具有降低的免疫原性的HLAI类缺陷的NK-92细胞的制作方法

本申请要求2016年9月29日提交的第62/401653号美国临时申请的优先权利益，该申请以引用方式并入本文中。

背景技术：

基于细胞的免疫疗法是治疗癌症的有力工具。使用表达嵌合抗原受体的工程化原代t细胞(car-t细胞)的淋巴恶性肿瘤患者治疗的早期成功将这一领域推向癌症免疫治疗的前沿。除了car-t细胞外，基于nk细胞的使用的免疫疗法也正在开发。

nk-92是在患有非霍奇金斯淋巴瘤的受试者血液中发现和然后离体永生化的细胞溶解性癌细胞系。nk-92细胞来源于nk细胞，但缺乏正常nk细胞所呈现的主要抑制性受体，而同时保留大多数激活受体。然而，nk-92细胞不攻击正常细胞，也不在人类中引起不可接受的免疫排斥反应。nk-92细胞系的表征公开于wo1998/49268及美国专利申请公开第2002-0068044号中。nk-92细胞也作为治疗某些癌症的潜在治疗剂被评估。

技术实现要素：

本发明提供具有降低的hlai类表达的修饰的nk-92细胞、产生这类细胞的方法和使用该修饰的nk-92细胞治疗疾病(例如，癌症)的方法。

在一个方面，本公开因此提供β-2微球蛋白(b2m)-修饰的nk-92细胞，其包含抑制β-2微球蛋白的表达的b2m-靶向的改变。在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞的β-2微球蛋白基因经遗传改变以抑制b2m的表达。在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞包含靶向b2m且抑制其表达的一种或多种干扰rna。在一些实施方式中，由b2m-修饰的nk-92细胞表达的β-2-微球蛋白的量与不具有靶向β-2-微球蛋白的改变的nk-92细胞相比降低至少20％，至少30％，至少50％，至少60％或至少80％。在一些实施方式中，权利要求1的b2m-修饰的nk-92细胞通过敲低或敲除nk-92细胞中的β-2微球蛋白(例如，使用crispr)产生。在一些实施方式中，细胞通过敲除nk-92细胞中的β-2微球蛋白(例如，使用crispr)产生。在一些实施方式中，nk-92细胞被另外地修饰以表达包含hla-e结合肽、b2m和hla-e重链的单链三聚体。在一些实施方式中，单链三聚体包含b2m(β2微球蛋白)信号肽、cw*03前导肽(例如，cw*0304前导肽)、成熟b2m多肽和成熟hla-e多肽。在一些实施方式中，cw*03前导肽通过柔性接头连接于成熟b2m多肽和/或成熟b2m多肽通过柔性接头连接于成熟hla-e多肽。一个或两个柔性接头可以包含gly和ser。在一些实施方式中，hla-e重链包含成熟hla-e^g氨基酸序列。在一些实施方式中，单链三聚体包含seqidno:18的氨基酸序列。

在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞(例如，如本文中和之前的段落中所述的)表达至少一种fc受体或至少一种嵌合抗原受体(car)。在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞(例如，如本文中和之前的段落中所述的)表达在细胞表面上的至少一种fc受体和至少一种car。在一些实施方式中，fc受体是cd16。在一些实施方式中，cd16多肽是具有成熟形式的158位处的缬氨酸的人cd16多肽，其对应于包括原始信号肽的人cd16序列的176位。在一些实施方式中，至少一种fc受体包含编码与seqidno:5的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸序列且包含对应于seqidno:5的158位的位置处的缬氨酸。在一些实施方式中，fc受体是fcγriii。在一些实施方式中，car包含fcεriγ的胞质结构域。在一些实施方式中，car靶向肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞经修饰以进一步表达细胞因子。在一些实施方式中，细胞因子是白介素-2或其变体。在一些实施方式中，细胞因子靶向于内质网。

在另一方面，本公开提供用于产生相对于未遗传修饰以降低β-2微球蛋白水平的对照nk-92细胞表达降低水平的β-2微球蛋白的nk-92细胞的方法，该方法包括遗传修饰nk-92细胞中的β-2微球蛋白表达。在一些实施方式中，遗传修饰β-2微球蛋白表达的步骤包括使待修饰的nk-92细胞与靶向β-2微球蛋白的干扰rna接触。在一些实施方式中，靶向β-2微球蛋白的干扰rna是sirna、shrna、微rna或单链干扰rna。

在一些实施方式中，遗传修饰β-2微球蛋白表达的步骤包括用锌指核酸酶(zfn)、tale-效应结构域核酸酶(talen)或cripsr/cas系统修饰β-2微球蛋白基因。在一些实施方式中，遗传修饰β-2微球蛋白基因表达包括：i)将成簇的规则间隔短回文重复序列相关(cas)蛋白引入nk-92细胞中，和ii)将一种或多种核糖核酸引入待修饰的nk-92细胞中，其中所述核糖核酸指引所述cas蛋白以与β-2微球蛋白序列的靶基序杂交，且其中靶基序被切割。在一些实施方式中，cas蛋白以蛋白质形式引入nk-92细胞中。在一些实施方式中，cas蛋白通过引入cas核酸编码序列而引入nk-92细胞中。在一些实施方式中，cas蛋白是cas9。在一些实施方式中，靶基序是20核苷酸的dna序列。在一些实施方式中，靶基序在β2微球蛋白基因的第一外显子中。在一些实施方式中，一个或多个核糖核酸选自seqidno.1-4。

在进一步的方面，本公开提供包含多个以上公开的b2m-修饰的nk-92细胞的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含生理上可接受的赋形剂。

在另外的方面，本公开提供修饰的nk-92细胞系，其包含多个以上公开的任何b2m-修饰的nk-92细胞。在一些实施方式中，细胞系的细胞经历少于10次的群体倍增。在一些实施方式中，细胞系的细胞在包含少于10u/ml的il-2的培养基中培养。

在另一方面，本公开提供治疗需要的患者的癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的以上所述的任何b2m-修饰的nk-92细胞系，从而治疗癌症。在一些实施方式中，所述方法还包括施用抗体。在一些实施方式中，约1x10⁸至1x10¹¹个细胞/m²患者体表面积施用于患者。

在进一步的方面，本公开提供用于治疗癌症的试剂盒，其中该试剂盒包括(a)如上所述的b2m-修饰的nk-92细胞组合物或细胞系中的任何一种，和(b)使用说明。在一些实施方式中，试剂盒还包括生理上可接受的赋形剂。

上述概述和以下详细说明是示例性和解释性的，且旨在提供对所要求保护的本发明的进一步解释。本领域技术人员将从以下本发明的详细描述中容易看出其他目的、优势和新颖特征。

本发明的说明性实施方式包括但不限于以下：

实施方式1:一种β-2-微球蛋白-修饰的(b2m-修饰的)nk-92细胞，其包含靶向β-2微球蛋白的遗传修饰以抑制β-2微球蛋白的表达。

实施方式2:实施方式1的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述细胞通过敲低或敲除nk-92细胞中的β-2微球蛋白产生。

实施方式3:实施方式2的b2m-修饰的nk-92细胞，其包含靶向b2m且抑制其表达的干扰rna。

实施方式4:实施方式1-3任一项的b2m-修饰的nk-92细胞，其中由所述细胞表达的β-2-微球蛋白的量与不具有靶向β-2-微球蛋白的改变的nk-92细胞相比降低至少50％，至少60％，至少70％或至少80％。

实施方式5:实施方式1的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述细胞通过敲除nk-92细胞中的β-2微球蛋白产生。

实施方式6:实施方式1-5任一项的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述细胞被修饰以表达包含hla-e结合肽、b2m和hla-e重链的单链三聚体。

实施方式7:实施方式6的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述单链三聚体包含b2m(β2微球蛋白)信号肽、cw*0304前导肽、成熟b2m多肽和成熟hla-e多肽。

实施方式8:实施方式7的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述cw*0304前导肽通过柔性接头连接于成熟b2m多肽和/或所述成熟b2m多肽通过柔性接头连接于成熟hla-e多肽。

实施方式9:实施方式8的b2m-修饰的nk-92细胞，其中将c2*0304前导肽连接于成熟b2m多肽的柔性接头和/或将成熟b2m多肽连接于成熟hla-e多肽的柔性接头包含gly和ser。

实施方式10:实施方式6-9任一项的b2m-修饰的nk-92细胞，其中hla-e重链包含成熟hla-eg氨基酸序列。

实施方式11:实施方式6-10任一项的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述单链三聚体包含seqidno:18的氨基酸序列。

实施例12:实施方式1-11任一项的b2m-修饰的nk-92细胞，其中b2m-修饰的nk细胞表达细胞表面上的至少一种fc受体或细胞表面上的至少一种嵌合抗原受体(car)；或者细胞表面上的至少一种fc受体和至少一种car。

实施方式13:实施方式12的b2m-修饰的nk-92细胞，其中至少一种fc受体是在对应于成熟形式的cd16多肽的158位处具有缬氨酸的人cd16多肽。

实施方式14:实施方式12的b2m-修饰的nk-92细胞，其中至少一种fc受体包含编码与seqidno:5的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸序列且在对应于seqidno:5的158位的位置处包含缬氨酸。

实施方式15:实施方式12的b2m-修饰的nk-92细胞，其中至少一种fc受体是fcγriii。

实施方式16:实施方式12-15任一项的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述car包含fcεriγ的胞质结构域。

实施方式17:实施方式12-16任一项的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述car靶向肿瘤相关抗原。

实施方式18:实施方式1-17任一项的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述细胞进一步表达细胞因子。

实施方式19:实施方式18的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述细胞因子是白介素-2或其变体。

实施方式20:实施方式19的b2m-修饰的nk-92细胞，其中所述细胞因子靶向于内质网。

实施方式21:一种组合物，包含实施方式1-20任一项的多个细胞。

实施方式22:实施方式21的组合物，还包含生理上合适的赋形剂。

实施方式23:一种修饰的nk-92细胞系，包含实施方式1-20任一项的多个修饰的nk-92细胞。

实施方式24:实施方式23的细胞系，其中所述细胞经历少于10次的群体倍增。

实施方式25:实施方式23的细胞系，其中所述细胞在包含少于10u/ml的il-2的培养基中培养。

实施方式26:一种治疗需要的患者的癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的实施方式23的细胞系，从而治疗癌症。

实施方式27:实施方式26的方法，其中所述方法还包括施用抗体。

实施方式28:实施方式26或27的方法，其中约1x10⁸至1x10¹¹个细胞/m²患者体表面积施用于患者。

实施方式29:一种用于产生相对于对照nk-92细胞表达降低水平的β-2微球蛋白的nk-92细胞的方法，该方法包括遗传修饰所述nk-92细胞以抑制β-2微球蛋白表达。

实施方式30:实施方式29的方法，其中遗传修饰β-2微球蛋白表达的步骤包括用锌指核酸酶(zfn)、tale-效应结构域核酸酶(talen)或cripsr/cas系统修饰β-2微球蛋白基因以消除或减少β-2微球蛋白基因的表达。

实施方式31:实施方式30的方法，其中遗传修饰β-2微球蛋白表达的步骤包括用cripsr/cas系统修饰β-2微球蛋白基因以消除或减少β-2微球蛋白基因的表达。

实施方式32:实施方式29的方法，其中遗传修饰β-2微球蛋白表达的步骤包括使待修饰的nk-92细胞与靶向β-2微球蛋白的干扰rna接触。

实施方式33:实施方式32的方法，其中靶向β-2微球蛋白的干扰rna是sirna、shrna、微rna或单链干扰rna。

实施方式34:实施方式29-33任一项的方法，其中由所述细胞表达的β-2-微球蛋白的量与不具有靶向β-2-微球蛋白的改变的nk-92细胞相比降低至少50％，至少60％，至少70％或至少80％。

实施方式35:实施方式29的方法，其中遗传修饰β-2微球蛋白基因表达包括：

i)将成簇的规则间隔短回文重复序列相关(cas)蛋白引入nk-92细胞中，和

ii)将一种或多种核糖核酸引入待修饰的nk-92细胞中，其中所述核糖核酸指引cas蛋白以与β-2微球蛋白序列的靶基序杂交，且其中所述靶基序被切割。

实施方式36:实施方式35的方法，其中所述cas蛋白以蛋白质形式引入nk-92细胞中。

实施方式37:实施方式35的方法，其中cas蛋白通过将cas-编码多核苷酸引入nk-92细胞中而被引入所述nk-92细胞中。

实施方式38:实施方式35-37任一项的方法，其中所述cas蛋白是cas9。

实施方式39:实施方式35-38任一项的方法，其中所述靶基序在β2微球蛋白基因的第一外显子中。

实施方式40:实施方式39的方法，其中所述靶基序是20核苷酸的dna序列。

实施方式41:实施方式35-40任一项的方法，其中所述一种或多种核糖核酸选自seqidno.1-4。

附图说明

图1提供了显示在混合淋巴细胞反应中nk-92细胞的免疫原性分析的说明性数据。自体或未刺激的pbmc用作阴性对照，而葡萄球菌肠毒素b超抗原(seb)用作增殖的阳性对照。nk-92细胞以6000拉德辐照，并以1:1的比率刺激来自9个健康对照的500,000个pbmc。分别在1和5天后测量cd4+(左)或cd8+(右)t细胞的ifn-g产生(上)和增殖(下)。

图2提供了证明cas9-nk-92和cas9-hank细胞系表达高水平的cas9蛋白的说明性数据。

图3提供了分析未转染的cas9-nk-92细胞或用10μg体外转录的b2msgrna-1rna转染的细胞中的β-2-微球蛋白(b2m)表达的说明性流式细胞分析数据。

图4的a和b图提供显示野生型和b2m-kocas9-nk-92细胞中的b2m和hlai类表达的分析的说明性流式细胞分析数据。结果表明，b2m-kocas9-nk-92细胞在经典hlai类(a、b、c)和非经典hla-e表达上存在缺陷。

图5提供了证明b2m-konk-92细胞对同种异体nk细胞的裂解易感的说明性数据。在4小时的细胞毒性试验中，在不同的效应-靶标(e:t)比率下评估新分离的(左)或激活的(右)原代nk细胞裂解亲本(nk-92和cas9-nk-92)或b2m-ko(克隆#27和#37)nk-92细胞的能力。k562(对于nk细胞裂解高度易感的hla-i缺陷红白血病细胞)包括作为阳性对照。“n”表示测试的供体的数量。

图6显示了说明性hla-e-sct(单链三聚体)分子的示意图。嵌合hla-e-sct分子由b2m(β2微球蛋白)信号肽、cw*03肽、(g4s)3接头、成熟b2m链、(g4s)4接头和成熟hla-e链组成。

图7提供了显示hla-i缺陷nk-92细胞中的有效hla-e-sct表达的说明性数据。在亲本b2m-konk-92和表达hla-e-sct的b2m-konk-92细胞中b2m、hla-i(a、b和c)和hla-e表达的流式细胞术分析。

图8提供了证明在hla-i缺陷nk-92细胞中强制的hla-e-sct表达赋予针对同种异体nk细胞的裂解的部分保护的说明性数据。在4小时的细胞毒性试验中，采用新分离的(左)或激活的(右)原代nk细胞在不同的效应-靶标(e:t)比率下评估亲本(nk-92和nk-92-cas9)、b2m-ko(克隆#27和#37)和表达hla-e-sct的b2m-konk-92细胞对同种异体nk细胞裂解的易感性。亲本和表达hla-e-sct的k562细胞包括作为参考。“n”表示测试供体的数量。

图9提供了证明hla-i缺陷nk-92细胞对于nk-92特异性同种异体cd8+t细胞的裂解具有抗性的说明性数据。在4小时的细胞毒性试验中，在两种不同的效应-靶标(e:t)比率下评估nk-92特异性同种异体cd8+t细胞裂解亲本(nk-92和nk-92-cas9)、b2m-ko(克隆#27和#37)或表达hla-e-sct的b2m-konk-92细胞的能力。1b9(左)和2h6(右)对应于针对亲本nk-92细胞产生的两种不同的寡克隆cd8+t细胞群体。

具体实施方式

在一个方面，本发明提供用于降低为治疗病症而施用的治疗性nk-92细胞的免疫原性并避免所施用的nk-92细胞变成患者的t细胞的靶标的不利后果的方法和组合物。本发明因此提供了具有降低的hlai类表达的b2m-修饰的nk-92细胞和产生这类细胞的方法。根据本公开的b2m-修饰的nk-92细胞具有nk-92细胞中靶向b2m的改变。这样的修饰使nk-92细胞被接受者自身的免疫系统攻击的风险最小化且因此提高nk-92细胞治疗的效能。

术语

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

在本说明书和随后的权利要求中，将引用一些应定义为具有以下含义的术语：

本文所用术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不打算限制本发明。如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一”、“一个”和“该”也应包括复数形式。

本文使用的术语“大约”和“约”，当用于修饰以数量值指定的量或范围时，是指该数量值以及本领域技术人员已知的与该值的合理变异(例如±20％、±10％或±5％)是在所陈述值的预期含义内。

术语“包含”的意思是组合物和方法包括所述的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由…组成”是指所指明的材料或步骤以及对所要求保护的发明的基本和新颖特性没有实质性影响的那些材料或步骤。“由…组成”应当意味着排除超过痕量的其他成分和所述及的实质方法步骤。由这些过渡性术语中的每一个定义的实施方式都在本发明的范围内。

术语“自然杀伤(nk)细胞”是指在不存在特定抗原性刺激的情况下杀死靶细胞，并且没有根据mhc类的限制的免疫系统的细胞。靶细胞可能是肿瘤细胞或携带病毒的细胞。nk细胞的特征是cd56表面标志物的存在和cd3表面标志物的不存在。

术语“nk-92细胞”(其在本公开的实例部分中也称为“ank细胞”)是指最初从患有非霍奇金淋巴瘤的患者获得的nk细胞系，nk-92。为本发明的目的且除非另有说明，术语“nk-92”旨在指原始nk-92细胞系以及经修饰(例如通过引入外源基因)的nk-92细胞系、nk-92细胞的克隆和nk-92细胞。nk92细胞及其示例性和非限制性的修饰在美国专利号7,618,817、8,034,332和8,313,943以及美国专利申请公开号2013/0040386(所有这些都通过引用全文并入本文中)中描述，并且包括野生型nk92、nk92-cd16、nk92-cd16-γ、nk92-cd16-ζ、nk92-cd16(f176v)、nk92mi和nk92ci。nk92细胞是本领域技术人员已知的，并且容易从nantkwest,inc.获得。

术语“靶向b2m的改变”是指对nk-92细胞中b2m的dna或rna的结构或性质的改变，例如敲除或敲低b2m表达，其导致b2m蛋白水平的降低。因此，靶向b2m的改变可以靶向b2m基因或b2m基因转录物。人b2m蛋白质序列(人b2m前体)的实例可在登录号np_004039下获得。人b2m位于15号染色体上，且定位于位置15q21-q22.2。根据genomereferenceconsortiumhumanbuild38修订版本7(grch38.p7)，注释版本108，unigene登录号为hs.534255，且位于15号染色体的44.71-44.72mb处。术语“b2m”还包括由b2m染色体位点处的基因编码的示例性参考序列的等位基因变体。

术语“b2m-修饰的nk-92细胞”是指具有导致b2m表达量减少的靶向b2m的改变的nk-92细胞。遗传修饰的nk-92细胞可进一步包含编码hla-e和/或其他转基因(例如fc受体、嵌合抗原受体(car)、il-2或自杀基因)的载体。

术语“未b2m-修饰的nk-92细胞”指的是不具有降低b2m表达的靶向b2m的改变的nk-92细胞。

术语“非辐照的nk-92细胞”是指未经辐照的nk-92细胞。辐照使得细胞不能生长和增殖。在一些实施方式中，用于施用的nk-92细胞可在患者治疗前在治疗机构或一些其他地点进行辐照，如在一些实施方式中，辐照和输注之间的时间不长于4小时以保持最佳活性。或者，nk-92细胞可以通过另一种机制灭活。

如用于描述本发明的，nk-92细胞的“灭活”使得其不能生长。灭活也可能与nk-92细胞的死亡有关。设想nk-92细胞可以在治疗应用中有效地清除与病理相关的活体外细胞样品后，或在它们停留在哺乳动物体内足够的时间以有效地杀死体内驻留的许多或所有靶细胞后被灭活。作为非限制性实例，可以通过施用nk-92细胞对其敏感的灭活剂来诱导灭活。

如用于描述本发明的，术语“细胞毒性的”和“细胞溶解的”当用于描述效应细胞如nk细胞的活性时意图是同义的。一般地，细胞毒性活性与通过多种生物学、生物化学或生物物理学机制中任一种杀灭靶细胞相关。细胞溶解更特别地指其中效应物裂解靶细胞的质膜，从而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀灭。不希望局限于理论，据信nk细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。

关于细胞/细胞群体的术语“杀灭”是指包括将导致该细胞/细胞群体的死亡的任何类型的操作。

术语“fc受体”是指在某些细胞(例如，自然杀伤细胞)的表面上发现的蛋白质，其通过与称为fc区的抗体部分结合而导致免疫细胞的保护性功能。抗体的fc区与细胞的fc受体(fcr)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)刺激细胞的细胞吞噬或细胞毒性活性。fcr基于它们识别的抗体类型进行分类。例如，fc-γ受体(fcγr)与igg类抗体结合。fcγriii-a(也称为cd16)是与igg抗体结合并激活adcc的低亲和力fc受体。fcγriii-a通常在nk细胞上发现。编码天然形式的cd16的代表性多核苷酸序列显示在seqidno:5中。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转移rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可以在多核苷酸的组装之前或之后赋予。核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子两者。除非另有说明或要求，否则作为多核苷酸的本发明的任何实施方式包括双链形式和已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式中的每一种。除非另有说明，否则核酸序列以5'至3'显示。

多核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列组成，例如天然存在的碱基腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和当多核苷酸是rna时，代替胸腺嘧啶的尿嘧啶(u)。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。

术语“百分同一性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列同一性。可以通过比较可以为比较目的而比对的每个序列中的位置来确定百分同一性。当比较的序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置处是相同的。如本文所用，短语“变体核苷酸序列”或“变体”氨基酸序列是指在核苷酸水平或氨基酸水平上具有至少指定的百分比的同一性的序列。变体核苷酸序列包括编码本文所示的核苷酸序列的天然存在的等位基因变体和突变的那些序列。变体核苷酸序列包括编码除人以外的哺乳动物物种的蛋白质的核苷酸序列。变体氨基酸序列包括含有保守氨基酸置换且多肽具有相同的结合和/或活性的那些氨基酸序列。在一些实施方式中，变体核苷酸或氨基酸序列与参考序列具有至少60％或更高的同一性，例如至少70％，或至少80％，至少85％或更高的同一性。在一些实施方式中，变体核苷酸或氨基酸序列与参考序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性。在一些实施方式中，变体氨基酸序列具有不超过15个，不超过10个，不超过5个或不超过3个保守氨基酸置换。可以通过已知算法确定百分同一性，例如，使用默认设置的gap程序(wisconsinsequenceanalysispackage,version8forunix,geneticscomputergroup,universityresearchpark,madisonwis.)，其使用smith和waterman的算法(adv.appl.math.,1981,2,482-489)。

当用于鉴定多肽序列中的给定氨基酸残基的情况中时，术语“对应于”或“参照…确定”是指当给定的氨基酸序列与参考序列最大程度地比对和比较时指定的参考序列的残基的位置。

术语“表达”是指基因产物的产生，其可以是rna或蛋白质。

术语“细胞因子”或“多种细胞因子”是指影响免疫系统的细胞的大类的生物分子。用于实施本发明的示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白介素(il)，特别是il-2、il-12、il-15、il-18和il-21。在优选的实施方案中，细胞因子是il-2。

术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得当载体置于允许细胞内(例如通过转化的过程)时可以复制。载体可以在一种细胞类型如细菌中复制，但在另一种细胞(例如哺乳动物细胞)中具有有限的复制能力。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸dna；与阳离子脂质复合的、单独的或与阳离子聚合物组合的dna；阴离子和阳离子脂质体；dna-蛋白质复合物和包含与阳离子聚合物(例如异质聚赖氨酸、限定长度的寡肽和聚乙烯亚胺)缩合的dna的颗粒，在一些情况下包含在脂质体中；和使用包含病毒和聚赖氨酸-dna的三元复合物。

术语“靶基序”是指其限定结合分子将结合的核酸的一部分的核酸序列，条件是存在用于结合的充分条件。

术语“干扰rna”是指rna核酸分子，其是双链或单链的并且能够实现针对敲低靶基因表达的rna干扰机制的诱导。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适合于本文所述的方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施方式中，患者、受试者或个体是人。

术语“接受者”是指在治疗期间被施用nk-92细胞(无论是修饰的还是未修饰的)的患者。

术语“治疗”或“处理”涵盖在受试者(如人)中本文所述的疾病或障碍的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即引起障碍的消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。术语对受试者“施用”或“给予”单克隆抗体或自然杀伤细胞包括引入或递送抗体或以细胞以执行预期功能的任何途径。施用可以通过适合递送细胞或单克隆抗体的任何途径进行。因此，递送途径可包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下递送。在一些实施方式中，nk-92细胞直接施用于肿瘤，例如通过注射到肿瘤中。

术语“接触”(即，使多核苷酸序列与成簇的规则间隔短回文重复序列相关的(cas)蛋白和/或核糖核酸接触)旨在包括在体外将cas蛋白和/或细胞中的核糖核酸一起孵育(例如，将cas蛋白或编码cas蛋白的核酸加入培养的细胞中)。在一些实施方式中，术语“接触”不旨在包括细胞体内暴露于本文公开的cas蛋白和/或核糖核酸(其可以天然存在于微生物(即细菌)中)。如本文公开的使靶多核苷酸序列与cas蛋白和/或核糖核酸接触的步骤可以以任何合适的方式进行。例如，细胞可以在贴壁培养中或在悬浮培养中处理。应当理解，与本文公开的cas蛋白和/或核糖核酸接触的细胞也可以同时或随后与另一药剂(例如生长因子或其他分化剂或环境)接触以稳定细胞或使细胞进一步分化。

如本文所用，术语“敲除”包括以干扰靶多核苷酸序列的功能的方式删除靶多核苷酸序列的全部或一部分，使得由该靶多核苷酸编码的rna和/或蛋白质产物不表达。例如，可以通过在靶多核苷酸序列的功能域(例如，dna结合域)中诱导靶多核苷酸序列的插入缺失来改变靶多核苷酸序列而实现敲除。本领域技术人员基于本文所述的细节将容易理解如何使用各种遗传途径，例如crispr/cas系统、zfn、talen、tgago，来敲除靶多核苷酸序列或其部分。

如本文所用，术语“敲低”是指与不含减少表达的遗传修饰的对应细胞中靶mrna或相应蛋白质的表达相比，在遗传修饰的细胞中靶mrna或相应蛋白质的表达可测量的减少。本领域技术人员基于本文描述的细节将容易理解如何使用各种遗传途径，例如sirna、shrna、微rna、反义rna或其他rna介导的抑制技术，来敲低靶多核苷酸序列或其一部分。

术语“减少”或“降低”在本文中可互换使用，是指与参考水平(例如，不具有降低b2m表达的遗传修饰的对应细胞)相比降低至少10％。在一些实施方式中，表达降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或高达并包括100％的降低(即与参考样品相比不存在的水平)，或与参考水平相比在10-100％之间的任何降低。

术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、癌瘤和肉瘤。示例性的癌症包括脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和成神经管细胞瘤。其他实例包括霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰岛瘤、恶性类癌瘤、膀胱癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺肿瘤以及前列腺癌。

nk-92细胞

nk-92细胞系是被发现在白介素2(il-2)存在下增殖的一种独特的细胞系。gong等，leukemia8：652-658(1994)。这些细胞对多种癌症具有高细胞溶解活性。nk-92细胞系是具有广谱的抗肿瘤细胞毒性的同质癌性nk细胞群体，其在扩增后具有可预测的产率。i期临床试验证实了其安全性特征。

发现nk-92细胞系表现出cd56^bright、cd2、cd7、cd11a、cd28、cd45和cd54表面标志物。另外，它不表现cd1、cd3、cd4、cd5、cd8、cd10、cd14、cd16、cd19、cd20、cd23和cd34标志物。培养物中nk-92细胞的生长取决于重组白介素2(ril-2)的存在，低至1iu/ml的剂量足以维持增殖。il-7和il-12不支持长期生长，测试的其他细胞因子(包括il-1α、il-6、肿瘤坏死因子α、干扰素α和干扰素γ)也不支持。即使在1:1的低效应物:靶标(e:t)比率下，nk-92也具有高细胞毒性。gong等,同上。

迄今为止，对内源性nk细胞的研究表明il-2(1000iu/ml)对于运输过程中的nk细胞活化很重要，但细胞不需要维持在37℃和5％二氧化碳下。koepsell等.,transfusion53:398-403(2013)。

hlai类

人白细胞抗原(hla)系统是编码人类的主要组织相容性复合物(mhc)蛋白的基因复合体。hlai类蛋白质全部具有长的α链和短的β链(b2m)。很少hlai类可以在没有b2m的情况下表达，并且b2m的表达是hlai类蛋白质从细胞内部呈递肽所需要的。本公开提供了b2m-修饰的nk-92细胞，其与未b2m-修饰的nk-92细胞相比表达减少量的b2m。因此，这些细胞避免了免疫监视和细胞毒性t细胞的攻击。在一个实施方案中，b2m是seqidno:6。

本公开提供了b2m-修饰的nk-92细胞，其包含抑制b2m表达的靶向b2m的改变。在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞由crispr/cas9介导的b2m遗传消融产生。在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞通过敲低b2m产生。本公开还提供了治疗需要的患者的癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的包括b2m-修饰的nk-92细胞的细胞系。

敲除nk-92细胞中的β2微球蛋白

在一些实施方式中，通过敲除nk-92细胞中的b2m产生包含靶向b2m的改变的b2m-修饰的nk-92细胞。敲除靶基因表达的方法包括但不限于锌指核酸酶(zfn)、tale-效应结构域核酸酶(talen)和cripsr/cas系统。此类方法通常包括向细胞施用一种或多种编码一种或多种核酸酶的多核苷酸，使得核酸酶介导内源基因的修饰(例如在一种或多种供体序列的存在下，使得供体整合到核酸酶靶向的内源基因中)。一种或多种供体分子的整合通过同源指导修复(hdr)或通过非同源末端连接(nhej)相关修复而发生。在某些实施方案中，使用一个或多个核酸酶对，该核酸酶可以由相同或不同的核酸编码。

crispr

在一些实施方式中，使用cripsr/cas系统进行b2m的敲除或敲低。crispr/cas系统包括cas蛋白和至少一种至两种能够将cas蛋白指引到b2m序列中的靶基序并与其杂交的核糖核酸。cas蛋白然后切割靶基序并导致双链断裂或单链断裂结果。可以使用能够改变细胞中的靶多核苷酸序列的任何crispr/cas系统。在一些实施方式中，crisprcas系统是crispri型系统，在一些实施方式中，crispr/cas系统是crisprii型系统。在一些实施方式中，crispr/cas系统是crisprv型系统。

用于本发明的cas蛋白可以是天然存在的cas蛋白或其功能衍生物。“功能衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与相应的天然序列多肽共同的生物学活性。本文考虑的生物学活性是功能衍生物将dna底物水解成片段的能力。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体、共价修饰及其融合体，如衍生物cas蛋白。合适的cas多肽或其片段的衍生物包括但不限于cas蛋白或其片段的突变体、融合体、共价修饰。

在一些实施方式中，本发明中使用的cas蛋白是cas9或其功能衍生物。在一些实施方式中，cas9蛋白来自酿脓链球菌。cas9含有2个核酸内切酶结构域，包括切割与crrna不互补的靶dna的ruvc-样结构域，和切割与crrna互补的靶dna的hnh核酸酶结构域。cas9的双链核酸内切酶活性还要求短的保守序列(2-5个核苷酸)，称为原型间隔区相关基序(pam)，紧接着靶序列中靶基序的3'-。

在一些实施方式中，将cas蛋白以多肽形式引入nk-92细胞中。在某些实施方案中，cas蛋白可以与本领域熟知的细胞穿透多肽或细胞穿透肽缀合或融合。细胞穿透肽的非限制性实例包括millettif,cell-penetratingpeptides:classes,orginandcurrentlandscape.drugdiscov.today17:850-860(2012)中提供的那些，其相关公开内容通过引用整体并入本文。在某些情况中，未b2m修饰的nk-92细胞经遗传工程化以产生cas蛋白。

在一些实施方式中，b2m基因中的靶基序(其中cas蛋白由指导rna指引到该靶基序)的长度为17至23bp。在一些实施方式中，靶基序的长度为至少20bp。在一些实施方式中，靶基序是20-核苷酸的dna序列。在一些实施方式中，靶基序是20-核苷酸的dna序列，并且紧接在由cas蛋白识别的称为原始间隔区相关基序(pam)的短保守序列之前。在一些实施方式中，pam基序是ngg基序。在一些实施方式中，b2m基因的靶基序位于第一外显子内。

在一些实施方式中，靶基序可以选择为最小化本发明的crispr/cas系统的脱靶效应。在一些实施方式中，选择靶基序以使得当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较时，其含有至少两个错配。在一些实施方式中，选择靶基序以使得当与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比时，其包含至少一个错配。本领域技术人员将理解，可以使用多种技术来选择合适的靶基序以最小化脱靶效应(例如，生物信息学分析)。

能够将cas蛋白指引到b2m序列中的靶基序并与其杂交的核糖核酸被称为单指导rna(“sgrna”)。可以根据所用的特定crispr/cas系统和靶多核苷酸的序列选择sgrna，如本领域技术人员所理解的。在一些实施方式中，也可以选择所述的一至两种核糖核酸以最小化与靶多核苷酸序列之外的核酸序列的杂交。在一些实施方式中，该一至两种核糖核酸与含有与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列相比的至少两个错配的靶基序杂交。在一些实施方式中，该一至两种核糖核酸与含有与细胞中的所有其他基因组核苷酸序列比较的至少一个错配的靶基序杂交。在一些实施方式中，该一至两种核糖核酸设计为与紧邻cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的靶基序杂交。在一些实施方式中，将一至两种核糖核酸中的每一个设计成与紧邻由cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序(其侧邻位于靶基序之间的突变等位基因)的靶基序杂交。也可以使用容易获得的软件来设计指导rna，例如，在http://crispr.mit.edu上可得。根据本领域已知的方法，可以通过转染将一种或多种sgrna转染到其中cas蛋白存在的nk-92细胞中。在一些实施方式中，sgrna选自seqidno:1-4。

使用crispr/cas系统来降低基因表达的方法描述于各种出版物中，例如us专利公开号2014/0170753，其全部公开内容通过引用并入本文。

锌指核酸酶(zfn)

在一些实施方式中，包含靶向b2m的改变的b2m-修饰的nk-92细胞通过用锌指核酸酶(zfn)敲除nk-92细胞中的b2m来产生。zfn是包含foki内切核酸酶的非特异性切割结构域(n)和锌指蛋白(zfp)的融合蛋白。成对的znf参与识别靶基因中的特定基因座—一个识别待修饰位点上游的序列，和另一个识别下游的序列—并且zfn的核酸酶部分在特定基因座处切割和导致目标基因的敲除。使用zfn减少基因表达的方法是众所周知的，例如，如美国专利号9,045,763，以及durai等，“zincfingenucleases:custom-designedmolecularscissorsforgenomeengineeringofplantandmamaliancells,”nucleicacidresearch33(18):5978-5990(2005)中公开的，其公开内容全文以引用的方式并入本文。

转录激活因子样效应物核酸酶(talens)

在一些实施方式中，通过用转录激活因子样效应物核酸酶(talens)敲除nk-92细胞中的b2m来产生包含靶向b2m的改变的b2m-修饰的nk-92细胞。talen类似于zfn，因为它们作为一对结合在基因组位点周围并指导相同的非特异性核酸酶foki以在特定位点处切割基因组，但不是识别dna三联体，每个结构域识别单一核苷酸。使用zfn减少基因表达的方法也是众所周知的，例如，如美国专利号9,005,973号，以及christian等,“targetingdnadouble-strandbreakswithtaleffectornulceases,”genetics186(2):757-761(2010)中公开的，其公开内容通过引用整体并入本文。

敲低nk-92细胞中的β2微球蛋白

在一些实施方式中，包含靶向b2m的改变的b2m-修饰的nk-92细胞通过用干扰rna敲低b2m而产生。干扰rna在体内引入时与其他蛋白质形成rna诱导沉默复合物(“risc”)，并启动称为rna干扰(rnai)的过程。在rnai过程中，risc合并单链干扰rna或双链干扰rna的一条链。合并的链充当risc的模板以识别互补的mrna转录物。一旦确认互补mrna，risc中的蛋白质组分激活并切割mrna，导致靶基因表达的敲低。用于敲低b2m表达的干扰rna分子的非限制性实例包括sirna、短发夹rna(shrnas)、单链干扰rna和微rna(mirnas)。使用这些干扰rna的方法是本领域技术人员熟知的。

在一个实施方式中，干扰rna是sirna。sirna是双链rna，其通常小于30个核苷酸长。sirna的基因沉默开始于sirna的一条链并入称为rna诱导的沉默复合体(risc)的核糖核蛋白复合物中。并入risc中的链识别与并入的sirna链至少部分互补的mrna分子，且然后risc切割这些靶mrna或抑制它们的翻译。

在一个实施方式中，干扰rna是微rna。微rna是小的非编码rna分子，其可以与mrna分子内的互补序列杂交，从而导致mrna的切割，或通过其聚(a)尾的缩短使mrna失稳定。

在一个实施方式中，干扰rna是单链干扰rna。单链也可以以与双链sirna类似的方式实现mrna沉默，尽管效率低于双链sirna。如对于上述双链sirna，单链干扰rna通常具有约19至约49个核苷酸的长度。

短发夹rna或小发夹rna(shrna)是具有紧密发夹环的人工rna分子，其可用于通过其在细胞中产生的sirna沉默靶基因表达。shrna在细胞中的表达通常通过递送质粒或通过病毒或细菌载体来实现。合适的细菌载体包括但不限于腺相关病毒(aavs)、腺病毒和慢病毒。shrna是sirna的有利介质，因为它具有相对低的降解和转换率。

本发明中使用的干扰rna可以通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换或修饰而不同于天然存在的rna。非核苷酸材料可以在5'末端、3'末端或内部与干扰rna结合。干扰rna相对于天然存在的rna可以包含的修饰的非限制性实例公开于us8,399,653中，其通过引用整体并入本文。这些修饰通常设计用于提高干扰rna的核酸酶抗性、改善细胞摄取、增强细胞靶向、帮助追踪干扰rna、进一步改善稳定性或降低干扰素途径激活的可能性。例如，干扰rna可以在突出端的末端包含嘌呤核苷酸。例如，借助于吡咯烷接头将胆固醇缀合到sirna分子的有义链的3'末端也为sirna提供稳定性。

本发明中使用的干扰rna通常长度为约10-60、10-50或10-40个(双链体)核苷酸，更通常长度为约8-15、10-30、10-25或10-25个(双链体)核苷酸，长度约10-24个(双链体)核苷酸(例如，双链sirna的每个互补序列长度为10-60、10-50、10-40、10-30、10-25或10-25个核苷酸，长度约10-24、11-22或11-23个核苷酸，且双链sirna长度为约10-60、10-50、10-40、10-30、10-25或10-25个碱基对)。

选择目的基因中用于rnai的靶基序的技术是本领域技术人员已知的，例如，如tuschl,t.等,“thesirnauserguide”，2004年5月6日修订(可在洛克菲勒大学网站上找到)中公开的；通过ambioninc.网站上的ambiontechnicalbulletin#506,“sirnadesignguidelines,”；以及通过在例如invitrogen、dharmacon、integrateddnatechnologies、genscript或proligo网站上的其他基于网页的设计工具。初始检索参数可包括35％至55％之间的g/c含量和19至27个核苷酸的sirna长度。靶序列可位于mrna的编码区中或在5'或3'非翻译区中。靶序列可用于衍生干扰rna分子，如本文所述的那些。

可以通过使用本领域熟知的方法测量b2mmrna或蛋白质的量来评估敲除或敲低的效率，例如，定量pcr、蛋白质印迹、流式细胞术等等。在一些实施方式中，评估b2m蛋白的水平以评价敲除或敲低效率。在某些实施方式中，与未b2m-修饰的nk-92细胞相比，b2m表达降低的效率为至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少60％或至少80％。在某些实施方式中，降低的效率为约10％至约90％。在某些实施方式中，降低的效率为约30％至约80％。在某些实施方式中，降低的效率为约50％至约80％。在一些实施方式中，降低的效率大于或等于约80％。

hla-e修饰

在一些实施方式中，本公开提供了b2m-修饰的nk-92细胞，其也在细胞表面上表达hla-e。患者的内源性nk细胞通过受体cd94/nkg2a或cd94/nkg2b识别hla-e。非局限于理论，受体和hla-e之间的相互作用导致内源性nk细胞的细胞毒活性的抑制。因此，本发明提供了具有靶向b2m的改变以及上述进一步的修饰中任何一种或多种的b2m-修饰的nk-92细胞，其进一步修饰以表达包含hla-e前导肽(其通常被hla-e结合)、成熟形式的b2m和成熟hla-e重链的单链三聚体。在一些实施方式中，三聚体包含hla结合肽、b2m和hla-e重链的编码序列之间的接头序列。hla-e结合肽来自其他hlai类分子(例如hla-a、hla-b或hla-c)的前导序列。例如，在一个实施方式中，hla-e结合肽是hla-a*0201的前导序列，并且具有vmaprtlvl的序列(seqidno:20)。在一个实施方式中，由三聚体肽包含的hla-e重链多肽包含对应于seqidno:7的成熟多肽区的氨基酸序列，即包含seqidno:7的氨基酸22-358。在替代的实施方式中，三聚体肽包含的hla-e重链多肽包含seqidno:16的氨基酸序列。

三聚体单链hla-e分子已经成功地用于异种移植实验中以保护猪内皮细胞不被人nk细胞杀死(crew等molimmunol2005和lilienfelde等xenotransplantation2007)。在这些研究中，所用的肽对应于人hla-cw*0304的前导肽。如上所述，也可以使用来自其他hlai类分子的前导肽，因为它们已经显示为结合hla-e并抑制由cd94/nkg2a+nk细胞克隆介导的杀灭(参见例如braud等nature1998和eur.j.immunol.1997)。

如上所述，在一些实施方式中，三聚体可以包含接头序列。在一些实施方式中，接头是柔性接头，例如含有如gly、asn、ser、thr、ala等的氨基酸。使用已知参数设计这类接头。例如，接头可以具有重复序列，如gly-ser重复序列。

另外的修饰

fc受体

在一些实施方式中，包含靶向b2m的改变的b2m-修饰的nk-92细胞进一步修饰以在细胞表面上表达fc受体。例如，在一些实施方式中，例如其中b2m-修饰的nk-92细胞与单克隆抗体一起施用，fc受体允许nk细胞与通过adcc杀死靶细胞的抗体一致地起作用。在一些实施方式中，fc受体是iggfc受体fcγriii。在一些实施方式中，fc受体是跨膜免疫球蛋白γfc区受体iii-a(cd16)的高亲和力形式，其中缬氨酸存在于成熟形式的多肽的158位处。

fc受体的非限制性实例提供如下。这些fc受体在其优选配体、亲和力、表达和与抗体结合后的效应方面不同。

表1.说明性fc受体

在一些实施方式中，fc受体是cd16。在典型的实施方式中，nk-92细胞经修饰以表达人cd16的高亲和力形式，其具有在成熟形式的蛋白质(例如seqidno:5)的158位的缬氨酸。成熟蛋白质的158位对应于包括天然信号肽的人cd16序列的176位。

在一些实施方式中，cd16与seqidno:5具有至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的同一性，并且包含如参照seqidno:5所确定的158位的缬氨酸。

嵌合抗原受体

在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞进一步工程化以在细胞表面上表达嵌合抗原受体(car)。任选地，car对肿瘤特异性抗原具有特异性。作为非限制性实例，肿瘤特异性抗原在us2013/0189268、wo1999024566a1、us7098008和wo2000020460a1中描述，其每一个通过引用整体并入本文。肿瘤特异性抗原包括但不限于nkg2d、cs1、gd2、cd138、epcam、ebna3c、gpa7、cd244、ca-125、eta、mage、cage、bage、hage、lage、page、ny-seo-1、gage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c-met、egfr、fab、wt-1、psma、ny-eso1、afp、cea、ctag1b、cd19和cd33。另外的非限制性肿瘤相关抗原及与其相关的恶性肿瘤可见于表2中。

表2:肿瘤特异性抗原及相关的恶性肿瘤

在一些实施方式中，car靶向cd19、cd33或cspg-4。在一些实施方式中，car靶向与特定癌症类型相关的抗原。例如，癌症可以选自白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括成髓细胞性、早幼粒细胞性、髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

car可以如，例如，专利公开no.wo2014039523、us20140242701、us20140274909、us20130280285和wo2014099671中所述工程化，其各自通过引用整体并入本文。任选地，car是cd19car、cd33car或cspg-4car。

细胞因子

在一些实施方式中，本发明提供b2m-修饰的nk-92细胞，其进一步修饰以表达至少一种细胞因子。在这样的细胞中，细胞中细胞因子的表达通常指向内质网。这一特征防止细胞因子全身性施用的不良作用，如影响心血管、胃肠、呼吸和神经系统的毒性。在一些实施方式中，该至少一种细胞因子是il-2、il-12、il-15、il-18、il-21或其变体。在优选的实施方案中，细胞因子是il-2，例如人il-2。

在某些实施方式中，il-2是靶向于内质网的变体。因此，例如，il-2与指引il-2到内质网的信号序列一起表达。在一些实施方式中，il-2是人il-2。非局限于理论，但将il-2指引到内质网允许il-2以足以进行自分泌激活的水平表达，而不是细胞外释放il-2。参见konstantinidis等“targetingil-2totheendoplasmicreticulumconfinesautocrinegrowthstimulationtonk-92cells”exphematol.2005feb；33(2):159-64。

在一些实施方式中，自杀基因也可插入b2m-修饰的nk-92细胞中，例如，在表达il-2的b2m-修饰的nk-92细胞中，以防止il-2的不受调控的内源表达(其可能导致具有自主生长的突变体的潜在发生)。在一些实施方式中，自杀基因是icaspase9(icas9)。

转基因表达

本公开还包括与上述多核苷酸或多肽(例如，cas蛋白、hla-e、cd16、fc受体、car和/或il-2)具有显著序列同一性的序列。这些序列也可以引入未b2m-修饰的nk-92细胞中。在一些实施方式中，序列与它们各自的天然序列具有至少70％，至少80％，至少85％，至少88％，至少95％，或至少98％或至少99％的序列同一性。

可以通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因(例如，cas蛋白、hla-e、cd16、fc受体、car和/或il-2)工程化到表达质粒中。转基因可以被工程化到相同或不同的表达质粒中。在优选的实施方案中，转基因在相同的质粒上表达。

可以使用本领域已知的任何瞬时转染方法将转基因引入nk-92细胞中，包括例如电穿孔、脂质转染、核转染或“基因枪”。

可以使用任何数量的载体来表达这些转基因。在一些实施方式中，载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，载体是质粒载体。可以使用的其他病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体等等。

组合疗法

在一些实施方式中，本公开的b2m-修饰的nk-92细胞与治疗性抗体和/或其他抗癌剂组合使用。治疗性抗体可用于靶向被感染的或表达癌症相关标志物的细胞。癌症治疗性单克隆抗体的实例显示在表3中。

表3.说明性的治疗性单克隆抗体

抗体可通过多种机制治疗癌症。当免疫细胞(例如也表达fcr的本公开的b2m-修饰的nk细胞)与通过fc受体(如cd16)与靶细胞结合的抗体结合时，发生抗体依赖性细胞毒性(adcc)。因此，在一些实施方式中，将表达fcr的b2m-修饰的nk-92细胞与针对特定癌症相关蛋白的抗体一起施用于患者。这种nk-92细胞的施用可以与单克隆抗体的施用同时进行，或以顺序的方式进行。在一些实施方式中，nk-92细胞在用单克隆抗体治疗受试者后施用于受试者。或者，b2m-修饰的nk-92细胞可以在单克隆抗体的同时(例如在24小时内)施用。

在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞静脉内施用。在一些实施方式中，将表达fcr的nk-92细胞直接输注到骨髓中。

治疗

还提供了用如本文所述的b2m-nk-92细胞治疗患者的方法。在一些实施方案中，患者患有癌症或传染病。如上所述，b2m-nk-92细胞可以进一步修饰以表达靶向在患者癌细胞的表面上表达的抗原的car。在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞也可以表达fc受体，例如cd16。在一些实施方式中，患者用b2m-修饰的nk-92细胞及抗体治疗。

b2m-修饰的nk-92细胞可以按照细胞的绝对数量施用于个体，例如，所述个体可以施用约1000个细胞/注射至最多约100亿个细胞/注射，例如约、至少约或至多约1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³(等等)个nk-92细胞/注射，或任何两个数字之间的任何范围，包括端点。

在其它实施方式中，所述个体可以施用约1000个细胞/注射/m²至最多约100亿个细胞/注射/m²，例如约、至少约或至多约1×10⁸/m²、1×10⁷/m²、5×10⁷/m²、1×10⁶/m²、5×10⁶/m²、1×10⁵/m²、5×10⁵/m²、1×10⁴/m²、5×10⁴/m²、1×10³/m²、5×10³/m²(等等)nk-92细胞/注射，或任何两个数字之间的任何范围，包括端点。

在其它实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞可以按照细胞的相对数量施用于这样的个体，例如，所述个体可以施用每千克个体体重约1000个细胞至多达约100亿个细胞，例如约、至少约或至多约1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³(等等)个nk-92细胞/千克个体体重，或任何两个数字之间的任何范围，包括端点。

在其它实施方式中，总剂量可以按照体表面积的m²计算，包括约1×10¹¹、1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷/m²，或任何两个数字之间的任何范围，包括终点。一般人为约1.6至约1.8m²。在优选的实施方案中，向患者施用约10亿至约30亿个nk-92细胞。在其它实施方式中，每剂量注射的nk-92细胞的量可以按照体表面积的m²计算，包括1×10¹¹、1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷/m²。一般人是1.6-1.8m²。

b2m-修饰的nk-92细胞和任选的其他抗癌剂可以一次施用于患有癌症的患者，可以多次施用，例如，在治疗期间每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更多周一次，或任何两个数字之间的任何范围，包括端点。

在一些实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞以包含b2m-修饰的nk-92细胞和介质(例如人血清或其等同物)的组合物施用。在一些实施方式中，介质包含人血清白蛋白。在一些实施方式中，介质包含人血浆。在一些实施方式中，介质包含约1％至约15％的人血清或人血清等同物。在一些实施方式中，介质包含约1％至约10％的人血清或人血清等同物。在一些实施方式中，介质包含约1％至约5％的人血清或人血清等同物。在优选的实施方式中，介质包含约2.5％的人血清或人血清等同物。在一些实施方式中，血清是人ab血清。在一些实施方式中，使用可接受用于人治疗剂中的血清替代物代替人血清。这种血清替代物可以是本领域已知的，或将来开发的。尽管可以使用超过15％的人血清浓度，但是预期大于约5％的浓度将是成本过高的。在一些实施方式中，nk-92细胞在包含nk-92细胞和支持细胞存活力的等渗液体溶液的组合物中施用。在一些实施方式中，nk-92细胞在从冷冻保存的样品重构的组合物中施用。

药学上可接受的组合物可包括各种载体和赋形剂。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常没有不希望的物质。合适的载体和赋形剂及其制剂描述于remington:thescienceandpracticeofpharmacy,21stedition,davidb.troy,ed.,lippicottwilliams&wilkins(2005)中。药学上可接受的载体是指在生物学上或其他方面不是不合乎需要的材料，即，该材料施用于受试者而不会引起不希望的生物学效应或以有害的方式与包含它的药物组合物的其他组分相互作用。如果施用于受试者，任选地选择载体以使活性成分的降解最小化并使受试者中的不良副作用最小化。如本文所用，术语药学上可接受的与生理学上可接受的和药理学上可接受的同义使用。药物组合物通常包含用于缓冲和在储存中防腐的试剂，并且可以包括用于适当递送的缓冲剂和载体，这取决于给药途径。

这些用于体内或体外应用的组合物可以通过用于细胞的灭菌技术灭菌。组合物可根据需要含有可接受的辅助物质以接近生理条件，例如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的细胞和/或其他药剂的浓度可以变化，并且按照所选择的特定施用方式和受试者的需要，主要根据流体体积、粘度、体重等来选择。

在一个实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞与一种或多种用于所治疗癌症的其他治疗结合施用于患者。在一些实施方式中，用于所治疗的癌症的两种或更多种其他治疗包括例如抗体、放射、化疗、干细胞移植或激素治疗。

在一个实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞与靶向患病细胞的抗体结合施用。在一个实施方式中，b2m-修饰的nk-92细胞和抗体一起施用于患者，例如，在相同的制剂中施用；单独地施用，例如，在独立的制剂中同时施用；或者可以单独地施用，例如，按照不同的给药方案或在一天中的不同时间。当单独施用时，抗体可以以任何合适的途径施用，例如静脉内或口服施用。

在一些实施方式中，也表达fcr(例如高亲和力cd16)的b2m-修饰的nk-92细胞可以与单克隆抗体的施用同时进行，或以顺序方式进行。在一些实施方式中，在用单克隆抗体处理受试者后24小时内将表达fcr的nk-92细胞施用于受试者。

试剂盒

还公开了使用包含一定量的如本文所述的b2m-修饰的nk-92细胞的组合物治疗癌症或传染病的试剂盒。在一些实施方式中，本公开的试剂盒还可包括至少一种单克隆抗体。

在某些实施方式中，试剂盒可以含有另外的化合物，例如治疗活性化合物或药物，其在b2m-修饰的nk-92细胞施用之前、同时或之后施用。此类化合物的实例包括抗体、维生素、矿物质、氟氢可的松、布洛芬、利多卡因、奎尼丁、化疗剂等。

在各种实施方案中，试剂盒的使用说明书将包括在癌症或传染病的治疗中使用试剂盒组分的指示。说明书还可以包含关于如何操作b2m-修饰的nk-92细胞(例如，解冻和/或培养)的信息。说明书还可以包括关于剂量和施用频率的指导。

公开了可以用于所公开的方法和组合物、可以与所公开的方法和组合物一起使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产物的材料、组合物和组分。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，尽管可能未明确公开这些化合物的每种不同的个体和集体组合和排列的具体引用，但其每一个都在本文中特别地考虑和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法并且讨论了可以对包括该方法的许多分子进行的多种修改，则特别地考虑该方法的各个和每一个组合和排列以及可能的修改，除非具体地表明相反的情况。同样地，还特别地考虑和公开了这些的任何子集或组合。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多个另外的步骤，则应理解，这些另外的步骤中的每一个可以利用所公开方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每个这样的组合或组合子集被特别地考虑并且应该被认为是公开的。

实施例

以下实施例仅用于说明目的，且不应解释为对要求保护的发明的限制。多种替代技术和程序是本领域技术人员可用的，它们类似地允许成功地执行预期的发明。

实施例1:nk-92细胞的免疫原性的分析

在混合淋巴细胞反应(mlr)实验中进行nk-92细胞免疫原性的初步评估，其中来自健康供体的pbmc(外周血单核细胞)与经照射的同种异体pbmc或nk-92细胞混合。如图1所示，观察cd8+t细胞针对同种异体pbmc和nk-92细胞的增殖反应。葡萄球菌肠毒素b(seb)超抗原用作增殖的阳性对照。

实施例2:cas9-nk-92和cas9-hank细胞系的产生

通过用edit-rcas9慢病毒感染nk-92和hank亲本细胞产生稳定表达cas9蛋白的细胞系。简而言之，edit-rcas9慢病毒原液通过用以下量的质粒转染每10cm皮氏培养皿7x10⁶个293t细胞产生：7.5μgedit-r-cas9(dharmacon,目录#cas10138)、5μgpcmv-δr8.2和2.5μgpcmv-vsv.g。使用lipofectamine3000(lifetechnologies,目录#l3000-008)按照制造商的说明进行转染。转染后48小时收集病毒上清液，并使用来自systembiosciences的peg-it病毒沉淀溶液(目录#lv810a-1)浓缩10倍。5x10⁵个nk-92或hank亲本细胞(表达高亲和力cd16的nk-92细胞)通过旋转接种(spinoculation)(840g，在35℃下99分钟)在transdux(systembiosciences,目录#lv850a-1)存在下在24孔板中的1ml最终培养基中用100μl浓缩病毒感染。转导后48小时，通过在15μg/ml杀稻瘟素(invivogen,目录#ant-bl-1)存在下生长细胞来选择表达cas9的细胞。

nk-92细胞是非常难于dna转染的。大多数转染方法(基于脂质体或电穿孔的)是无效的，且导致差的细胞回收。与dna转染相反，使用电穿孔的rna转染是高效的并且始终导致90％或更高的细胞存活力(数据未显示)。尽管其性能较好，但大rna分子的高效转染可能是一个挑战。因此，为了该实验的目的，如上所述产生稳定表达cas9的nk-92和hank细胞。在补充有1mmpmsf、1μg/ml抑肽酶、1μg/ml亮肽素的ripa裂解缓冲液(50mmtris-hclph7.4,150mmnacl,1mmedta,1％tritonx-100,1％脱氧胆酸钠,0.1％sds)中制备细胞裂解产物。通过bca蛋白质分析(pierce)测量蛋白质浓度。总蛋白(10μg)在10％sds-page上解析，使用iblot2装置(lifetechnologies)转移至硝基纤维素膜(lifetechnologies,目录号ib23002)，并用针对cas9的一抗(cellsignaling,目录号14697)或抗-α微管蛋白(santacruzbiotechnology,sc-23948)进行探测，然后与辣根过氧化物酶-(hrp)偶联的绵羊抗小鼠或抗兔ig(amersham)一起孵育。信号使用supersignalwestfemto(pierce)显现。

图2显示cas9-nk-92和cas9-hank细胞表达高水平的cas9蛋白。更重要的是，这些细胞系可用于有效地产生基因敲除。如图3所示，将b2msgrna-1转染到nk-92细胞中导致大约30％的nk-92细胞对于b2m表达是阴性的。转染后48小时进行流式细胞术分析，用体外转录的b2msgrna-1rna转染的cas9-nk-92细胞中的有效ko。

实施例3:pt7-指导-ivtb2m(β-2-微球蛋白)sgrna构建体的产生

指导rna使用mit网页工具http://crispr.mit.edu设计。sgrna靶向人b2m,nm_004048的第一外显子。

将b2m靶位点克隆到pt7-指导-ivt质粒(origene,目录号ge100025)中。寡核苷酸使用pt7-指导-ivt中的两个bsmbi位点并遵循制造商的说明书进行克隆。使用megashortscripttmt7试剂盒(lifetechnologies,目录号am1354)按照制造商的说明书产生体外转录的b2msgrna。

实施例4:b2m-konk-92细胞的产生和表征

使用maxcytegt电穿孔仪，通过用b2msgrna-1rna转染cas9-nk-92细胞产生b2m-konk-92细胞。简言之，使用nk-92-3-oc方案，用10μg体外转录的b2msgrna-1rna转染5x10⁶个cas9-nk-92细胞。转染后48小时，通过有限稀释将细胞铺板。在细胞生长15天后，选择单个克隆、扩增并通过流式细胞术测试b2m表达。图4的a和b图显示了两个代表性b2m-konk-92克隆的b2m和hlai类表达。如图4所示，nk-92细胞中b2m基因的遗传消融导致细胞表面上hlai类表达的完全丧失。

抗-b2m-pe(目录号316306)、抗-hla-i-pe(目录号311406)和igg1-pe对照(目录号#400114)抗体获自biolegend。在macsquant10流式细胞仪(miltenyi)上进行细胞荧光分析，并使用flowjo软件进行分析。

实施例5:hlai类-缺陷nk-92细胞对于同种异体nk细胞的裂解是易感的

产生较低免疫原性的hlai类阴性的nk-92变体的潜在缺陷是这些细胞可能变得易于被接受者的nk细胞裂解。nk细胞的细胞毒活性通过由多种细胞表面受体介导的激活和抑制信号之间的平衡来决定。已知nk细胞通过利用细胞表面受体(kir和cd94/nkg2a)监测hlai类表达，所述细胞表面受体转导抑制性信号并在hlai类分子识别时阻断nk细胞介导的裂解。因此，hlai类表达的丧失导致缺乏受体介导的nk细胞抑制，这可能导致它们的激活和hlai类阴性靶标的裂解。

我们使用来自多个供体的新纯化(非激活的)或激活的(il-2刺激的)nk细胞作为效应物在细胞毒性实验中评估hla-1缺陷nk-92细胞对同种异体nk细胞的裂解的易感性。如图7所示，与亲本nk-92细胞相比，不表达hlai类分子的nk-92细胞变成对同种异体nk细胞的裂解高度易感。它们的易感性与k562(一种对nk细胞杀伤高度易感的hla-i缺陷细胞系)相当。

实施例6:hlai类缺陷nk-92细胞通过作为单链三聚体表达hla-e的保护

该实施例评估了在hla-i类缺陷nk-92细胞中表达hla-e单链三聚体的保护作用。说明性hla-e单链三聚体的设计如图6所示。

hla-e-sct赋予针对同种异体nk细胞裂解的部分保护

hla-e结合源自其他经典hla-1分子的信号序列的肽，并且是nk受体cd94/nkg2a、cd94/nkg2b和cd94/nkg2c的配体。已经表明嵌合hla-i分子(由表达为单一分子的抗原性肽、β2微球蛋白和hla-i重链组成)可以有效地在细胞表面上展示并被其抗原受体识别(yu等，jimmunol168:3145-9,2002)。特别地，hla-e作为单链三聚体(sct)的强制表达已被用于预防异种移植中的猪内皮细胞以及同种异体多能干细胞(pscs)的nk细胞裂解(crew等,molimmunol42:1205-14,2005；gornalusse等,natbiotechnol,25:765-772,2017)。在hla-1缺陷nk-92细胞中恢复作为单链三聚体的hla-e表达以评估表达是否保护hla-1缺陷nk-92细胞免于被同种异体nk细胞裂解。嵌合hla-e-sct分子包括以下元件：β2m信号肽、cw*0304肽(vmaprtlil,seqidno:12)、(g4s)3接头、成熟β2m链、(g4s)4接头和成熟hla-e链(图6)。虽然这种嵌合蛋白是基于crew等，同上的嵌合蛋白，但是重要的区别在于该实施例中使用的设计对应于hla-e^g等位基因(e*0101等位基因)(其在107位含有gly)，并且证明表现出对大多数肽的较高的亲和力和较高的热稳定性(strong等,jbiolchem:278:5082-90,2003)。如图7所示，在两个不同的hla-1缺陷nk-92克隆中hla-e-sct的强制表达使hla-e表达恢复至高于亲本细胞的水平。重要的是，由于β2m链与成熟hla-e链共价连接，因此细胞对于经典hla-a、-b和-c分子的表达仍然是缺陷的(图7)。尽管在表达hla-e-sct的b2m-konk-92细胞中hla-e的高表达水平，在本实施例中，hla-e赋予了针对非激活或激活的同种异体nk细胞的裂解的部分保护(图8)。非局限于理论，这很可能是由于nk细胞子集的抑制性cd94/nkg2a受体的受限表达。事实上观察到针对同种异体nk细胞裂解的较高保护与cd94/nkg2a阳性nk细胞的较高百分比的之间的正相关性(数据未显示)。

hla-i缺陷nk-92细胞不引发同种异体cd8+t细胞反应

nk-92细胞在标准混合淋巴细胞反应(mlr)实验中引发cd8+或cd4+t细胞增殖(图1)，表明这些细胞是免疫原性的。此外，在已经接受nk-92细胞输注的患者中检测到针对nk-92细胞表达的hla分子的抗体。因此，由于目前的临床方案涉及辐照的nk-92细胞的多次输注，因此存在一些患者可能产生对nk-92细胞的免疫应答并且损害其有效性的风险。

hla-i缺陷nk-92细胞不应被cd8+t细胞识别，因为它们缺乏经典的hla-a、-b和-c分子(其通过与其tcr(t细胞受体)结合而向cd8+t细胞呈递抗原肽)。为了正式地证明hla-1缺陷nk-92细胞的免疫原性潜力的缺乏，我们产生了与亲本nk-92细胞反应性的多克隆cd8+t细胞(如材料和方法中所述)。值得注意的是，这些nk-92特异性cd8+t细胞能够识别并杀灭亲本nk-92细胞，但不能裂解hla-i缺陷nk-92细胞(图9)。

材料和方法

细胞培养物

将nk-92细胞维持在补充有5％人血清(valleybiomedical,目录号hp1022)和重组人il-2(500iu/ml；prospec,目录#cyt-209)的x-vivo10培养基(lonza,目录号be04-743q)中。k562细胞购自美国典型培养物保藏中心(atcc,rockville,md)，并维持在补充有10％fbs(gibco,目录号10438026)和1％青霉素/链霉素(gibco，目录号15070-063)的rpmi-1640培养基(thermoscientific,目录号61870-127)中。

hla-e-sct(单链三聚体)设计和序列

hla-e单链三聚体(sct)包括以下序列：b2m(β2微球蛋白)信号肽-cw*0304前导肽-接头(g4s)3-成熟b2m序列-接头(g4s)4-成熟hla-e序列(图6)。hla-e-sct的dna和蛋白质序列对应于：

b2m信号肽

b2m,β-2-微球蛋白→基因id:567。

蛋白质:uniprot→p61769

b2m信号肽氨基酸序列:

msrsvalavlallslsglea(seqidno:8)

b2m信号肽核苷酸序列:

atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggct(seqidno:9)

接头

接头(g4s)3核苷酸序列:

ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct(seqidno:10)

接头(g4s)4核苷酸序列:

ggaggaggtgggtctggaggtggaggatctggtggaggtgggtctggaggaggtgggtct(seqidno:11)

cw*0304肽

cw*0304肽对应于hlai类组织相容性抗原cw-3α链(uniprot:p04222)的前导肽

氨基酸序列:

vmaprtlil(seqidno:12)

编码cw*0304肽的核苷酸序列:

gtcatggcgccccgaaccctcatcctg(seqidno:13)

b2m成熟链

氨基酸序列:

iqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdm(seqidno:14)

编码b2m成熟链多肽的核苷酸序列:

atccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtgggatcgagacatg(seqidno:15)

hla-e成熟链

hla-e→基因id:3133.mrna登录号nm_005516

蛋白质:uniprot→p13747

hla-e成熟链不包含信号肽(前21个氨基酸)。它包含107位的gly，其对应于hla-e^g(e*0101等位基因)。

氨基酸序列:

gshslkyfhtsvsrpgrgeprfisvgyvddtqfvrfdndaasprmvprapwmeqegseywdretrsardtaqifrvnlrtlrgyynqseagshtlqwmhgcelgpdgrflrgyeqfaydgkdyltlnedlrswtavdtaaqiseqksndaseaehqrayledtcvewlhkylekgketllhleppkthvthhpisdheatlrcwalgfypaeitltwqqdgeghtqdtelvetrpagdgtfqkwaavvvpsgeeqrytchvqheglpepvtlrwkpasqptipivgiiaglvllgsvvsgavvaaviwrkkssggkggsyskaewsdsaqgseshsl(seqidno:16)

编码seqidno:16的hla-e成熟多肽序列的核苷酸序列:

ggctcccactccttgaagtatttccacacttccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatctctgtgggctacgtggacgacacccagttcgtgcgcttcgacaacgacgccgcgagtccgaggatggtgccgcgggcgccgtggatggagcaggaggggtcagagtattgggaccgggagacacggagcgccagggacaccgcacagattttccgagtgaatctgcggacgctgcgcggctactacaatcagagcgaggccgggtctcacaccctgcagtggatgcatggctgcgagctggggcccgacgggcgcttcctccgcgggtatgaacagttcgcctacgacggcaaggattatctcaccctgaatgaggacctgcgctcctggaccgcggtggacacggcggctcagatctccgagcaaaagtcaaatgatgcctctgaggcggagcaccagagagcctacctggaagacacatgcgtggagtggctccacaaatacctggagaaggggaaggagacgctgcttcacctggagcccccaaagacacacgtgactcaccaccccatctctgaccatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcaggatggggagggccatacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggagaggagcagagatacacgtgccatgtgcagcatgaggggctacccgagcccgtcaccctgagatggaagccggcttcccagcccaccatccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctccttggatctgtggtctctggagctgtggttgctgctgtgatatggaggaagaagagctcaggtggaaaaggagggagctactctaaggctgagtggagcgacagtgcccaggggtctgagtctcacagcttg(seqidno:17)

全长hla-e-sct氨基酸序列:

msrsvalavlallslsgleavmaprtlilggggsggggsggggsiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdmggggsggggsggggsggggsgshslkyfhtsvsrpgrgeprfisvgyvddtqfvrfdndaasprmvprapwmeqegseywdretrsardtaqifrvnlrtlrgyynqseagshtlqwmhgcelgpdgrflrgyeqfaydgkdyltlnedlrswtavdtaaqiseqksndaseaehqrayledtcvewlhkylekgketllhleppkthvthhpisdheatlrcwalgfypaeitltwqqdgeghtqdtelvetrpagdgtfqkwaavvvpsgeeqrytchvqheglpepvtlrwkpasqptipivgiiaglvllgsvvsgavvaaviwrkkssggkggsyskaewsdsaqgseshsl(seqidno:18)

编码seqidno:18的多肽序列的全长hla-e-sctdna序列:

atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctgtcatggcgccccgaaccctcatcctgggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctatccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtgggatcgagacatgggaggaggtgggtctggaggtggaggatctggtggaggtgggtctggaggaggtgggtctggctcccactccttgaagtatttccacacttccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatctctgtgggctacgtggacgacacccagttcgtgcgcttcgacaacgacgccgcgagtccgaggatggtgccgcgggcgccgtggatggagcaggaggggtcagagtattgggaccgggagacacggagcgccagggacaccgcacagattttccgagtgaatctgcggacgctgcgcggctactacaatcagagcgaggccgggtctcacaccctgcagtggatgcatggctgcgagctggggcccgacgggcgcttcctccgcgggtatgaacagttcgcctacgacggcaaggattatctcaccctgaatgaggacctgcgctcctggaccgcggtggacacggcggctcagatctccgagcaaaagtcaaatgatgcctctgaggcggagcaccagagagcctacctggaagacacatgcgtggagtggctccacaaatacctggagaaggggaaggagacgctgcttcacctggagcccccaaagacacacgtgactcaccaccccatctctgaccatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcaggatggggagggccatacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggagaggagcagagatacacgtgccatgtgcagcatgaggggctacccgagcccgtcaccctgagatggaagccggcttcccagcccaccatccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctccttggatctgtggtctctggagctgtggttgctgctgtgatatggaggaagaagagctcaggtggaaaaggagggagctactctaaggctgagtggagcgacagtgcccaggggtctgagtctcacagcttgtaa(seqidno:19)

慢病毒生产和感染

hla-e-sct基因使用限制性位点bamhi和sali克隆到慢病毒载体pcdh-ef1-mcs-pgk-puro(systembiosciences,目录号cd810a-1)中。通过用以下量的质粒转染每10cm皮氏培养皿7x10⁶个293t细胞来产生编码hla-e-sct的慢病毒原液：7.5μg表达hla-e-sct的pcdh-ef1-mcs-pgk-puro慢病毒载体、5μgpcmv-δr8.2和2.5μgpcmv-vsv.g。使用lipofectamine3000(lifetechnologies,目录号l3000-008)按照制造商的说明进行转染。转染后48小时收集病毒上清液，并使用来自systembiosciences的peg-it病毒沉淀溶液(目录号lv810a-1)浓缩10倍。

通过用编码hla-e-sct的慢病毒感染hla-i缺陷nk-92或k562细胞产生稳定表达hla-e-sct的细胞系。简言之，在transdux(systembiosciences,目录#lv850a-1)存在下，通过在24孔板的1ml最终培养基中用100μl浓缩病毒通过旋转接种(840g，在35℃下99分钟)感染5x10⁵个nk-92或k562细胞。转导后48小时，通过在2μg/ml嘌呤霉素(sigma,目录号p9620)存在下生长细胞来选择表达hla-e-sct的细胞。

流式细胞分析

在macsquant10流式细胞仪(miltenyi)上进行细胞荧光分析，并使用flowjo软件进行分析。抗体购自biolegend，且包括：抗b2m-pe(cat#316306)、抗hla-i-pe(cat#311406)、抗hla-e-apc(cat#342606)、抗cd3-pe(cat#300408)、抗-cd8-af647(cat#300918)、igg1-apc对照(cat#400122)、igg1-af647对照(cat#400136)和igg1-pe对照(cat#400114)。

细胞毒性分析

根据制造商的说明书，用荧光染料pkh67-gl(sigmaaldrich,saintlouis,mo)染色靶细胞。将靶和效应细胞在96孔板(falconbd,franklinlakes,nj)中以不同的效应物-靶标(e:t)比率组合，简短离心，并在5％co2培养箱中37℃下在补充有5％人血清的x-vivo10培养基(lonza,cat#04-743q)中孵育4小时。孵育后，将细胞在1％bsa/pbs缓冲液中用10μg/ml的碘化丙啶(pi,sigmaaldrich)染色，并立即通过流式细胞术进行分析。死的靶细胞被鉴定为pkh67-gl和pi双阳性的。还用pi单独地对靶细胞和效应细胞进行染色以评估自发细胞裂解。通过从具有效应物的样品中的pkh(+)/pi(+)细胞的百分比减去单独的靶细胞(自发裂解)的pkh(+)/pi(+)细胞的百分比来获得nk介导的细胞毒性的百分比。

nk细胞纯化

来自健康供体的pbmc通过使用从researchbloodcomponents(网站地址httpresearchbloodcomponents.com)购买的血沉棕黄层通过ficollhypaque梯度离心来纯化。按照制造商的说明，使用cd56microbeads(miltenyi,130-050-401)和ls柱(miltenyi,130-042-401)纯化nk细胞。cd56+/cd3-nk细胞的纯度使用抗-cd3-fitc(bdpharmingen,cat#555332)和抗-cd56-pe(bdpharmingen,cat#555516)抗体通过流式细胞术验证，并且始终≥80％的cd56+/cd3-。纯化的nk细胞在纯化后立即使用(非激活的nk细胞)或在x-vivo10/5％人血清加10³u/ml的il2中生长6-9天(激活的nk细胞)。

nk-92特异性同种异体cd8+t细胞的产生

根据制造商的说明，使用来自miltenyi的cd8+t细胞分离试剂盒(cat#130-096-495)从pbmc中纯化cd8+t细胞。cd8+t细胞的纯度使用抗-cd3-fitc(bdpharmingen,cat#555332)和抗-cd8-af647(biolegend,cat#300918)抗体通过流式细胞术验证，并且始终≥80％的cd3+/cd8+。为了产生nk-92特异性同种异体cd8+t细胞，将5x10⁴个纯化的cd8+t细胞接种在具有5x10⁴个辐照(10gy)的nk-92细胞的“u”形底96孔板中(1:1比率)。将细胞接种在补充有5％人血清但没有细胞因子的x-vivo10培养基中。培养9-12天后，cd8+t细胞用新辐照的nk-92细胞再刺激。通过在补充有5％人血清和0.5μg/mlpha-l加500iu/mlil-2的x-vivo10培养基中生长细胞进一步扩增显示出刺激的cd8+t细胞增殖的孔。

应当理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且对其的各种修改或改变是本领域技术人员可以想到的，并且包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。出于所有目的，本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请均通过引用整体并入本文。

说明性序列的表格

seqidno:1实施例3中的指导rna#1

gagtagcgcgagcacagcta

seqidno:2实施例3中的指导rna#2

cgcgagcacagctaaggcca

seqidno:3实施例3中的指导rna#3

ctcgcgctactctctctttc

seqidno:4实施例3中的指导rna#4

gctactctctctttctggcc

seqidno:5cd16高亲和力变体f158v免疫球蛋白γfc区受体iii-a氨基酸序列(成熟形式):

argthrgluaspleuprolysalavalvalpheleugluproglntrptyrargvalleuglulysaspservalthrleulyscysglnglyalatyrserprogluaspasnserthrglntrpphehisasngluserleuileserserglnalasersertyrpheileaspalaalathrvalaspaspserglyglutyrargcysglnthrasnleuserthrleuseraspprovalglnleugluvalhisileglytrpleuleuleuglnalaproargtrpvalphelysglugluaspproilehisleuargcyshissertrplysasnthralaleuhislysvalthrtyrleuglnasnglylysglyarglystyrphehishisasnseraspphetyrileprolysalathrleulysaspserglysertyrphecysargglyleuvalglyserlysasnvalsersergluthrvalasnilethrilethrglnglyleualavalserthrileserserphepheproproglytyrglnvalserphecysleuvalmetvalleuleuphealavalaspthrglyleutyrpheservallysthrasnileargserserthrargasptrplysasphislysphelystrparglysaspproglnasplys

seqidno:6人β-2-微球蛋白(b2m)前体多肽序列(np_004039)

msrsvalavlallslsgleaiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdm

seqidno:7登录号nm_005516编码的人hla-e序列

mvdgtlllllsealaltqtwagshslkyfhtsvsrpgrgeprfisvgyvddtqfvrfdndaasprmvprapwmeqegseywdretrsardtaqifrvnlrtlrgyynqseagshtlqwmhgcelgpdgrflrgyeqfaydgkdyltlnedlrswtavdtaaqiseqksndaseaehqrayledtcvewlhkylekgketllhleppkthvthhpisdheatlrcwalgfypaeitltwqqdgeghtqdtelvetrpagdgtfqkwaavvvpsgeeqrytchvqheglpepvtlrwkpasqptipivgiiaglvllgsvvsgavvaaviwrkkssggkggsyskaewsdsaqgseshsl

seqidno:8b2m信号肽氨基酸序列

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seqidno:9b2m信号肽核苷酸序列

atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggct

seqidno:10接头(g4s)3核苷酸序列

ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct

seqidno:11接头(g4s)4核苷酸序列

ggaggaggtgggtctggaggtggaggatctggtggaggtgggtctggaggaggtgggtct

seqidno:12cw*0304肽，其对应于hlai类组织相容性抗原cw-3α链(uniprot:p04222)的前导肽，氨基酸序列

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seqidno:13编码seqidno:12的cw*0304肽的核苷酸序列

gtcatggcgccccgaaccctcatcctg

seqidno:14b2m成熟链氨基酸序列

iqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdm

seqidno:15编码b2m成熟链氨基酸序列的核苷酸序列

atccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtgggatcgagacatg

seqidno:16缺乏信号肽hla-e^g(e*0101等位基因)的hla-e成熟多肽序列

gshslkyfhtsvsrpgrgeprfisvgyvddtqfvrfdndaasprmvprapwmeqegseywdretrsardtaqifrvnlrtlrgyynqseagshtlqwmhgcelgpdgrflrgyeqfaydgkdyltlnedlrswtavdtaaqiseqksndaseaehqrayledtcvewlhkylekgketllhleppkthvthhpisdheatlrcwalgfypaeitltwqqdgeghtqdtelvetrpagdgtfqkwaavvvpsgeeqrytchvqheglpepvtlrwkpasqptipivgiiaglvllgsvvsgavvaaviwrkkssggkggsyskaewsdsaqgseshsl

seqidno:17编码seqidno:16的核酸序列

ggctcccactccttgaagtatttccacacttccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatctctgtgggctacgtggacgacacccagttcgtgcgcttcgacaacgacgccgcgagtccgaggatggtgccgcgggcgccgtggatggagcaggaggggtcagagtattgggaccgggagacacggagcgccagggacaccgcacagattttccgagtgaatctgcggacgctgcgcggctactacaatcagagcgaggccgggtctcacaccctgcagtggatgcatggctgcgagctggggcccgacgggcgcttcctccgcgggtatgaacagttcgcctacgacggcaaggattatctcaccctgaatgaggacctgcgctcctggaccgcggtggacacggcggctcagatctccgagcaaaagtcaaatgatgcctctgaggcggagcaccagagagcctacctggaagacacatgcgtggagtggctccacaaatacctggagaaggggaaggagacgctgcttcacctggagcccccaaagacacacgtgactcaccaccccatctctgaccatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcaggatggggagggccatacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggagaggagcagagatacacgtgccatgtgcagcatgaggggctacccgagcccgtcaccctgagatggaagccggcttcccagcccaccatccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctccttggatctgtggtctctggagctgtggttgctgctgtgatatggaggaagaagagctcaggtggaaaaggagggagctactctaaggctgagtggagcgacagtgcccaggggtctgagtctcacagcttg

seqidno:18全长hla-e-sct氨基酸序列:

msrsvalavlallslsgleavmaprtlilggggsggggsggggsiqrtpkiqvysrhpaengksnflncyvsgfhpsdievdllkngeriekvehsdlsfskdwsfyllyyteftptekdeyacrvnhvtlsqpkivkwdrdmggggsggggsggggsggggsgshslkyfhtsvsrpgrgeprfisvgyvddtqfvrfdndaasprmvprapwmeqegseywdretrsardtaqifrvnlrtlrgyynqseagshtlqwmhgcelgpdgrflrgyeqfaydgkdyltlnedlrswtavdtaaqiseqksndaseaehqrayledtcvewlhkylekgketllhleppkthvthhpisdheatlrcwalgfypaeitltwqqdgeghtqdtelvetrpagdgtfqkwaavvvpsgeeqrytchvqheglpepvtlrwkpasqptipivgiiaglvllgsvvsgavvaaviwrkkssggkggsyskaewsdsaqgseshsl

seqidno:19编码seqidno:18的核酸序列

atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggctgtcatggcgccccgaaccctcatcctgggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctatccagcgtactccaaagattcaggtttactcacgtcatccagcagagaatggaaagtcaaatttcctgaattgctatgtgtctgggtttcatccatccgacattgaagttgacttactgaagaatggagagagaattgaaaaagtggagcattcagacttgtctttcagcaaggactggtctttctatctcttgtactacactgaattcacccccactgaaaaagatgagtatgcctgccgtgtgaaccatgtgactttgtcacagcccaagatagttaagtgggatcgagacatgggaggaggtgggtctggaggtggaggatctggtggaggtgggtctggaggaggtgggtctggctcccactccttgaagtatttccacacttccgtgtcccggcccggccgcggggagccccgcttcatctctgtgggctacgtggacgacacccagttcgtgcgcttcgacaacgacgccgcgagtccgaggatggtgccgcgggcgccgtggatggagcaggaggggtcagagtattgggaccgggagacacggagcgccagggacaccgcacagattttccgagtgaatctgcggacgctgcgcggctactacaatcagagcgaggccgggtctcacaccctgcagtggatgcatggctgcgagctggggcccgacgggcgcttcctccgcgggtatgaacagttcgcctacgacggcaaggattatctcaccctgaatgaggacctgcgctcctggaccgcggtggacacggcggctcagatctccgagcaaaagtcaaatgatgcctctgaggcggagcaccagagagcctacctggaagacacatgcgtggagtggctccacaaatacctggagaaggggaaggagacgctgcttcacctggagcccccaaagacacacgtgactcaccaccccatctctgaccatgaggccaccctgaggtgctgggccctgggcttctaccctgcggagatcacactgacctggcagcaggatggggagggccatacccaggacacggagctcgtggagaccaggcctgcaggggatggaaccttccagaagtgggcagctgtggtggtgccttctggagaggagcagagatacacgtgccatgtgcagcatgaggggctacccgagcccgtcaccctgagatggaagccggcttcccagcccaccatccccatcgtgggcatcattgctggcctggttctccttggatctgtggtctctggagctgtggttgctgctgtgatatggaggaagaagagctcaggtggaaaaggagggagctactctaaggctgagtggagcgacagtgcccaggggtctgagtctcacagcttgtaa

seqidno:20hla-a*0201的前导氨基酸序列

vmaprtlvl