用于连接细胞组成物和基质的方法与流程

本申请要求于2016年4月22日提交的美国临时申请62/326,266号的优先权，其通过引用纳入本文用于所有目的。

政府权益的声明

本发明在国立卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的ro1gm085169和国立卫生研究院授予的5dp1gm106412的政府资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。

本发明通常涉及细胞组成物与细胞内基质的连接。

背景技术：

荧光原位杂交(fish)是一种强大的技术，其中，核酸通过荧光标记的探针被靶向，然后通过显微镜检测显示。fish是一种单细胞试验，这使其特别适用于检测可能在混合或异步细胞群中丢失的罕见事件。此外，因为fish用于固定细胞或组织样品，其可以揭示染色体相对于核、细胞质甚至组织结构的位置，特别是当与细胞组分的免疫荧光靶向一起施用时。fish还可以用于显示rna，使研究人员能够同时评估基因表达、染色体位置和蛋白质定位。

技术实现要素：

本公开提供了将细胞组成物与导入细胞中的基质连接的方法。本公开提供了共价连接细胞内染色体与基质的方法，其包括修饰染色体内多个核苷酸以包含基质连接部分，其中所述染色体接触基质，并将多个核苷酸的基质连接部分和基质连接，从而将染色体与基质连接。本公开提供了细胞中染色体结构建模的方法，其包括将多个寡核苷酸与染色体杂交，其中染色体在细胞内接触基质，并且将多个寡核苷酸与基质连接，其中连接基质的多个寡核苷酸代表细胞中染色体的结构。多个寡核苷酸可以是如本文所述的寡涂针(oligopaint)。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一幅有色附图。本专利或专利申请公开与彩色附图的副本将根据要求，在支付所需的费用之后由政府机关提供。结合附图，通过以下示例性实施方式的详述能够更清楚地理解本发明实施方式的上述和其他特征和其他优点，其中：

图1是描述切割核酸和向游离末端核苷酸添加基质连接部分的示意图。

图2是具有可膨胀基质已进行原位基因组测序的细胞图像。用靶向各染色体300kb-1mb独特区域的寡涂针以各区域3750个寡涂针(约8探针/kb)对imr90细胞进行染色。细胞在exm凝胶中膨胀约4.5倍。寡涂针环化，然后进行滚环扩增，并进行1轮系连测序(sequencingbyligation)。各种颜色表示1碱基的solid测序。比例尺＝10微米。

图3a-e涉及证明acrydite修饰的寡涂针能够将寡涂针栓系(tether)于exm凝胶基质的实验。图3a是描述以acrydite修饰的寡涂针的示意图。acrydite(黄色梯形)被掺入各寡涂针的5'端。寡涂针藉由荧光团标记的二级寡核苷酸与主道(mainstreet)(互补核酸序列上游的非基因组序列)结合来显示。图3b-3e描述了在exm凝胶中用约20,000个寡涂针(绿色)染色的pgp1f细胞，所述寡涂针靶向染色体19的q臂上2.1mb区域(9.2探针/kb)。未修饰的寡涂针如图3b-3c所示。acrydite修饰的寡涂针如图3b-3e所示。在通过70％甲酰胺于73℃处理以去除寡涂针后，acrydite修饰的寡涂针与膨胀(expansion)凝胶保持连接。比例尺＝10微米。

具体实施方式

本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论述和文本中的术语和符合，例如，kornberg和baker，dnareplication(《dna复制》)，第二版(w.h.弗里曼出版社(w.h.freeman)，纽约，1992)；lehninger，biochemistry(《生物化学》)，第二版(沃斯出版社(worthpublishers)，纽约，1975)；strachan和read，humanmoleculargenetics(《人类分子遗传学》)，第二版(wl出版社(wiley-liss)，纽约，1999)；eckstein编，oligonucleotidesandanalogs:apracticalapproach(《寡核苷酸和类似物：实践方法》)(牛津大学出版社(oxforduniversitypress)，纽约，1991)；gait编，oligonucleotidesynthesis:apracticalapproach(《寡核苷酸合成：实践方法》)(irl出版社，牛津，1984)；等。

本公开提供了连接细胞组成物与细胞内基质的方法。根据一个方面，本文所述方法涉及通过共价连接或其他方式将天然产生的核酸(如染色体或rna)固定于其天然环境内(如细胞内或组织样品内)。三维核酸基质可以在细胞或组织样品中原位生成以保持天然产生的核酸序列的多样性(如dna和rna)以及在细胞、组织或任何其它复杂的生物材料内的空间方向。根据这一方面，核酸的位置以及其相对位置被鉴定为诸如亚细胞区室内、细胞内、组织内的三维结构，被鉴定为三维核酸集合，被鉴定为三维核酸材料等。

本公开提供了共价连接细胞内染色体与基质的方法，其包括修饰染色体内多个核苷酸以包含基质连接部分，其中所述染色体接触基质，并将多个核苷酸的基质连接部分和基质连接，从而将染色体连接于基质。本公开提供了将基质形成材料导入细胞，并形成接触染色体的基质。本公开提供了基质可以膨胀，并且染色体内其他核苷酸经修饰以包含基质连接部分，并且基质连接部分与基质连接。尽管单次膨胀可以是有效地，但是本公开提供了将基质膨胀1次或多次，即可以重复地膨胀基质，并且染色体内的其他核苷酸经修饰以包含基质连接部分，而基质连接部分与基质连接。本公开提供了基质形成材料聚合形成基质。本公开提供了基质形成材料交联形成基质。本公开提供了多个核苷酸经化学修饰以包含基质连接部分。本公开提供了多个核苷酸经化学修饰而包含基质连接部分的直接结合位点或包含基质连接部分通过接头的结合位点，并且基质连接部分或接头与结合位点结合。本公开提供了通过与相邻核苷酸切割开来修饰多个核苷酸，以产生一个或多个游离末端核苷酸，并且其中包含基质连接部分的核苷酸直接连接或作为寡核苷酸的一部分连接一个或多个游离末端核苷酸，并且基质连接部分连接基质。本公开提供了游离末端核苷酸经处理以允许连接包含基质连接部分的核苷酸或连接含有包含基质连接部分的核苷酸的寡核苷酸。本公开提供了游离末端核苷酸经处理以产生钝端，从而允许连接包含基质连接部分的核苷酸或连接含有包含基质连接部分的核苷酸的寡核苷酸。本公开提供了游离末端核苷酸经处理以产生突出端，从而允许连接包含基质连接部分的核苷酸或连接含有包含基质连接部分的核苷酸的寡核苷酸。本公开提供了通过限制性内切酶、dna酶、单链切割器(cutter)、双链切割器或辐照来切割染色体dna，以产生多个单链或双链断裂或缺口。本公开提供了包含基质连接部分的核苷酸直接连接或经由寡核苷酸系连(ligate)于一个或多个游离末端核苷酸。本公开提供了自一个或多个游离末端核苷酸延伸出包含基质连接部分的核苷酸。本公开提供了用聚合酶将一个或多个修饰的核苷酸添加于末端核苷酸，将基质连接部分与一个或多个修饰的核苷酸连接，并将基质连接部分与基质连接。本公开提供了使用聚合酶将一个或多个核苷酸添加于末端核苷酸，其中一个或多个核苷酸经化学修饰而包含基质连接部分的直接结合位点或包含基质连接部分通过接头的结合位点，并且基质连接部分或接头与结合位点结合，并且基质连接部分连接于基质。本公开提供了基质连接部分是胺、胺反应性基团、acrydite、acrydite修饰的实体、炔烃、生物素、叠氮化物、巯基和巯基-修饰的实体以及适用于点击化学技术的实体中的一种或多种。本公开提供了基质材料在三维上膨胀，在染色体dna中生成断裂，产生一个或多个其他游离末端核苷酸。本公开提供了基质是聚丙烯酰胺、纤维素、藻酸盐、聚酰胺、交联琼脂糖、交联葡聚糖、交联聚乙二醇中的一种或多种。

本公开提供了用于细胞中染色体结构建模的方法，其包括将染色体与多个寡核苷酸杂交，其中染色体在细胞内接触基质，并且将多个寡核苷酸与基质连接，其中连接基质的多个寡核苷酸代表细胞中染色体的结构，因为寡核苷酸杂交于染色体。多个寡核苷酸可以是探针，如寡涂针或ish或fish探针，并且可以是任何合适的长度，如本文所述，如约5核苷酸长度的短探针至1kb或2kn或3kn或更长。合适的探针可以在沿探针的一个或多个或多个位置与基质连接，以模拟染色体的序列。本公开提供了将基质形成材料导入细胞，并形成接触染色体的基质。本公开提供了基质可以膨胀，而更多寡核苷酸与染色体杂交并且连接于基质。尽管单次膨胀可能就足够了，但是本公开提供了基质可以被膨胀一次或多次，即可以被重复地膨胀，而更多寡核苷酸与染色体杂交并且连接于基质。本公开提供了基质形成材料聚合形成基质。本公开提供了基质形成材料交联形成基质。本公开提供了从材料移除染色体，其中连接基质材料的多个寡核苷酸代表细胞中染色体的结构，因为寡核苷酸与染色体杂交并且连接于基质。本公开提供了多个寡核苷酸，其包含连接于基质的基质连接部分。本公开提供了多个寡核苷酸，其包括基质连接部分或一个或多个或多个基质连接部分，其连接于基质并且其中多个寡核苷酸包含dna连接部分，dna连接部分连接于染色体dna。本公开提供了多个寡核苷酸经化学修饰而包含基质连接部分，并且基质连接部分连接于基质。本公开提供了多个寡聚核苷酸包含二级探针杂交位点，并且包含基质连接部分的二级探针杂交于二级探针杂交位点，基质连接部分连接基质。本公开提供了多个寡聚核苷酸包含多个二级探针杂交位点，并且包含基质连接部分的二级探针杂交于多个二级探针杂交位点，基质连接部分连接基质。

根据图1，染色体被描述为细胞内的双链核酸。细胞经甲醛处理以固定或提供基质形成材料，并且在接触染色体的细胞内形成基质，例如以固定染色体并保持其在细胞内三维形状和相对位置的方式围绕染色体。使用片段化方法将染色体片段化，以产生具有游离末端核苷酸的片段。可以如所需处理末端，以产生钝端或突出端。具有连接部分(如acrydite部分)的寡核苷酸系连于游离末端核苷酸，然后连接于基质。可以膨胀基质一次或多次。本领域技术人员已知可膨胀基质材料和膨胀基质的方法。

对于本文和上述方法，下述部分作为方法的某些特征的示例性方面提供。

细胞组成物

本公开提供了细胞组成物与细胞内基质的连接。示例性的细胞组成物包括染色体、蛋白质、rna等。本文所用术语“染色体”是指活细胞中携带遗传的基因的支持物，包括dna、蛋白质、rna和其他相关因子。常规国际系统用于鉴定和编号人基因组染色体。单个染色体的尺寸将在多染色体基因组内变化并且在基因组间变化。染色体可获自任何物种。染色体可获自成年对象、青少年对象、婴儿对象、未出生对象(例如，来自胎儿，例如，通过产前测试如羊膜穿刺术、绒膜绒毛取样、等或直接来自胎儿，例如胎儿手术期间)来自生物样品(例如，生物组、流体或细胞(例如，痰液、血液、血细胞、组织或细针活检样品、尿液、脑脊液、腹膜液、和胸膜液、或来自其的细胞)或来自细胞培养样品(例如，原代细胞、永生细胞、部分永生细胞等)。在某些示例性实施方式中，一种或多种染色体可获自一个或多个属，包括但不限于人属(homo)、果蝇属(drosophila)、线虫属(caenorhabiditis)、鱼丹属(danio)、鲤属(cyprinus)、猫属(equus)、犬属(canis)、羊属(ovis)、大马哈鱼属(ocorynchus)、鳟属(salmo)、牛属(bos)、猪属(sus)、原鸡属(gallus)、番茄属(solanum)、小麦属(triticum)、稻属(oryza)、玉蜀黍属(zea)、大麦属(hordeum)、芭蕉属(musa)、燕麦属(avena)、杨属(populus)、芸薹属(brassica)、甘蔗属(saccharum)等。

基质材料和在细胞内制备基质

本公开提供了在细胞内使用由一种或多种基质形成材料形成的基质来将细胞组成物与基质连接的用途。细胞组成物(如染色体)共价地连接于基质以保护其在基质内x、y和z轴的空间方向。示例性的基质材料可以是半固体培养基，其可以由聚丙烯酰胺、纤维素、海藻酸盐、聚酰胺、交联琼脂糖、交联葡聚糖、交联聚乙二醇等制成或可以是上述物质。应当理解的是，基质可由聚合形成基质的单体或寡聚体形成，或由经交联以形成基质的聚合物或寡聚物形成，或两者形成。本领域技术人员已知在细胞内制备三维机构基质的方法，包括向细胞或组织样品中引入基质形成材料的一个或多个组分，并且在细胞内形成基质。通过使形成基质的材料聚合和/或交联，使用针对形成基质的材料的方法以及本领域技术人员已知的方法、试剂和条件，基质形成材料可以形成基质。

本公开提供了示例性三维基质是多孔的，即达到所需试剂或材料可以扩散或以其他方式移动穿过基质以接触核酸的程度。多孔性可以是由用于制备基质材料的分子的聚合和/或交联或使用分子筛所导致。凝胶基质内的扩散特性主要是孔尺寸的作用。根据本领域技术人员已知的方法，通过改变交联密度、链长度以及共聚化的单体分子的百分比来控制多孔性。

根据一个方面，三维基质材料是化学惰性且热稳定的，以允许各种反应条件和反应温度，如荧光原位杂交所需。根据一个方面，三维基质材料是光学透明的。根据一个方面，三维基质材料是光学透明的，以允许进行本领域技术人员已知的三维成像技术。根据一个方面，用于形成基质的材料与许多生物和非生物样品原位相容，从而避免将核酸分子从其天然环境提取。根据一个方面，基质可以在x、y和z轴上膨胀，即，可以在三个维度中膨胀。根据一个方面，基质可以在各个方向一致地膨胀。

根据一个方面，形成基质的材料可以被导入细胞。细胞用甲醛固定，并且然后将其浸入乙醇中以破坏脂质膜。向样品添加基质形成试剂，并且允许其渗透过整个细胞。然后加入聚合诱导催化剂、uv或功能性交联剂以允许形成凝胶基质。洗脱未被纳入的材料，并且将任何剩余的功能性反应基团淬火。示例性的细胞包括任何细胞，人类或其它，包括疾病细胞或健康细胞。某些细胞包括人细胞、非人细胞、人干细胞、小鼠干细胞、原代细胞系、永生化细胞系、原代和永生化成纤维细胞、hela细胞和神经元。

基质连接部分或接头

本公开提供了在核酸(如染色体)上使用一种或多种基质连接部分或接头的用途，以将核酸连接于细胞内的基质。本文中所用的术语“连接(attach)”指共价相互作用和非共价相互作用。共价相互作用是两个原子或自由基之间由共用一对电子(即，单键)、两对电子(即，双键)或三对电子(即，三键)所形成的化学连接。共价相互作用在本领域中已知为电子对相互作用或电子对键连。非共价相互作用包括但不限于，范德华相互作用、氢键、弱化学键(即，通过短范围非共价力)、疏水相互作用、离子键等。非共价相互作用的综述可见于alberts等，刊于《细胞分子生物学》(molecularbiologyofthecell)，第三版，加兰出版社(garlandpublishing)，1994，通过引用将其全部内容纳入本文用于所用目的。基质连接部分可以通过与基质上位点、原子或部分的共价键或通过与基质上位点、原子或部分的非共价结合连接于基质。本领域技术人员将容易地鉴定用于将核酸(如dna或rna)连接于特定基质材料的合适基质连接部分。

存在的核酸的一个或多个核苷酸(如染色体或其部分、片段或区段)或添加于存在的核酸的核苷酸(如染色体或其部分、片段或区段)可以经修饰以包含基质连接部分。含有基质连接部分的一个或多个核苷酸可以添加于存在的核酸，如染色体或其部分、片段或区段。基质连接部分可以共价地连接于细胞内基质，共价地交联，共聚化或以其它方式非共价地连接基质。基质连接部分可以是可激活的。本文所用术语“可激活的”表示直到被激活(例如，通过将可激活的基质连接部分暴露于光、热、一种或多种化学化合物等)之前都是惰性(例如，不结合靶标)的基质连接部分。

基质连接部分可与交联剂反应。基质连接部分可以是配体-配体结合对的部分。示例性的基质连接部分包括胺、胺反应性基团、acrydite、acrydite修饰的实体、炔烃、生物素、叠氮化物、巯基和巯基-修饰的实体以及适用于点击化学技术的实体。当基质包含亲和素/链霉亲和素衍生物或抗-生物素抗体(例如，可检测标记的抗体)时，生物素或其衍生物可以用作基质连接部分。地高辛可以用作基质连接部分，并且随后通过连接基质的抗-地高辛抗体结合。氨基烯丙基-dutp残基可纳入寡核苷酸并随后偶联至n-羟基琥珀酰亚胺，所述n-羟基琥珀酰亚胺可以掺入基质。通常，偶联对或反应对的任何成员可以用于将核苷酸(无论是寡核苷酸或染色体)连接于基质。

基质连接部分包含化学交联剂。交联剂通常包含至少两个反应基团，所述反应基团对许多基团具有反应性的，包括但不限于，硫基和胺，并且在两个或多个分子之间生成共价键。基质连接部分包含交联剂，如伯胺、羧基、巯基、碳水化合物和羧酸。蛋白质分子具有许多这些官能团，并且因此蛋白质和肽可以使用这些交联剂容易地偶联。交联剂为本领域所熟知，并且市售可得(赛默科技公司(thermoscientific)(伊利诺伊州罗克福德))。在交联的情况中，基质连接部分可以交联至修饰的dntp或dutp或两者。合适的示例性交联剂反应基团亚氨酸酯(dmp)、琥珀酰亚胺酯(nhs)、马来酰亚胺(硫代-smcc)、碳化二亚胺(dcc,edc)和苯基叠氮化物。在本公开范围内的交联剂可以包括间隔物部分。这样的间隔物部分可以是功能化的。这样的间隔物部分可以化学稳定的。合适的示例性间隔物部分包括聚乙二醇、碳间隔物、光可裂解间隔物和本领域技术人员已知的其他间隔物等。

可检测标记物

本公开提供了可检测标记物的用途，所述可检测标记物可以连接于本文所述的探针，其可以与细胞组成物杂交，如染色体。可检测标记物或部分是本领域技术人员已知的。本文所用术语“可检测标记物”是指可用于鉴定靶标(例如，与感兴趣的核酸序列、染色体或亚染色体区域相关因子)的标记物。通常，可检测标记物连接于多核苷酸的3'或5'端。或者，可检测标记物连接于寡核苷酸的内部。可检测标记物可在尺寸和组成上广泛变化；以下参考文献提供了选择特定实施方式的合适寡核苷酸标签的指南：brenner，美国专利号5,635,400；

brenner等，proc.natl.acad.sci.,97:1665；shoemaker等，(1996)naturegenetics,14:450；morris等，ep专利公开号0799897a1；wallace，美国专利号5,981,179等。

可检测部分的示例包括各种放射性部分、酶、辅基、荧光标志物、发光标志物、生物发光标志物、金属颗粒、蛋白质-蛋白质结合对、蛋白质-抗体结合对等。荧光部分的示例包括但不限于，黄色荧光蛋白(yfp)、绿色荧光蛋白(gfp)、青色荧光蛋白(cfp)、伞形花内酯、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、花青、丹磺酰氯、藻蓝蛋白、藻红蛋白等。生物发光标志物的示例包括但不限于萤光素酶(如细菌、萤火虫、叩头虫(clickbeetle)等)、萤光素、发光蛋白等。有可见检测信号的酶系统示例包括但不限于半乳糖苷酶、葡糖醛酸苷酶(glucorimidase)、磷酸酶、过氧化物酶、乙酰胆碱酯酶等。可鉴定标志物也包括放射活性化合物，如¹²⁵i、³⁵s、¹⁴c、或³h。可鉴定标志物可以从各种来源市售获得。

荧光标记物及其与核苷酸和/或寡核苷酸的接合描述于许多综述，包括haugland，《荧光探针和研究化学品》(handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals)，第9版(分子探针公司(molecularprobes,inc.)，尤金(eugene)，2002)；keller和manak，《dna探针》(dnaprobes)，第2版(斯托克顿出版社(stocktonpress)，纽约，1993)；eckstein编，《寡核苷酸和类似物：实践方法》(oligonucleotidesandanalogues:apracticalapproach)(irl出版社，牛经，1991)；和wetmur，生物化学与分子生物学评论(criticalreviewsinbiochemistryandmolecularbiology)，26:227-259(1991)。可应用于本发明的具体方法公开于以下参考文献的样本中：美国专利号4,757,141、5,151,507和5,091,519。在一个方面中，一个或多个荧光染料用作标记的靶序列的标记物，例如，美国专利号5,188,934(4,7-二氯荧光素染料)；5,366,860(光谱可分辨若丹明染料)；5,847,162(4,7-二氯若丹明染料)；4,318,846(醚-取代的荧光素染料)；5,800,996(能量转移染料)；lee等，5,066,580(黄嘌呤染料)；5,688,648(能量转移染料)等所述。也可用量子点进行标记，如以下专利和专利公开中所示：美国专利号6,322,901、6,576,291、6,423,551、6,251,303、6,319,426、6,426,513、6,444,143、5,990,479、6,207,392，2002/0045045和2003/0017264。本文所用术语“荧光标记物”包括信号转导部分，其通过一个或多个分子的荧光吸收和/或发射性质传递信息。这种荧光性质包括荧光强度、荧光寿命、发射光谱特异性、能量转移等。

使用的检测方法将取决于反应性标记物、可恢复标记物和/或可检测标记物中使用的具体可检测标记物。在某些示例性实施方式中，通过本文所述的探针具有与其结合的一个或多个反应性标记物、可恢复标记物、或可检测标记物的包括但不限于间期、早前期、前期、前中期、中期、后期、末期和胞质分裂的细胞周期各阶段期间的靶核酸，如染色体和染色体的亚染色体区域可经选择和/或扫描用于使用显微镜、分光光度计、管发光计或板发光计、x-射线膜、闪烁器、荧光活化的细胞分选(facs)设备、微流体设备等。

当使用荧光标记的靶向部分、可恢复部分或可检测标记物时，可使用荧光光学显微镜来检测并记录采用本领域已知的常规方法的原位杂交的结果。或者，可使用具有图像处理能力的数字(计算机执行)荧光显微镜。2种熟知的用于对具有与之结合的多色标记物的染色体的成像fish的系统包括多重-fish(m-fish)和光谱核型分析(sky)。参见schrock等，(1996)science273:494；roberts等，(1999)geneschrom.cancer25:241；fransz等，(2002)proc.natl.acad.sci.usa99:14584；bayani等，(2004)curr.protocol.cellbiol.

22.5.1-22.5.25；danilova等，(2008)chromosoma117:345；美国专利号6,066,459；和fishtagtmdna多色试剂盒说明书(分子探针公司)，针对用于喷涂染色体和检测喷涂的染色体的方法的综述。

在某些示例性实施方式中，使用带修饰(例如，软件，chroma84000滤片组，和增强滤波器)的计算机成像系统，如appliedimagingcorporationcytovision系统(加利福尼亚州圣克拉拉的应用成像公司(appliedimagingcorporation,santaclara,calif.))来检测并记录荧光标记的染色体的图像。其他合适的系统包括计算机成像系统，使用与zeissaxiophot显微镜偶联的冷却的ccd相机(photometrics，装配kodakkaf1400ccd的nu200系列)，图像处理如ried等，(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:1388所述。其他合适的成像和分析系统由schrock等，同上和speicher等，同上描述

核苷酸和修饰的核苷酸

本公开提供了核苷酸的修饰以包含基质连接部分，或提供修饰的核苷酸，其包含用于基质连接部分连接的位点，或提供向游离端或末端核苷酸添加核苷酸或修饰的核苷酸。术语“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且旨在包括但不限于，可能具有各种长度的核苷酸的聚合物形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。本文所述标记的探针可以包括或可以是“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“核酸片段”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”。能够用于本文所述方法的寡核苷酸或多核苷酸可以包括天然核酸序列和其变体、人工核酸序列或这些序列的组合。寡核苷酸或多核苷酸可以是双链或单链的。

多核苷酸通常由4个核苷酸碱基的特定序列组成，所述4个核苷酸碱基为：腺嘌呤(a)；胞嘧啶(c)；鸟嘌呤(g)；和胸腺嘧啶(t)(当多核苷酸是rna时，尿嘧啶(u)替代胸腺嘧啶(t))。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示；或者，该术语可以应用于多核苷酸分子本身。可以将该字母表示输入具有中央处理单元的计算机中的数据库中，并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性搜索。多核苷酸任选地可以包括一个或多个非标准的核苷酸、核苷酸类似物和/或修饰的核苷酸。

修饰的核苷酸的示例包括但不限于，二氨基嘌呤、s2t、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2、2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、五步苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2,6-二氨基嘌呤等。还可以在碱基部分(例如，在通常能够与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子)、糖部分或磷酸骨架修饰核酸分子。核酸分子可以还包含胺改性的基团，如氨基烯丙基-dutp(aa-dutp)和氨基己基丙烯酰胺-dctp(aha-dctp)，以允许如n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)的胺反应性部分共价连接。

在某些示例性实施方式中，将使用核苷酸类似物或衍生物，如这样的核苷或核苷酸：在分子的碱基部分或糖部分具有保护基团，或具有连接的或掺入的标记物，或具有产生单体的等排替代，所述单体以与母体单体类似的方式在合成或生理环境中起作用。核苷酸可以具有保护基团，其连接于核苷酸上的反应基团并将其掩蔽。基质连接部分可以添加至反应位点，或基质连接部分可以存在于核苷酸上，但是处于通过保护基团失活或封闭的状态。去除保护基团可以激活基质连接部分来连接基质。许多保护基团能够用于本发明，并且可以被选择。根据一个方面，自回避(self-avoiding)核苷酸可以用于制作探针。自回避核苷酸能够与天然核苷酸碱基配对，但是不能与自身碱基配对。自回避核苷酸为本领域技术人员所熟知，并且述于hoshika,等,angew.chem.int.ed.2010,49,第5554-5557页和hoshika等,nucleicacidsresearch(2008)，通过引用其全部内容纳入本文。

杂交探针和寡涂针

本公开提供了使用杂交探针(如寡涂针)来与细胞组成物(如染色体)杂交，并且其中杂交探针包含基质连接部分并且可以连接于基质。如本文所述，基质连接部分可以直接或间接地连接或偶联于核苷酸或核酸或探针或寡涂针。

通常，寡涂针包含与靶寡核苷酸序列(如dna序列的部分，或特定染色体或特定染色体的亚染色体区域)互补的互补核酸序列。可以说互补核酸序列具有基因组同源性，因为寡涂针旨在与互补基因组核酸序列杂交。互补核酸序列可以是15-50碱基或32-42碱基的长度。互补核酸序列可能是任何核酸序列，并且可能是dna序列、rna序列(如crispr系统所理解的引导rna序列)或dna/rna杂交序列。寡涂针可以还包含互补核酸序列上游的区域或非基因组核酸序列，其可以被称之为“主道(mainstreet)”序列。寡涂针可以还包含互补核酸序列下游的区域或非基因组核酸序列，其可以被称之为“后道(backstreet)”序列。寡涂针可以包含互补核酸序列上游的第一非基因组核酸序列或区域(“主道”)和互补核酸序列下游的第二非基因组核酸序列或区域(“后道”)。以此方式，互补或基因组核酸序列可以通过主道序列和后道序列侧接。尽管互补或基因组核酸序列的目的是与靶基因组核酸序列杂交，但是主道和后道序列可以用于携载功能性部分。功能性部分可以直接连接于主道或后道序列，或者它们可以间接地连接于主道或后道序列。例如，功能性部分可以间接地连接，如果功能性部分直接连接与非基因组主道或后道序列的部分互补的第一非基因组核酸序列探针。以此方式，第一非基因组核酸序列探针杂交至非基因组主道或后道序列的互补部分。

使用本文所述探针的原位杂交方法可在多种生物或临床样品上，在处于细胞周期任何(或全部)阶段(例如，有丝分裂、减数分裂、间期、g0、g1、s和/或g2)的细胞中进行。示例包括全部类型的细胞培养物、动物或植物组织、外周血淋巴细胞、口颊涂片、从未经培养的原代肿瘤制备的涂片标本、癌细胞、骨髓、从活检获得的细胞、或体液(例如，血液、尿液、痰液等)中的细胞、来自羊水的细胞、来自母体血液的细胞(例如，胎儿细胞)、来自睾丸和卵巢的细胞等。样品经制备用于使用常规技术的本发明的试验，其一般取决于获得样品或试样的来源。这些例子不构成对可用于本文所述的方法和/或组合物的样品类型的限制。

本公开提供了多重染色体特异性探针，其包含基质连接部分或接头，用于连接基质。这类探针可以还包含一个或多个可检测部分。根据本公开的方法包括本领域技术人员所知将核酸探针用于杂交至核酸的任何方法，其中所述核酸如双链dna，其中双链dna的部分已经分成两条单独的链，即第一链和互补链。应当理解的是，当分离双链核酸时，提及第一链和互补链是相对的。也就是，任何一条链都可以是第一链或互补链。将一条链选作第一链使得剩下的链成为互补链。

其中本文所述的标记探针具有特定用途的一种示例性方法包括荧光原位杂交或fish，其是用于检测和定位染色体上特定dna序列的存在与否的细胞遗传学技术。fish使用这样的荧光探针，所述荧光探针仅与染色体中显示出高度的序列互补性的那些部分结合。荧光显微镜可以用于发现荧光探针在哪里结合染色体。fish常用于在dna中发现用于遗传咨询、医学和物种鉴定的特定特征。fish还可以用于检测和定位细胞中的特定rna靶标(mrna、lncrna和mirna)，循环肿瘤细胞和组织样品。在这种背景下，其能在细胞和组织中帮助定义基因表达的空间－时间模式。示例性的fish方法为本领域技术人员所熟知，并且容易在公开文献中获得。

将包含基质连接部分或接头的探针与靶标染色体序列杂交可以通过标准原位杂交(ish)技术(参见例如，gall和pardue(1981)meth.enzymol.21:470；henderson(1982)int.reviewofcytology76:1)实现。通常，ish包括下述主要步骤：(1)固定待分析的生物结构(例如，染色体铺展(spread))，(2)生物结构的预杂交处理，以增加靶dna的可及性(例如，用热或碱变性)，(3)任选的预杂交处理以减少非特异性结合(例如，通过封闭重复序列的杂交能力)，(4)将核酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(5)后杂交洗涤，以去除在杂交中没有结合的核酸片段和(6)检测杂交的标记的寡核苷酸(例如，杂交的寡涂针)。用于各步骤的试剂和其使用条件视具体情况以及特定探针是否需要其使用而定。杂交条件也述于美国专利第5,447,841号。应当理解的是，原位杂交方案和条件的许多变化是已知的，并且从业者可以遵从本文提供的指导与本发明联用。

本公开范围内的探针包括已知能够用于fish方法的那些。fish探针通常源自亚克隆至载体(如质粒、粘粒和细菌人工染色体(bac))的基因组插入物或来自流式分选的染色体。这些插入物和染色体可以用于产生经由切口平移或pcr在荧光团偶联的核苷酸存在的情况下直接标记的探针或用核苷酸偶联的半抗原(如生物素和地高辛)间接标记的探针，其可以用第二检测试剂显示。探针dna常常经片段化至约150-250bp的片段以促进渗透进入固定的细胞和组织。由于很多基因组克隆包含高度重复序列，如sine和alu元件，杂交常常需要在未标记的重复dna存在的情况下进行，以防止增加背景信号的脱靶杂交。这样的探针可以称之为“染色体涂针(paint)”，其指这样的可检测标记的多核苷酸，所述可检测标记的多核苷酸具有与来自特定染色体或特定染色体亚染色体区域的dna序列互补的序列。市售可得的染色体涂针源自经荧光活化的细胞分选的(facs)和/或流式分选的染色体或源自细菌人工染色体(bac)或酵母人工染色体(yac)。

多种类型的定制合成的寡核苷酸(oligo)也已经用作fish探针，包括dna、肽核酸(pna)和锁核酸(lna)寡核苷酸。寡核苷酸探针的一个优势是它们被设计成靶向精确定义的序列，而不是依赖于对所需基因组靶标具有特异性的克隆的分离。此外，因为这些探针通常较短(约5bp至约300bp、约8bp至约250bp、约9bp至约200bp、约10bp至约150bp、约15bp至约100bp或约20bp至约50bp)并且在自然状态下为单链，所以它们有效地扩展至固定的细胞和组织中的，并且不受到互补探针片段之间竞争性杂交的阻碍。当前研发的利用寡核苷酸探针的方法已经能够使用分支dna信号放大或数十个短股核苷酸探针显示单拷贝的病毒dna以及单个mrna分子并且通过靶向高度重复序列的连续区块(block)作为策略来扩大信号，使第一个基于fish的全基因组rnai筛选能够进行。寡核苷酸fish探针也已经由基因组dna直接产生，其使用多个平行pcr反应或使用滚环循环方法，或者使用多轮t7rna聚合酶然后进行一轮或多轮逆转录(在此期间标记物或标记物的前体经由引物或在延伸期间添加)和rna模板的清除/降解的方法。此类方法为本领域技术人员已知。

寡核苷酸序列，如待用于探针的单链寡核苷酸序列可由天然来源分离，合成或购自商业来源。在某些示例性实施方式中，可以使用一种或多种亚磷酰胺接头，和/或通过本领域技术人员已知的系连(ligation)方法测序来制备寡核苷酸序列。寡核苷酸序列也可以通过任何合适的方法制备，例如，如本文下述的标准亚磷酰胺方法，以及通过beaucage和carruthers((1981)tetrahedronlett.22:1859)中所述的那些方法或根据matteucci等.(1981)j.am.chem.soc.

103:3185)的三酯方法，或通过使用本领域已知的商用自动寡核苷酸合成仪或高通量、高密度阵列的其它化学方法(参见，美国专利号5,602,244、5,574,146、5,554,744、5,428,148、5,264,566、5,141,813、5,959,463、4,861,571和4,659,774其在此出于所有目的完整引入以供参考)。也可以从多个供应商购买获得预合成的寡核苷酸。

在某些示例性实施方式中，可以使用本领域已知的各种微阵列技术制备寡核苷酸序列。预合成的寡核苷酸和/或多核苷酸序列可以连接到支持物或使用下列方法原位合成：光导向方法、流动通道和点样法、喷墨法、销型方法和基于珠的方法，示于下列参考文献中：mcgall等，(1996)proc.natl.acad.sci.u.s.a.93:13555；《基因工程中的合成dna阵列》(syntheticdnaarraysingeneticengineering)，卷20:111，普莱南出版社(plenumpress)(1998)；duggan等，(1999)nat.genet.s21:10；《微阵列：制作和用于微阵列生物信息学》

(microarrays:makingthemandusingtheminmicroarraybioinformatics)，剑桥大学出版社(cambridgeuniversitypress)，2003；美国专利申请公开号2003/0068633和2002/0081582；美国专利号6,833,450、6,830,890、6,824,866、6,800,439、6,375,903和5,700,637；和pct公开号wo04/031399、wo04/031351、wo04/029586、wo03/100012、wo03/066212、wo03/065038、wo03/064699、wo03/064027、wo03/064026、wo03/046223、wo03/040410和wo02/24597。

可以在合成期间使用已知的材料和方法将聚合酶识别位点、切割位点和/或标记物或可检测部分添加位点添加至单链寡核苷酸。

能够用于根据本公开的探针的寡核苷酸探针可以具有任意所需核苷酸长度和核酸序列。因此，本公开的多个方面涉及使用多个核酸探针或核酸探针组，如单链核酸探针，如寡核苷酸涂针(oligonucleotidepaint)。术语“探针”指这样的单链寡核苷酸序列，其将识别并与靶核酸序列或其cdna衍生物中的互补序列形成氢键结合的双链体。该探针包含靶杂交核酸序列。示例性核酸序列可以是短核酸或长核酸。示例性核酸序列包含寡核苷酸涂针。示例性的核酸序列是这样的序列，其具有约1核苷酸至约100,000核苷酸、约3核苷酸至约50,000核苷酸、约5核苷酸至约10,000核苷酸、约10核苷酸至约10,000核苷酸、约10核苷酸至约1,000核苷酸、约10核苷酸至约500核苷酸、约10核苷酸至约100核苷酸、约10核苷酸至约70核苷酸、约15核苷酸至约50核苷酸、约20核苷酸至约60核苷酸、约50核苷酸至约500核苷酸、约70核苷酸至约300核苷酸、约100核苷酸至约200核苷酸以及之间的所有范围或值，无论重叠与否。示例性的寡核苷酸探针包括约10核苷酸至约100核苷酸、约10核苷酸至约70核苷酸、介约15核苷酸至约50核苷酸、约20核苷酸至约60核苷酸以及之间的所有范围或值，无论重叠与否。根据一个方面，根据本公开的寡核苷酸探针应当能够与靶核酸杂交。根据本公开的探针可以包含标记物或可检测的部分，如本文所述基质连接部分。如果需要，可以在计算机软件(如dnaworks、或gene2oligo)的协助下设计寡核苷酸或多核苷酸。

根据本公开的寡核苷酸探针不需要与单链核酸形成完美配对的双链体，尽管完美配对的双链体是示例性的。根据一个方面，如本文所述的寡核苷酸探针与靶序列在严谨至中度严谨杂交和洗涤条件下与靶序列形成稳定的杂交体。如果预期探针将与靶序列基本上完全互补(即，约99％或更大)，那么可以使用严谨条件。如果预期将发生一些错配，并导致探针不完全互补，可以减少杂交的严谨性。影响杂交的条件以及选择针对非特异性结合的条件是本领域已知的，并且述于例如sambrook等,(2001)中。通常，较低的盐浓度和较高的温度增加结合的严谨性。例如，通常认为严谨条件是在这样的溶液中孵育，所述溶液含有大约0.1xssc，0.1％sds，处于约65℃孵育/洗涤温度，而温和严谨条件是在这样的溶液中孵育，所述溶液含有大约1-2xssc，0.1％sds和约50°-65℃孵育/洗涤温度。低严谨条件为2xssc和约30°-50℃。

术语“严谨性”或“严谨杂交条件”指这样的杂交条件，所述杂交条件将影响杂交体的稳定性，例如，温度、盐浓度、ph、甲酰胺浓度等。按经验优化这些条件以最大化特异性结合并最小化引物或探针与其靶核酸序列的非特异性结合。所用术语包括对示例性条件的引用，在示例性条件下，探针与其靶序列的杂交程度明显大于其他序列(如至少2倍于背景)。其他这类调节可以是合适的。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。通常，严谨条件选择为比特定序列在确定离子强度和ph下的热解链点(tm)低约5℃。tm是50％互补靶序列与完全匹配探针或引物杂交时的温度(在确定离子强度和ph的条件下)。通常，严谨条件是盐浓度小于约1.0mna⁺离子，一般约0.01至1.0mna⁺离子浓度(或其它盐)，ph7.0至8.3，对短探针或引物(例如，10-50个核苷酸)而言温度至少约为30℃、对长探针或引物(例如大于50个核苷酸)而言至少约60℃的条件。也可加入去稳定剂如甲酰胺以获得严谨条件。示例性的低严谨条件或“严谨性降低的条件”包括用30％甲酰胺、1mnacl、1％sds的缓冲溶液于37℃杂交，并在2×ssc中于40℃洗涤。示例性的高严谨条件包括在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中于37℃杂交，并在0.1×ssc中于60℃洗涤。杂交过程为本领域所熟知，并且在例如ausubel等,1998和sambrook等,2001中描述。应理解任何所需的严谨性和/或条件可以如所需使用。

根据本公开的核酸探针可以经标记或未经标记。某些核酸探针可经直接标记或间接标记。某些核酸探针可直接包含基质连接部分。某些核酸探针可以间接地包含基质连接部分，如通过与探针杂交的二级寡核苷酸，并且其中所述基质连接部分直接连接二级寡核苷酸。

根据某些方面，除了与靶核酸杂交的探针序列之外，核酸探针可以包含与靶核酸序列非可杂交的一级核酸序列示例性的一级核酸序列或靶标非杂交核酸序列包括约10核苷酸至约100核苷酸、约10核苷酸至约70核苷酸、约15核苷酸至约50核苷酸、约20核苷酸至约60核苷酸以及之间的所有范围或值，无论重叠与否。根据某些方面，一级核酸序列可以与一个或多个二级核酸序列杂交。根据某些方面，二级核酸序列可以包含标记物或基质连接部分。根据这个方面，随着二级核酸结合一级核酸，核酸探针间接地经标记，或者间接地包含基质连接部分，从而间接地标记与靶核酸序列杂交的探针，或间接地提供具有基质连接部分的探针。根据某些方面，提供了多个核酸探针，各自具有共同的一级核酸序列。也就是，一级核酸序列对于多个核酸探针是常见的，因此多个核酸探针各自具有相同或基本相似的一级核酸序列。根据一个方面，一级核酸序列是单链物质(species)。以此方式，提供了多个共同的二级核酸序列，其与多个共同的一级核酸序列杂交。也就是，各二级核酸序列具有相同或基本相似的核酸序列。根据一个示例性实施方式，向多个核酸探针中的每一个核酸探针提供单个一级核酸序列。相应地，只需提供可与一级核酸序列杂交的单个二级核酸序列以标记每个核酸探针。根据某些方面，共同的二级核酸序列可以包含共同的标记物或共同的基质连接部分。根据这一方面，提供了具有完全不同核酸序列的多个核酸探针，其可与不同靶核酸序列杂交，并且其中多个核酸探针具有共同的一级核酸序列。相应地，具有标记物或连接部分的共同的二级核酸序列可以用于间接地标记或提供连接部分至多个核酸探针中的每一个。根据这一方面，单个或共同的一级核酸序列和二级核酸序列对可以用于间接地标记或提供连接部分至不同的核酸探针序列。提供了这样的实施方式，其中，如在阵列上商业合成具有一级核酸结构的多个核酸探针。也可以商业合成经标记的二级核酸序列，从而使其能够与一级核酸序列杂交。核酸探针可与经标记的二级核酸和一种或多种或多个靶核酸序列在使一个或多个核酸探针与一个或多个靶核酸序列杂交、而一级核酸序列与一个或多个靶核酸序列非可杂交的条件下组合。具有标记物或连接部分的二级核酸序列与对应的一级核酸序列杂交。

根据某些方面，一级核酸序列可以用一个或多个标记物或连接部分修饰。根据这一方面，一个或多个标记物或连接部分可以使用本领域技术人员已知道方法添加到一级核酸序列。

根据其他实施方式，核酸探针可以包含配体-配体结合对(如生物素-亲和素)的前一半。这类核酸探针可以或可以不包含一级核酸序列。配体-配体结合对的前一半可以直接连接核酸探针。根据某些方面，配体-配体结合对的后一半可以包含标签或连接部分，或者配体-配体的后一半可以位于靶核酸如染色体上，从而将探针连接于染色体。

通过大规模平行合成产生的复杂寡核苷酸文库可以用作本文所述的探针。这些文库在固体结构上合成，然后经扩增或化学切割，从而将文库移动至溶液中。其他标记的探针包括如us2010/0304994中所述称之为“寡涂针”的那些，通过引用将其全部内容纳入本文用于所有目的。本文所用术语“寡涂针”指这样的可检测标记的多核苷酸，所述可检测标记的多核苷酸具有与寡核苷酸序列(例如，dna序列的部分，例如，特定染色体或特定染色体的亚染色体)互补的序列。寡涂针由合成探针和阵列产生，任选地，所述阵列为计算机图案化的(computationallypatterned)(而不是使用天然dna序列和/或染色体作为模板)。因为寡涂针使用存在于库中的核酸序列生成，所用它们不再是空间可寻址的(即，不再与阵列连接)。然而，令人惊讶的是，该方法相对使用酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)和/或流式分选的染色体制成的染色体涂针，增加了寡涂针的分辨率。

在某些示例性实施方式中，提供了小寡涂针。本文所用术语“小寡涂针”指介于约5碱基和约100碱基长度之间的寡涂针，或约5碱基、约10碱基、约15碱基、约20碱基、约25碱基、约30碱基、约35碱基、约40碱基、约45碱基、约50碱基、约55碱基、约60碱基、约65碱基、约70碱基、约75碱基、约80碱基、约85碱基、约90碱基、约95碱基或约100碱基的寡涂针。小寡涂针可以接触较长寡核苷酸探针不可接触的靶标。例如，在某些方面，小寡涂针可以进入细胞，可以进入细胞核，和/或可以与通过一个或多个蛋白质等部分结合的靶标杂交。小寡涂针还可以用于降低背景，因为它们可以比较大的杂交寡核苷酸序列更加容易地洗掉。本文所用术语“寡喷涂的(oligopainted)”和“寡喷涂的区域”指分别与一个或多个寡涂针杂交的靶核苷酸序列(例如，染色体)或靶核苷酸序列的区域(例如，亚染色体区域)。寡涂针可以包含与基质或可检测标记物连接的连接部分或接头，用于在包括但不限于间期、早前期、前期、前中期、中期、后期、末期和胞质分裂的细胞循环各阶段，靶向具有可检测标记物的核苷酸序列，例如，染色体或染色体的亚染色体区域。寡涂针可以用于衍射受限的(diffraction-limited)显微术(常被称为传统光学显微术)以及超分辨率显微术，即受激发射减损显微术(stimulatedemissiondepletionmicroscopy)或sted，结构化照明显微术(structuredilluminationmicroscopy)或sim，以及单分子超分辨率显微技术，如光激活定位显微术(photo-activatedlocalizationmicroscopy)或palm，随机光学重建显微术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy)或storm以及纳米级测绘中基于dna的点积累(dna-basedpointaccumulationinnanoscaletopography)或dna-paint，这些均为本领域技术人员所知。

在多个位置切割染色体的方法

本公开提供了将染色体、其部分或片段或其他天然产生的核酸与基质连接的方法，所述方法通过切割染色体或其他天然产生的核酸以产生游离端或末端核苷酸，然后修饰游离端或末端核苷酸以包含基质连接部分。本公开提供了使用本领域已知方法的位点特异性切割。染色体切割或断裂后，产生两个或多个染色体片段。这些片段各自可以具有被称之为突出端的破裂末端(fracturedextremity)。这些断端显示出粘性，并且具有粘附到另一个这样的粘性端的能力，这提供了将包含基质连接部分的核苷酸或寡核苷酸与片段连接的方法。该片段还可以包含钝端，包含基质连接部分的核苷酸或寡核苷酸可以直接连接于该钝端，或在修饰钝端以产生突出端后连接于该钝端。

可以将染色体或其他天然产生的核酸置于基质内，从而维持染色体的三维结构以及其在细胞内的相对位置，并且可以将其切割，例如，使用位点特异性切割酶或方法，以使用本领域已知的方法产生游离末端或末端核苷酸。示例性切割酶包括切割双链核酸单链的那些(切口核酸酶)或切割双链核酸两条链的那些。

本公开设想了使用限制性酶或限制性内切核酸酶，其在称为限制性位点的特定识别核苷酸序列处或附近切割dna。限制性酶通常分成3类，其区别在于它们的结构以及它们是否在其识别位点切割dna底物，或者识别和切割位点彼此分开。为了切割dna，限制性酶产生两个切口，每次通过dna双螺旋的各糖-磷酸主链(即每条链)。限制性酶可以容易在文献中确认，并且是市售可得的。基于其组合物和酶辅因子需求、其靶序列的性质和其dna切割位点相对于靶序列的位置，天然产生的限制性内切核酸酶被分为4类(i、ii、iii和iv型)。许多酶识别特异性短dna序列并进行dna内切核酸溶解(endonucleolytic)切割，以产生具有末端5'-磷酸盐的特异性片段。它们区别于其识别序列、亚基组成、切割位置和辅因子需求。

i型酶在远离识别位点的位点切割；需要atp和s-腺苷-l-甲硫氨酸起作用；具有限制性和甲基化酶活性的多功能蛋白质。ii型酶在识别位点内或短的特定距离切割；大多数需要镁；独立于甲基化酶的单一功能(限制性)酶。iii型酶在距离识别位点短距离的位点切割；需要atp(但不将其水解)；s-腺苷-l-甲硫氨酸刺激反应，但不是必需的；并作为具有修饰甲基化酶的复合物的一部分存在。iv型酶靶向修饰的dna，例如，甲基化，羟甲基化和葡糖基羟甲基化dna。v型限制酶(例如，来自crispr的cas9-grna复合物)利用引导rna以靶向在入侵生物体上发现的特定非回文序列。只要提供合适的引导rna，它们就可以切割可变长度的dna。通过将天然或工程改造的dna结合结构域与核酸酶结构域(常常是iis性限制性酶foki的切割结构域)融合可以产生人工限制性酶。这类人工限制性酶可以靶向大dna位点(多至36bp)并且可以经工程改造以结合所需dna序列。锌指核酸酶是最常用的人工限制性酶，通常用于基因工程应用，但也可用于更标准的基因克隆应用。其他人工限制性酶基于tal效应物的dna结合结构域，如talen。示例性的限制性酶包括ecori、ecorii、bamhi、hindiii、taqi、noti、hinfi、sau3ai、pvuii、smai、haeiii、hgai、alui、ecorv、ecop15i、kpni、psti、saci、sali、scai、spei、sphi、stui和xbai。使用限制性内切酶来切割dna述于kejnovsky等,internationaljournalofbiologicalmacromolecules34(2004)213-222中，通过引用其全部内容纳入本文。

本公开设想了使用脱氧核糖核苷酸酶(dna酶)，其可以用于催化dna骨架中磷酸二酯键的水解切割，从而切割核酸，如dna或染色体。各种脱氧核糖核酸酶，无论是外切核酸酶还是内切核酸酶都是本领域已知的，并且它们区别在于底物特异性、化学机制和生物学功能。示例性的dna酶是dna酶i或dna酶ii。

本公开设想了本领域已知的其他方法来切割或剪切dna，如uv辐照或电离辐射。如果电离辐射与dna大分子相互作用，那么转移的能量会破坏其化学键之一，可能会切开一个(单链断裂)或两个(双链断裂)糖磷酸键。

将核苷酸或寡核苷酸连接于游离末端核苷酸的方法

本公开提供了使用本领域技术人员已知的方法(如系连、延伸等)向游离末端核苷酸添加核苷酸或寡核苷酸。通常，可以酶促地或化学地实现系连。“系连(ligation)”表示在两个或多个核酸末端(例如，寡核苷酸和/或多核苷酸)之间在模板驱动的反应中形成共价键或连接。键或键的性质可以广泛变化，并且系连可以酶促或化学方式进行。如本文所用，系连通常通过酶促进行，以在一个寡核苷酸末端核苷酸的5'碳与另一个寡核苷酸的3'碳之间形成磷酸二酯键。这样的连接酶包括：本领域技术人员已知的dna连接酶和本领域技术人员已知的rna连接酶。dna连接酶包括细菌和哺乳动物dna连接酶。示例性连接酶包括：t3连接酶、t4连接酶、t7连接酶、大肠杆菌dna连接酶、taqdna连接酶、环状连接酶等。下述文献中描述了各种模板驱动的系连反应，通过引用全文纳入本文：whitely等，美国专利第4,883,750号；letsinger等，美国专利第5,476,930号；fung等，美国专利第5,593,826号；kool，美国专利第5,426,180；landegren等，美国专利第5,871,921号；xu和kool(1999)nucl.acidsres.27:875；higgins等，meth.inenzymol.(1979)68:50；engler等(1982)theenzymes,15:3(1982)；和namsaraev，美国专利公开号2004/0110213。化学系连方法公开于ferris等，nucleosides&nucleotides,8:407-414(1989)和shabarova等，nucleicacidsresearch,19:4247-4251(1991)。酶促系连利用连接酶。本领域已知许多连接酶，如lehman,science,186:790-797(1974)；engler等,dnaligases,boyer第3-30页，编辑，theenzymes,第15b卷(学术出版社(academicpress)，纽约，1982)；等。示例性连接酶包括：t4dna连接酶，t7dna连接酶，大肠杆菌dna连接酶，taq连接酶，pfu连接酶等。使用连接酶的某些方案由制造商公开并且也在sambrook,《分子克隆实验手册》(molecularcloning:alaboratorymanual)，第二版(冷泉港实验室出版社,纽约,1989)；barany,《pcr方法和应用》(pcrmethodsandapplications),1:5-16(1991)；marsh等,strategies,5:73-76(1992)中公开。

核苷酸还可以通过聚合酶添加至游离末端核苷酸。聚合酶是产生核酸序列的酶。这类聚合酶可以是模板依赖性或非模板依赖性的。产生rna聚合物的聚合酶被称为rna聚合酶，而产生dna聚合物的聚合酶被称为dna聚合酶。示例性dna聚合酶包括dna聚合酶i、dna聚合酶ii，dna聚合酶iii，dna聚合酶iv，dna聚合酶v等。dna聚合酶为本领域技术人员熟知。示例性rna聚合酶包括rna聚合酶、rna聚合酶ii、rna聚合酶iii、t7rna聚合酶等。rna聚合酶为本领域技术人员熟知。

包含错误的聚合酶是本领域已知的，并且在本文中称为“易错聚合酶”。非模板依赖性聚合酶可以是易错聚合酶。非模板依赖性聚合酶，如末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)，也被称为dna核苷酸基内转移酶(dnanucleotidylexotransferase，dntt)或末端转移酶，其通过催化核苷酸添加到不具有模板的dna分子的3'末端制备核酸链。tdt的进一步描述在biochimbiophysacta.,2010年5月；1804(5):1151–1166中提供，其全部内容通过引用纳入本文。

在合成期间可以添加修饰的核苷酸。合成可指代，例如，寡核苷酸的固体支持物合成。在该情况中，修饰的核酸可以是核酸类似物，或用基质连接部分修饰的核酸，所述修饰的核酸是核酸片段。合成也可指代由聚合酶进行的过程，同时其合成核酸模板的互补链。某些dna聚合酶能够使用并纳入用基质连接部分修饰的核酸类似物(或修饰的核酸)至互补核酸模板。

通过将含有核苷酸的寡核苷酸与突出端杂交或通过产生突出端，如通过含有核苷酸的寡核苷酸的系连和杂交，该核苷酸可以直接添加至游离末端核苷酸。或者，连接部分可以用于将第一寡核苷酸与游离末端核苷酸连接，而含有基质连接部分的互补寡核苷酸可与第一寡核苷酸杂交。直接加入标记物或连接部分的方法述于本文。

实施例i

在膨胀的基质内使用fisseq对寡涂针测序

将pgp1f细胞接种于玻璃显微载玻片上，并且使其在细胞培养箱中37℃过夜粘附。第二天，将载玻片上的细胞转移至科普林氏缸(coplinjar)，并用1xpbs洗涤1次，然后在rt(室温)下用4％甲醛的pbs固定10分钟。进行另一次1xpbs洗涤，并在1xpbs+0.5％曲通x-100中在rt下透化10分钟。在rt下进行5分钟两次1xpbs+0.1％曲通x-100(1xpbt)洗涤，每次各5分钟。然后可以将载玻片以4℃储存于1xpbt中，或用于实验。如果进行实验，以rt在0.1nhcl中处理载玻片5分钟。在rt下于2xssc吐温中进行5分钟的两次洗涤。然后，在rt下于50％甲酰胺的2xssct溶液中5分钟进行预杂交。在相同缓冲液中的另一洗涤以60℃进行20分钟。将载玻片稍微风干，并将25ul探针溶液添加至各载玻片，所述探针溶液包含50％甲酰胺中的100pmols寡涂针、10％聚丙烯酸、2xssct和20mgrna酶1，用22x22mm盖玻片覆盖并用橡胶胶合剂密封。探针于42℃在湿度箱中杂交过夜。第二天，小心地去除橡胶胶合剂和盖玻片。未结合的探针于60℃用2xssct进行20分钟洗脱。在rt下进行2次2xssct洗涤，每次5分钟，然后在rt下进行0.2xssc洗涤5分钟。使用胶凝室(封口膜包裹的玻璃显微镜载玻片与有用作间隔物的2个22x221.5盖玻片)将30ul的exm凝胶浇铸于载玻片上的细胞，并于37℃聚合1小时。聚合后，小心地去除胶凝室，并将载玻片上的凝胶在消化缓冲液和1:100的neb蛋白酶k(20mg/ml)中以37℃消化过夜。消化后，去除玻璃载玻片，并通过在rt下振荡2次7分钟，将凝胶在1xpbs中膨胀。为了确保凝胶在后续的步骤期间保持膨胀，将凝胶再次包埋。用具有0.05％aps和0.05％temed的1xpbs中的3％丙烯酰胺/bis将凝胶在rt下于1.5ml管中倾斜20分钟。然后去除凝胶并置于显微载玻片。将经破碎以足够覆盖凝胶的一块1.5盖玻片置于凝胶之上。将显微载玻片上被覆盖的凝胶置于湿度箱，所述湿度箱中充满了氩气以从箱中去除氧气。胶凝在37℃下进行1小时。再次包埋的凝胶在rt下于100mmmes中洗涤1次，7分钟。将样品在rt下于150mmedc、150mmnhs、2m乙醇胺盐酸盐和5mnacl中钝化2小时。然后通过向凝胶中加入2m乙醇胺盐酸盐、62.5mm硼酸钠缓冲液(ph8.5)和5mnacl，使乙醇胺在rt下反应40分钟。然后在rt下将凝胶在1xsolid仪器缓冲液中在室温下洗涤3次、10分钟。在rt下于1xt4连接酶缓冲液中洗涤7分钟以准备寡涂针环化。然后通过在rt下添加1xt4连接酶缓冲液中的2um寡核苷酸夹板(oligosplint)和，t4dna连接酶并轻轻摇动2小时，使寡涂针环化。然后将样品在rt下于1x仪器缓冲液中洗涤2次7分钟，然后在rt下于1xneb缓冲液1中洗涤7分钟。ssdna和非环化的寡涂针被37℃、45分钟的1x外切核酸酶i缓冲液中的1ulneb外切核酸酶i降解。在rt下进行3次1x仪器缓冲液洗涤7分钟，然后在rt下于2xssc中的30％甲酰胺中洗涤1次10分钟。1um滚环扩增(rca)引物(与夹板一样)的杂交在rt下于30％甲酰胺和2xssc中经1小时实现。在rca引物杂交后，在仪器缓冲液中洗涤样品2次各10分钟，然后在phi29聚合酶缓冲液中洗涤1次10分钟。rca通过在30℃添加1xphi29缓冲液、250umdntp、20um氨基烯丙基dutp和2单位的phi29dna聚合酶过夜进行。rca扩增子在rt下于980ul1xpbs中的20ulbs(peg)9中交联30分钟。通过在1mtris(ph8.0)中孵育样品45分钟来完成bs(peg)9的猝灭。然后将猝灭的样品在rt下于1x仪器缓冲液中洗涤3次10分钟。为了准备测序，将5xssct中的2.5um测序引物在rt下杂交1小时。在1x仪器缓冲液中洗涤2次各10分钟，然后在rt下于1xt4dna连接酶缓冲液中洗涤10分钟。为了测序，在rt下向各样品中加入1xt4连接缓冲液、5ul的t4dna连接酶、1ul的solid测序核苷酸混合物以及84ul的水，持续2小时。然后在成像前用1x仪器缓冲液在rt下洗涤样品1小时。图2显示了在固定和膨胀的人细胞中原位实现了寡涂针环化，然后进行滚环扩增以及通过系连的1轮solid测序。

实施例ii

具有acrydite连接部分的寡涂针与基质连接并与具有可检测部分的二级寡核苷酸杂交

首先线性地pcr扩增寡涂针文库以限制pcr错误。pcr产物经柱纯化，并重悬于水中。再次pcr扩增该线性产物，并将t7启动子序列经由反向引物添加至各后道(互补序列的非基因组序列下游)。将1.3ug的纯化pcr产物在37℃下体外转录过夜。该rna用作逆转录的模板，其使用含有5'acrydite修饰的正向引物将acrydite附加到寡涂针上。rna通过碱水解降解。然后以zymo100柱纯化试剂盒纯化样品，其中使用寡核苷酸结合(oligobinding)缓冲液而非dna结合缓冲液。然后将acrydite修饰的寡涂针用于标准fish方案中。过夜杂交acrydite修饰的寡涂针后，使用胶凝室将exm(可膨胀基质)凝胶浇铸于样品上，并使其在37℃下聚合1小时。在具有1:100蛋白酶k(neb)的消化缓冲液中过夜消化细胞。在2xssct中将凝胶洗涤3次30分钟。然后切下并分离凝胶，使得一些样品可以用二级寡核苷酸(样品n)探测，并且一些样品可以在用二级探针(样品d)探测之前变性以评估对exm凝胶基质的栓系。样品n在rt下保持于2xssct中。将样品d在73℃下于70％甲酰胺/2xssc中孵育3分钟2次，以确认acrydite修饰的寡涂针与基质的栓系。然后样品d在rt下用2xssct洗涤2次、10分钟。3.3um二级寡核苷酸在rt下与样品n和d杂交1小时。将凝胶在rt下于30％甲酰胺的2xssct中洗涤2次、30分钟。在2xssct中进行2次洗涤、10分钟，然后在rt下于pbs中的1：500dapi染色20分钟。然后对样品成像。图3a-3e涉及成功合成在5'端具有acrydite修饰的寡涂针，并且在高浓度甲酰胺加热处理后，寡涂针保持栓系并能够通过二级寡核苷酸杂交(图3e)。这与不再存在于样品中的非修饰的寡涂针不同。

贯穿本发明中所引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容通过引用全文纳入本文并用于所有目的。

等同形式

其他实施方式对于本领域技术人员而言将是显而易见的。应当理解的是，前述仅为了清楚描述而提供，并且仅仅是示范性的。本发明的精神和范围并不限于上述示例，而是被所述权利要求所包括。以上引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体指出通过引用并入。