施方案中，3'-末端经修饰的核酸分子以下式(viii-oo)表示：其中n是0-6的整数，例如1-5的整数，例如2-4的整数，例如1、2或3。在进一步的特定实施方案中，3'-末端经修饰的核酸分子以下式(viii)表示：其中n是0-6的整数，例如1-5的整数，例如2-4的整数，例如1、2或3。式(vii)和式(viii)中的术语寡核苷酸以核酸的宽范围来理解，特别是如本文所述。本发明的单-galnac核酸缀合物可以特别设计成用于结合脱唾液酸糖蛋白受体(asgpr)。因此，根据一些实施方案，本发明的单价、二价或优选三价galnac核酸缀合物具有对asgpr的强亲和力。在本发明中，“强亲和力”指以ic50值低于50nm、优选25nm或更低、更优选10nm或更低、更优选5nm或更低为特征的亲和力。在特别优选的实施方案中，单价galnac-核酸缀合物对asgpr而言的ic50为50nm，优选25nm或更低，更优选15nm或更低，更优选10nm或更低，更优选5nm或更低。在特别优选的实施方案中，二价galnac-核酸缀合物对asgpr而言的ic50为50nm，优选25nm或更低，更优选15nm或更低，更优选10nm或更低，更优选5nm或更低。在其它特别优选的实施方案中，三价galnac-核酸缀合物对asgpr而言的ic50为25nm或更低，优选15nm或更低，更优选10nm或更低，更优选5nm或更低，更优选1nm至5nm，例如约3nm。ic50是50％抑制与aspgr结合的标记配体的galnac-核酸缀合物的浓度。ic50可以通过rensen等人,2001journalofbiologicalchemistry第276卷第37577页中所述的方法来确定。简言之，将肝细胞(原代或在培养物中)与一个浓度(例如5nm)的配体125i-标记的脱唾液酸血清类粘蛋白(asor)一起在渐增量的所考察galnac-核酸缀合物的存在下于4℃孵育2小时。对于单价galnac-核酸缀合物，浓度可以为2至200mm；对于二价galnac-核酸缀合物，浓度可以为1至1000nm；和对于三价galnac-核酸缀合物，浓度可以为0.2至200nm，在渐增的浓度下。标记asor的结合在待考察galnac-核酸缀合物的存在下追踪。非特异性结合可以在100mmgalnac的存在下确定。置换结合数据可以采用单位点结合模型进行分析，计算了ic50。三苯甲基-单-galnac化合物的制备在另一方面，本发明涉及制备单-galnac化合物的方法。因此，本发明提供了制备式(i)化合物的方法，该方法包括如下步骤：(i)使通式(ix)化合物与丝氨醇反应，产生通式(x)化合物(ii)将通式(x)化合物的游离羟基之一进行保护，得到通式(xi)化合物和(iii)使通式(xi)化合物与通式(lg)-r3的化合物反应，其中(lg)是离去基，得到通式(xii)化合物，在式(ix)、(x)、(xi)和(xii)中，变量r1、r2、r3、a1和l如上文有关通式(i)和(ii)中所定义。作为通式(lg)-r3的示例性化合物，可以提及2-氰基乙基ν,ν,ν',ν'-四异丙基phosphorodiamidite(还称为双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦)，其中二异丙基氨基之一表示离去基(lg)，和分子其余部分表示r3。核酸分子待缀合至本发明的galnac缀合部分的核酸分子能够调节靶核酸，通常是在哺乳动物如人细胞中。在一些实施方案中，核酸分子与靶核酸结合并与常规表达水平相比实施至少10％或20％的表达抑制，更优选与常规表达水平(例如在不存在核酸分子或核酸分子缀合物的情况下的表达水平)相比至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％抑制。表达水平的调节可以通过测定蛋白质水平来确定，例如通过诸如sds-page、然后采用适宜的对抗靶蛋白质的抗体进行蛋白质印迹的方法。或者，表达水平的调节可以通过测定mrna水平、例如通过northern印迹或定量rt-pcr来确定。核酸分子可以包含相应于靶核酸的反向互补的邻接核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，核酸分子当杂交至靶核酸序列时可以耐受1、2、3或4个错配，并且仍然足以结合靶标以显示出预期的作用，即，调节靶核酸。错配可以例如通过存在于核酸分子中的核酸分子的长度增加和/或经修饰核苷如2'糖经修饰的核苷、包括lna核苷的数目增加来补偿。在一些实施方案中，当杂交至靶核酸时，例如杂交至编码哺乳动物靶蛋白质的核酸序列的相应区时，邻接核苷酸序列包含不多于3个错配，例如不多于2个错配。在一些实施方案中，当杂交至靶核酸、例如编码哺乳动物靶蛋白质的核酸序列的相应区时，邻接核苷酸序列包含不多于单个错配。根据预期的应用选择核酸分子的长度。在优选的实施方案中，核酸分子的长度为7至50个核苷酸。在其它实施方案中，核酸分子的长度为10至30、例如11至22、例如12至18、例如13至17或14至16个邻接核苷酸长度。在一些特定实施方案中，核酸分子的长度为14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。核酸分子的核苷酸序列优选至少80％等同于靶核酸中存在的相应序列的反向互补，例如至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％等同、至少97％等同、至少98％等同、至少99％等同、例如100％等同。mrna调节可以通过与牵涉rnai-诱导沉默络合物(risc)的细胞的rna干扰途径机制相互作用进行促进。在一个实施方案中，缀合物的rnai核酸分子由两个寡核苷酸片段装配，其中一个片段包含rnai分子的反义链的核苷酸序列，第二个片段包含rnai分子的有义区的核苷酸序列。在另一个实施方案中，有义链经由连接基分子、例如聚核苷酸连接基或非核苷酸连接基与反义链连接。优选地，本发明的缀合物与rnai分子的有义链偶联。如果在rnai和缀合物之间存在可裂解连接基，则缀合物可以与有义链或反义链连接。根据本发明的一些实施方案，所要求保护的核酸分子是双链rnai分子。特别地，修饰可以使得一个或多个含galnac部分与有义链或反义链连接。在优选的实施方案中，一个或多个含galnac部分与有义链连接。即，通式(iv)的术语r7o-(y1)p或术语(y2)q-or8与sirna分子的有义链连接。微rnas(mirnas)是约22个核苷酸长度的小的非编码rna基因产物，其指导它们的mrna靶的破坏或翻译抑制。如果mirna和靶核酸之间的互补是部分的，则靶核酸的翻译被抑制。如果互补是广泛的，则靶核酸被裂解。对于mirnas，与靶位点的络合结合经常位于mrna的3'utr，其通常与mirna共享仅部分同源性。“种子区”—在mirna的5'端上的约7个连续核苷酸的一段序列，其与靶形成完美的碱基配对—在mirna特异性中发挥关键作用。用寡核苷酸阻断mirna的种子区或促进risc/mirna络合物与mrna结合可导致蛋白质翻译的抑制或者mrna的裂解和降解。rnai聚核苷酸表达盒可以被转录到细胞中以产生小发夹rna，其可作为rnai分子、分开的有义链和反义链线性sirna或mirna发挥功能。rna聚合酶iii转录dna含有选自如下的启动子：u6启动子、hi启动子和trna启动子。rna聚合酶ii启动子包括u1、u2、u4和u5启动子、snrna启动子、微rna启动子和mrna启动子。或者，rna调节可以通过与靶核酸互补的单链寡核苷酸(这类寡核苷酸还称为反义寡核苷酸)来促进。可以认识到，反义寡核苷酸可以经由非rnase介导的靶核酸降解(例如通过翻译的立体位阻、剪接开关或其它方法)来发挥功能，然而，本发明的优选的反义寡核苷酸能够募集内切核糖核酸酶(rnase)、例如rnaseh。根据本发明的一些优选实施方案，所要求保护的核酸分子是单链反义寡核苷酸。在本发明的一些优选实施方案中，核酸分子能够募集rnaseh。为了募集rnaseh，反义寡核苷酸或邻接核苷酸序列可以是gapmer、headmer或mixmer的形式。在一些特定实施方案中，本发明的核酸分子是gapmer。"headmer"定义为包含彼此邻接的x区和y区的反义寡核苷酸，y区的5'-端基(5'-most)的单体与x区的3'-端基(3'-most)的单体相连。x区包含非-rnase募集核苷类似物的邻接序列段，y区包含可被rnase识别和裂解的dna单体或核苷类似物单体的邻接序列段(例如至少7个邻接单体)。"tailmer"定义为包含彼此邻接的x区和y区的反义寡核苷酸，y区的5'-端基单体与x区的3'-端基单体相连。x区包含可被rnase识别和裂解的dna单体或核苷类似物单体的邻接序列段(例如至少7个邻接单体)，和x区包含非-rnase募集核苷类似物的邻接序列段。"mixmer"由(i)可被rnase识别和裂解的dna单体或核苷类似物单体和(ii)非rnase募集核苷类似物单体的交替组合物组成。mixmers的实例可见于wo2005/023995，该文献引入本文作为参考。"gapmer"如下文中详细定义。在本发明的优选实施方案中，所要求保护的核酸分子包含至少一个经修饰核苷，其特定地在每种情况下独立地选自2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧基乙基-rna、2'-氨基-dna、2'-氟-dna、阿拉伯核酸(ana)、2'-氟-ana和lna核苷。在一些优选的实施方案，所要求保护的核酸分子的所述至少一个经修饰核苷是2'-4'-桥连核苷。根据本发明的核酸分子的一些优选实施方案，2'-4'-桥连核苷是lna核苷，特别是2'-o-ch2-4'-、2'-o-ch2-ch2-4'-、2'-o-ch(ch3)-4'-、2'-o-ch(och2ch3)-4'-或2'-o-c(ch3)2-4'-核苷。特别地，lna核苷是β-d-氧基lna或α-l-氧基-lna。核酸分子中的核苷酸间链接可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯，从而允许靶rna的rnaseh裂解。由于改善的核酸酶抗性和其它原因如生产容易性，硫代磷酸酯是优选的。因此，在本发明的一些实施方案中，所要求的核酸分子包含至少一个经修饰核苷间链接。特别地，核酸分子可以包含至少一个经修饰核苷间链接，其中邻接核苷酸序列中的至少一个核苷间链接是硫代磷酸酯核苷间链接。gapmer设计在优选的实施方案中，本发明的核酸分子是反义寡核苷酸，其继而是gapmer。在本发明的一些优选实施方案中，寡核苷酸的gapmer结构因此包含至少三个不同的结构区：5'-侧翼、gap和3'-侧翼，f-g-f'的方向为'5—>3'。在此设计中，侧翼区f和f'(还称为翼区)包含与靶核酸互补的经修饰核苷的邻接序列段，而gap区g包含当寡核苷酸与靶核酸为二聚体时能够募集核酸酶、优选内切核酸酶、例如rnase、例如rnaseh的核苷酸的邻接序列段。能够募集核酸酶、特别是rnaseh的核苷可选自dna、α-l-氧基-lna、2'-氟-ana和una。作为g区的5'和3'端侧翼的f和f'区优选包含非核酸酶募集核苷(具有3'内结构的核苷)，更优选一个或多个增强亲和力的经修饰核苷。在一些实施方案中，3'侧翼包含至少一个lna核苷、优选至少2个lna核苷。在一些实施方案中，5'侧翼包含至少一个lna核苷。在一些实施方案中，5'和3'侧翼区包含lna核苷。在一些实施方案中，侧翼区中的所有核苷是lna核苷。在其它实施方案中，侧翼区可以包含lna核苷和其它核苷(混合侧翼)、例如dna核苷和/或非lna经修饰核苷、例如2'取代的核苷。在这种情况中，gap定义为至少5个rnaseh募集核苷(具有2'内结构的核苷，优选dna)的邻接序列，其在5'和3'端的侧翼为增强亲和性的经修饰核苷，优选lna，例如β-d-氧基-lna。因此，与gap区相邻的5'侧翼区和3'侧翼区的核苷是经修饰核苷，优选非核酸酶募集核苷。f区与g区的'5端连接的f区(5'侧翼或5'翼)包含、含有或由如下组成：至少一个经修饰核苷，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个经修饰核苷。在一个实施方案中，f区包含或由如下组成：1至7个经修饰核苷，例如2至6个经修饰核苷，例如2至5个经修饰核苷，例如2-4个经修饰核苷，例如1至3个经修饰核苷，例如1、2、3或4个经修饰核苷。f区通过在区的5'端和3'端具有至少一个经修饰核苷来定义。在一些实施方案中，f区中的经修饰核苷具有3'内结构。在一个实施方案中，f区中的经修饰核苷中的一个或多个是2'经修饰核苷。在一个实施方案中，f区中的所有核苷是2'经修饰核苷。在另一个实施方案中，f区除了2'经修饰核苷以外还包含dna和/或rna。包含dna和/或rna的侧翼的特征是在f区的5'端和3'端(与g区相邻)具有2'经修饰核苷。在一个实施方案中，f区包含dna核苷，例如1至3个邻接dna核苷，例如1至3个或1至2个邻接dna核苷。侧翼中的dna核苷应当优选不能募集rnaseh。在一些实施方案中，f区中的2'经修饰核苷和dna和/或rna核苷与1至3个2'经修饰核苷和1至3个dna和/或rna核苷交替。这样的侧翼还称为交替侧翼。具有交替侧翼的寡核苷酸中的5'侧翼(f区)的长度可以是4至10个核苷，例如4至8个，例如4至6个核苷，例如4、5、6或7个经修饰核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸的仅5'侧翼是交替的。具有交替核苷的f区的特定实例有：2'1-3-n'1-4-2’1-32'1-2-n'1-2-2’1-2-n'1-2-2’1-2其中2'指经修饰核苷且n'是rna或dna。在一些实施方案中，交替侧翼中的所有经修饰核苷是lna且n'是dna。在进一步实施方案中，f区中的2'经修饰核苷中的一个或多个选自2'-o-烷基-rna单元、2'-o-甲基-rna、2'-氨基-dna单元、2'-氟-dna单元、2'-烷氧基-rna、moe单元、lna单元、阿拉伯核酸(ana)单元和2'-氟-ana单元。在一些实施方案中，f区同时包含lna和2'取代的经修饰核苷。这些经常称为混合翼或混合侧翼寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，f区中的所有经修饰核苷是lna核苷。在进一步实施方案中，f区中的所有核苷是lna核苷。在进一步实施方案中，f区中的lna核苷独立地选自氧基-lna、硫基-lna、氨基-lna、cet和/或ena，为β-d或α-l构型或其组合。在优选的实施方案中，f区在邻接的5'端处具有至少一个β-d-氧基lna单元。g区g区(gap区)优选包含、含有或由如下组成：至少4个、例如至少5个、例如至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个能够募集上述核酸酶、特别是rnaseh的连续核苷。在进一步实施方案中，g区包含、含有或由如下组成：5至12个或6至10个或7至9个、例如8个能够募集上述核酸酶的连续核苷酸单元。在一个实施方案中，g区中能够募集核酸酶的核苷单元选自dna、α-l-lna、c4'烷基化dna(如pct/ep2009/050349和vester等人.,bioorg.med.chem.lett.18(2008)2296-2300中所述，均引入本文作为参考)、阿拉伯糖衍生的核苷如ana和2'f-ana(mangos等人,2003j.am.chem.soc.125,654-661)、una(解锁核酸)(如fluiter等人.,mol.biosyst.,2009,10,1039中所述，引入本文作为参考)。una是解锁核酸，通常其中核糖的c2和c3之间的键已经被除去，形成了解锁"糖"残基。在进一步实施方案中，区g中的至少一个核苷单元是dna核苷单元，例如1至12个dna单元，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个dna单元，优选2至12个dna单元，例如4至12个dna单元，更优选5至11个或2至10个、4至10个或6至10个dna单元，例如7至10个dna单元，最优选8、9或10个dna单元。在一些实施方案中，g区由100％dna单元组成。在进一步实施方案中，g区可以由dna和能够介导rnaseh裂解的其它核苷的混合物组成。g区可以由至少50％dna、更优选60％、70％或80％dna和甚至更优选90％或95％dna组成。在进一步实施方案中，g区中的至少一个核苷单元是α-l-lna核苷单元，例如至少一个α-l-lna，例如2、3、4、5、6、7、8或9个α-l-lna。在进一步实施方案中，g区包含至少一个α-l-lna是α-l-氧基-lna。在进一步实施方案中，g区包含dna和α-l-lna核苷单元的组合。在一些实施方案中，g区中的邻接序列的尺寸可以更长，例如12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷单元。在一些实施方案中，g区中的核苷具有2'内结构。在一些实施方案中，g区可以包含gapbreaker核苷，从而产生gapbreaker寡核苷酸，其能够募集rnaseh。f'区与g区的'3端连接的f'区(3'侧翼或3'翼)包含、含有或由如下组成：至少一个经修饰核苷，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个经修饰核苷。在一个实施方案中，f'区包含或由如下组成：1至7个经修饰核苷，例如2至6个经修饰核苷，例如2至4个经修饰核苷，例如1至3个经修饰核苷，例如1、2、3或4个经修饰核苷。f'区通过在区的5'端和3'端处具有至少一个经修饰核苷来定义。在一些实施方案中，f'区中的经修饰核苷具有3'内结构。在一个实施方案中，f'区中的经修饰核苷中的一个或多个是2'经修饰核苷。在一个实施方案中，f'区中的所有核苷是2'经修饰核苷。在一个实施方案中，f'区中的经修饰核苷中的一个或多个是2'经修饰核苷。在一个实施方案中，f'区中的所有核苷是2'经修饰核苷。在另一个实施方案中，f'区除了2'经修饰核苷以外还包含dna或rna。包含dna或rna的侧翼的特征是在f'区的5'端(与g区相邻)和3'端具有2'经修饰核苷。在一个实施方案中，f'区包含dna核苷，例如1至4个邻接dna核苷，例如1至3或1至2个邻接dna核苷。侧翼中的dna核苷应当优选不能募集rnaseh。在一些实施方案中，f'区中的2'经修饰核苷和dna和/或rna核苷与1至3个2'经修饰核苷和1至3个dna和/或rna核苷交替，这样的侧翼还称为交替侧翼。具有交替侧翼的寡核苷酸中的3'侧翼(f'区)的长度可以是4至10个核苷，例如4至8个、例如4至6个核苷，例如4、5、6或7个经修饰核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸的仅3'侧翼是交替的。具有交替核苷的f'区的特定实例有：2'1-2-n'1-4-2’1-42'1-2-n'1-2-2’1-2-n'1-2-2’1-2其中2'指经修饰核苷且n'是rna或dna。在一些实施方案中，交替侧翼中的所有经修饰核苷是lna且n'是dna。在进一步实施方案中，f'区中的经修饰核苷选自2'-o-烷基-rna单元、2'-o-甲基-rna、2'-氨基-dna单元、2'-氟-dna单元、2'-烷氧基-rna、moe单元、lna单元、阿拉伯核酸(ana)单元和2'-氟-ana单元。在一些实施方案中，f'区同时包含lna和2'取代的经修饰核苷。这些经常称为混合翼或混合侧翼寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，f'区中的所有经修饰核苷是lna核苷。在进一步实施方案中，f'区中的所有核苷是lna核苷。在进一步实施方案中，f'区中的lna核苷独立地选自氧基-lna、硫基-lna、氨基-lna、cet和/或ena，为β-d或α-l构型或其组合。在优选的实施方案中，f'区在邻接序列的3'端处具有至少两个β-d-氧基lna单元。d'和d"区d'和d"区可以分别连接至f区的5'端或f'区的3'端。d'或d"区可以独立地包含1、2、3、4或5个另外的核苷酸，其可以与靶核酸互补或不互补。在此方面，本发明的寡核苷酸在一些实施方案中可以包含能够调节靶的邻接核苷酸序列，其在5'和/或3'端的侧翼是另外的核苷酸。这种另外的核苷酸可以用作对核酸酶敏感的可生物裂解的连接基。在一些实施方案中，另外的5'和/或3'端核苷酸与磷酸二酯链接连接，并且可以是dna或rna。在另一个实施方案中，另外的5'和/或3'端核苷酸是经修饰核苷酸，其可以例如被包括在内以增强核酸酶稳定性或为了合成容易性。在本发明的寡核苷酸的实施方案中，除了邻接核苷酸序列以外还包含d'和/或d"区。在一些实施方案中，d'或d"区包含序列aa、at、ac、ag、ta、tt、tc、tg、ca、ct、cc、cg、ga、gt、gc或gg的二核苷酸，其中c可以是5-甲基胞嘧啶(还称为mc)和/或t可以被u代替。本发明的gapmer寡核苷酸可以以下式表示：f-g-f'；特别是f1-7-g4-12-f'1-7d'-f-g-f'，特别是d'1-3-f1-7-g4-12-f'1-7f-g-f'-d"，特别是f1-7-g4-12-f'1-7-d"1-3d'-f-g-f'-d"，特别是d'1-3-f1-7-g4-12-f'1-7-d"1-3上文已经描述了f、g和f'、d'和d"区中的核苷的优选数目和类型。在本发明的一些优选实施方案中，核酸分子是式5'-f-g-f'-3的gapmer，其中f和f'区在每种情况下独立地包含1至7个经修饰核苷，g是6至16个能够募集rnaseh的核苷的区。本发明的寡核苷酸缀合物具有与寡核苷酸、特别是上文给出的gapmer寡核苷酸的5'或3'端共价连接的c区。在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸缀合物包含式5'-d'-f-g-f'-3'或5'-f-g-f'-d"-3'的寡核苷酸，其中f和f'区独立地包含1-7个经修饰核苷，g是6至16个能够募集rnaseh的核苷的区，且d'或d"区包含1-5个磷酸二酯连接的核苷。优选地，d'或d"区存在于寡核苷酸的端，其中关注了与缀合部分的结合。具有交替侧翼的寡核苷酸的实例可以以下式表示：2'1-3-n'1-4-2'1-3-g6-12-2’1-2-n'1-4-2’1-42'1-2-n'1-2-2’1-2-n'1-2-2’1-2-g6-12-2'1-2-n'1-2-2'1-2-n'1-2-2'1-2f-g6-12-2'1-2-n'1-4-2'1-4f-g6-12-2'1-2-n'1-2-2'1-2-n'1-2-2'1-22'1-3-n'1-4-2’1-3-g6-12-f'2'1-2-n'1-2-2’1-2-n1-2-2'1-2-g6-12-f'当侧翼以f或f'表示时，其仅含有2'经修饰核苷，例如lna核苷，和其中2'指经修饰核苷和n'是rna或dna。上文已经描述了交替区和f、g和f'、d'和d"区中核苷的优选数目和类型。在一些实施方案中，寡核苷酸是由10、11、12、13、14、15或16个核苷酸长度组成的gapmer，其中f和f'区各自独立地由1、2、3或4个与靶核酸互补的经修饰核苷单元组成，g区由7、8、9或10个当与靶核酸形成二聚体时能够募集核酸酶的核苷单元组成。在进一步实施方案中，寡核苷酸是gapmer，其中f和f'区各自独立地由3、4、5或6个经修饰核苷单元组成，例如含2'-o-甲氧基乙基-核糖(2'-moe)的核苷单元或含2'-氟-脱氧核糖的核苷单元和/或lna单元，g区由8、9、10、11或12个核苷单元、例如dna单元或其它募集核酸酶的核苷如α-l-lna或者dna和募集核酸酶的核苷的混合物组成。在进一步的特定实施方案中，寡核苷酸是gapmer，其中f区和f'区各自由两个lna单元组成，g区由8、9或10个核苷单元、优选dna单元组成。该性质的特定gapmer设计包括2-8-2、2-9-2和2-10-2。在进一步的特定实施方案中，寡核苷酸是gapmer，其中f区和f'区各自独立地由三个lna单元组成，g区由8、9或10个核苷单元、优选dna单元组成。该性质的特定gapmer设计包括3-8-3、3-9-3和3-10-3。在进一步的特定实施方案中，寡核苷酸是gapmer，其中f区和f'区各自由四个lna单元组成，g区由8或9或10个核苷单元、优选dna单元组成。该性质的特定gapmer设计包括4-8-4、4-9-4和4-10-4。该性质的特定gapmer设计包括选自如下的f-g-f'设计：具有6个核苷和在侧翼独立地具有1-4个经修饰核苷的gap，包括1-6-1、1-6-2、2-6-1、1-6-3、3-6-1、1-6-4、4-6-1、2-6-2、2-6-3、3-6-2、2-6-4、4-6-2、3-6-3、3-6-4和4-6-3gapmers。该性质的特定gapmer设计包括选自如下的f-g-f'设计：具有7个核苷和在侧翼独立地具有1-4个经修饰核苷的gap，包括1-7-1、2-7-1、1-7-2、1-7-3、3-7-1、1-7-4、4-7-1、2-7-2、2-7-3、3-7-2、2-7-4、4-7-2、3-7-3、3-7-4、4-7-3和4-7-4gapmers。该性质的特定gapmer设计包括选自如下的f-g-f'设计：具有8个核苷和在侧翼独立地具有1-4个经修饰核苷的gap，包括1-8-1、1-8-2、1-8-3、3-8-1、1-8-4、4-8-1、2-8-1、2-8-2、2-8-3、3-8-2、2-8-4、4-8-2、3-8-3、3-8-4、4-8-3和4-8-4gapmers。该性质的特定gapmer设计包括选自如下的f-g-f'设计：具有9个核苷和在侧翼独立地具有1-4个经修饰核苷的gap，包括1-9-1、2-9-1、1-9-2、1-9-3、3-9-1、1-9-4、4-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、2-9-4、4-9-2、3-9-3、3-9-4、4-9-3和4-9-4gapmers。该性质的特定gapmer设计包括选自如下的f-g-f'设计：具有10个核苷的gap，包括1-10-1、2-10-1、1-10-2、1-10-3、3-10-1、1-10-4、4-10-1、2-10-2、2-10-3、3-10-2、2-10-4、4-10-2、3-10-3、3-10-4、4-10-3和4-10-4gapmers。在所有实例中，f-g-f'设计可以另外包括d'和/或d"区，其可以具有1、2或3个核苷单元，例如dna单元。优选地，f和f'区中的核苷是经修饰核苷，而g区中的核苷酸优选是未经修饰的核苷。在每种设计中，优选的经修饰核苷是lna。在另一个实施方案中，gapmer中的gap中的所有核苷间链接是硫代磷酸酯和/或硼烷磷酸酯链接。在另一个实施方案中，gapmer中的侧翼(f和f'区)中的所有核苷间链接是硫代磷酸酯和/或硼烷磷酸酯链接。在另一个优选的实施方案中，gapmer中的d'和d"区中的所有核苷间链接是磷酸二酯链接。对于如本文公开的具体gapmers，在各个实施方案中，当胞嘧啶(c)残基注释为5-甲基-胞嘧啶时，存在于寡核苷酸中的一个或多个cs可以是未经修饰的c残基。在特定实施方案中，gapmer是如wo2008/113832中所述的所谓shortmer，该文献引入本文作为参考。其它gapmer设计公开于wo2004/046160、wo2007/146511中，并入本文作为参考。可以并入本发明的缀合物的示例性核酸分子是5'-gmcattggtattmca-3'(seqidno：1)，大写字母表示lna核苷；所有lnac是5'甲基c；小写字母表示dna核苷；核苷间链接是硫代磷酸酯链接。另一个可以并入本发明的缀合物的示例性核酸分子是5'-cagmcattggtattmca-3'(seqidno：2)，大写字母表示lna核苷；所有lnac是5'甲基c；小写字母表示dna核苷；从5'端的两个第一核苷间链接是磷酸二酯链接，其余的核苷间链接是硫代磷酸酯链接。靶本发明的核酸缀合物可用于调节核酸靶。在一些实施方案中，核酸分子调节肝脏表达的rna，例如肝脏表达的mrna或微rna。特别是肝细胞中表达的mrna或微rna。在一些实施方案中，核酸分子调节选自下表1的靶核酸。本发明的核酸缀合物可用于药物中以治疗一种或多种选自下表1的疾病。表1：肝脏靶和相关疾病组合物本发明的核酸缀合物可用于药物制剂和组合物。适宜地，这类组合物包含可药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。因此，在本发明的一些实施方案中，这类药物组合物包含如本文所述的核酸分子和可药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。可药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)，可药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施方案中，可药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，寡核苷酸以50-300μμ溶液的浓度用于可药用稀释剂中。适用于本发明的制剂可见于remington'spharmaceuticalsciences,mack出版公司,费城,pa.,第17版,1985。关于药物递送方法的简述，参见例如langer(science249：1527-1533,1990)。wo2007/031091提供了适宜的和优选的可药用稀释剂、载体和佐剂——其引入本文作为参考。wo2007/031091中还提供了适宜的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合、前药制剂——其引入本文作为参考。这些组合物可以通过常规灭菌技术进行灭菌，或者可以过滤灭菌。所得水溶液可以包装用于原样使用或进行冷冻干燥，冷冻干燥制剂在施用前与无菌水性载体合并。制剂的ph通常将为3至11，更优选为5至9或6至8，最优选为7至8，例如7至7.5。所得固体形式的组合物可以以多个单剂量单位进行包装，每个单位含有固定量的上述一种或多种药物，例如在片剂或胶囊剂的密闭包装中。固体形式的组合物还可以包装在容器中用于灵活量，例如在设计成用于具体应用霜剂或软膏剂的可挤压管中。在一些实施方案中，本发明的核酸缀合物是前药。特别是就具有可生物裂解的连接基的核酸缀合物而言，一旦前药被递送至作用位点如靶细胞，缀合部分就与核酸分子裂解。应用本发明的化合物可以用作研究试剂用于例如诊断、治疗和预防。特别地，本申请所要求保护的核酸分子或药物组合物用于药物，特别是人用药物。药物可用于治疗表1中列出的任意疾病。本发明提供了调节、例如下调或抑制靶细胞中的蛋白质和/或mrna和/或微rna和/或长的非编码rna的表达或功能的方法，该方法包括给所述细胞施用本发明的核酸缀合物以下调或抑制所述细胞中靶蛋白质和/或mrna和/或微rna和/或长的非编码rna的表达或功能。适宜地，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞，优选是肝脏细胞。在一些实施方案中，施用可以发生在体外。在一些实施方案中，施用可以发生在体内。组合物的施用是足以在人中有效治疗或预防疾病或调节生理状态的量。还提供了治疗被怀疑患有或倾向于患有疾病或病症的哺乳动物、例如人的方法，该方法通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的核酸缀合物来进行。本发明的核酸缀合物或药物组合物通常以有效量进行施用。具体而言，式(iv)化合物可用于本发明的应用。本发明还提供了所述的本发明的核酸缀合物在制备用于治疗障碍的药物中的用途或在治疗障碍的方法中的用途，所述障碍受靶核酸调节的影响。本发明还提供了治疗障碍的方法，所述方法包括给需要其的患者施用本发明的化合物和/或本发明的药物组合物。待治疗障碍的实例有肝脏疾病，例如表1中列出的那些。在一个实施方案中，本发明的核酸缀合物用于制备药物，所述药物用于治疗肝脏中的感染性疾病，例如病毒性肝脏感染，例如hbv或hcv。在一个实施方案中，本发明的核酸缀合物用于制备药物，所述药物用于治疗代谢障碍，例如高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高血糖、葡萄糖内稳态、心血管疾病、心肌代谢疾病、动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、冠心病、肥胖、代谢综合征、抗胰岛素性、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪肝疾病(nafld)、非胰岛素依赖性糖尿病(niddm)、2型糖尿病、1型糖尿病、卟啉病。在一个实施方案中，本发明的核酸缀合物用于制备药物，所述药物用于治疗增殖性疾病，例如肝癌。在一个实施方案中，本发明的核酸缀合物用于制备药物，所述药物用于治疗与血液或补体系统相关的障碍，例如血栓形成、血友病a,b罕见、贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)、非典型溶血尿毒综合征(ahus)和血色素沉着病。在一个实施方案中，本发明的核酸缀合物用于制备药物，所述药物用于治疗炎性障碍如关节炎和结肠炎。实施方案本发明的以下实施方案可以与本文所述的任意其它实施方案相组合。1.通式(i)化合物、包括其任意盐，其中所述化合物如下表示：其中r1是h或c1-6烷基；a.r2是基于三苯基甲基的羟基保护基，b.r3是含磷基团，特别是亚磷酰胺或phosphonoamidite基团，且k以通式(ii)表示：其中a1是羟基保护基，其在每次出现时可以相同或不同，且l是连接基。2.实施方案1的化合物，其中r1是h。3.实施方案1或2的化合物，其中r2是三苯基甲基、甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基，特别是二甲氧基三苯甲基。4.实施方案1-3任一项的化合物，其中r3以通式(iii)表示：其中r4和r5独立地选自c1-6烷基，或者r4和r5一起形成5-或6-元环，其可以是被取代的和其可以含有一个另外的选自n和o的杂原子；x是o或s，n是0或1，且r6是任选被硫基或硫代基(thio)、氧代基、卤素和/或cn取代的c1-8烷基。5.实施方案4的化合物，其中nr4r5选自二甲基氨基、二乙基氨基、二正丙基氨基、二异丙基氨基、二丁基氨基、吡咯烷子基、哌啶子基、2,6-二甲基哌啶子基、吗啉代基、咪唑基和4-甲基咪唑基，和/或其中xr6选自甲基、乙基、2-氰基乙基氧基、2-氰基乙基硫基、甲氧基、乙氧基、s-异丁酰基-2-(2-巯基乙氧基)乙氧基、s-新戊酰基-2-(2-巯基乙氧基)乙氧基和s-新戊酰基-2-巯基乙氧基。6.实施方案4或5的化合物，其中nr4r5是二异丙基氨基和/或xr6是2-氰基乙氧基。7.实施方案1-6任一项的化合物，其中a1选自酰基基团和甲硅烷基基团，优选选自乙酰基、苯甲酰基、苯氧基-乙酰基、新戊酰基、异丁酰基、叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和异丙基二甲基甲硅烷基。8.实施方案1-7任一项的化合物，其中a1是乙酰基。9.实施方案1-8任一项的化合物，其中l是具有2-30个原子的链长度的连接基基团。10.实施方案1-9任一项的化合物，其中l选自：-(ch2)m-c(o)-，其中m＝2-12，特别是4、5或11；-(ch2-ch2-o)n-ch2-c(o)-，其中n＝1-5，特别是2、3或4，更特别是3；-(ch2)m1-co-nh-(ch2)m2-nh-c(o)-，其中ml和m2各自独立地是1-5，特别是3、4或5；-(ch2)m3-co-nh-(ch2)m4-c(o)-，其中m3和m4各自独立地是1-5，特别是3、4或5；和-(ch2)m6-nh-c(o)-，其中m6是2-12，特别是12；且其中在每种情况下c(o)-与nr1连接。11.实施方案1-10任一项的化合物，其中所述化合物以式(xv)表示：12.实施方案1-11任一项的化合物，其中l选自-(ch2)4-c(o)-、-(ch2)5-c(o)-、-(ch2)11-c(o)-、-(ch2)6-nh-c(o)-、-(ch2)12-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)5-c(o)-、-(ch2)4-co-nh-(ch2)3-nh-c(o)-、-(ch2)4-co-nh-(ch2)4-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)3-nh-c(o)-、-(ch2)5-co-nh-(ch2)4-nh-c(o)-、-(ch2)6-nh-co-ch2-nh-c(o)-和-(ch2ch2o)2-(ch2)2-nh-c(o)-和其中在每种情况下c(o)-与nr1或nh连接。13.实施方案1-12任一项的化合物，其中所述化合物以式(xv)表示：14.实施方案1-13任一项的通式(i)化合物作为并入生物分子的结构单元的用途。15.根据实施方案14的用途，其中当与不具有所述化合物的生物分子相比时，所述化合物增加生物分子在肝脏、特别是肝细胞中的效应。16.根据实施方案14或15的用途，其中生物分子是核酸分子。17.具有连接至其5'-末端和/或3'-末端的至少一个衍生自如实施方案1-13任一项中所定义的通式(i)化合物的结构单元的核酸分子。18.5'-和/或3'-末端经修饰的核酸分子，包含通式(iv)化合物、包括其任意盐，其中化合物(iv)如下表示：5'-r7o-(y1)p-na-(y2)q-or8-3'(iv)其中na是核酸分子p和q是0至6、特别是0至4的整数，条件是p+q至少是1，r7选自h、基于三苯基甲基的羟基保护基或5'-羟基封端基团，r8选自h或3'-羟基封端基团，y1在每种情况下独立地以通式(v)化合物表示：y2在每种情况下独立地以通式(vi)化合物表示：其中对于y1和y2各自而言，独立地，，r1是h或c1-6烷基；k'以通式(ιi')表示：其中l是连接基，且z1和z2在每种情况下独立地选自o和s。19.实施方案18的核酸分子，其中连接基是具有2-30个原子的链长度的连接基基团，特别是如实施方案10或实施方案11中所定义的连接基。20.实施方案18或19的核酸分子，其中在每种情况下独立地，z1是s且z2是o，或者z1和z2是o。21.实施方案18-20任一项的核酸分子，其中i)p是1且q是0，ii)p是2且q是0，iii)p是3且q是0，iv)p是4且q是0，v)p是0且q是1，vi)p是0且q是2，vii)p是0且q是3，或者viii)p是0且q是4。22.实施方案18-21任一项的核酸分子，其中p是3且q是0，或者其中p是0且q是3。23.实施方案21或22的核酸分子，其中对于与na连接的y1和/或y2部分而言，z1和z2是o，其中z1、z2、y1和y2根据实施方案18中定义。24.实施方案21-23任一项的核酸分子，其中对于与第一个y1和/或y2部分相邻的y1和/或y2部分而言，z1和z2为o。25.实施方案23或24任一项的核酸分子，其中对于y1和/或y2部分的其余部分而言，z1和z2为s。26.实施方案21或22的核酸分子，其中对于所有y1和/或y2部分而言，z1和z2为o，其中z1、z2、y1和y2根据实施方案18中进行定义。27.实施方案18-21任一项的核酸分子，其中分子以式(vii-xy)或式(viii-xy)表示：其中n是0至6的整数，且y和x独立地选自s和o。28.实施方案18-21任一项的核酸分子，其中分子以式(vii)表示，且n是0至6的整数，29.实施方案18-21任一项的核酸分子，其中分子以式(vii-oo)表示且n是0-6的整数，30.实施方案18-21任一项的核酸分子，其中分子以式(viii)表示且n是0-6的整数，31.实施方案18-21任一项的核酸分子，其中分子以式(viii-oo)表示且n是0-6的整数，32.实施方案27-29的核酸分子，其中n是1、2或3。33.实施方案17-31任一项的核酸分子，其中核酸分子的长度为10至50个核苷酸。34.实施方案17-33任一项的核酸分子，其中核酸分子包含至少一个经修饰核苷，其特别在每种情况下独立地选自2'-o-烷基-rna、2'-o-甲基-rna、2'-烷氧基-rna、2'-o-甲氧基乙基-rna、2'-氨基-dna、2'-氟-dna、阿拉伯核酸(ana)、2'-氟-ana和lna核苷。35.实施方案34的核酸分子，其中所述的至少一个经修饰核苷是lna核苷。36.实施方案34或35的核酸分子，其中lna核苷是选自如下的2'-4'-桥连核苷：2'-o-ch2-4'-、2'-o-ch2-ch2-4'-、2'-o-ch(ch3)-4'-、2'-o-ch(och2ch3)-4'-和2'-o-c(ch3)2-4'-核苷。37.实施方案34-36的核酸分子，其中lna核苷是β-d-氧基-lna-核苷或α-l-氧基-lna-核苷。38.实施方案17-37任一项的核酸分子，其中核酸分子包含至少一个经修饰核苷间链接。39.实施方案38的核酸分子，其中核酸分子中的所有核苷间链接是经修饰的。40.实施方案38或39的核酸分子，其中经修饰核苷间链接是硫代磷酸酯核苷间链接。41.实施方案17-40任一项的核酸分子，其中分子是单链反义寡核苷酸。42.实施方案17-40任一项的核酸分子，其中核酸分子能够募集rnaseh，特别是其中核酸分子是gapmer。43.实施方案17-42任一项的核酸分子，其中核酸分子是式5'-f-g-f'-3'的gapmer，其中f和f'区在每种情况下独立地包含1-7个经修饰核苷，g是6-16个能够募集rnaseh的核苷的区。44.实施方案17-40任一项的核酸分子，其中分子是双链rnai分子。45.实施方案44的核酸分子，其中通式(i)化合物或者通式(iv)的术语r7o-(y1)p或术语(y2)q-or8与分子的有义链连接，其中r7、r8、y1和y2根据实施方案18进行定义。46.药物组合物，包含实施方案17-45任一项的核酸分子和可药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。47.实施方案17-46任一项的核酸分子或实施方案46的药物组合物，用于药物，特别是人用药物。实施例实施例1：dmt-单-galnac亚磷酰胺的合成该实施例描述了制备dmt-单-galnac亚磷酰胺的方法作为上述三苯甲基-单-galnac亚磷酰胺的具体实例。以下反应流程示例了由通式(ix)化合物开始合成通式(xii)化合物。化合物1如wo2012/083046(第54-55页)中所述进行了制备。化合物2如下进行了生产：向化合物1(7.00g,12.1mmol,与乙腈和甲苯共蒸发)在60ml二甲基甲酰胺中的溶液中加入丝氨醇(1.37g,15.0mmol)和1-羟基苯并三唑(hoat,2.04g,15.0mmol)。将反应混合物冷却至0℃(冰浴)，历经20分钟分批加入n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl,2.88g,15.0mmol)。将反应混合物于室温搅拌5小时，加入水(5ml)，蒸发溶剂(50℃,6mbar)。将残余物经硅胶色谱法纯化(用乙醇在二氯甲烷中的5％至15％溶液洗脱)。获得化合物2，为无色油，7.62g。化合物3如下进行了生产：向2(2.32g,3.97mmol,用乙腈和甲苯共蒸发三次)在150ml四氢呋喃中的溶液中加入二异丙基乙基胺(1.31ml,7.6mmol)，然后在3小时内分批加入4,4'-二甲氧基三苯甲基氯(1.67g,4.94mmol)。将反应混合物于室温搅拌20小时。加入水(1.5ml)和乙醇(1.5ml)，将反应溶剂蒸发。残余物经硅胶色谱法纯化(用乙醇在二氯甲烷中的0％至20％溶液洗脱)。获得化合物3，为白色泡沫，2.27g。化合物4如下进行了生产：于20℃在20分钟内向3(2.60g,2.85mmol,用乙腈和甲苯共蒸发)在二氯甲烷(55ml)中的溶液中同时加入4,5-二氰基咪唑(dci,235mg,2.00mmol)在乙腈(5ml)中的溶液和2-氰基乙基四异丙基phosphorodiamidite(1.03g,3.42mmol)在dcm(5ml)中的溶液。将反应混合物于0℃和于室温搅拌3小时，用二氯甲烷(100ml)稀释，用饱和nahco3(100ml)、盐水(100ml)萃取，经na2so4干燥，蒸发。残余物经硅胶色谱法纯化(洗脱剂为乙酸乙酯在己烷中的70％至100％溶液+5％三乙胺)。获得化合物4，为白色泡沫，2.72g。实施例2：寡核苷酸的合成以dmt-on模式、以1μmοl规模在nittophaseunylinker200载体上通过标准亚磷酰胺化学合成了寡核苷酸粗品。4,5-二氰基咪唑(0.5m,在乙腈中)用作激活剂。使用苍耳烷氢化物(22mm,在吡啶/乙腈1:5中)用于硫氧化(thiooxidation)。使用oxidizer0.05m(safc,目录号l560250)用于氧化。使用具有苯甲酰基保护的a和c和异丁酰基保护的g的标准dna亚磷酰胺。使用具有苯甲酰基保护的a和5-甲基-c和二甲基甲脒保护的lna-g的lna亚磷酰胺。dna和lna单体的偶联次数分别为2×3和5分钟。对于单体4，偶联扩展至2×10分钟。在末端合成后，将载体混悬于60℃的0.5ml浓氢氧化铵中达16小时。将载体滤出，将溶液在真空下蒸发至干。在固相提取短柱上纯化dmt-on寡核苷酸粗品(watersoasishlb6cc200mg)。将短柱首先用乙腈和0.1m乙酸铵平衡。将寡核苷酸粗品溶于0.1m乙酸铵中进行应用，将短柱用乙腈在0.1m乙酸铵中的15％溶液洗脱。通过3％三氟乙酸除去dmt基团10分钟，向柱子中加入0.1m乙酸铵，然后加入水。将寡核苷酸用乙腈在水中的15％溶液洗脱，蒸发溶剂，得到纯化合物。通过uplc-ms分析确定纯度和鉴别。实施例3：具体的单-galnac核酸缀合物在实施例2的寡核苷酸合成中采用实施例1的dmt-单-galnac亚磷酰胺，合成了表1和2中所示的galnac核酸缀合物。在寡核苷酸的5'-端并入了一个或多个本发明的单-galnac部分的示例性寡核苷酸缀合物的通式以下式(vii)表示：已经合成了基于该通式(vii)的具体化合物，以表2中的化合物a、b、c和d表示。表2：5'缀合的核酸化合物化合物n5'-寡核苷酸-3'5'端的galnac部分ao5′-coaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′单价b15′-coaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′二价c25′-coaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′三价d35′-coaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′四价大写字母＝β-d-氧基lna，小写字母＝dna，o＝磷酸二酯,s＝硫代磷酸酯，mc＝5-甲基胞嘧啶。化合物a-d的寡核苷酸序列相应于seqidno：2。类似地，在寡核苷酸的3'-端并入一个或多个单-galnac部分的示例性寡核苷酸缀合物的通式以下式(viii)表示：已经合成了基于该通式(viii)的一个具体化合物，以表3中的化合物e表示。表3：3'缀合的核酸化合物化合物n5'-寡核苷酸-3'3'端的galnac部分e25′-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsaocoa-3′三价大写字母＝β-d-氧基lna，小写字母＝dna，s＝硫代磷酸酯，mc＝5-甲基胞嘧啶。化合物e的寡核苷酸序列相应于seqidno：3。为了比较目的，已经制备了如下的参比化合物f(裸寡核苷酸,即没有galnac)和g(惯例制备的三价galnac)，如表4所示。表4：参比化合物化合物5'-寡核苷酸-3'5'端的galnac部分f5′-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′无g5′-galnac2sgsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′三价(galnac2)大写字母＝β-d-氧基lna，小写字母＝dna，s＝硫代磷酸酯，mc＝5-甲基胞嘧啶。化合物f和g的寡核苷酸序列相应于seqidno：1。实施例4：由单-dmt-单-galnac-亚磷酰胺制备的galnac寡核苷酸缀合物的体内作用使6只黑色小鼠接受表1-3显示的寡核苷酸缀合物或对照化合物，测定了apobmrna敲减、寡核苷酸的组织含量和总胆固醇。给雌性c57bl6/j小鼠(每组5只，到达时约20g)皮下(sc)注射单剂量盐水或0.25mg/kg未缀合lna-反义寡核苷酸(化合物f)或0.25mg/kg或0.1mg/kggalnac缀合的lna反义寡核苷酸(本发明的化合物c或e或参比化合物g)。在给药前在第-6天和在给药后在第3和7天采集50μl血样。将动物在第10天处死，收集总血清以及肝脏和肾脏。通过qpcr分析了apobmrna敲减。简言之，采用magnapurerna分离和纯化系统(目录号03604721001和05467535001；roche)按照生产商的指导由匀化肝脏和肾脏分离了rna。采用taqmanfastuniversalpcrmastermix2x(appliedbiosystems目录号4364103)和taqman基因表达分析(mapob,mn01545150_m1和mgapdh#4352339e)按照如下生产商方案进行了rt-qpcr。表5显示了结果。表5：apobmrna表达，为盐水的％采用elisa测定了肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量(参见例如straarup等人,2010nucleicacidres,第38卷,第7100-7111页)，表6显示了结果。表6：肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量采用abxpentracholesterolcp(triolab,brondby,丹麦)、按照生产商的指导测定了血清中的总胆固醇。结果显示在图1中。采用abxpentraaltcp试剂(a11a01627triolab,brondby,丹麦)测定了alt(丙氨酸转氨酶)。结果显示在表7中。表7：第10天的血清alt水平，作为盐水l的％结论：当与未缀合(裸)apoblna寡核苷酸(化合物f)比较时，由与apoblna反义寡核苷酸缀合的dmt-单-galnac亚磷酰胺制备的新的galnac寡核苷酸缀合物(化合物c和e)显示出改善的肝脏apobmrna敲减。3'缀合的新的galnac寡核苷酸缀合物构建体(化合物e)显示出与galnac2簇缀合的lna寡核苷酸(化合物g)相当的apobmrna敲减，而5'缀合的新的galnac寡核苷酸缀合物构建体(化合物c)在高剂量浓度下显示出比galnac2缀合的lna寡核苷酸好的敲减(表5)。在较低剂量水平(0.1mg/kg)下，galnac缀合的lna寡核苷酸显示出相当的肝脏apobmrna敲减。显示总胆固醇降低的数据与mrna敲减的观察结果相关(图1a和图1b)。寡核苷酸的组织含量(表6)显示了galnac缀合的lna寡核苷酸(化合物c、e和g)与未缀合寡核苷酸(化合物f)相比如何增加肝脏中的吸收和降低肾脏中的吸收。而且，在高剂量时，5'缀合的新的galnac寡核苷酸缀合物构建体(化合物c)当与galnac2缀合的lna寡核苷酸(化合物g)比较时显示具有改善的肝脏/肾脏分布比例。所有受试化合物是安全的。受试构建体无一显示出升高的alt读数，如表7所示。实施例5：在单-galnac单元和寡核苷酸之间具有不同ps和po链接的galnac核酸缀合物在实施例2的寡核苷酸合成中采用实施例1的dmt-单-galnac亚磷酰胺，合成了表8所示的galnac核酸缀合物。所述分子与实施例3的分子的区别是，可生物裂解的ca磷酸二酯(po)连接的二核苷酸被除去，被单-galnac单元之间的磷酸二酯链接代替或补充有单-galnac单元之间的磷酸二酯链接而不是式(vii)中的硫代磷酸酯(ps)链接。表8：在核酸分子的5'端并入的三价和二价galnac化合物化合物nxy5'-寡核苷酸-3'seqidnoh2ss5′-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′1i2so5′-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′1j2oo5′-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′1k2oo5′-coaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′2l1oo5′-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′1大写字母＝β-d-氧基lna,小写字母＝dna,o＝磷酸二酯,s＝硫代磷酸酯,mc＝5-甲基胞嘧啶。在寡核苷酸的5'-端并入一个或多个本发明的单-galnac部分的示例性寡核苷酸缀合物的通式以下式(vii-xy)表示：除了表4中的参比化合物，生产了参比化合物m5'-galnac2ocoaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3'(seqidno：2)。该化合物与参比化合物g的区别是在与靶核酸互补的反义寡核苷酸(seqidno1)和galnac2部分之间具有磷酸二酯连接的ca二核苷酸的形式的可生物裂解的连接基。实施例6：改变单-galnac单元和反义寡核苷酸之间的ps和po链接使6只黑色小鼠接受在单-galnac单元和反义寡核苷酸化合物之间具有不同的硫代磷酸酯(ps)和磷酸二酯(po)链接的寡核苷酸缀合物。测定了apobmrna敲减、寡核苷酸的组织含量、总胆固醇和alt。给雌性c57bl6/j小鼠(每组5只，到达时约20g)静脉内(iv)注射单剂量盐水、0.22mg/kg、0.45mg/kg或0.89mg/kg的galnac缀合的lna反义寡核苷酸(本发明的化合物h、i或j)或裸参比化合物f。在给药前在第-6天采集50μl血样。在第3天将动物处死。收集总血清以及肝脏和肾脏。如实施例4所述测定了apobmrna敲减，结果显示在表9和10中。表9：肝脏中的apobmrna/mgapdh表达，为盐水的％表10：肾脏中的apobmrna表达，为盐水的％采用elisa测定了肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量(参见例如straarup等人,2010nucleicacidres第38卷,第7100-7111页)，结果显示在表11a和11b中。表11a：每克肝脏组织中的寡核苷酸含量(μg/g)表11b：每克肾脏组织中的寡核苷酸含量(μg/g)采用abxpentracholesterolcp(triolab,brondby,丹麦)、按照生产商的指导测定了血清中的总胆固醇。结果显示在表12中。表12：盐水的血清胆固醇百分比采用abxpentraaltcp试剂(a11a01627triolab,brondby,丹麦)测定了alt(丙氨酸转氨酶)。结果显示在表13中。表13：在第3天的血清alt水平(u/l)，为盐水的％结论：当与未缀合(裸)apoblna寡核苷酸(化合物f)比较时，用并入apoblna反义寡核苷酸中的dmt-单-galnac亚磷酰胺制备的所有galnac寡核苷酸缀合物(化合物h、i和j)显示出改善的肝脏:肾脏比例(表9至11)。为了获得改善的肝脏apob敲减和血清胆固醇降低，必须存在至少一个磷酸二酯链接(化合物i和j，表9和12)。概括而言，受试化合物就肝毒性而言是安全的。对于化合物j，一些动物在最高剂量下显示出增加的alt水平，这可能是由于夸大的药理学(表13)。实施例7：改变po链接的位置使6只黑色小鼠接受在单-galnac单元和反义寡核苷酸化合物之间的不同位置具有磷酸二酯(po)核苷链接的寡核苷酸缀合物(表14)。测定了apobmrna敲减、寡核苷酸的组织含量、总胆固醇和alt。表14：在核酸分子的5'端并入的三价和二价galnac化合物化合物nxy5'-寡核苷酸-3'seqidm---galnac2ocoaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′2j2oo5′-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′1k2oo5′-coaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′2c2so5′-coaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′2l1oo5′-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′1b1so5′-coaogsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3′2大写字母＝β-d-氧基lna，小写字母＝dna,o＝磷酸二酯,s＝硫代磷酸酯,mc＝5-甲基胞嘧啶。给雌性c57bl6/j小鼠(每组5只，到达时约20g)静脉内(iv)注射单剂量盐水或0.1mg/kggalnac缀合的lna反义寡核苷酸(本发明的化合物j、k、l、b或c或者参比化合物m)。在给药前在第-6天和在给药后在第3、7、10和14天采集50μl血样。将动物在第7或14天处死，收集总血清以及肝脏和肾脏。如实施例4所述测定了apobmrna敲减。结果显示在表15中。表15：在肝脏和肾脏中的apobmrna/mgapdh表达，为盐水的％采用elisa测定了肝脏和肾脏中的寡核苷酸含量(参见例如straarup等人,2010nucleicacidres第38卷,第7100-7111页)，结果显示在表16中。表16：每克肝脏或肾脏组织中的寡核苷酸含量(μg/g)采用abxpentracholesterolcp试剂(triolab,brondby,丹麦)、按照生产商的指导测定了血清中的总胆固醇。结果显示在图2中。采用abxpentraaltcp试剂(a11a01627triolab,brondby,丹麦)测定了alt(丙氨酸转氨酶)。结果显示在表17中。表17：在第3天的血清alt水平(u/l)，作为盐水的％结论：在用仅0.1mg/kg进行的单次处理后，所有的galnac缀合的化合物能够降低apobmrna水平以及胆固醇水平(表15和图2)。与具有galnac2部分的对照化合物相比，本发明的化合物的作用持续时间显示稍微更短(表15，第14天)。所有化合物均是有活性的，无论可裂解磷酸二酯(po)链接的位置在哪里。二价缀合反义寡核苷酸显示与三价缀合反义寡核苷酸的效力相同，尽管存在如下事实：对这些分子而言的肝脏中寡核苷酸的总含量低于三价缀合分子(表16)。这些分子无一显示出alt升高的迹象。因此，总体结论是，对galnac缀合反义寡核苷酸的总设计谱是非常宽的，允许根据目的进行最优化。实施例8：立体限定的单-galnac亚磷酰胺的制备如putnam和bashkin2006nucleosides,nucleotides,andnucleicacids,24(9)：1309-1323中所述，分别由l-和d-丝氨酸甲基酯制备了dmt-保护的丝氨醇5-l和5-d。化合物6-d如下制得：向1(1.23g,2.29mmol,用mecn和甲苯共蒸发)在dmf(12ml)中的溶液中加入5-d(900mg,2.29mmol)和hoat(311mg,2.29mmol)。将反应混合物冷却至0℃(冰浴)，历经20分钟分批加入edc.hcl(438mg,2.29mmol)。将反应混合物于室温搅拌26小时。加入水(1ml)，将混合物蒸发。向残余物中加入etoac(70ml)，将混合物用10％柠檬酸(30ml)、饱和nahco3(30ml)、盐水(30ml)萃取，经na2so4干燥，蒸发。将残余物经柱色谱法纯化(用etoh在dcm中的2％-8％溶液洗脱)，得到化合物6-d，为白色泡沫，1.77g。使用相同的操作制备了化合物6-l。化合物7-d如下制得：于0℃在25分钟内向6-d(1.65g,1.81mmol,用mecn、甲苯(3x)共蒸发)在dcm(20ml)中的溶液中同时加入2-氰基乙基四异丙基phosphorodiamidite(599mg,1.99mmol)在dcm(15ml)中的溶液和4,5-二氰基咪唑(dci,149mg,1.27mmol)在mecn(2.5ml)的溶液。将反应混合物于0℃搅拌30分钟，于室温搅拌3小时，用dcm(100ml)稀释，用饱和nahco3(50ml)、盐水(50ml)提取，经na2so4干燥，蒸发。残余物经柱色谱法纯化(用etoac在己烷中的60％-100％溶液+5％net3洗脱)，得到化合物7-d，为白色固体，1.23g。使用相同的操作制备了化合物7-l。实施例9：具有立体限定的单-galnac部分的galnac缀合物的研究行为本发明的单-galnac部分的并入给膦酸酯链接之间的主链中引入了立体中心，如下文箭头所示。在本实施例中，研究了化合物的立体限定版本是否影响效力和寡核苷酸含量。在小鼠原代肝细胞中进行了实验。采用实施例3的方法，采用立体限定的dmt-单-galnac亚磷酰胺7-d和7-l(参见实施例88)产生了表18的化合物。用于缀合的寡核苷酸是5'-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa(seqidno：1)。并入位于在寡核苷酸和第一个单-galnac部分之间以及在如下的立体限定的单-galnac单元之间具有磷酸二酯链接的寡核苷酸的5'端。化合物是化合物j的立体限定版本。寡核苷酸中的galnac单元各自的立体构象涉及在寡核苷酸合成中亚磷酰胺7-d(d)或7-l(l)的使用。立体构型d和l不表示寡核苷酸j-1至j-8或化合物5-d、5-l、6-d、6-l、7-d或7-l的任何测定的旋光性。表18：化合物j的立体限定版本化合物立体构型j-15′-dddj-25′-dldj-35′-ddlj-45′-dllj-55′-lddj-65′-ldlj-75′-lldj-85′-lll除了立体限定的化合物，本研究还包括化合物f(未缀合寡核苷酸)和化合物g(galnac2缀合的寡核苷酸)。从c57bl/6j雌性小鼠分离了原代小鼠肝细胞。将小鼠处死，以7ml/分钟的流速经由大静脉给肝脏灌注含有15mmhepes和0.38mmegta的hank's平衡盐溶液5分钟，然后灌注胶原酶溶液(hank's平衡盐溶液，含有0.17mg/ml2型胶原酶(worthington4176)、0.03％bsa、3.2mmcacl2和1.6g/lnahco3)达12分钟。在灌注后，移出肝脏，将肝脏囊打开，将肝脏混悬液采用williame介质经70μm细胞滤过器过滤。将细胞混悬液于50xg离心3分钟。使活肝细胞通过用45％percoll(sigma目录号p4937)于50xg梯度离心10分钟而进一步富集。将沉淀物洗涤，重新混悬于25mlwilliame介质(sigma目录号w1878，补充有1xpen/strep,2mml-谷氨酰胺和10％fbs(atcc#30-2030))中，以25.000个细胞/孔接种在涂布胶原的96孔板中。3小时后，交换介质，采用9至000.4μμ的3倍稀释加入寡核苷酸。使用了两个不同的孵育方案，一个是细胞与寡核苷酸一起孵育4小时、然后更换介质和继续孵育总共72小时。在第二个方案中，细胞与寡核苷酸一起孵育72小时。采用purelinkpro96rna纯化试剂盒(ambion)、按照生产商的指导从细胞提取了总mrna。对于基因表达分析，采用qscripttmxltone-steprt-qpcrlow(quantabioscience)以与taqman基因表达分析(mapob，mm01545150_m1和mgapdh#4352339e,rmosceintific)的双重设置、按照生产商的方案进行了qpcr。图3显示了相对于gapdh的apobmrna表达水平，为对照的百分比(经pbs处置的细胞)，表19显示了ic50值。表19：ic50值,μμ,n＝2化合物j-1j-2j-3j-4j-4j-6j-7j-8gf4h脉冲/72h0.1040.0970.1760.1740.1170.1580.1390.1230.0532.62072h0.0040.0040.0060.0170.0080.0120.0060.0060.0060.331采用elisa进行了寡核苷酸含量分析(参见例如straarup等人,2010nucleicacidres第38卷第7100-7111)，结果显示在下表20和21中。表20：4小时寡核苷酸处理(脉冲)和72小时总孵育处理后细胞培养物中的寡核苷酸含量(pmol/μg蛋白质),n＝2n.d.＝未检测化合物f(裸寡核苷酸)还以27μμ剂量进行了分析，此时寡核苷酸含量为1.4+/-0.2pmol/μg蛋白质。表21：在72小时寡核苷酸处理后细胞培养物中的寡核苷酸含量(pmol/μg蛋白质),n＝2化合物f(裸寡核苷酸)还以27μμ剂量进行了分析，此时寡核苷酸含量为34.2+/-0.7pmol/μg蛋白质。结论：立体限定的galnac缀合物的行为就靶敲减和寡核苷酸含量而言是非常相似的。当与化合物g(现有技术的galnac构建体-galnac2)比较时，立体限定的galnac化合物的比活性显示高一些，因为细胞中较低的寡核苷酸含量获得了等同的apob敲减。当比较两种不同的孵育方案时，可以观察到，在仅4小时寡核苷酸孵育后可以获得非常有效的靶敲减，而对于裸寡核苷酸而言吸收更慢，因此需要多于4小时以使足够的寡核苷酸进入细胞以获得靶敲减。与应用4小时寡核苷酸孵育相比，用72小时寡核苷酸孵育时galnac缀合物在低于0.33μμ的剂量获得了较高的apob敲减。当前第1页12