测量微生物计数的方法与流程

本发明涉及一种简单且容易地测量样品中的微生物计数的方法。

背景技术：

就饮用水、软饮料、工业水、制药用水(pharmaceuticalwater)、透析(dialysis)水等而言，要求污染等级应该最小，且众所周知，存在于其中的微生物的计数通常非常低。尤其来说，就饮用水而言，活细胞(viablecell)计数的标准是100菌落形成单位/毫升(cfu/ml)或小于100菌落形成单位/毫升，且就透析水而言，标准是10菌落形成单位/毫升或小于10菌落形成单位/毫升。在标准控制上，监测以定期评估精确的微生物计数是重要的(非专利文献1)。

针对食物或类似物中微生物的检测，通常采用对1毫升的样品悬浮液或类似物进行浇灌培养(pourculture)的方法。然而，就存在于其中的微生物的计数非常低的例如饮用水的样品而言，可能并不能通过以上方法精确地测量微生物计数。举例来说，在10菌落形成单位或小于10菌落形成单位的微生物存在于100毫升中的情况下，如果只检验1毫升样品，可能不能检测到微生物，以致可能不能精确地评估污染状况。

为了消除这种缺点，此前已使用薄膜过滤器法(membranefiltermethod)。即，通过薄膜过滤器来过滤液体样品的总量以在薄膜过滤器的表面上捕获样品中的微生物，且接着在琼脂培养基(agarmedium)平板上进行培育(非专利文献2)。通过所述方法可精确地测量即使存在于大量样品中的微生物的低计数。

引用文件列表

非专利文献

npl1：日本药典第17版，通用信息，g8水

npl2：日本临床工程师协会(japanassociationforclinicalengineers)2014年3月11日2.01版"tosekiseijou-ka指南(针对更清洁的透析的指南(guidelineforcleanerdialysis))"。

技术实现要素：

技术问题

然而，对薄膜过滤器法来说，用于过滤的包含漏斗和吸引泵(suctionpump)的设备是必要的，且每次对每一零件进行杀菌是麻烦的。另外，某些技能是操作所必需的，因为如果过滤之后将薄膜过滤器放置在琼脂培养基上，薄膜过滤器与琼脂培养基表面之间形成气泡，那么会出现以下问题：一些捕获到的微生物可能不接触培养基，且不在将要检测的位置上。

鉴于这类情形，本发明的目标是提供一种简单且精确地测量液体样品中的微生物计数(尤其是存在于大量液体样品中的微生物的低计数)的方法，而不使用特殊仪器。

问题解决方案

本发明人努力研究以实现达成通过利用液体样品本身作为构成培养基的溶剂来简化操作以及通过培育来发展菌落以使样品中的微生物可视化的目的。另外，已发现，从执行微生物计数测量进而完成本发明的简单操作和易于视觉识别的观点来看，聚丙烯酸和/或其盐是用于这种培养基的成分的合适的胶凝剂(gellingagent)。

即，本发明如下。

[1]一种用于制备培养基以供微生物计数测量的组合物(下文称为“本发明的组合物”)，包括(a)聚合物，无需通过加热的熔融步骤且无需冷却便能够形成不可流动透明凝胶，以及(b)营养成分。

[2]根据上文[1]的组合物，其中聚合物能够保留多达自身重量的10倍或大于10倍的水。

[3]根据上文[1]或[2]的组合物，其中凝胶不发生水分离。

[4]根据上文[1]到[3]中的任一者的组合物，其中聚合物具有作为单体单元的丙烯酸。

[5]根据上文[4]的组合物，其中聚合物是聚丙烯酸和/或其盐。

[6]根据上文[1]到[5]中的任一者的组合物，进一步包括(c)着色试剂。

[7]一种用于测量微生物计数的试剂盒，包括根据上文[1]到[6]中的任一者的组合物，以及培养容器。

[8]一种测量微生物计数的方法(下文称为“本发明的测量方法”)，包括：将根据上文[1]到[6]中的任一者的组合物与添加到其中的样品进行共混的步骤，

培育含于样品中的微生物的步骤，以及

测量微生物的菌落计数的步骤。

[9]根据上文[8]的方法，其中样品中的微生物计数是0.1菌落形成单位/毫升或小于0.1菌落形成单位/毫升。

[10]根据上文[8]或[9]的方法，其中样品重量高达组合物中的聚合物的重量的10倍到10000倍。

[11]一种用于测量微生物计数的组合物的用途，所述组合物包括(a)聚合物，无需通过加热的熔融步骤且无需冷却便能够形成不可流动透明凝胶，以及(b)营养成分。

[12]一种在用于制备培养基以供微生物计数测量的组合物的制造中的(a)聚合物以及(b)营养成分的用途，所述聚合物无需通过加热的熔融步骤且无需冷却便能够形成不可流动透明凝胶。

虽然下文中不存在对样品的特定限制，但样品通常是液体样品，且具体地说是水性液体样品，例如饮用水、软饮料、工业水、制药用水、透析水以及尿液。

另外，微生物在下文中通常意指大肠菌群(coliformgroup)、葡萄球菌(staphylococci)、弧菌属细菌(vibriobacteria)、肠球菌(enterococci)、真菌(fungi)、枯草杆菌(bacillussubtilis)等。

本发明的有利效应

根据本发明可简单且精确地测量样品中的微生物计数。尤其来说，可成功地定量检测到即使存在于大量样品中的微生物的低计数。

附图说明

[图1]图1是在袋型容器(100毫升容量)中使用本发明的组合物的一个实施例的照片。

[图2]图2是在实例1中100毫升凝胶中的红色菌落的照片。

具体实施方式

本发明的组合物强制性地含有(a)聚合物，无需通过加热的熔融步骤且无需冷却便能够形成不可流动透明凝胶，以及(b)营养成分。

本发明的组合物是用于制备培养基以供微生物计数测量。所述制备通常通过以下来进行：添加含有原样(asitis)测量目标微生物的液体样品作为用于构成培养基的凝胶的溶剂，且将其共混在一起。在这种使用模式下，本发明的组合物和使用其制备的培养基不同于用于微生物的常规培养基。

从另一观点来看，本发明可被视为一种用于测量微生物计数的组合物的用途，所述组合物包括(a)聚合物，无需通过加热的熔融步骤且无需冷却便能够形成不可流动透明凝胶，以及(b)营养成分。

此外，本发明可被视为一种在用于制备培养基以供微生物计数测量的组合物的制造中的(a)聚合物以及(b)营养成分的用途，所述聚合物无需通过加热的熔融步骤且无需冷却便能够形成不可流动透明凝胶。

(a)聚合物起到构成用于培育和测量目标微生物的培养基的胶凝剂的作用，所述聚合物无需通过加热的熔融步骤且无需冷却便能够形成不可流动透明凝胶。聚合物通过与液体样品共混来形成凝胶。

作为聚合物，能够优选地保留多达自身重量的10倍或大于10倍的水、更优选地保留多达自身重量的20倍或大于20倍的水且进一步优选地保留多达自身重量的30倍或大于30倍的水的聚合物是适合的。通过对水的这种保留，可形成适用于制备培养基的凝胶。

由于形成的凝胶不可流动，微生物的丰度(abundance)可精确地被测量。另外，优选的是凝胶中不发生水分离。如果发生水分离，虽然微生物的菌落的存在可定性地检测，但是有时可能很难精确地测量丰度。就这一点而言，水分离意指保留在凝胶中的水与凝胶分离。另外，“不发生水分离”具体意指例如在室温下静置60分钟之后，将要与凝胶分离的水的量保留在凝胶中的初始水量优选地是0.5％或小于0.5％，且更优选地是0.1％或小于0.1％。

由于将要形成的凝胶是透明的，可在视觉上精确地检测到微生物的菌落。就这一点而言，“透明”意味着当将聚合物添加到在将要形成的凝胶不可流动的浓度下的蒸馏水中时，通过分光光度法测量(光学路径长度：1厘米)得出的可见光透射率优选地是70％或大于70％(就蒸馏水的可见光透射率为100％而言)，但不限于此。

由于聚合物能够在无需通过加热的熔融步骤且无需冷却的情况下形成凝胶，所以操作变简单且不阻碍目标微生物的生长。就这一点而言，“加热”在本文中意指使温度从室温升高，且具体来说使温度升高到微生物不可存活的范围，例如超过60℃。同时，“冷却”意指使聚合物从其溶解于液体样品中的温度冷却。另外，“室温”在下文通常意指从1℃到40℃，优选地从1℃到30℃，且进一步优选地从20℃到30℃。

这种聚合物的优选实例包含具有作为单体单元的丙烯酸的彼等聚合物，且在其具有作为单体单元的丙烯酸的情况下，其不但可以是均聚物(homopolymer)，还可以是共聚物(copolymer)或甚至交联聚合物。具体来说，所述聚合物优选地是聚丙烯酸和/或其盐，或其衍生物，且聚丙烯酸钠尤其适合。

聚丙烯酸钠是所谓的超吸收性聚合物(superabsorbentpolymer)中的一种，且能够在无需加热或冷却的情况下在室温下固化液体，且此外能够通过简单的混合操作(例如温和摇晃)来形成均匀固态。因此，对于培养基的制备操作是简单且容易的。

使用聚丙烯酸钠所产生的凝胶具有高透明度。另外，由于可以低成本获得聚丙烯酸钠，所以其是适合于本发明的胶凝剂。

一般来说，对微生物培养基等来说，使用例如琼脂、角叉菜胶(carrageenan)以及刺槐豆胶(locustbeangum)的胶凝剂，在均匀地固化液体溶剂时需对胶凝剂进行加热。因此，上文的胶凝剂不适合于原样固化含有微生物的液体样品。另外，还因为使用胶凝剂固化的凝胶具有低透明度，所以上文的胶凝剂不适合。

同时，聚(乙烯醇)具有以下缺点：其很难均匀地与液体溶剂混溶且其易于引起水分离。另外，就黄原胶(xanthangum)而言，黄原胶也难以与液体溶剂混合，且易于发展结块且进一步使得固化凝胶不透明。

由于羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)不能够固化液体样品且形成了可流动凝胶，所以羧甲基纤维素不适合于微生物的定量检测。

同时，透明质酸(hyaluronicacid)能够形成具有高保水力(waterretentioncapacity)和低流动性的透明凝胶，因此其适用于本发明。然而，从成本方面看，聚丙烯酸和/或其盐是更优选的。

在将聚丙烯酸钠用作根据本发明的(a)聚合物的情况下，从固化力(solidificationpower)的观点来看，10,000或大于10,000的聚合度是优选的，且22,000或大于22,000的聚合度是更优选的。其可交联或不交联。

虽然在根据本发明的使用期间不存在对聚丙烯酸钠的浓度的特定限制，但是例如优选地是10克/100毫升到0.01克/100毫升，且更优选地是5克/100毫升到0.5克/100毫升。

在使用另一(a)聚合物的情况下，使用期间的浓度可在任何范围中，只要形成固体凝胶，且达到不削弱本发明的优点的程度。

(b)营养成分用于发展目标微生物。

虽然不存在对营养成分的特定限制，但是其优选实例包含蛋白胨(peptone)、动物肉提取物、酵母提取物以及鱼肉提取物。

如非专利文献1中所描述，推荐使用标准琼脂培养基以用于测试饮用水，且使用r2a琼脂培养基以用于测试制药用水和透析水。因此，优选地使用从中除去了琼脂的琼脂培养基的培养液培养基(brothmedium)或等效成分作为本发明的组合物的成分。

本发明的组合物优选地进一步包括(c)着色试剂。这是用于使将要通过培育形成的微生物菌落着色，使得对其的检测和测量可变得更容易。

着色试剂的实例包含氧化还原指示剂，例如2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride；ttc)和四唑紫(tetrazoliumviolet)。对于应测量存在于样品中的所有种类的微生物的情况，可有利地使用所述氧化还原指示剂。当使用ttc时，其在使用期间的浓度优选地是100毫克/升到1毫克/升，且更优选地是50毫克/升到10毫克/升。

作为显色试剂，可使用化合物，所述化合物是仅由特定种类的微生物拥有的酶的受质(substrate)(下文称为“酶受质(enzymesubstrate)”)且能够通过降解来释放着色剂化合物(colorantcompound)。可有利地使用所述化合物以用于测量特定微生物。

就这一点而言，作为着色剂化合物，可使用在可见光下着色或发出荧光的任何种类的着色剂化合物。在可见光下作为着色化合物释放的官能基的实例包含5-溴-4-氯-3-吲哚基。释放的5-溴-4-氯-3-吲哚通过氧化缩合转换成5,5'-二溴-4,4'-二氯-靛蓝以显现蓝色。作为荧光化合物释放的官能基的实例包含4-甲基伞形基(4-methylumbelliferylgroup)。释放的4-甲基伞形酮在紫外光照射下发出荧光。

可有利地使用的酶受质的实例在目标微生物是大肠菌群的情况下包含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳吡喃糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-galactopyranoside；x-gal)和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖醛酸；在目标微生物是黄色葡萄球菌属的情况下包含5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indoxylphosphate；x-phos)；在目标微生物是肠球菌属的情况下包含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄吡喃糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-glucopyranoside；x-gluc)；且在目标微生物是真菌(fungus)的情况下包含x-phos、5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸盐以及5-溴-4-氯-3-吲哚丁酸盐。另外，在应检测到所有种类的微生物的情况下，可以将上文的所有酶受质组合使用。

酶受质在使用期间的浓度优选地是例如从0.01克/升到1.0克/升，且更优选地是从0.2克/升到1.0克/升。

本发明的组合物可进一步包括选择性剂(selectiveagent)、抗菌物质(antibacterialsubstance)、无机盐、糖类(saccharide)、增稠剂(thickener)、ph调节剂等。

选择性剂的实例包含抗生素，例如多粘菌素b和万古霉素，以及表面活性剂，例如月桂基硫酸钠(sodiumlaurylsulfate；sds)、吐温(tween)80以及包含胆酸钠的胆汁盐。

抗菌物质的实例包含聚离胺酸、硫酸鱼精蛋白、甘胺酸以及山梨酸。

无机盐的实例包含无机酸金属盐，例如氯化钠和硫代硫酸钠，以及有机酸金属盐，例如丙酮酸钠、柠檬酸铁铵以及柠檬酸钠。

糖类的实例包含葡萄糖、乳糖、蔗糖、木糖、纤维二糖以及麦芽糖。

增稠剂的实例包含淀粉和其衍生物、透明质酸、丙烯酸衍生物、聚醚以及胶原蛋白。

ph调节剂的实例包含碳酸钠和碳酸氢钠。就这一点而言，本发明的组合物构成使用期间的ph(从目标微生物的生长的观点来看)优选地变成从6.0到8.0，且更优选地从6.5到7.5。

本发明的组合物可与培养容器组合提供为用于测量微生物计数的试剂盒。

培养容器是用于接收通常未经例如浓缩和稀释的处理的原样液体样品，且使液体与本发明的组合物在其中混合以允许含于组合物中的聚合物凝胶化(gelate)，以使得形成用于培育微生物的培养基。

不存在对培养容器的形状的特定限制，可充分容纳必要量的液体样品即可。举例来说，为了通过摇晃以将本发明的组合物与液体样品进行共混，具有例如圆柱形形状且由抗变形材料制成的容器是优选的。同时，例如，在通过连同容器一起摩擦或挤压以将本发明的组合物与液体样品进行共混的情况下，由柔性材料制成的可容易地变形的容器是优选的。容器的优选实例包含由聚乙烯基类(polyvinyl-type)聚合物或聚乙烯类(polyethylene-type)聚合物制成的袋型容器，且具有例如罩盖和拉链的扣合物的容器是更优选的(参考图1)。另外，培养容器优选地是透明的，因为可从容器的外部容易地测量微生物菌落。不存在对最大可接收量的特定限制，且优选实例是100毫升到1000毫升，这适合应用于含有较小微生物的计数的大体积样品。

就常规试剂盒而论，样品与先前制备的培养基接触，且接着执行培育和测量。对比而言，本发明的用于测量微生物计数的试剂盒适用于一使用模式，其中使用培养容器中的液体样品本身作为溶剂使得聚合物凝胶化，以使得样品中的微生物在凝胶中培育且接着测量。

培养容器还可以是适用于检测体积小到约1毫升的样品的小型平板(片材(sheet))。

所述小型平板的实例包含普通培养皿和组合培养皿状(dish-like)凹形片材与扁平或凸形片材的容器类型。通过形成扁平形状，可更容易地测量微生物菌落。另外，通过缩小所述小型平板的尺寸，可容易地同时处理多个样品。

由于这种小型扁平形状培养容器可适用于经过稀释的样品，所述培养容器还适用于样品中的微生物计数是例如300菌落形成单位/毫升或小于300菌落形成单位/毫升的情况。

上文所描述的本发明的用于制备培养基以供微生物计数测量的组合物可有利地用于本发明的测量方法。

本发明的测量方法包括：将本发明的组合物与添加到其中的样品进行共混的步骤；培育含于样品中的微生物的步骤；以及测量微生物的菌落计数的步骤。

可通过任选方法将本发明的组合物与液体样品进行共混，且例如可通过将容器和其内容物一起摇晃、挤压所述容器和其内容物或使用无菌工具搅拌内容物来将本发明的组合物与液体样品进行共混。

不存在对针对微生物的培育条件的特定限制，且可取决于目标微生物的类型来适当地选择培育条件。举例来说，35±2℃和24小时到48小时是优选的。

在培育之后，目标微生物的已生长的菌落在培养基中出现，且可在视觉上或以其他方式检测到，且可精确地测量已生长的菌落的计数。

可将本发明的测量方法有利地用于具有低丰度微生物的样品，即高度清洁的样品。举例来说，所述测量方法适合于样品中的微生物计数低到0.1菌落形成单位/毫升或小于0.1菌落形成单位/毫升的情况，所述情况无法通过使用1毫升的普通检查来检测。

一般来说，就具有高丰度微生物的样品而言，可在适合于检测方法来适当地稀释样品之后执行测量，然而就低丰度的情况而言，浓缩可能是麻烦或困难的。本发明的测量方法即使在这种情况下也是有用的，因为可简单且精确地检测到微生物计数。

另外，本发明的测量方法非常有用，因为即使是大量液体样品也可在无需预处理的情况下以原样经受测量。举例来说，在样品重量对应于本发明的组合物中的(a)聚合物(例如就聚丙烯酸钠而论)的保水力大到聚合物重量的10倍到10000倍而较大的情况下，所述测量方法也是适合的。或更具体地说，在样品具有例如100毫升或大于100毫升的大体积的情况下，所述测量方法也是适合的。

不存在对本发明的测量方法可适用于的样品的特定限制，且所述样品的实例包含液体样品，例如饮用水、软饮料、工业水、制药用水、透析水以及尿液。所述测量方法还可适用于通过预先使用胰蛋白酶(tryptic)大豆培养液等培育样品而产生的培养液。

实例

接下来，将借助于实例详细地描述本发明，前提是本发明不受所述实例限制。

(实例1)

(1)用于制备培养基以供微生物计数测量的组合物的产生

在150毫升圆柱形透明塑料容器中混合具有表1中所阐述的组合物的源材料，以产生本发明的组合物。

[表1]

表1

*作为聚丙烯酸钠，使用aqualicca(日本触媒株式会社(nipponshokubaico.,ltd.))。

(2)测试用菌株

将枯草杆菌nbrc3134和大肠杆菌nbrc102203用作测试用菌株。所述枯草杆菌和大肠杆菌中的每一个在胰蛋白酶大豆琼脂培养基上预培养24小时，且使用无菌的棉签悬浮于无菌的生理盐水溶液中来形成对应于麦克法兰(mcfarland)浊度标准#1(约3.0×10⁸菌落形成单位/毫升)的细菌储备溶液。使用每一细菌储备溶液，用无菌的生理盐水溶液反复进行10倍连续稀释降至10^-8，以产生若干菌落形成单位/毫升(cfu/ml)的细菌稀释溶液。将一个(1)毫升的细菌稀释溶添加到99毫升无菌水中，以形成具有低到若干菌落形成单位/100毫升(cfu/100ml)的微生物计数的样品液体。将各自为100毫升的量的每一样品液体添加到如上所产生的组合物中，且上下摇晃混合物以在室温下进行共混和固化。静置固化的培养基以允许在35℃下培育24小时，且接着检验是否出现了发展。

(比较例1和比较例2)

同样，通过将30克聚(乙烯醇)(重均分子量：5000到200000，以及皂化度：85％到90％)或10克黄原胶(分子量2000000或高于2000000，生产商的产品号：02960021，生产商：mp生物医疗公司(mpbiomedicalsinc.)，以及经销商：和光纯药工业株式会社(wakopurechemicalindustries,ltd.))代替实例1中的聚丙烯酸钠进行共混，来制备对应的组成物作为比较例1和比较例2。测试菌株以与实例1相同地进行评估。

(评估结果)

图2显示实例1中的枯草杆菌的菌落。

就使用本发明的组合物的实例1而论，具有任一个细菌菌株的样品液体快速固化，且在培育之后，如图2中所显示，在透明凝胶中识别红色菌落且可容易地测量菌落计数。

另一方面，就比较例1(即，使用聚(乙烯醇)的组合物作为胶凝剂)而论，具有任一个细菌菌株的样品液体可能仅部分地固化且识别出液体成分的分离。另外，就使用黄原胶作为胶凝剂的比较例2而论，黄原胶本身结团，使得液体成分可能固化得不均匀，从而形成大量不溶物。另外，固化部分是不透明的。

工业实用性

根据本发明可简单且精确地测量样品中的微生物计数。尤其来说，即使是存在于大体积样品中的微生物的低计数也可成功地定量检测到。因此，即使就例如饮用水的高度清洁的样品而言，存在于其中的少量微生物的计数也可成功地彻底测量。因此，本发明是有用的。