用于工程化信号产生的竞争性探针的制作方法

本申请要求于2016年4月1日提交的美国临时专利申请号62/317,151的权益，该临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。发明背景实时pcr是通过记录由嵌入型染料(如sybrgreen)或靶特异性报告探针在每个循环产生的荧光来监测pcr反应的过程。这通常在实时pcr仪上进行，该pcr仪执行样品的热循环以完成pcr循环，并且在每个循环中的特定点通过一系列激发/发射滤波器组测量每个通道中的样品的荧光。在全基因组测序和高通量分析的时代，需要一次检测多种qpcr靶标的方法。当前qpcr机器的限制是可用于靶标检测的通道数。现代仪器具有2至6个通道，这意味着在每个实验中只能检测到2至6种报告分子。当代多重化技术提供了2至4种不同的荧光报告分子，并且因此在单个反应中可以检测到2至4种靶标。遗憾的是，不同报告分子重叠的荧光信号阻止了将2至4种靶标中的每一种准确地与其他靶标相区分。因此，仍然需要一种可靠且精确的方法用于在多重qpcr反应期间区分多种报告信号。技术实现要素：实时聚合酶链反应或定量pcr(qpcr)是一种常见的分子生物学技术，其使用荧光报告分子监测反应中靶核酸的指数扩增过程。传统上，所述过程限于在qpcr仪上的每个荧光发射滤波器(颜色通道)仅能区分一种靶标的存在。加州理工学院纳米加工实验室最近取得的进展允许在实时pcr扩增曲线特征(例如振幅和曲线形状)方面使用数学算法来检测每个发射滤波器的多种分析物(2014年9月16日公开的美国专利8,838,394和2015年2月26日公开的美国专利申请公开号us2015-0057178，两者均以其全文并入本文)。对相同颜色通道中的靶标进行“编码”以显示这些扩增曲线特征。编码包括设定颜色通道中每种靶标的强度水平。本文公开了不依赖每种靶标的总探针浓度来调节通过qpcr探针产生的有效相对荧光强度的方法。这是多分析物编码技术的重要改进。本文公开了用于唯一且明确地检测单个颜色检测通道中的多种靶标的方法和组合物。所公开方法的一个方面是通过对每种靶标的任何给定颜色的信号强度(亮度)的比例-度量编码来区分多种靶标的能力以及针对规避简并性的数学策略。当在qpcr仪上的每个可用颜色通道内使用时，所公开的方法显著增加了可检询的靶标测量的数目。本文提供了鉴定第一靶核酸的方法，该方法包括：提供包含所述第一靶核酸的样品；提供与所述第一靶核酸具有互补性的第一组成对寡核苷酸，所述第一组成对寡核苷酸包含第一比例的(a)第一竞争性寡核苷酸与(b)包含第一信号标签的第一信号寡核苷酸，其中所述第一竞争性寡核苷酸与所述第一信号寡核苷酸竞争结合所述第一靶核酸；用聚合酶链反应扩增所述第一靶核酸，从而降解所述第一信号寡核苷酸并允许第一信号产生；产生所述第一信号；测量所述第一信号的强度；以及将所述第一信号的强度与所述第一比例相关联，从而鉴定所述第一靶核酸。在一些方面，所述样品包含第二靶核酸。在一些方面，所述方法进一步包括通过以下方法鉴定所述第二靶核酸：提供与所述第二靶核酸具有互补性的第二组成对寡核苷酸，所述第二组成对寡核苷酸包含第二比例的(a)第二竞争性寡核苷酸与(b)包含第二信号标签的第二信号寡核苷酸，其中所述第二竞争性寡核苷酸与所述第二信号寡核苷酸竞争结合所述第二靶核酸；用聚合酶链反应扩增第二靶序列，从而降解所述第二信号寡核苷酸并允许第二信号产生；产生所述第二信号；测量所述第二信号的强度；以及将所述第二信号的强度与所述第二比例相关联，从而鉴定所述第二靶核酸。在一些方面，所述第一信号寡核苷酸和所述第二信号寡核苷酸包含相同的信号标签。在一些方面，所述第一靶核酸和所述第二靶核酸由在相同的聚合酶链反应中产生的不同的信号强度来鉴定。在一些方面，所述第一信号强度与所述第二信号强度不同。在一些方面，所述成对寡核苷酸包含qpcr探针。在一些方面，所述信号寡核苷酸包含信号标签和信号猝灭标签。在一些方面，所述信号标签包含荧光团。在一些方面，所述信号猝灭标签阻断与所述信号标签相对应的信号的产生，直到所述信号猝灭标签在聚合酶链反应期间通过寡核苷酸降解与所述信号标签分离，从而允许所述信号产生。在一些方面，产生所述信号包括激发所述信号标签。在一些方面，激发包括在所述信号标签处引导光照、电磁辐射和从能源发射的能量中的至少一种。在一些方面，所述竞争性寡核苷酸不包含信号标签。在一些方面，所述竞争性寡核苷酸包含至少一个修饰末端。在一些方面，所述修饰末端阻止在扩增期间的酶促延伸。在一些方面，所述修饰末端包含缺少羟基的3’端。在一些方面，所述修饰末端包含缺少磷酸基团的5’端。在一些方面，所述修饰末端包含5’加帽端。在一些方面，所述修饰末端包含3’加帽端。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:1。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:2。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:3。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:4。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:5。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:6。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:7。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:8。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:9。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:10。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:16。在一些方面，信号寡核苷酸与竞争性寡核苷酸的比例或竞争性寡核苷酸与信号寡核苷酸的比例为约1:20。在一些方面，所述成对寡核苷酸仅包含信号寡核苷酸或仅包含竞争性寡核苷酸。在一些方面，所述第一组成对寡核苷酸的总浓度与所述第二组成对寡核苷酸的总浓度相同。在一些方面，所述方法进一步包括：使用至多30组成对寡核苷酸鉴定至多30种靶核酸序列，其中每组成对寡核苷酸与所述至多30种靶核酸序列中的一种具有互补性，其中所述至多30组成对寡核苷酸中的每组均包含独特比例的(a)竞争性寡核苷酸与(b)包含信号标签的信号寡核苷酸，其中每组内的竞争性寡核苷酸与同一组内的信号寡核苷酸竞争结合相应的靶核酸序列；用聚合酶链反应扩增所述至多30种靶核酸序列，从而降解所述信号寡核苷酸并允许至多30个信号产生；产生至多30个信号；测量所述至多30个信号的强度；以及将所述至多30个信号的强度与所述至多30个比例相关联，从而鉴定所述至多30种靶核酸序列。在一些方面，所述至多30组成对寡核苷酸中每一组内的信号寡核苷酸的信号标签是相同的。在一些方面，所述至多30种靶核酸序列由在相同的聚合酶链反应中产生的信号强度来鉴定。在一些方面，所述至多30个比例中的每一个比例与所述至多30个比例中的所有其他比例均不同。在一些方面，所述至多30个信号强度中的每一个信号强度与所述至多30个信号强度中的所有其他信号强度均不同。在一些方面，所述聚合酶链反应通过使用具有5’至3’外切核酸酶活性的核酸聚合酶、外切聚合酶(exo-polymerase)或分子信标进行。在一些方面，在单个荧光通道中测量至多五个信号。在一些方面，至多五组成对寡核苷酸中的每组的总浓度相同。在一些方面，所述反应中的分子总数保持不变。本文提供了组合物，其包含与第一靶核酸具有互补性的第一组成对寡核苷酸，所述第一组成对寡核苷酸包含第一比例的(a)竞争性寡核苷酸与(b)包含信号标签的信号寡核苷酸，其中所述竞争性寡核苷酸被配置为在用聚合酶链反应扩增所述第一靶核酸期间与所述信号寡核苷酸竞争结合所述第一靶核酸，其中所述信号寡核苷酸被适配为当在聚合酶链反应期间被核酸聚合酶降解并被能源激发时产生具有第一强度的第一信号，并且其中所述第一强度与所述第一比例相关联。本文提供了鉴定第一靶分子的方法，该方法包括：提供包含所述第一靶分子的样品；提供结合所述第一靶分子的第一组成对捕获分子，所述第一组成对捕获分子包含第一比例的(a)第一竞争性捕获分子与(b)包含信号标签的第一信号捕获分子，其中所述竞争性捕获分子与所述信号捕获分子竞争结合所述第一靶分子；产生所述第一信号；测量所述第一信号的强度；以及将所述第一信号的强度与所述第一比例相关联，从而鉴定所述第一靶分子。在一些方面，所述样品包含第二靶分子。在一些方面，所述方法进一步包括通过以下方法鉴定所述第二靶分子：提供与所述第二靶分子结合的第二组成对捕获分子，所述第二组成对捕获分子包含第二比例的(a)第二竞争性捕获分子与(b)包含所述信号标签的第二信号捕获分子，其中所述第二竞争性捕获分子与所述第二信号捕获分子竞争结合所述第二靶分子；产生所述第二信号；测量所述第二信号的强度；以及将所述第二信号的强度与所述第二比例相关联，从而鉴定所述第二靶分子。在一些方面，所述第一信号捕获分子和所述第二信号捕获分子包含相同的信号标签。在一些方面，第一靶标捕获分子和第二靶标捕获分子由产生的不同的信号强度来鉴定。在一些方面，所述第一信号强度与所述第二信号强度不同。在一些方面，所述信号标签包含荧光团。在一些方面，产生所述信号包括激发所述信号标签。在一些方面，激发包括在所述信号标签处引导光照、电磁辐射和从能源发射的能量中的至少一种。在一些方面，所述竞争性捕获分子不包含信号标签。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:1。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:2。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:3。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:4。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:5。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:6。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:7。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:8。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:9。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:10。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:16。在一些方面，信号捕获分子与竞争性捕获分子的比例或竞争性捕获分子与信号捕获分子的比例为约1:20。在一些方面，所述第一成对捕获分子仅包含信号捕获分子或仅包含竞争性捕获分子。在一些方面，所述方法进一步包括：使用至多100组成对捕获分子鉴定至多100种靶分子，其中每组成对捕获分子与所述至多100种靶分子中的一种结合，其中所述至多100组成对捕获分子中的每组均包含独特比例的(a)竞争性捕获分子与(b)包含信号标签的信号捕获分子，其中每组内的竞争性捕获分子与同一组内的信号捕获分子竞争结合相应的靶分子；产生至多100个信号；测量所述至多100个信号的强度；以及将所述至多100个信号的强度与至多100个比例相关联，从而鉴定所述至多100种靶分子。在一些方面，所述至多100组捕获分子中每组内的信号捕获分子的信号标签是相同的。在一些方面，所述至多100种靶分子由同时产生的信号强度来鉴定。在一些方面，所述至多100个比例中的每一个比例与所述至多100个比例中的所有其他比例均不同。在一些方面，所述至多100个信号强度中的每一个信号强度与所述至多100个信号强度中的所有其他信号强度均不同。在一些方面，在单个荧光通道中测量所述至多100个信号。在一些方面，所述靶分子固定至表面。在一些方面，所述捕获分子固定至表面。在一些方面，所述靶分子包含蛋白质或其功能片段。在一些方面，所述靶分子包含抗原。在一些方面，所述靶分子包含适体。在一些方面，所述靶分子包含核酸。在一些方面，所述捕获分子包含蛋白质、蛋白质或其功能片段。在一些方面，所述捕获分子包含抗体、蛋白质或其功能片段。在一些方面，所述捕获分子包含适体。在一些方面，所述反应中的分子总数保持不变。本文提供了组合物，其包含与第一靶分子具有互补性的第一组成对捕获分子，所述第一组成对捕获分子包含第一比例的(a)竞争性捕获分子与(b)包含信号标签的信号捕获分子，其中所述竞争性捕获分子被配置为与所述信号捕获分子竞争结合所述靶分子，其中所述信号捕获分子被适配为当被能源激发时产生具有第一强度的第一信号，并且其中所述第一强度与所述第一比例相关联。在一些方面，所述靶分子包含蛋白质或其功能片段。在一些方面，所述靶分子包含抗原。在一些方面，所述靶分子包含适体。在一些方面，所述靶分子包含核酸。在一些方面，所述捕获分子包含蛋白质或其功能片段。在一些方面，所述捕获分子包含抗体或其功能片段。在一些方面，所述捕获分子包含适体。本文提供了改变靶核酸的扩增水平的方法，该方法包括：提供包含所述靶核酸的样品；提供与所述靶核酸具有互补性的成对寡核苷酸组，所述成对寡核苷酸组包含一定比例的(a)竞争性寡核苷酸与(b)功能性寡核苷酸，其中所述竞争性寡核苷酸与所述功能性寡核苷酸竞争结合所述靶核酸并且不可通过核酸聚合酶延伸，其中所述功能性寡核苷酸可通过核酸聚合酶延伸，作为通过聚合酶链反应(pcr)扩增所述靶核酸的引物；以及用pcr扩增所述靶核酸。在一些方面，所述竞争性寡核苷酸包含至少一个修饰末端。在一些方面，所述修饰末端阻止在扩增期间的酶促延伸。在一些方面，所述修饰末端包含缺少羟基的3’端。在一些方面，所述修饰末端包含缺少磷酸基团的5’端。在一些方面，所述修饰末端包含5’加帽端。在一些方面，所述修饰末端包含3’加帽端。在一些方面，所述反应中的分子总数保持不变。本文提供了组合物，其包含与靶核酸具有互补性的成对寡核苷酸组，所述成对寡核苷酸组包含一定比例的(a)竞争性寡核苷酸与(b)功能性寡核苷酸，其中所述竞争性寡核苷酸被配置为在用聚合酶链反应扩增所述第一靶核酸期间与所述功能性寡核苷酸竞争结合核酸靶标，并且不可通过核酸聚合酶延伸。附图说明图1示出了具有不同比例的竞争性探针与荧光探针的三个示例性探针组。图2示出了在四种不同编码水平下进行的示例性piv3基准分析滴定。图3a-3b示出了具有五种不同比例水平的标记和未标记竞争性探针的示例性rt-qpcr实验。图4a-4b示出了具有三种不同比例水平的标记和未标记竞争性探针的示例性rt-qpcr实验。具体实施方式不受理论束缚，聚合酶链反应是用dna聚合酶和引物在反应混合物中指数扩增特定靶dna的方法。引物是短的单链dna寡核苷酸，其与靶序列的正链和负链的3’序列互补。反应混合物在重复的加热和冷却步骤中循环。加热循环使双链dna靶标变性或分解成单链模板。在冷却循环中，引物与模板上的互补序列结合。在模板被引发后，dna聚合酶产生了原始模板的拷贝。重复循环在每个循环中以指数方式将靶标扩增2倍，导致靶序列在30个循环中增加大约10亿倍(saiki等人，1988)。实时pcr是通过记录由嵌入型染料(如sybrgreen)或靶特异性报告探针在每个循环产生的荧光来监测pcr反应的过程。这通常在实时pcr仪上进行，该pcr仪执行样品的热循环以完成pcr循环，并且在每个循环中的特定点通过一系列激发/发射滤波器组测量每个通道中的样品的荧光。通常，靶特异性报告探针是与扩增靶标的一条链互补的短寡核苷酸。所述探针缺少3’羟基，并且因此不可通过dna聚合酶延伸。taqman(thermofisherscientific)化学法是常见的用于多重实时pcr的报告探针方法(holland等人，1991)。taqman寡核苷酸探针用荧光团和猝灭标签共价修饰。在这种结构中，荧光团产生的荧光被猝灭，并且无法被实时pcr仪检测到。当感兴趣的靶标存在时，探针寡核苷酸碱基与扩增靶标配对。当结合时，其被taq聚合酶的5’->3’外切核酸酶活性消化，从而将荧光团与猝灭剂物理分离并释放信号以供实时pcr仪检测。其他方法，例如分子信标探针，也用于实时pcr并且适用于这种竞争性探针技术。对于某些qpcr、多重qpcr和编码qpcr方法，需要以可预测的方式调节信号水平。这通常通过增加或减少添加到反应中的荧光报告分子的数目来完成。虽然这确实将信号水平调节到一级，但它也有改变反应混合物的化学行为的风险，因为参与反应物的总数也发生了变化。通常，这会不利地影响反应混合物中其他组分的性能。特别地，这是多重qpcr的关键的故障模式。本文公开了用于在单个编码或多重qpcr反应中用相同的荧光团检测多种靶序列的方法和组合物。本文公开了用于在不调节混合物中的反应物浓度的情况下调节荧光强度的方法和组合物。在一些实施方案中，发光和非发光化学报告分子的组合用于独立地调节qpcr反应的荧光强度而不改变qpcr反应混合物的化学相互作用。在一些实施方案中，这通过产生非荧光寡核苷酸探针和taqman报告探针的混合物(用于qpcr反应中检询的每种靶标)来实现。本文所公开的竞争性探针(也称为变暗探针或非荧光探针)是与靶探针类似的寡核苷酸(除了共价连接的荧光团和猝灭剂以外)。在一些实施方案中，竞争性探针不具有荧光团和猝灭剂。在一些实施方案中，竞争性探针具有加帽的5’和3’端以阻止酶促延伸。在一些实施方案中，竞争性探针具有缺少磷酸基团的5’端。在一些实施方案中，竞争性探针具有缺少羟基的3’端。通常，竞争性探针在与扩增的靶序列结合时表现与特异性靶探针相同，并且在taqman式分析的情况下，结合的探针被taq聚合酶的5’->3’外切核酸酶活性消化。然而，因为竞争性探针不含荧光团，所以没有信号产生。本文公开了使用所公开的非荧光竞争性结合探针通过所述竞争性结合探针的比例滴定来调节单个基因的信号强度的方法和组合物。在一些实例中，这些方法使用taqman探针进行。图1图示了具有不同比例的竞争性探针和信号探针的三种不同探针混合物。在一些实施方案中，强度的滴定允许控制强度水平比例-度量编码以及在不影响强度水平编码的情况下调节给定靶标的总探针浓度的能力。在一些实施方案中，在pcr反应的探针退火部分期间，竞争性探针将以与在反应中的竞争性探针与标记和未标记的总探针的比例成比例的速率，结合扩增的靶标，从而产生与标记探针与总探针的比例成比例的荧光信号。在一些实施方案中，竞争性探针是不可延伸的探针。例如，竞争性探针不能使用多种3’修饰(包括但不限于磷酸化或添加猝灭分子)通过taq聚合酶来启动dna合成。在一些实施方案中，使用不同的纯化方法和探针序列来产生显著不同的荧光强度。在一些实例中，纯化质量的差异导致或多或少的未标记的产物(类似于竞争性探针)，从而减少了制剂的荧光。在一些实施方案中，探针的寡核苷酸序列组成影响荧光，特别是邻近荧光团的鸟嘌呤碱基，其可充当降低荧光强度的猝灭剂。在一些实施方案中，竞争性探针用于调节信号强度以使制剂之间保持一致，以获得更一致的批次性能。在一些实施方案中，如果染料的强度使特定实时pcr仪上的检测器过载，则使用竞争性探针。在一些实施方案中，竞争性探针用于改造pcr曲线的光学特征而不改变其化学特征。在一些实例中，这是因为竞争性探针与其他序列以及它们的taqman探针等同物竞争性相互作用而实现的。在这些实例中，这种竞争性相互作用允许在不改变pcr本身的化学性能的情况下微调pcr反应的信噪比的独特能力。本文公开了通过将多重反应的效率标准化使用竞争性引物进行多重定量的方法和组合物。在一些实施方案中，本文所公开的方法用于驱动pcr反应产生一条链比另一条链更多，这可导致pcr反应更早的平台期。在一些实施方案中，竞争性探针用于在pcr反应中替代一部分启动寡核苷酸。在这些实例中的许多实例中，通过3’磷酸化或其他方法使竞争性探针不可延伸。在这些情况下，竞争性引物将与可延伸引物竞争，导致模板链的可定量部分在pcr的延伸阶段不能复制。这些实施方案的一个优点是它允许调节一条或两条复制链的扩增效率。在一些实施方案中，本文所公开的竞争性探针用于taqman式pcr。在一些实施方案中，本文所公开的竞争性探针用于传统pcr。本文公开了通过检测相应信号(例如荧光信号)来鉴定靶标的方法。在一些实例中，可以在单个实验中检测多种靶标，其中来自每种靶标的相应信号是相同的。例如，可以鉴定多种靶标，其中每种靶标具有相应的荧光信号，其中在待检测的各种不同靶标中，信号产生分子(例如荧光团)是相同的。使用本文公开的方法，可以通过提供靶标结合分子组，例如探针，使用相同的荧光团检测多种靶标，其中每组分子包含独特比例的竞争性探针与信号探针。信号探针可包含信号产生分子，例如荧光团。竞争性探针通常不含有信号产生分子。在这些情况下，每组探针内的探针总数是相同的，其中竞争性探针与信号探针的比例对于每种待检测的靶标是独特的。这允许对每种靶标使用相同水平或浓度的总探针，同时仍然能够区分每种单独的靶标。本文公开了用相同荧光团检测多种靶序列的方法和组合物。本文还公开了使用荧光团暴露的寡核苷酸探针与非荧光团暴露的寡核苷酸探针组合在单个反应中检测多个靶特异性报告信号的方法和组合物。在一些实例中，使用寡核苷酸探针组检测每种靶序列。每个寡核苷酸组可包含两个寡核苷酸探针群，每个寡核苷酸探针群包含相同的核酸序列。在这些实例中，一个寡核苷酸群包含报告荧光团，而第二个寡核苷酸群不包含荧光团。在一些实施方案中，在单个反应中使用至多五组寡核苷酸探针检测至多五种靶序列。在这些实例的许多实例中，所述至多五组探针的荧光团是相同的。在一些方面，在每组寡核苷酸探针内，荧光团暴露的寡核苷酸与非荧光团暴露的寡核苷酸的比例被设定为预定比例。在一些实施方案中，每组寡核苷酸内的比例对于至多五组寡核苷酸中的每一组来说是不同的。在这些实例中，所述不同比例允许在单个反应中将至多五种靶标中每一种的报告信号彼此区分开。在这些实例中，每组探针中探针的总浓度是相同的，而探针组内的两个探针群的比例在每个探针组之间是不同的。荧光团暴露的探针可以是信号探针。非荧光团暴露的探针可以是竞争性探针。在一些实施方案中，在单个反应中使用至多100组寡核苷酸探针检测至多100种靶序列。例如，在单个反应中，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100组寡核苷酸探针检测1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100种靶序列。在这些实例的许多实例中，所述至多100组探针的荧光团是相同的。在一些方面，在每组寡核苷酸探针内，荧光团暴露的寡核苷酸与非荧光团暴露的寡核苷酸的比例被设定为预定比例。在一些实施方案中，每组寡核苷酸内的比例对于至多100组寡核苷酸中的每一组来说是不同的。在这些实例中，所述不同比例允许在单个反应中将至多100种靶标中每一种的报告信号彼此区分开。在这些实例中，每组探针中探针的总浓度是相同的，而探针组内的两个探针群的比例在每个探针组之间是不同的。荧光团暴露的探针可以是信号探针。非荧光团暴露的探针可以是竞争性探针。在一些实施方案中，在单个反应中使用大于100种寡核苷酸探针检测大于100种靶序列。在一些实施方案中，在单个反应中使用大于100种寡核苷酸探针检测至多100种靶序列。在一些实施方案中，在单个反应中使用至多100种寡核苷酸探针检测大于100种靶序列。本文公开了将未标记的类似物用于相应的标记的实体的方法和组合物，其在任何系统中在特定分析物存在时产生用于检测的信号。在一些实例中，所述系统是elisa(酶联免疫吸附测定)，在这种情况下，所述标记的实体是标记的抗体。在这些情况下，所述未标记的类似物是未标记的抗体。在一些实施方案中，如前面所讨论的，靶标组内标记抗体与未标记抗体的比例是预先确定的。在一些实施方案中，可以在单个elisa反应中使用多个靶抗体组检测多种靶标。在这些实例的许多实例中，每组靶抗体具有不同比例的标记抗体与未标记抗体，这允许独立的靶报告信号与其他信号区分开。在这些实例中，每组抗体中抗体的总浓度是相同的，而抗体组内的两个抗体群的比例在每个抗体组之间是不同的。荧光团暴露的抗体可以是信号抗体。非荧光团暴露的抗体可以是竞争性抗体。在一些实施方案中，尽管在不同组之间功能性实体与竞争性实体的比例发生变化，但反应中分子的总数保持不变。在一些方面，分子的总数是指蛋白质、核酸、溶液体积、发生反应所需的其他实体。在一些方面，所述反应是qpcr、elisa、pcr或测序反应。在一些方面，所述实体是寡核苷酸、蛋白质、抗体、qpcr探针、适体、核酸或其他合适的分子。在一些方面，功能性包括执行其预期目的，例如pcr延伸或发射荧光信号。在一些方面，竞争性包括与靶分子结合，无论是蛋白质、核酸或另一分子，但不能执行所述功能性分子的功能，例如在pcr期间延伸或在被激发时发射荧光信号。抗体标记elisa是使用荧光标记的抗体标记物鉴定蛋白质的标准分析技术。不受理论束缚，在夹心elisa中，使用两种抗体，即第一抗体和荧光标记的第二抗体来结合并鉴定感兴趣的蛋白(抗原)。通常，所述两种抗体结合所述蛋白质的不同区域。第一抗体粘附于表面或反应容器，暴露其结合域以允许蛋白质捕获。当引入样品时，感兴趣的蛋白将扩散通过房室并有利地结合所述第一抗体。在洗涤程序后，引入所述荧光标记的第二抗体。该荧光标记的第二抗体与固定的抗原的不同表位结合。在洗涤过量的、未结合的第二抗体后，对样品进行检询。所述荧光信号的存在和强度与已捕获的抗原的浓度相关联。然而，所述抗体的结合动力学不易于工程化。与核酸不同，抗体不能进行无机组装，并且甚至抗体结构的简单改变也会导致结合效率的显著变化。这严重限制了elisa的抗体多重化效率。本文公开了使用竞争性、非报告探针用于使用抗体进行荧光报告的方法和组合物。在一些实施方案中，荧光报告是在elisa测定的情况下。在一些实施方案中，第一抗体粘附于表面或反应容器，并且感兴趣的蛋白有利地结合第一抗体。在这些情况下，在洗涤程序后，引入荧光标记的第二抗体并将其与固定的抗原的不同表位结合。在这些情况下，在洗涤程序后，对样品进行检询并且荧光信号的存在和强度与已捕获的抗原的浓度相关联。在一些实施方案中，引入第二抗体组并将其与固定的抗原结合。在一些方面，通过与第一抗体结合来固定抗原，其转而粘附于表面或反应容器。在一些方面，第二抗体组包含标记群和未标记群。在一些方面，除了标记物的存在或不存在之外，在标记和未标记群中的第二抗体是相同的。在一些方面，第二抗体相同意味着它们包含相同的蛋白质序列。在一些方面，相同意味着它们结合相同的表位。在一些方面，相同意味着它们结合相同的抗原。在一些实施方案中，标记物是荧光标记物。在一些实施方案中，将第二抗体组内的标记与未标记的第二抗体的比例设定为预定比例。在一些方面，标记的与未标记的第二抗体的比例与信号强度相关联。在一些方面，通过测量信号强度，可以将信号强度与标记的与未标记的第二抗体的比例相关联。在一些实施方案中，用第二抗体组内的标记与未标记的第二抗体的比例设定elisa免疫测定的信号水平。在一些方面，设定比例而不改变所捕获的抗原的灵敏度或数目。在一些实施方案中，第一抗体决定捕获灵敏度和灵敏度。在一些实施方案中，可以使用本文所公开的方法在单个elisa反应中检测多个不同的抗原。在一些方面，在elisa中使用能够结合多种抗原中的每一种的一组第二抗体。在许多情况下，使用相同的标记物标记多组第二抗体中每一组内的标记的第二抗体。在一些方面，标记的与未标记的第二抗体的比例在多组第二抗体中的每一组内均是独特的。在许多实例中，独特的比例对应于独特的信号强度。在这些和其他实例中，测量独特的信号强度并将其与预定比例相关联，从而鉴定产生信号强度的第二抗体组。以这种方式，可以在elisa测定中鉴定特异性抗原，这是基于由用于结合特异性抗原的独特的第二抗体组内的标记与未标记第二抗体的独特比例所产生的独特信号。在许多实例中，本文公开的这些方法允许鉴定多种抗原，尽管对于多种抗原中的每一种在标记的第二抗体上使用相同的标记物。这通过对于多种抗原中的每一种使用独特比例的标记的与未标记的第二抗体来实现。独特的比例与独特的信号强度相关联，从而允许鉴定多种抗原中的每一种。测序偏差虽然基因组测序有望成为未来主要的临床工具，但它特别容易受到样品制备偏差的影响。不受理论束缚，在对核酸测序之前，使用高度多重化广谱结合pcr引物富集核酸。然而，这种富集在扩增靶标中产生很大偏差。这种偏差导致无效的测序。对于诸如癌症组织基因分型和肿瘤异质性评价的应用，这使得该技术不适用于许多临床使用情况。本文公开了使用竞争性寡核苷酸来减少测序偏差的方法和组合物。在一些实施方案中，通过在扩增期间使用寡核苷酸引物组来减少测序偏差。在一些方面，扩增包括聚合酶链反应。在一些实施方案中，引物组包含功能性引物群和竞争性引物群。在一些方面，功能性引物包含能够与互补序列退火并在聚合酶链反应期间延伸的引物。在一些方面，竞争性引物包含与其相应的功能性引物在序列上相同，能够结合相同的互补序列，但在聚合酶链反应期间不能延伸的那些。在一些实施方案中，调整功能性和竞争性引物的比例以改变测序偏差水平而不改变引物组本身的化学相互作用。在一些实施方案中，减少或增加功能性引物与竞争性引物的比例，增加或减少了待测序的dna的富集。在一些方面，进行该比例调整而不影响基因组其他部分的富集。在一些方面，该比例调整允许精密控制pcr偏差。在一些方面，该比例调整允许补偿当前用于测序准备的pcr方法的缺陷。在一些实施方案中，增加功能性引物与竞争性引物的比例。在一些方面，增加功能性引物与竞争性引物的比例以增加靶序列的测序偏差。在一些方面，改变测序偏差包括增加靶序列的扩增水平。在一些方面，增加靶序列的扩增水平导致待测序的最终样品中靶序列的水平增加。在一些实施方案中，降低功能性引物与竞争性引物的比例。在一些方面，降低功能性引物与竞争性引物的比例以降低靶序列的测序偏差。在一些方面，改变测序偏差包括降低靶序列的扩增水平。在一些方面，降低靶序列的扩增水平导致待测序的最终样品中靶序列的水平降低。在一些实施方案中，竞争性引物不能延伸。在一些方面，这些引物由于竞争性的、加帽的或以其他方式修饰的末端(例如本文描述和公开的那些末端)而不能延伸。实施例实施例1与采用相似量的荧光探针的反应相比，采用等摩尔比的竞争性探针与荧光探针的实时pcr反应在每次读取时将产生大约一半的荧光信号。图2显示了用4种不同比例的荧光探针与总探针进行的相同的taqman测定。用黄色(顶部实线)表示的100％荧光探针反应的振幅为用灰色(长虚线)表示的具有1份荧光探针和7份竞争性探针的测定的大约8倍。反应组成参见表1，pcr循环参数参见表2。表1：图2反应的反应组分表2：在abiviia7上进行的图2反应的温度时间表实施例2进行实时pcr反应以在单个反应内检测三种感兴趣的核酸序列。除了rt-pcr反应所需的其他组分外，还加入了三组探针。各组探针中的一组对应于并且能够唯一地结合三种感兴趣的转录物中的一种。组1包含25％的未标记的竞争性探针和75％的标记的探针，其用绿色荧光团和猝灭剂分子进行标记。除了荧光标记物和猝灭剂分子的存在之外，组1中的探针是相同的。组2包含50％的未标记的竞争性探针和50％的标记的探针，其用绿色荧光团和猝灭剂分子进行标记。除了荧光标记物和猝灭剂分子的存在之外，组2中的探针是相同的。组2中使用的绿色荧光团与组1中使用的绿色荧光团是相同的。组3包含75％的未标记的竞争性探针和25％的标记的探针，其用绿色荧光团和猝灭剂分子进行标记。除了荧光标记物和猝灭剂分子的存在之外，组3中的探针是相同的。组3中使用的绿色荧光团与组1和组2中使用的绿色荧光团是相同的。组1-3中的每一组内的探针彼此不同，因为选择它们是由于它们有特异性结合其相应的核酸靶标的能力。然而，用于标记每组内标记探针的荧光团是相同的。而且，每组内未标记探针与标记探针的比例与其他组相比是不同且唯一的。当反应首次开始时，检测不到荧光信号，因为来自每个荧光团的信号被猝灭剂分子阻断。随着反应的进行，每组内未标记和标记的探针竞争结合其互补核酸靶序列。因为每组内标记和未标记的探针基本相同，所以它们的结合和退火动力学基本相同。当标记的探针退火时，其随后被聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。该降解步骤将荧光团和猝灭分子分开，从而允许在适当的激发源激发时发射荧光信号。激发源激发绿色荧光团，并且从每个释放的绿色荧光团发射信号。检测并测量三种不同的信号强度。每种信号强度与特定比例相关联。因为每组探针包含独特比例的标记探针与未标记探针，所以可以将独特的信号强度与该特定探针组相关联。因此，使用每种独特的信号强度来鉴定各三种核酸靶标中的一种。实施例3图3a和3b显示了举例说明采用竞争性探针与稀释探针的一致性水平的示例性实验。制备10个rt-qpcr主混合物，用于含有在针对人鼻病毒、呼吸道合胞病毒a(rsva)和呼吸道合胞病毒b(rsvb)的单色通道中的三种taqmantm测定的系统。所有三种测定均使用具有相同荧光团猝灭剂组合的探针。对于这些反应中的五个，混合物的总探针浓度是保守的。表3总结了荧光和竞争性探针如何稀释至相同浓度。表4总结了引物组如何稀释至相同浓度。表5显示了含有荧光和竞争性探针的反应的主混合物组成。表5显示了仅含有荧光探针而不含有竞争性探针的反应的主混合物组成。表7显示了每个反应中包括的三种模板的浓度。用于两种靶标(rsva和rsvb)的荧光探针浓度是固定但不同的。对于最后的靶标(人鼻病毒，rh)，荧光探针浓度从25nm变化。如表5和表6所示，所有反应都含有相同的酶制剂和引物浓度。用dna模板上的已知单链dna模板测试10种主混合物中每一种的qpcr方案，其中dna模板的固定浓度为每个反应10,000个拷贝(表7)。qpcr反应在标准qpcr仪上进行，循环参数如表8所示。所得数据在图3a和图3b中示出。表3.寡核苷酸混合物表4.6plex引物混合物表5.反应主混合物—有竞争性探针表6.反应主混合物—无竞争性探针表7.模板名称浓度rht12e3个拷贝/μlrat22e3个拷贝/μlrbt12e3个拷贝/μlntctena(只有缓冲液)表8循环参数实施例4以下示例性实验和图4a和图4b中显示的所得数据证明了基于初始100％荧光探针数据，使用相同的报告荧光团和猝灭剂组合通过二元分离确定性地产生3plex测定的能力。为了产生初始荧光数据，制备rt-qpcr主混合物，其包含针对人鼻病毒(靶标a)、呼吸道合胞病毒a(靶标b)和呼吸道合胞病毒b(靶标c)的三种taqmantm测定。在这些测定中没有使用非荧光、竞争性探针。所有三种测定均用相同的荧光团猝灭剂组合进行标记。选择的引物浓度超过总探针浓度。针对每种靶标使用相同浓度的荧光探针，因此也使用相同浓度的总探针。表9显示了寡核苷酸主混合物的组成，其含有指示荧光探针而没有竞争性探针。表10显示了引物主混合物的组成。表11显示了仅含有100％荧光探针且没有竞争性探针的反应的主混合物组成。表12显示了每个反应中包括的三种模板的浓度。表13显示了用于rt-qpcr反应的循环参数。表9.25x荧光探针寡核苷酸混合物表10.25x引物混合物表11.反应主混合物表12.模板表13.循环参数用dna模板上的已知单链dna模板测试10种主混合物中每一种的qpcr方案，其中dna模板的固定浓度为每个反应10,000个拷贝(表12)。qpcr反应在标准qpcr仪上进行，参数如表13所示。该实验的结果显示在表14和图4a中。进行六次重复实验以及无模板对照(ntc)。表14.无竞争性探针的rt-qpcr数据靶标重复实验1重复实验2重复实验3重复实验4重复实验5重复实验6ntc靶标a0.40160.40280.39670.40180.40570.40560.0631靶标b0.52910.52350.44150.51470.53240.5331na靶标c0.45350.44150.44490.44450.44380.43810.0600表15.无竞争性探针的实验的荧光评分靶标名称评分靶标arht10.4023靶标brsvat20.5263靶标crsvbt10.4441为了计算用于经调整的混合物的荧光探针与竞争性探针的所需比例，从仅含有荧光探针的实验的数据确定来自6次重复实验的中值荧光水平(表15)。将靶标c设定为最高强度水平并保持在100％荧光探针初始浓度。通过用非荧光、竞争性探针替代一部分荧光探针，将靶标a和靶标b的水平设计成不同的。探针的总量(荧光加非荧光、竞争性)对于每种靶标是相同的，并且与图4a中所示的实验的总探针浓度相同。表16显示了寡核苷酸主混合物的组成，其含有指示荧光探针和竞争性探针。所使用的引物主混合物和反应主混合物分别与表10和表11中所显示的相同。所使用的模板和循环参数分别与表12和表13中所显示的相同。进行六次重复实验以及无模板对照(ntc)。所得数据显示在表17和图4b中。针对每种靶标计算出的荧光评分显示在表18中。表16.荧光和竞争性探针寡核苷酸混合物表17.采用竞争性探针的rt-qpcr的数据表18.采用竞争性探针的实验的荧光评分靶标名称评分靶标arht10.2135靶标brsvat20.1171靶标crsvbt10.4230实施例5进行elisa测定以在单个反应容器内检测三种感兴趣的蛋白。第一抗体组粘附于反应容器的表面上。各组中的其中一组能够唯一地结合各三种感兴趣的蛋白中的一组。将包含所述三种感兴趣的蛋白的样品加入反应容器中，并且这些蛋白各自有利地结合相应的第一抗体。进行洗涤程序以去除未结合的样品。接下来，将三组第二抗体加入反应容器中，其中一组对应于三种感兴趣的蛋白中的每一种。组1包含25％的未标记的竞争性第二抗体和75％的标记的第二抗体，其用绿色荧光团进行标记。除了荧光标记物的存在之外，组1中的第二抗体是相同的。组2包含50％的未标记的竞争性第二抗体和50％的标记的第二抗体，其用绿色荧光团进行标记。除了荧光标记物的存在之外，组2中的第二抗体是相同的。组2中使用的绿色荧光团与组1中使用的绿色荧光团是相同的。组3包含75％的未标记的竞争性第二抗体和25％的标记的第二抗体，其用绿色荧光团进行标记。除了荧光标记物的存在之外，组3中的第二抗体是相同的。组3中使用的绿色荧光团与组1和组2中使用的绿色荧光团是相同的。组1-3中的每一组内的第二抗体彼此不同，因为选择它们是由于它们有特异性结合其相应的感兴趣的蛋白的能力。然而，用于标记每组内标记的第二抗体的荧光团是相同的。而且，每组内未标记与标记的第二抗体的比例与其他组相比是不同且唯一的。将三组第二抗体加入反应容器中。来自每组的标记和未标记的第二抗体竞争结合其相应的蛋白质表位。因为除了荧光团的存在之外，每组内的标记和未标记的第二抗体是相同的，所以它们的结合动力学基本相同。在结合步骤后，进行洗涤程序以去除未结合的第二抗体。激发源激发绿色荧光团，并且从每个结合的标记的第二抗体发射信号。检测并测量三种不同的信号强度。每种信号强度与特定比例相关联。因为每组第二抗体包含独特比例的标记与未标记的第二抗体，所以可以将独特的信号强度与该特定的第二抗体组相关联。因此，使用每种独特的信号强度来鉴定各三种感兴趣的蛋白中的一种。实施例6在实验后从样品中分离mrna并对该mrna进行处理以用于测序。将mrna样品逆转录为cdna，然后进行pcr扩增，以制备测序文库。进行测序以检测感兴趣的靶标并确定由于实验条件，靶标水平与对照基因相比如何变化。遗憾的是，所述靶标来自非常高表达的基因，并且与对照基因相比在测序文库中过表达。这使得很难准确计算实验条件对基因表达水平的影响。沮丧的科学家们回到原始cdna样品并通过pcr进行重新扩增。然而，这次，他们将不同组的靶特异性引物包括在pcr反应混合物中。所述靶引物组包含25％的能够在pcr期间延伸的功能性引物，和75％的由于加帽端而不能延伸的竞争性引物。得到的测序结果具有较低水平的第一转录物，这允许更准确地计算由原始实验中使用的条件引起的转录水平。当前第1页12