2016年7月26日曾提交美国临时专利申请no.62/366,696，该临时专利将在此引用并整合入本文。
本文涉及有关纯化、活化和扩增t细胞及其亚群的方法。
背景技术：
过继性免疫疗法作为治疗多种疾病的治疗手段，包括癌症和慢性病毒感染，具有巨大的潜力。基于一些众所周知的显著临床成效，比如经基因工程改造的t细胞可以表达针对cd19的嵌合抗原受体(car-t细胞)，这些受体的作用可抑制b细胞恶性肿瘤，以及对实体肿瘤中可靶向的独特肿瘤标志物的深入探求，免疫细胞－特别是t细胞的纯化、活化、扩增和基因修饰已经成为一个重要的领域。目前正处于期待治愈各种癌症的早期阶段，人们在这些领域中正在付出非常大的努力。然而，由于提供这种治疗的显著成本和复杂性，非常需要开发简单、经济、有效和符合cgmp的方法。本文报道的方案以期满足这些以及其他需求。
技术实现要素：
本文报道提供同时分离和活化t细胞或其亚群的方法。
在一些方案中提供了同时分离和活化t细胞群或其亚群的方法。在一些方案中，该方法包括：a)将标记的磁性颗粒、至少一种可结合于t细胞表面受体并活化t细胞的抗体和血液样品一起温育；b)将混合的样品置于磁力之中；c)将与磁性颗粒结合的细胞与未结合的细胞分离。其中标记的磁性颗粒用共捕获试剂标记。
一些方案中提供了同时分离和活化t细胞群或其亚群的方法。在一些方案中，所述的方法包括：a)温育样品。所述样品包含：血液样品；非磁性颗粒，其至少可与一种第一抗体结合，该第一抗体与t细胞表面蛋白结合并活化血液制品中的t细胞；磁性颗粒其至少与一种第二抗体结合，后者与血液样品中的非t细胞的表面蛋白结合，其中第二抗体不与非磁性颗粒结合；b)对样品施加磁力；c)将与磁性颗粒结合的细胞与未与磁性颗粒结合的细胞分离；d)可任选培养未与磁性颗粒结合的细胞以扩增此细胞群。
在一些方案中，提供了同时分离和活化t细胞亚群的方法，该方法包括：a)孵育样品：其包含血液样品；与至少一种第一抗体结合的磁性颗粒，其与血液样品中所需细胞亚群的细胞表面蛋白结合；一群非磁性颗粒与至少一种第二抗体结合，并活化血液样品中所需的细胞亚群，其中第二抗体不与磁性颗粒结合；b)对样品施加磁力；c)将与磁性颗粒结合的细胞与未与磁性颗粒结合的细胞分离；d)可任选培养与磁性颗粒结合的细胞以扩增此细胞亚群。
在一些方案中，提供了同时分离和活化t细胞亚群的方法，该方法包括：a)孵育样品：包含血液样品；与至少一种第一抗体结合的磁性颗粒，第一抗体与血液制品中非所需细胞亚群结合；至少与一种第二抗体结合的非磁性颗粒与，此第二抗体与血细胞中的所需细胞亚群表面蛋白结合并活化此细胞亚群，其中第二抗体不与磁性颗粒结合；b)对样品施加磁力；c)将与磁性颗粒结合的细胞与未与磁性颗粒结合的细胞分离；d)可任选培养未与磁性颗粒结合的细胞以扩增细胞亚群。
具体实施方式
本文所使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。例如，对“组合物”的提及包括多种这样的组合物，以及单一组合物，并且对“一种抗体”的提及是指技术人员已知的一种或多种抗体及其等同物。
如本文所用，术语“由……组成”(和其任何形式，例如其单数和过去时)，“有”(和任何形式的有，例如其单复数)，“包括”(和任何形式的包括，例如其单复数)或“包含”(以及任何形式的包含，例如其单复数)，可以指包括或开放，并且不排除其他未提及的元素或方法步骤。
如本文所用，术语“约”是指其数值加或减10％。因此，约50％意味着在45％至55％的范围内。如这里当引用范围时，术语“约”修改范围的两端，即使该术语未被明确使用。例如，短语“约4：1”表示“约4至约1”的比率。另外，在使用术语“约”的情况下，还包括量或范围没有“约”的。例如，约2：1也含2：1的比例。
本文所用术语“抗体”是指包含至少一个功能性免疫球蛋白可变区序列的多肽，例如免疫球蛋白链或其片段。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。在一个方案中，抗体分子包含全长抗体或其抗原结合或功能片段。例如，全长抗体是天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(ig)分子(例如，igg抗体)。在方案中，抗体分子是指免疫球蛋白分子中有的免疫活性的抗原结合部分，例如抗体片段。抗体片段，例如功能片段，包含抗体的一部分，例如fab、fab′、f(ab′)2、f(ab)2、可变片段(fv)、区域抗体(dab)或单链可变片段(scfv)。功能性抗体片段与完整(例如全长)抗体识别结合相同的抗原。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链的可变区组成的“fv”片段，或由轻链和重链可变区重组的单链多肽分子通过连接肽组合(“scfv蛋白”)。在一些方案中，抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如fc片段或单个氨基酸残基。示例抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如dab(区域抗体)、单链、fab、fab′和f(ab′)2片段，以及单链可变区片段(scfv)。
术语“抗体”还意指完整抗体或抗原结合片段，以及单区域抗体，也称为“sdab”或“vhh”。区域抗体包含重链可变区(vh)或轻链可变区(vl)，其可作为独立的抗体片段。另外，区域抗体包括仅有重链的抗体(hcabs)，也包括含有igg恒定区ch2并以此作为的互补决定区(cdr)基础支架的抗体。它通常定义为由氨基酸序列组成的多肽或蛋白质,由三个互补决定区连接四个框架区组成。这表示为fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。sdab可以在诸如美洲驼的骆驼科动物中产生，但也可以使用本领域熟知的技术合成产生。sdab或多肽的氨基酸残基序列是根据kabat等人发表的vh结构的信息(“免疫学相关的蛋白质序列”，美国公共卫生服务，nihbethesda，md，出版号91，见参考文献)。根据该编序，sdab的fr1组成第1-30位的氨基酸残基，cdr1组成31-36位的氨基酸残基，fr2为36-49位，cdr2为50-65位，fr3为66-94位，cdr3为95-102位，fr4为103-113位。区域抗体在专利wo2004041862和wo2016065323中也曾给于描述，详见参考文献。
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”是指随后叙述的结构，事情或情况可能发生或可能不发生，并且该叙述包括事件发生和不发生的实例。
在各种方法中，本说明使用术语“至少一种第一抗体”和“至少一种第二抗体”。这些术语可以指单个抗体或一组抗体。例如，在一些方案中，抗体可用作分离抗体。也就是说，分离抗体用于将一个细胞群与另一个细胞群分离。正如本文所述，分离抗体可以是单一抗体或多种抗体。多种抗体的种数可根据分离的需要而改变。此外，文中提到的抗体并无限制，可使用或替代其他抗体。
不受任何特定理论的束缚，本文报道的方法是基于开发用于分离临床相关细胞的临床规模分离器时发现的结果。对于该应用，我们选择使用了称为铁磁流体的独特磁性纳米颗粒(rosensweig，r.e.，ferrohydrodynamics，cambridgeuniversitypress，newyork，1985)。这种材料具有许多可用于生物学应用的独特性能，并且我们使用的这种材料在各种分离相关的应用中积累了丰富的成功经验(美国专利no.5,200,084a；5,466,574a；5,622,831a；5,698,271a；5,876,593a；6,551,843b1；6,623,982b1；6,645,731b2；和7,332,288b2，详细见本文的参考文献)。我们的水性铁磁流体是稳定的胶体，包含磁性核(约100nm)的准球形磁铁矿晶体簇，其覆盖有多层人血清白蛋白(hsa)。这种hsa-铁磁流体是通过liberti等人报道的方法而改进制备的(美国专利no.6,120,856，见参考文献)，具有高稳定性和低非特异性结合的特性。它可与各种常见的捕获剂(如抗小鼠igg或链霉抗生物素蛋白)共价偶联，生成平均流体动力学大小约100～200nm的颗粒。这种称为共捕获铁磁流体的颗粒具有几个独特的特征：1)尽管它们的颗粒小，但它们具有极强的磁性，可使标记的目标通过由永久磁铁制做的相对简单的磁分离器分离(相对于产生高梯度磁场的方法，例如将填充有钢丝绒或铁磁珠的分离柱放置在外部磁场中)；2)它们对细胞无毒性；3)它们的蛋白质覆盖层使它们与生物细胞相容并赋予其与非靶细胞较低的非特异性结合；4)它作为胶体，使它以反应-扩散动力学结合细胞，因此孵育时间短，不需要搅拌；5)制造相对简单；6)容易过滤灭菌。
本方法旨在提高效率并减少从样品(例如血液样品)中分离和活化细胞的时间和步骤。因此，本文提供的方法将促进t细胞或其亚群的同时分离和活化，并可根据所需浓度和时间用共刺激剂或共刺激剂的组合进行分离和活化后的简单后续刺激。以这种方式活化和刺激的纯化t细胞或t细胞亚群可用于进行遗传修饰并扩增至足够数量，以用于本领域技术人员已知的治疗途径。
与目前使用的其他激活方法相比，本报道避免了首先进行一种或多种t细胞分离的需要，使分离和活化并行。所以在一些描述中，分离和活化同时发生。因而本文所述方法与其他方法相比可使用更复杂的细胞样品(如白细胞产物)，这在整体和成本降低方面具有显着优势。此外，同时分离和活化的方法可用于阳性或阴性分离t细胞及其亚群。由于刺激细胞可在分离和活化细胞后通过简单地加入可溶性共刺激剂或可溶性共刺激剂组合来实现，而共刺激剂的浓度和时间可根据任何所需而控制，因此该方法适用于不同的工作流程，并且给予操作者高度的灵活性来设定适合特定样品的刺激信号。与通常用于t细胞活化的大颗粒相比，本文中使用的颗粒(以及可溶性试剂)可以过滤灭菌，并且因为它的生物相容性而不影响后序的流程，无毒性，并且不会干扰细胞增殖或遗传修饰。
因此，本文报道了标记血液样品中细胞的方法，使其可在分离的同时活化，随后通过添加一种或多种可溶性共刺激剂刺激t细胞。在此更详细地描述其方法。显而易见，这里描述的每个方法可以以任何方式彼此组合。
本文报道提供了同时分离和活化t细胞群或其亚群的方法，该方法包括将标记的磁性颗粒与至少一种可与t细胞表面蛋白结合并活化细胞的抗体，以及血液制品一起孵育；对样品施加磁力；将与磁性颗粒结合的细胞与未结合的细胞分离，在此标记的磁性颗粒用共捕获试剂标记。在一些方案中，标记的磁性颗粒和至少一种抗体在与血液产品混合之前混合。在一些方案中，可在将标记的磁性颗粒混合之前先使至少一种抗体和血液产品混合。在一些方案中，也可以先将标记的磁性颗粒和血液产品混合，然后加入至少一种抗体混合。
在本文所述的一些或所有方案中，分离用于扩增的细胞在共刺激剂的存在下培养。共刺激剂可以是可溶的。在一些方案中，共刺激剂不与本文所述的颗粒结合。细胞可以在与磁性或非磁性颗粒结合的状态下进行培养，也可以在分离后从磁性颗粒或非磁性颗粒中释放出来再培养。
在本文所述的一些或所有方案中，一旦细胞被分离和活化，细胞可在可溶性共刺激剂的存在下培养。共刺激剂可以是抗cd28抗体、b7-1、b7-2、抗cd2和/或lfa-3。这些是一些共刺激剂的示例，并非局限于此，其他试剂也可用于刺激分离和活化的t细胞的增殖。在一些方案中，共刺激剂是可溶的。或者共刺激剂不与颗粒结合，所述颗粒也可称为颗粒珠。在一些方案中，细胞在一种或多种共刺激剂中培养。在一些方案中，共刺激剂是小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd28抗体。在一些方案中，可溶性共刺激剂是小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd28和cd2抗体的混合物。在一些方案中，共刺激剂在分离步骤后约1分钟至约20小时之间加入。在一些方案中，在分离步骤后约2分钟至约10小时加入。共刺激剂可以在该期间的多个时间点加入。在一些方案中，共刺激剂在分离步骤后的某单个时间点加入，不超过分离后20小时。在一些方案中，共刺激剂则在分离步骤后立即加入。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至约20小时添加共刺激剂。在一些方案中，可在分离步骤后的不同时间点加入共刺激剂，但不超过约20小时。如本文所讨论的，细胞可以在共刺激剂的存在下培养。因为共刺激剂的添加与细胞分离和活化步骤相分离，所以可溶性共刺激剂的浓度可根据活化抗体的特性而单独调整。而且刺激时间在某种程度上由操作者决定，尽管设置了上限以防止细胞进入无反应状态。在一些方案中，至少一种可溶性共刺激剂的水平比活化抗体高20倍。使用多种可溶性共刺激剂时，则需要根据彼此的活性水平以及活化抗体的水平而进行调整。刺激时间也可以改变。在一些方案中，可在分离步骤后约1分钟至约20小时期间的某一个时间点加入多种可溶性共刺激剂。在一些方案中，也可以在分离步骤后约1分钟至约20小时期间在不同时间点加入多种可溶性共刺激剂。
用于本文描述的方案的颗粒可以是任何大小。颗粒的平均大小可以约为50nm至约200nm，约50nm至约150nm，约75至约150nm，约100nm至约200nm，或约75nm至约250nm。在一些方案中，大小可以为约130nm至约150nm。颗粒可以是磁性的或非磁性的。非磁性颗粒的确切成分并不重要；然而，它可以是生物可降解的或刺激后可降解的，并且它可以是生物相容的，无毒性的，惰性的，并且尺寸与磁性纳米颗粒近似。在一些方案中，非磁性纳米颗粒由胶乳组成。在一些方案中，也可以是二氧化硅。在一些方案中，非磁性纳米颗粒由生物降解的聚(乳酸-共-乙醇酸)组成。
如本文所用，血液产品指的外周全血产品、白细胞产品或血沉棕黄层产品。在一些方案中，血液产品是从外周血获得的单个核细胞。在一些方案中，血液产品是富集的t细胞群。在一些方案中，血液产品至少是一种富集的t细胞亚群。在一些方案中，血液产品不是纯化的血液产品。非纯化的血液产品指血液产品可以是从供体中取出的血液，其从供体取出后未经过滤或其他纯化过程。
在一些方案中，血液产品，磁性颗粒和至少一种结合于t细胞表面蛋白并活化t细胞的抗体一起温育的时间约为5至30分钟。有时孵育约10分钟。
在一些方案中，施加磁力大约为5至30分钟以实现磁分离。这可以称为磁分离步骤。在一些方案中，施加磁力总共约10分钟，以从溶液中分离磁性颗粒和与其结合的细胞。在一些方案中，施加磁力约15分钟，以从溶液中分离磁性颗粒和与其结合的细胞。该磁力可以是恒定的施加以确保最大分离效果。
另外，在一些方案中，在施加恒定磁力以将磁性颗粒与溶液分离之前，可以反复施加磁力以促进纳米颗粒-细胞的相互作用。例如，在将血液制品，磁性颗粒和至少一种抗体一起温育一段时间后，将混合物置于磁力一段时间，然后混和以重新悬浮颗粒。不受任何特定理论的束缚，此反复循环操作可以增加颗粒和细胞之间的相互作用，从而增加细胞和颗粒的结合。这是混合溶液中各成分的另一种方式。并可重复该循环。在一些方案中，这些循环可以反复操作1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50或60次。在一些方案中，该循环重复至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50或60次。在一些方案中，或约5至100个循环，10至90个循环，20至60个循环，30至60个循环，40至80个循环，或50至100个循环。在一些方案中，每次循环进行约10秒，持续约10分钟。在一些方案中，每次循环进行约20秒，持续约10分钟。在一些方案中，每次循环进行约30秒，持续约10分钟。在一些方案中，孵育步骤期间施加的磁力呈间歇磁场梯度。在一些方案中，此间歇磁场梯度施加约为10秒至30秒。这里描述的有关施加磁力的方法适用于本文所述的任何方案中。在一些方案中，通过将样品反复置于磁场梯度以及随之的短暂混合使反应物经受间歇的磁场梯度。由此磁性纳米颗粒可以相对于混合物中的其他成分移动，从而促进细胞的标记。不受任何特定理论的限制，磁场梯度能够使细胞表面上的磁性纳米颗粒极化，这可以促进与受体的结合。在一些方案中，抗体、共捕获颗粒和细胞的混合物在静止状态孵育。在一些方案中，抗体、共捕获磁性颗粒和细胞的混合物通过循环的短暂置于磁梯度和随后的短暂混匀以经历间歇磁场梯度作用。在一些方案中，每次置于磁梯度的持续时间可为约5秒至60秒，可以是约5至15分钟的循环。在一些方案中，每次置于磁梯度的持续时间为约10秒，总时间为约10分钟。在一些方案中，每次置于磁梯度的持续时间为约30秒，总时间为约10分钟。尽管在这里描述了关于施加间歇磁场的方法，但此循环施加磁场的方法可用于本文所述的任何方案中。
在一些方案中，至少一种与磁性颗粒结合的抗体可结合于t细胞表面蛋白并活化t细胞。在一些方案中，至少一种抗体与带有共捕获试剂的磁性颗粒结合。在一些方案中，共捕获试剂可以是如本文所述的抗igg抗体。在一些方案中，此抗-igg抗体可以是抗-igg1亚型的抗体。在一些方案中，此至少一种抗体可以是用生物素或其衍生物(例如生物素化的)标记的抗体，并且所述的共捕获试剂可以是结合生物素或其衍生物的试剂。此类试剂的实例包括但不限于链霉抗生物素蛋白、天然抗生物素蛋白、去糖基化的抗生物素蛋白、抗生物素抗体以及其组合。
在一些方案中，此至少一种抗体是活化抗体。活化抗体是与t细胞结合并激活它的抗体。此类抗体的实例包括但不限于抗cd3抗体和/或抗cd2抗体等。在一些方案中，抗cd3抗体可以作为至少一种抗体或活化抗体。在一些方案中，抗cd3抗体是抗人cd3抗体。
本文提供的方案还包括通过分离和活化未与磁性颗粒结合的细胞来同时分离和活化t细胞群或其亚群。所述方法包括：a)孵育样品。此样品包含：血液样品；非磁性颗粒其与至少一种第一抗体结合，该第一抗体可与t细胞表面蛋白结合并活化血液制品中的t细胞；与至少一种第二抗体结合的磁性颗粒，其与血液样品中的非t细胞及其亚群的细胞表面蛋白结合，此第二抗体不与非磁性颗粒结合；b)对样品施加磁力；c)将与磁性颗粒结合的细胞与未与磁性颗粒结合的细胞分离；d)也可以培养此未与磁性颗粒结合的细胞以扩增细胞群。不受任何特定理论的束缚，这个方案可以活化血液产品中的所有t细胞，但仅分离所需的t细胞亚群。例如，可以通过加入抗cd3抗体一起孵育以活化整个t细胞群体。因此在一些方案中，第一抗体是抗cd3抗体。在一些方案中，第一抗体是抗人cd3抗体、或抗体片段、或以生物素或其衍生物标记的抗体或其片段。如果第一抗体用生物素或其衍生物标记，则用结合生物素或其衍生物的试剂标记磁性颗粒。第一抗体和第二抗体可以是不同的种类。然后，磁性颗粒可以与物种特异性的抗igg抗体结合，并且其与第二抗体之间无相互作用。例如，如果第一抗体是在大鼠中产生而第二抗体在绵羊中产生，则磁性颗粒可以用抗大鼠igg的抗体包被使其可与第一抗体结合，但不结合第二抗体。这将允许不同的颗粒结合不同的抗体。在一些方案中，第一抗体是抗cd3和/或抗cd2的抗体。
在一些方案中，第一抗体是用生物素或其衍生物标记的抗人cd3抗体或其片段，其中第一抗体不是igg1亚型的小鼠抗人cd3抗体。在这样的方案里，非磁性颗粒则用结合生物素或其衍生物的共捕获试剂标记。共捕获试剂可以是链霉抗生物素蛋白、天然抗生物素蛋白、去糖基化的抗生物素蛋白或抗生物素抗体，或其组合。在一些方案中，第一抗体是抗人cd3抗体并且与第一非磁性颗粒上的抗-igg抗体结合，但不与磁性颗粒结合。
在一些方案中，至少一种第二抗体可称为分离抗体。也就是说，此抗体用于将非所需细胞从所需细胞群中分离出来。这些分离抗体可以是非t细胞特异的抗体。在一些方案中，此第二抗体或分离抗体可以是抗cd11b、抗cd16、抗cd19、抗cd36、抗cd41a、抗cd56或抗cd235a抗体中的一种或多种。在一些方案中，分离抗体也可称作为第一抗体。抗体或多种抗体是否被称为第一或第二抗体并不重要。而且对抗体选则并无限制，通常基于用户的偏好来选择任何其他抗体以从细胞群体中分离所需的细胞，也可基于所需目的来选择分离抗体。尽管在此处阐述，但这些分离抗体可以与本文描述的任何方案结合使用。这里，磁性颗粒分离出非所需的细胞，即未被活化和增殖的细胞。因此，磁力将非所需细胞分离，留下的细胞(称作阴性选择的细胞)则是本文所述的在后序培养时被激活和扩增的细胞。
在一些方案中，施加磁力共约5至30分钟以促进纳米颗粒和细胞的相互作用。这个过程可称之为磁分离步骤。在一些方案中，磁力存在共约10分钟，以从溶液中分离磁性颗粒和与其结合的细胞。在一些方案中，可以施加磁力共约15分钟，以从溶液中分离磁性颗粒和与之结合的细胞。该力可以作为恒定力施加，以确保最大程度的分离。
另外，在一些方案中，在施加恒定磁力以将磁性颗粒与溶液分离之前，可以循环反复施加磁力以促进纳米颗粒与细胞的相互作用。例如，在将血液样品，磁性颗粒和至少一种抗体一起温育一段时间后，将混合物置于磁力一段时间，然后混和以重新分布颗粒。不受任何特定理论的束缚，循环重复可以增加颗粒和细胞之间的相互作用，从而增加细胞和颗粒的结合。这是在溶液中混合组分的另一种方式。然后可以重复该流程。在一些方案中，这些循环可以重复1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或60次。在一些方案中，该循环重复至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或60次。在一些方案中，进行约5至100个循环，约10至90个循环，约20至60个循环，约30至60个循环，约40至80个循环，或约50至100个循环。在一些方案中，循环每次进行约10秒，持续约10分钟。在一些方案中，循环每次进行约20秒，持续约10分钟。在一些方案中，循环每次进行约30秒，持续约10分钟。在一些方案中，在孵育步骤期间施加间歇性磁力。在一些方案中，可以在孵育步骤期间施加约10秒至30秒的间歇磁场梯度。这里描述的与磁力的施加有关的方法可以应用于本文所述的任何方法。在一些方案中，通过反复循环将混合物置于磁场梯度以及随后的短暂混匀使混合物经受间歇的磁场梯度。因此导致磁性纳米颗粒可以相对于混合物中的其他元素移动，以促进细胞标记。不受任何特定理论的束缚，磁场梯度能够使细胞表面上的磁性纳米颗粒极化，以促进受体连接。在一些方案中，抗体、共捕获磁性颗粒和细胞的混合物在静止状态孵育。在一些方案中，抗体、共捕获磁性颗粒和细胞的混合物则通过经历反复循环的磁梯度和随后的短暂混合而经历间歇磁场梯度的作用。在一些方案中，每次放置于磁梯度的持续时间为约5秒至60秒。可以进行约5至约15分钟的循环。在一些方案中，每次放置于磁梯度的持续时间为约10秒，总时间为约10分钟。在一些方案中，每次放置于磁梯度的持续时间为约30秒，总时间为约10分钟。尽管关于反复循环的磁梯度在此章节的方案中描述，但此方法可以应用于本文所述的任何方案中。
正如在本文其他方案中所述，一旦细胞被分离和活化，细胞可以在可溶性共刺激剂的存在下培养。在一些方案中，共刺激剂是抗cd28抗体、b7-1、b7-2、抗cd2和/或lfa-3。在一些方案中，共刺激剂可以是可溶的。在一些方案中，共刺激剂可以不与颗粒或颗粒珠结合。在一些方案中，细胞在一种或多种共刺激剂中培养。在一些方案中，共刺激剂可以是igg1亚型的从小鼠衍生的抗人cd28抗体。在一些方案中，或者是可容性的igg1亚型的从小鼠衍生的抗人cd28和cd2两种抗体的混合物。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至20小时加入共刺激剂。在一些方案中，在分离步骤后约2分钟至10小时加入共刺激剂。可以在该期间的多个时间点添加共刺激剂。在一些方案中，在分离步骤后的单个时间点加入共刺激剂，但在分离步骤后不超过约20小时。在一些方案中，可于分离步骤后立即加入共刺激剂。在一些方案中，共刺激剂在分离步骤后约1分钟至20小时期间添加。在一些方案中，可于分离步骤后的不同时间点加入共刺激剂，但加入时间应不超过分离步骤后的约20小时。如本文所讨论的，细胞可以在共刺激剂的存在下培养。因为共刺激剂的添加可以与分离和活化步骤分离，所用可溶性共刺激剂的用量水平可以根据于活化抗体的水平而单独地调整。此外，共刺激剂的给予时间也可以在某种程度上由操作者决定，尽管存在时间的上限以防止细胞进入无反应状态。在一些方案中，至少一种可溶性共刺激剂的用量比活化抗体的水平高20倍。其中在使用多种可溶性共刺激剂时，每一种共刺激剂的用量应根据其他共刺激剂用量和活化抗体的水平而进行调整。这里的时间也可以有变化。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至20小时期间的一个时间点加入多种可溶性共刺激剂。在一些方案中，可以在分离步骤后约1分钟至20小时期间的不同时间点加入多种可溶性共刺激剂，或如本文中另外描述的。
在一些方案中，提供了同时分离和活化t细胞亚群的方法，该方法包括：
a)孵育样品，其中包括：
血液样品；
与至少一种第一抗体结合的磁性颗粒，其与血液样品中所需的亚细胞群的细胞表面蛋白结合；
与至少一种第二抗体结合的非磁性颗粒，此第二抗体结合并活化血液产品中所需的细胞亚群，而且第二抗体不会与磁性颗粒结合；
b)将样品置于磁力中；
c)将与磁性颗粒结合的细胞与未与磁性颗粒结合的细胞分离；并且
d)可以培养与磁性颗粒结合的细胞以扩增此细胞亚群。
在一些方案中，第一抗体是抗cd4或抗cd8抗体。在一些方案中，第二抗体是抗cd3抗体和/或抗cd2抗体。在一些方案中，第一抗体通过共捕获剂与磁性颗粒结合，即磁性颗粒被共捕获剂标记。在一些方案中，共捕获试剂可以是抗igg抗体。在一些方案中，共捕获试剂也可以是结合生物素或其衍生物的试剂。本文描述了这些共捕获试剂的实例。如果磁性颗粒上的共捕获试剂是与生物素或其衍生物结合的试剂，则第一抗体是生物素化抗体。磁性颗粒上的共捕获试剂应不同于第二颗粒上的共捕获试剂。例如，如果磁性颗粒上的共捕获试剂是与生物素或其衍生物结合的试剂，则非磁性颗粒上的共捕获试剂将不能够与生物素或其衍生物结合，反之亦然。另一个例子，如果共捕获试剂结合来自大鼠的抗体，例如大鼠抗igg，那么另一种共捕获试剂将不会结合相同类型的抗体。因此确保了磁性颗粒和非磁性颗粒不与相同的抗体结合。为避免疑问，应理解抗体对靶标并不总是100％特异性的。因此，通过其表面蛋白与不同抗体结合的细胞可以存在于两种颗粒群中，但是不同的颗粒将富集与其反应的抗体选择的细胞群。
在一些方案中，施加磁力总共约5至30分钟，以促进纳米颗粒和细胞的相互作用，这个过程可以称之为磁分离步骤。在一些方案中，施加磁力总共约10分钟，以从溶液中分离磁性颗粒和与其结合的细胞。在一些方案中，也可以施加磁力共约15分钟，以从溶液中分离磁性颗粒和与其结合的细胞。该力可以作为恒定力施加，以确保最大程度的细胞分离。
另外，在一些方案中，在施加恒定磁力以将磁性颗粒与溶液分离之前，可以采用反复施加磁力以促进纳米颗粒和细胞的相互作用。例如，在将血液样品，磁性颗粒和至少一种抗体一起温育一段时间后，将混合物置于磁力一段时间，然后混合以重新分布颗粒。不受任何特定理论的束缚，此磁力和混匀的循环可以增加颗粒和细胞之间的相互作用，从而促进细胞和颗粒的结合。这是在溶液中混合各个成分的另一种方式。这种磁力作用和混和相结合的循环可以重复使用。在一些方案中，这些循环可以重复1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或60次。在一些方案中，该循环重复至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或60次。在一些方案中，进行约5至100个循环，或约10至90个循环，约20至60个循环，约30至60个循环，约40至80个循环，或约50至100个循环。在一些方案中，循环每次进行约10秒，持续约10分钟。在一些方案中，循环每次进行约20秒，持续约10分钟。在一些方案中，循环每次进行约30秒，持续约10分钟。在一些方案中，在孵育步骤期间施加磁力作为间歇磁场梯度。在一些方案中，在孵育步骤期间将磁力作为间歇磁场梯度持续约10秒至30秒。这里描述的与磁力的施加有关的方法可以应用于本文所述的任何方案。在一些方案中，通过循环放置于磁场梯度合并随后的短暂混合使样品经受间歇的磁场梯度，因此磁性纳米颗粒可以相对于混合物中的其他元素移动，从而可以促进细胞标记。不受任何特定理论的束缚，磁场梯度能够使细胞表面上的磁性纳米颗粒极化，以促进其与受体的连接。在一些方案中，抗体、共捕获颗粒和细胞的混合物在静止状态孵育。在一些方案中，抗体、共捕获磁性颗粒和细胞的混合物也可以置于磁梯度和短暂混合的反复循环而经历间歇磁场梯度。在一些方案中，每次样品混合物置于磁梯度的持续时间为约5秒至60秒，可以进行约5至15分钟的循环。在一些方案中，也可以每次暴露于磁梯度的持续时间为约10秒，总时间为约10分钟；在一些方案中，或每次暴露于磁梯度的持续时间为约30秒，总时间为约10分钟。尽管关于在孵育期间施加间歇磁场梯度的方法在该部分可以阐述，但是此方法可以用于本文所述的任何方案中。
关于本文所述的其他方案，一旦细胞被分离和活化，细胞可在可溶性共刺激剂的存在下培养。在一些方案中，共刺激剂是抗cd28抗体、b7-1、b7-2、抗cd2和/或lfa-3。在一些方案中，共刺激剂是可溶的。在一些方案中，共刺激剂可以不与颗粒或颗粒珠结合。在一些方案中，细胞可以和一种或多种共刺激剂培养。在一些方案中，共刺激剂可以是小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd28抗体。在一些方案中，此可溶性共刺激剂是小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd28和cd2的混合物。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至20小时加入共刺激剂。在一些方案中，在分离步骤后约2分钟至10小时加入共刺激剂。在一些方案中，可以在该期间的多个时间点添加共刺激剂。在一些方案中，在分离步骤后的单个时间点加入共刺激剂，但在分离步骤后不超过约20小时。在一些方案中，可以在分离步骤后立即加入共刺激剂。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至20小时添加共刺激剂。在一些方案中，在分离步骤后的不同时间点加入共刺激剂，并且不超过分离步骤后约20小时。如本文所讨论的，细胞可以在共刺激剂的存在下培养。因为共刺激剂的添加与分离和活化步骤相分开，所以可溶性共刺激剂加入的量可以相对于活化抗体的水平而单独调整。而且加入的时间也可以在某种程度上由操作者决定，尽管仍然存在时间的上限以防止细胞进入无反应状态。在一些方案中，此至少一种可溶性共刺激剂的用量比活化抗体的水平高20倍。如果使用多种可溶性共刺激剂，可根据共刺激剂彼此的用量以及活化抗体的用量进行调整。在这里的时间也可以改变。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至20小时期间的一个时间点加入多种可溶性共刺激剂，或如本文中另外描述的。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至约20小时期间的不同时间点加入多种可溶性共刺激剂，或如本文另外描述的。
这个方案也提供了同时分离和活化t细胞亚群的方法，该方法包括：
a)孵育样品，其包括：
血液制品；
磁性颗粒，其与至少一种第一抗体结合，此第一抗体与血液制品中所需的t细胞亚群结合，并且
非磁性颗粒群其与至少一种第二抗体结合，此第二抗体与血液制品中所需的t细胞亚群结合并活化此t细胞亚群。其中此第二抗体不与磁性颗粒结合；
b)对样品施加磁力；
c)将与磁性颗粒结合的细胞与未与磁性颗粒结合的细胞分离；并且
d)可以培养未与磁性颗粒结合的细胞以扩增此细胞亚群。
在一些方案中，第一抗体不与非磁性颗粒结合。
所述至少一种第一抗体可以是多种抗体，此多种抗体可以与需要分离去除的细胞结合，然后根据本文所述的方法分离以达到活化和扩增所需要的细胞。因此，此至少一种第一抗体可以是特异的针对不同细胞类型的多种抗体，但是第一抗体应不包含可与分离活化后培养的细胞结合的抗体。例如，在一些方案中，所述至少一种第一抗体可在抗cd11b、抗cd16、抗cd19、抗cd36、抗cd41a、抗cd56、抗cd235a、抗cd4和抗cd8抗体之中选择，或是其任何组合。然而，在一些方案中，当期望获得cd4+细胞而不是cd8+细胞时，至少一种第一抗体将不包含抗cd4抗体，其使得cd4+细胞从血液样品中分离和活化。然而，此至少一种第一抗体将包含抗cd8抗体。在一些方案中，如果需要收集cd8+细胞而非cd4+细胞，则所述至少一种第一抗体应不包含抗cd8抗体，但会包含抗cd4抗体。此抗体的罗列仅用于示例的目的，并且可以选择使用任何期望的抗体来进行磁性颗粒介导的细胞分离。
在一些方案中，至少一种第二抗体是生物素化的。在一些方案中，至少一种第一抗体不是生物素化的。在一些方案中，第二抗体是抗cd3和/或抗cd2抗体。这些抗体也可以与被磁性颗粒标记的细胞结合。然而，如本文所述，在磁力存在的分离活化步骤期间，任何与磁性颗粒结合的细胞将与仅和非磁性可粒结合的细胞分离。在一些方案中，活化细胞的抗体可以是能活化t细胞的抗体的组合，无论分离和活化的细胞群体是什么。如本文所讨论的，在其他方案中，磁性和非磁性颗粒可以用共捕获试剂覆盖或标记，但不能用相同的共捕获试剂标记，以防止交叉反应。因此，如果一个颗粒群体覆盖有与生物素或其衍生物结合的共捕获试剂，使得其可以结合生物素化抗体，则另一个颗粒群体不应覆盖类似的共捕获试剂。在另一个实例中，共捕获试剂是抗igg抗体。在此类方案中，另一种共捕获试剂应不是抗igg抗体，或是不识别相同物种和相同抗体亚型的抗igg抗体。当提及识别一种抗体的共捕获试剂时，它指的是产生抗体的物种，而不是此抗体识别的蛋白质的物种。
另外，在一些方案中，在施加恒定磁力以将磁性颗粒与溶液分离之前，可以循环施加磁力以促进纳米颗粒和细胞的相互作用。例如，在将血液样品，磁性颗粒和至少一种抗体一起温育一段时间后，将混合物置于磁力中一段时间，然后混合以重新混匀颗粒。不受任何特定理论的束缚，此磁力和混合的循环可以增加磁颗粒和细胞之间的相互作用，从而增加细胞和颗粒的结合。这是在溶液中混合组分的另一种方式。然后可以重复该循环。在一些方案中，这些循环可以重复1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或60次。在一些方案中，该循环重复至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或60次。在一些方案中，进行约5至约100个循环，约10至约90个循环，约20至约60个循环，约30至约60个循环，约40至约80个循环，或约50至约100个循环。在一些方案中，循环每次进行约10秒，持续约10分钟。在一些方案中，循环每次进行约20秒，持续约10分钟。在一些方案中，循环每次进行约30秒，持续约10分钟。在一些方案中，于孵育步骤期间施加磁力作为间歇磁场梯度。在一些方案中，在孵育步骤期间将磁力作为间歇磁场梯度施加约10秒至约30秒。这里描述的与磁力的施加有关的方法可以应用于本文所述的任何方案。在一些方案中，通过短暂磁场梯度和短暂混合的反复循环使混合物经受间歇的磁场梯度。因此，磁性纳米颗粒可以相对于混合物中的其他元素而移动，从而促进细胞的标记。不受任何特定理论的束缚，磁场梯度能够使细胞表面上的磁性纳米颗粒极化，以促进其与受体的连接。在一些方案中，抗体、共捕获颗粒和细胞的混合物在静止状态孵育。在一些方案中，抗体，共捕获磁性颗粒和细胞的混合物通过反复循环的磁梯度和随之的混合而经历了间歇性磁场梯度。在一些方案中，每次处于磁梯度的持续时间为约5秒至约60秒，可以进行约5至约15分钟的循环。在一些方案中，每次处于磁梯度的持续时间为约10秒，总时间为约10分钟。在一些方案中，每次处于磁梯度的持续时间为约30秒，总时间为约10分钟。尽管关于在细胞孵育期间施加磁场的方法在该部分描述，但这些方法可以用于本文所述的任何方案中。
正如本文其他方案所述，一旦细胞被分离和活化，细胞可以和可溶性共刺激剂一起培养。在一些方案中，共刺激剂是抗cd28抗体、b7-1、b7-2、抗cd2和/或lfa-3。在一些方案中，共刺激剂可以是可溶的。在一些方案中，共刺激剂不与颗粒或颗粒珠结合。在一些方案中，细胞在一种或多种共刺激剂中培养。在一些方案中，共刺激剂可以是从小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd28抗体。在一些方案中，或者是可容性的从小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd28和cd2两种抗体的混合物。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至约20小时加入共刺激剂；在一些方案中，或者在分离步骤后约2分钟至约10小时加入共刺激剂。可以在该期间的多个时间点添加共刺激剂。在一些方案中，在分离步骤后的单个时间点加入共刺激剂，但在分离步骤后不超过约20小时。在一些方案中，可于分离步骤后立即加入共刺激剂。在一些方案中，共刺激剂在分离步骤后约1分钟至20约小时期间添加。在一些方案中，可于分离步骤后的不同的时间点加入共刺激剂，但加入时间应不超过分离步骤后的约20小时。如本文所讨论的，细胞可以在共刺激剂的存在下培养。因为共刺激剂的添加可以与分离和活化步骤相分离，所用可溶性共刺激剂的用量水平可以根据活化抗体的水平而单独地调整。此外，共刺激剂的给予时间也可以在某种程度上由操作者决定，尽管存在时间的上限以防止细胞进入无反应状态。在一些方案中，至少一种可溶性共刺激剂的用量比活化抗体的水平高20倍。并且在使用多种可溶性共刺激剂时，每一种共刺激剂的用量应根据其他共刺激剂用量以及活化抗体的水平而进行调整。这里的时间也可以有变化。在一些方案中，在分离步骤后约1分钟至约20小时期间的一个时间点加入多种可溶性共刺激剂；在一些方案中，也可以在分离步骤后约1分钟至约20小时期间的不同时间点加入多种可溶性共刺激剂，或如本文中另外的描述。
因此，本文报道的方案提供了t细胞或其亚群的阳性和阴性分离和活化。如本文提供的案例所示，与先前的方法相比，该方法减少了所需的步骤，并且增强了细胞的活化和增殖。不受任何特定理论束缚，这些方案的发现基于使用间接标记方法用磁性颗粒从血液产品(例如白细胞分离产物，血沉棕黄层，甚至全血)中分离t细胞的深入研究的结果。本文所述的磁性颗粒可以是高磁性的胶体纳米颗粒，其也可以称之为铁磁流体。这些铁磁流体可方便地制备成各种大小，同时保持胶体状态，可于简单容器中进行磁性细胞分离，磁性分离器由相对简单的永久磁体组成(例如与产生强磁场梯度的柱型分离器相反)。而且另一个优点是这些材料可以容易地通过过滤灭菌。
在一些方案中，颗粒与细胞的比例可以调整。在一些方案中，颗粒与细胞的比例大于每个细胞200个颗粒。在一些方案中，颗粒与细胞的比例为每个细胞约30至约120个颗粒。在一些方案中，颗粒与细胞的比例为每个细胞约45至约90个颗粒。在一些方案中，颗粒的比例为每个细胞60个颗粒。为避免疑义，用本文所述的颗粒覆盖/标记了共捕获试剂，此共捕获试剂可与已结合了细胞群的抗体相互作用，所述的细胞群是期待从其他细胞中分离和/或活化的细胞，无论是否此细胞群与磁性颗粒或非磁性颗粒结合。
在一些方案中，提供了简单地通过添加第二共捕获纳米颗粒和至少一种分离抗体来从细胞混合物中阳选择分离并同时活化至少一种t细胞亚群的方法。然后可以根据前述的方法刺激此分离活化的t细胞。在一些方案中，为了同时分离和活化所需的t细胞亚群，可将至少一种分离抗体、一种活化抗体、能够结合至少一种分离抗体的由第一种共捕获剂覆盖的磁性纳米颗粒，和覆盖了能够结合活化抗体的第二种共捕获剂的非磁性纳米颗粒组合在一起；第一种共捕获剂既不能结合活化抗体，第二种共捕获剂也不能与至少一种分离抗体结合。然后立即将该抗体和纳米颗粒的混合物与含有所需t细胞亚群(例如cd4+细胞、cd8+细胞、或cd4+细胞和cd8+细胞)的细胞混合物混合。假设使用抗cd3作为活化抗体，混合物中存在的所有cd3+细胞将被非磁性纳米颗粒活化；然而，只有所需的t细胞亚群将被磁性颗粒标记(同时结合了非磁性纳米颗粒和磁性纳米颗粒)。如本文所述，在适当的温育期后，进行磁分离以回收磁性标记的细胞。
在一些方案中，提供了用于分离和活化期望的t细胞亚群的方法，所用的包含某t细胞群的细胞混合物可以是纯的或不纯的。在一些方案中，所述方法应用于富集的t细胞群或至少是一种富集的t细胞亚群。在一些方案中，该方法应用于从外周血获得的单个核细胞。在一些方案中，该方法应用于白细胞分离产品。在一些方案中，所述方法应用于外周全血。
如本文所述，一些方法使用作为分离抗体的抗体。在一些方案中，分离抗体选自小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd4、抗人cd8以及其组合。在一些方案中，这些抗体与磁性纳米颗粒结合，所述磁性纳米颗粒是固体，为由人血清白蛋白(has)包被的铁磁流体纳米颗粒，并且表面固定了第一种共捕获剂-大鼠衍生的抗小鼠igg1抗体。这种组合可以与作为活化抗体的第二抗体组合，后者可以是生物素化的小鼠衍生的igg2a亚类的抗人cd3抗体，并且固定在非磁性颗粒上的第二种共捕获剂应是链霉抗生物素蛋白。将抗体和两种类型的纳米颗粒的快速混合，并与含有所需t细胞亚群的细胞混合，然后使用磁力分离方法来分离并回收磁性标记的细胞。
在一些方案中，至少一种分离抗体选自生物素化的小鼠衍生的igg2a亚型的抗人cd4抗体、抗人cd8抗体、或其组合。如本文所述，分离抗体可以是技术人员希望用于从正在处理的样品中，例如血液制品，分离所需细胞的任何抗体。其他分离抗体包括但不局限于抗cd11b、抗cd16、抗cd19、抗cd36、抗cd41a、抗cd56、抗cd235a、抗cd4和抗cd8的抗体。在一些方案中，磁性纳米颗粒可以是固体的，由hsa覆盖的铁磁流体纳米颗粒，并且固定在磁性纳米颗粒上的第一种共捕获剂是链霉抗生物素蛋白。在一些方案中，当存在分离和活化抗体同时存在时，活化抗体可以是抗cd3抗体。在一些方案中，活化抗体是小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd3抗体，标记在固体非磁性颗粒上的第二种共捕获剂是大鼠来源的抗小鼠igg1抗体。在一些方案中，将抗体混合物和两种类型的纳米颗粒快速混合，并与含有所需t细胞亚群的细胞样品混合，然后使用磁力分离磁性标记的细胞，然后将分离的细胞其回收。如本文所解释的，这个过程使不同的颗粒结合不同的细胞群。
如本文所述，该方法还可用于“阴性地”选择并同时活化来自细胞混合物的t细胞或至少一个t细胞亚群。然后可以用前述的方式以激活此分离活化的t细胞。例如，在一些方案中，为了用阴性选择来分离和活化t细胞或至少一种t细胞亚群(即靶细胞)，可以组合至少一种分离抗体与非靶细胞结合(不需要的细胞)，一种第二抗体用作活化抗体，覆盖有第一种共捕获剂的磁性纳米颗粒其可以与至少一种分离抗体结合，和覆盖有第二种共捕获剂的非磁性纳米颗粒其能够与活化抗体结合，其中第一共捕获剂既不能与活化抗体结合，而且第二种共捕获剂也不能与至少一种分离抗体结合。然后立即将该抗体和纳米颗粒混合物与含有t细胞群或所需t细胞亚群(例如cd4+细胞、cd8+细胞、或cd4+细胞和cd8+细胞)的细胞混合物组合。在一些方案中，例如，可以使用抗cd3抗体作为活化抗体，混合物中存在的所有cd3+细胞将被非磁性纳米颗粒活化。然而，只有与至少一种分离抗体结合的非靶细胞会被磁性颗粒标记，而所需的t细胞或t细胞亚群将不与磁性纳米颗粒结合(其仅结合于非磁性纳米颗粒)。在适当的温育期后，进行磁分离以除去磁性标记的非靶细胞，而留下的所需细胞被分离，如本文所述，分离的细胞可在有或没有共刺激剂的情况下进行进一步的扩增。
由于这些方法可用于分离和活化t细胞或至少一种t细胞亚群，使用该方法时含有t细胞群的细胞混合物可以是纯的或不纯的。在一些实案中，该方法应用于富集的t细胞群或至少一种t细胞亚群。在一些方案中，该方法应用于从外周血获得的单个核细胞。在另一个方案中，该方法应用于白细胞分离产品。在又一个方案中，该方法应用于外周全血。任何其他血液产品都可使用本文所述的方法。
在一些方案中，至少一种分离抗体是任何小鼠衍生的igg1亚型的抗人抗体，其能够与非靶细胞结合。本文提供了此类抗体的实例。如本文所解释的，分离抗体可以是单一抗体或多种抗体。在一些方案中，磁性纳米颗粒是固体，由hsa包被的铁磁流体纳米颗粒，并且标记在磁性纳米颗粒上的第一种共捕获剂是大鼠衍生的抗小鼠igg1抗体，其将结合于小鼠衍生的igg1亚型抗体。在一些方案中，活化抗体是生物素化的由小鼠衍生的igg2a亚型的抗人cd3抗体，标记在固体非磁性颗粒上的第二种共捕获剂是链霉抗生物素蛋白。将抗体混合物和两种类型的纳米颗粒快速组合，与含有t细胞群或所需t细胞亚群的细胞样品混合，并使用磁力将磁性标记的细胞与非磁性标记的细胞分离，然后收获后者。第二颗粒与已经结合于靶细胞(所需细胞)的生物素化抗体结合。
在一些方案中，至少一种分离抗体是任何生物素化的小鼠衍生的igg2a亚型的抗人抗体，其能够结合非靶细胞。磁性纳米颗粒是固体的由hsa包被的铁磁流体纳米颗粒，并且标记在磁性纳米颗粒上的第一种共捕获剂是链霉抗生物素蛋白。此外，活化抗体是的小鼠衍生的igg1亚型的抗人cd3抗体，标记在固体非磁性颗粒上的第二种共捕获剂是大鼠来源的抗小鼠igg1抗体。将抗体混合物和两种类型的纳米颗粒快速组合，与含有t细胞群或所需t细胞亚群的细胞混合，并使用磁力将磁性标记的细胞与非磁性标记的细胞分离，然后收获后者。
本文报道的方法不同于现有方法，并且与其他方法相比，它们具有很大的实用性和许多优点。例如，表1提供了本文报道的方法与先以前方法的比较。与市场现有方法相反，本文方法例如不需要用纯t细胞群，这是由于其独特的方法使分离和活化同时进行。通过大幅度减少了处理时间、精力，以及所需的试剂量，此方法显著度节省了成本。关于后者，就分离和活化t细胞所需的抗体和共捕获纳米颗粒而言，本文报道的方案旨在用特别保守的剂量。例如，为了从含有5×109个有核细胞的白细胞分离产物中用阳性选择的方法来分离和活化t细胞，仅需要100μg抗cd3的抗体和800μg的共捕获铁磁流体。与dynabeads(thermofisher)和macsibeads(miltenyi)不同，本文所述的各种方法中使用的固体颗粒足够小，使其可以通过用0.22μm过滤器进行无菌过滤，这有利于其用于制备细胞产品。另外，因为在一些方案中，细胞的刺激与分离和活化方法相分离，所以容易改变活化和共刺激试剂的相对用量，共刺激剂的作用时间也可以改变。总的来说，本文报道的方法与其他方法之间突出的差异说明，与其他方法相比，本方法提供了显著和意想不到的优点。
表1.本文报道的方法与其他方法的比较。
以下实例是本文所述方法和组合试剂的说明而非限制。对通常在治疗中遇到的并且本领域技术人员常碰到的各种条件和参数的适当的修改符合本文所述方法和化合物的范围。
例1.使用各种磁性标记方法比较t细胞的活化和扩增
为了比较各种标记方法在t细胞的活化和扩增的应用，这里使用三种不同修改了的标记方法对细胞进行阳性选择和活化，并在第二天加入可溶性抗cd28抗体以刺激细胞。在所有情况下，用optiprep方法(axisshield)从人外周血中分离单个核细胞(pbmc)，将每10ml全血与的1.25mloptiprep混合，在1500rcf(20℃)下离心30分钟。吸取pbmc层并通过用含有1％hsa的无镁和钙的dpbs(sigma)离心洗涤以沉淀细胞。将细胞重新悬浮并再以300rcf再离心两次以除去血小板。
在第一种方法中，将6μg/mligg1亚型的抗cd3抗体(ancell)与等体积的48μg/ml共捕获ram-铁磁流体组合混匀。然后将等体积的pbmc加入上述混合物中，使最终的细胞浓度为3×107个细胞/ml(其最终的[抗-cd3抗体]＝1.5μg/ml；最终的[ram-铁磁流体]＝12μg/ml)。将样品置于间歇磁场梯度中，施于10秒的磁力和随之的短暂搅拌，反复循环总共约10分钟。然后将细胞混合物置于四极磁力分离器中分离15分钟。当分离结束时，用巴斯德吸管吸除非磁性结合的细胞部分，然后将新鲜的缓冲液(dpbs，1％hsa)加入试管中而不使管壁上被磁性分离收集的细胞悬浮，并与磁性细胞部分一起孵育10分钟。这个过程再重复一次。在非磁性细胞的部分最终吸除后，从磁场梯度中取出样品，并将磁性分离的细胞重新悬浮在含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基(stemcelltechnologies)中，细胞总浓度为1×106个细胞/ml，于37℃(5％co2)下孵育。孵育过夜后，将0.5μg/mligg1亚型的小鼠抗人cd28抗体(mabtech)加入到孵育的细胞分中。定期搅拌细胞并用新鲜的扩增培养基稀释细胞至1×106个细胞/ml。培养4天后，通过流式细胞术(flowsight，amnis)分析细胞中cd25表面标志受体的存在。经分析，89％的细胞在第4天表达cd25表面标志物，并且细胞在第15天经历了311倍的扩增。
在第二种方法中，将1.5μg/ml的igg1亚型抗cd3抗体(ancell)与稀释至1×108个细胞/ml的pbmc组合，并在25℃下孵育10分钟。然后将细胞与等体积的20μg/ml的共捕获ram-铁磁流体混合(最终的[ram-铁磁流体]＝10μg/ml)，将细胞稀释至5×107个细胞/ml，并将混合物置于间歇磁场梯度，即置于磁场梯度10秒，随之短暂搅拌，反复循环总共10分钟。然后将细胞稀释至3×107个细胞/ml并置于四极磁力分离器中15分钟。当分离结束时，用巴斯德吸管抽吸除去非磁性结合的细胞部分，并将新鲜缓冲液(dpbs，1％hsa)加入管中，并且不重悬磁性分离收集的细胞，然后与磁性细胞一起孵育10分钟。这个过程再重复一次。在非磁性细胞部分最终抽吸后，将样品从磁场梯度中取出，并将磁性细胞部分重新悬浮在补充含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基中(stemcelltechnologies)。细胞的总浓度为1×106个细胞/ml，并在37℃(5％co2)孵育。孵育过夜后，将0.5μg/ml的igg亚型的小鼠抗人cd28抗体(mabtech)加入到孵育的细胞中，定期搅拌细胞并用新鲜的扩增培养基稀释至1×106个细胞/ml。培养4天后，通过流式细胞术(flowsight，amnis)分析细胞中cd25表面标志物的存在。经分析，75％的细胞在第4天表达cd25表面标志，并且细胞在第15天经历176倍扩增。
在第三种方法中，将1μg/ml的igg1亚型的抗cd3抗体(ancell)与稀释至3×107个细胞/ml的pbmc组合，并在25℃下孵育10分钟。然后将细胞稀释至6×105个细胞/ml并以300rcf离心15分钟。将沉淀的细胞重悬于1.4×107个细胞/ml，并将它们与等体积的20μg/ml共捕获ram-铁磁流体混合(最终的[ram-ferrofluid]＝10μg)使细胞浓度稀释至7×106个细胞/ml。将样品置于磁场梯度10秒并随后短暂搅拌，反复循环总共10分钟，使混合物经受间歇磁场梯度。然后将细胞混合物稀释至3×106个细胞/ml并置于四极磁力分离器中分离15分钟。当分离结束时，通过巴斯德吸管抽吸除去非磁性细胞部分，并将新鲜缓冲液(dpbs，1％hsa)加入管中，而且不再重悬磁性结合的细胞，然后孵育10分钟。这个过程再重复一次。在非磁性结合的细胞的最终抽吸去除后，将样品从磁场梯度中取出，并将磁性分离的细胞部分重新悬浮在补充有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基(stemcelltechnologies)中，至细胞总浓度为1×106个细胞/ml，并在37℃(5％co2)孵育。孵育过夜后，将0.5μg/mligg1亚型的小鼠抗人cd28抗体(mabtech)加入到孵育的细胞中。定期搅拌细胞并用新鲜的扩增培养基稀释至细胞1×106个细胞/ml，培养4天后，通过流式细胞术(flowsight，amnis)分析细胞中cd25表面标志物的存在。经分析，55％在第4天表达cd25表面标志物，并且细胞在第15天经历了104倍的扩增。
表2总结了前三种方法的结果。显然，第一种改进的标记方法，即同时分离和活化，在细胞活化和扩增方面提供了最好的结果。另外两种方法虽然可以激活t细胞并使其扩增，但程度相对较小。第一种方法呈现了意外的、令人惊讶的显著的细胞扩增效果。
表2.使用改进的标记方法比较细胞的活化和扩增。
例2.纳米颗粒相对pbmc的比例对细胞活化和增殖的影响。
为了测试铁磁流体纳米颗粒与pbmc的比例对t细胞活化和扩增的影响，使用本文报道的方法分离和活化细胞，其中真对每个细胞的铁磁流体纳米颗粒的比例是变化的。通过optiprep方法(axisshield)从人外周血中分离pbmc，将每10ml血液与1.25mloptiprep混合，并在1500rcf(20℃)下离心30分钟。吸取pbmc层并通过用含有1％hsa的无镁和钙的dpbs(sigma)以离心洗涤以细胞。将离心沉淀的细胞重新悬浮于含有1％has的dpbs中并再以300rcf离心两次以除去血小板。
将6μg/ml的igg1亚型的抗cd3抗体(ancell)与等体积的40μg/ml共捕获ram-铁磁流体混合。再将等体积的pbmc以1×108个细胞/ml，8×107个细胞/ml或6×107个细胞/ml加入到上述混合物的三个等分试样中，得到最终细胞浓度分别为5×107个细胞/ml，4×107个细胞/ml，或3×107个细胞/ml(最终[抗-cd3抗体]＝1.5μg/ml；最终[ram-铁磁流体]＝10μg/ml)。在此浓度时铁磁流体纳米颗粒对应于每个细胞的比率如下，对于最高细胞浓度为60个纳米颗粒/细胞，对于中间细胞浓度为75个纳米颗粒/细胞，对于最低细胞浓度为100个纳米颗粒/细胞。然后将样品置于间歇的磁场梯度，经历3秒的磁场梯度和随之的短暂混合，如此反复循环共10分钟。将所有样品稀释(如果需要)至细胞浓度为3×107个细胞/ml，并将细胞混合物置于四极磁力分离器中15分钟。当分离结束时，用巴斯德吸管吸出除去非磁性结合的细胞，并将新鲜缓冲液(dpbs，1％hsa)加入管中，而且不再重新悬浮磁性结合的细胞，然后孵育10分钟。这个过程再重复一次。当非磁性结合的细胞级被最终后吸除后，将样品从磁场梯度中取出，并将磁性分离的细胞重新悬浮于含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基(stemcelltechnologies)中。至细胞总浓度为1×106个细胞/ml，并在37℃(5％co2)条件下孵育。通过流式细胞术(flowsight，amnis)来分析pbmc、磁性结合的细胞和非磁性结合的细胞样品中cd3表面受体的存在。孵育过夜后，将0.5μg/mligg1亚型的小鼠抗人cd28抗体(mabtech)加入到孵育的细胞中。定期搅拌细胞并用新鲜的扩增培养基稀释至1×106个细胞/ml，培养4天后，用流式细胞术分析细胞中cd25标志物的存在。该实验的结果如下表3所示。
表3.纳米颗粒与pbmc的比例对t细胞活化和增殖的作用比较。
例3.与dynabeads比较在阳性选择细胞时用同时活化和后续刺激cd8+t细胞的效果
为了比较本文所述的方案与dynabeadshumant-activatorcd3/cd28的效果，由于后者需要纯化的t细胞进行最佳活化，这里将用冷冻保存的cd8+t细胞用于该实验。在使用dynabeads活化和刺激cd8+t细胞时，遵循生产商推荐的方案，随后将细胞在含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基(stemcelltechnologies)中孵育。细胞浓度为1×105个细胞/ml，在37℃(5％co2)的条件下孵育。
与dynabeads方法相反，我们的实验方案如下进行。将2.5ml的1μg/ml小鼠衍生的igg1亚型单克隆抗人cd3抗体(ucht1克隆，ancell)与2.5ml的8μg/ml共捕获ram-铁磁流体混合并短暂涡旋。将此5ml的抗体和铁磁流体混合物加入到5ml浓度为2×107个细胞/ml的细胞液中，得到最终细胞浓度为1×107个细胞/ml(最终[抗cd3抗体]＝0.25μg/ml；最终[ram-铁磁流体]＝2μg/ml)。此浓度相当于60个纳米颗粒/细胞的比例。然后将混合物置于30秒的间歇磁场梯度和随后的短暂搅拌，反复循环总共10分钟。将混合物置于四极磁力分离器中10分钟。当分离结束时，除去非磁性细胞部分，并将新鲜缓冲液(pbs，1％hsa)加入管中，重悬浮磁性结合的细胞并与之一起温育10分钟。这个过程再重复两次。当非磁性结合的细胞部分的最终被抽吸去除后，从磁场梯度中取出样品，并将磁性结合的细胞部(含有99.7％的cd8+t细胞)重悬于immunocultxft细胞扩增培养基(stemcell)中。其中含有100iu/mlil-2(gibco)，细胞浓度为1×105个细胞/ml，并在37℃(5％co2)的条件下孵育。孵育过夜后，将0.5μg/mligg1亚型的小鼠衍生的单克隆抗人cd28抗体(3608-1-50，mabtech)加入到孵育的细胞中。定期搅拌细胞并用新鲜的扩增培养基稀释细胞至1×105个细胞/ml，培养4天后，通过流式细胞术分析细胞表面cd25标志物的存在。在10天的培养期间，计数细胞以确定平均倍增时间，并在10天后评估细胞的存活率。虽然dynabead方法和本实施例中描述的方法提供了类似的活化和扩增速率，但发现本实例中描述的方法提供了更有活性的细胞。例如，根据本实例中描述的方法制备的细胞的存活率为75％，而用dynabeads处理的细胞的存活率为62.5％。因此，目前描述的方法提供了增加的细胞活力途经，这是事先没有预测的。
例4.比较大规模和小规模在阳性选择来自白细胞分离术产物的t细胞时其同时分离活化和随后刺激的效果
实验已经证明，同时活化和随后刺激的t细胞阳性选择方法可以大规模的应用于白细胞去除产品。可从商业供应商(le1003f，stemexpress)获得含有2-2.5×109个有核细胞的白细胞分离产物。对于小规模实验，使用来自实例3的方案，其中先将抗体和共捕获铁磁流体混合，然后与等体积的白细胞分离产物组合，并且在间歇磁场梯度中孵育，最后用四极磁分离器分离细胞。对于大规模实验，将50ml的1μg/ml小鼠衍生的igg1亚型单克隆抗人cd3抗体(ucht1克隆，ancell)与50ml的8μg/ml的共捕获ram-铁磁流体轻轻地搅拌混合。将此100ml抗体和铁磁流体的混合物加入到含有100ml白细胞分离产物的血袋中，其细胞浓度为2×107个有核细胞/ml，得到最终细胞浓度为1×107个有核细胞/ml，最终[抗cd3抗体]＝0.25μg/ml；最终[ram-铁磁流体]＝2μg/ml。此浓度相当于60个铁磁纳米颗粒/有核细胞的比率。然后将袋子放置在磁体阵列上置于磁场梯度30秒，随后将其倒置以达到短暂搅拌，如此反复共10分钟，使混合物经受间歇磁场梯度。随后将袋中的混合物置于磁体阵列上分离10分钟。当分离结束时，将新鲜缓冲液通过入口泵入袋中以除去非磁性结合的细胞，其迫使非磁性结合的细胞通过对侧上出口离开血袋。让分离袋仍然保持在磁体阵列上，然后搅拌混合物以移出任何非磁性结合的细胞，之后将新鲜的缓冲液泵入袋中以进一步洗涤磁性结合的细胞。再重复这个过程两次，最后除去非磁性结合的细胞部分后，将袋子从磁场梯度中取出，然后将磁性结合的细胞重新悬浮于含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基中(stemcelltechnologies)，至细胞总浓度为5×105个细胞/ml，并在摇瓶中于37℃(5％co2)的条件下温育。类似地，将从小规模实验中回收的磁性细胞悬浮于含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基中(stemcelltechnologies)，至细胞总浓度为5×105个细胞/ml，并在摇瓶中于37℃(5％co2)的条件下温育。孵育过夜后，将0.5μg/mligg1亚型的小鼠衍生的单克隆抗人cd28抗体(3608-1-50，mabtech)加入到孵育的细胞中。培养4天后，通过流式细胞术分析细胞表面cd25标志物的存在。继续用新鲜的扩增培养基稀释细胞至1×106个细胞/ml，不断的分批培养13天。在此17天期间，计数细胞以确定扩增速率并评估细胞活力。实验证实，大规模实验显示了与小规模几乎相同的结果，表现在细胞的活化、扩增速率和活力(在所有时间点均为80-90％)。
例5.采用同时分离活化和随后刺激的方案用阳性选择法以分离来自白细胞分离产物的t细胞亚群(即cd4+t细胞)
如本文所述，各种实施方案描述了从细胞混合物同时阳性选择和活化t细胞亚群，随后通过添加一种或多种可溶性共刺激剂对细胞进行进一步的刺激。在进行同时分离和活化cd4+t细胞时，首先将igg2a亚型的小鼠衍生的抗人cd4的生物素化的f(ab′)2片段(分离抗体)与小鼠来源的igg1亚型抗人cd3抗体(活化抗体)组合，其中两种抗体的终浓度均为1μg/ml。然后将链霉抗生物素蛋白包被的铁磁流体(平均大小为130nm)与覆盖有大鼠衍生的抗小鼠igg1的聚(乳酸-共-乙醇酸)纳米颗粒(平均大小为130nm)组合，此两种纳米颗粒的最终浓度均为8μg/ml。然后将含有两种抗体的溶液与等体积的含有两种纳米颗粒的溶液相混合，并立即将所得的混合物与等体积的白细胞分离产物(2-2.5×107个总有核细胞/ml)混合。然后将此混合物置于间歇的磁场梯度孵育，即磁场梯度中30秒并随后短暂搅拌，反复循环总共10分钟。之后进行15分钟的磁分离以分离磁性结合的cd4+细胞，并将洗涤两次以除去非磁性结合的细胞。然后回收磁性结合的细胞并重新悬浮于含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基(stemcelltechnologies)中，至细胞总浓度为1×106个细胞/ml，并在37℃(5％co2)条件下温育。孵育过夜后，将0.5μg/mligg1亚型的小鼠抗人cd28抗体(mabtech)加入到孵育的细胞级分中。定期搅拌细胞并用新鲜的扩增培养基稀释至1×106个细胞/ml。
例6.采用同时分离活化和随后刺激的方案用阴性选择法以分离来自白细胞分离产物的t细胞
如本文所述，本文报道的方案提供了从细胞混合物中用阴性选择的方式同时分离和活化t细胞，并且通过添加一种或多种可溶性共刺激剂来进一步刺激分离活化的细胞的方法。在进行t细胞的同时阴性选择和活化时，首先将小鼠衍生的igg1亚型抗人抗体混合物(抗cd11b、抗cd16、抗cd19、抗cd36、抗cd41a，抗cd56和抗-cd235a；分离抗体)与igg2a亚型的小鼠衍生的生物素化的抗人cd3抗体(活化抗体)组合，其中活化抗体的终浓度为1μg/ml。接下来，将覆盖有大鼠衍生的抗小鼠igg1的铁磁流体(ram-铁磁流体，平均尺寸为130nm)与链霉抗生物素蛋白包被的聚(乳酸-共-乙醇酸)纳米颗粒(平均尺寸为130nm)组合，其中两种纳米颗粒的最终浓度均为8μg/ml。然后将抗体溶液与等体积的两种纳米颗粒的溶液相混合，并立即将所得混合物与等体积的白细胞分离产物(2-2.5×107个有核细胞/ml)混合。随后将此混合物置于间歇的磁场梯度孵育，即磁场梯度中30秒并随后短暂搅拌，反复循环总共10分钟。之后进行15分钟的磁分离以分离磁性结合的细胞，随之将非磁性结合的细胞吸出。可以重复此过程以确保去除所有磁性标记的细胞。将此回收的活化t细胞重悬于含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基(stemcelltechnologies)中，至细胞浓度为1×106个细胞/ml，并在37℃(5％co2)温育。孵育过夜后，将0.5μg/ml小鼠igg1亚型抗人cd28抗体(mabtech)加入到孵育的细胞液中。定期搅拌细胞并用新鲜的扩增培养基稀释至1×106个细胞/ml。
例7.采用同时分离活化和随后刺激的方案用阴性选择的方式以分离来自白细胞分离产物的t亚群(即cd8+t细胞)
如本文所述，本文报道的方案提供了从细胞混合物中用阴性选择的方式来同时分离和活化cd8+t细胞，并随后添加一种或多种可溶性共刺激剂以进一步刺激所分离的细胞的方法。当进行cd8+t细胞的同时阴性选择和活化时，先将小鼠衍生的igg1亚型抗人抗体混合物(抗cd4、抗cd11b、抗cd16、抗cd19、抗cd36、抗cd41a、抗cd56、抗cd123、抗cd235a和抗γδtcr；分离抗体)与小鼠衍生的igg2a亚型生物素化抗人cd3抗体(活化抗体)混合，其中活化抗体的最终浓度为1μg/ml。然后将覆盖有大鼠衍生的抗小鼠igg1的铁磁流体(平均大小为130nm)与链霉抗生物素蛋白包被的聚(乳酸-共-乙醇酸)纳米颗粒(平均大小为130nm)组合，其中两种纳米颗粒的最终浓度均为8μg/ml。随后将抗体溶液与等体积的两种纳米颗粒的溶液混合，并立即将所得混合物与等体积的白细胞分离产物(2-2.5×107个有核细胞/ml)混合。随后将此混合物置于间歇的磁场梯度孵育，即磁场梯度中30秒并随后短暂搅拌，反复循环总共10分钟。之后进行15分钟的磁分离以分离磁性结合的cd8-细胞，随之通过抽吸收取非磁性标记的cd8+t细胞；这个过程可以重复以确保去除了所有磁性标记的细胞。然后将回收活化的cd8+t细胞重悬于含有100iu/mlil-2(gibco)的immunocultxft细胞扩增培养基(stemcelltechnologies)中，至细胞浓度为1×106个细胞/ml，并在37℃孵育(5％co2)。孵育过夜后，将0.5μg/mligg1亚型的小鼠抗人cd28抗体(mabtech)加入到孵育的细胞液中。定期搅拌细胞并用新鲜的扩增培养基稀释细胞至1×106个细胞/ml。
以上具体描述旨在以一些实例来说明和解释本方案，而不应视为此方案的限制和要求。本文引用的每篇参考文献均以引文的目的和方式整合并入本文。