metap2为金属蛋白酶，其裂解产生自核糖体的新生肽的起始甲硫氨酸。wo2010/065879报道用于治疗肥胖的小分子metap2抑制剂。
dpp-4抑制剂为已确立的用以改善罹患ii型糖尿病的患者的血糖控制的药品类型。需要在metap2和dpp-4二者中具有双重抑制活性的化合物。
本发明提供具有双重metap2和dpp-4抑制的新型化合物。这些双重抑制剂化合物可以用于治疗metap2和dpp-4介导的病况。
本发明提供式i化合物
其中x选自
r选自
或其药学上可接受的盐。
本发明提供式ii化合物
其中q选自
r2选自
或其药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方案中，x为
在本发明的一个实施方案中，x为
在本发明的一个实施方案中，x为
在一个实施方案中，q为
在一个实施方案中，q为
在一个实施方案中，q选自
在一个实施方案中，q选自
r2选自
或其药学上可接受的盐。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述式i化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供一种治疗哺乳动物肥胖的方法。该方法包括给予需要治疗的哺乳动物上述式i化合物或其药学上可接受的盐。本发明提供一种引发有需要的哺乳动物期望的重量减轻的方法，包括给予有效量的式i化合物。本发明提供一种有需要的哺乳动物的治疗性重量减轻的方法，包括给予有效量的式i化合物。
本发明提供用于治疗的上述根据式i化合物或其药学上可接受的盐。
在另一种形式中，本发明提供上述根据式i的化合物、其药学上可接受的盐或药物组合物，其用于治疗有需要的哺乳动物的肥胖。优选地，所述哺乳动物为人类。
本发明还提供药物组合物，其包含上述式i化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和任选地与一种或多种药学上的活性剂组合。附加的药学上的活性剂包括例如二甲双胍和/或西他列汀。在本发明的一个实施方案，附加的药学上的活性剂为二甲双胍。在本发明的一个实施方案中，附加的药学上的活性剂为西他列汀。在本发明的一个实施方案中，附加的药学上的活性剂为sglt-2抑制剂。本领域技术人员会意识到第二药学上的活性剂适合与metap2调节剂顺序地或同时地给药。
本发明提供一种治疗通过metap2活性调节的病况的方法。本发明提供一种治疗患者肥胖的方法。本发明提供一种对需要治疗的患者治疗ii型糖尿病的方法，包括给予患者有效量的式i化合物或其药学上可接受的盐。优选地，患者为人类。本发明提供一种对需要此类治疗的患者治疗非酒精性脂肪肝炎的方法，包括给予患者有效量的式i化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供根据式i的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肥胖。本发明提供根据式i的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗以提供治疗性重量减轻。
本发明还提供一种药物组合物，其包含上述式ii化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明还提供一种治疗哺乳动物肥胖的方法。该方法包括给予需要治疗的哺乳动物上述式ii化合物或其药学上可接受的盐。本发明提供一种引发有需要的哺乳动物期望的重量减轻的方法，包括给予有效量的式ii化合物。本发明提供一种用于有需要的哺乳动物的治疗性重量减轻的方法，包括给予有效量的式ii化合物。
本发明提供用于治疗的上述根据式ii的化合物或其药学上可接受的盐。
在另一种形式中，本发明提供上述根据式ii的化合物、其药学上可接受的盐或药物组合物，其用于治疗有需要的哺乳动物的肥胖。优选地，所述哺乳动物为人类。
本发明还提供药物组合物，其包含上述式ii化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和任选地与一种或多种药学上的活性剂组合。附加的药学上的活性剂包括例如二甲双胍和/或西他列汀。在本发明的一个实施方案，附加的药学上的活性剂为二甲双胍。在本发明的一个实施方案中，附加的药学上的活性剂为西他列汀。在本发明的一个实施方案中，附加的药学上的活性剂为sglt-2抑制剂。本领域技术人员会意识到第二药学上的活性剂适合与metap2调节剂顺序地或同时地给药。
本发明提供一种治疗通过metap2活性调节的病况的方法。本发明提供一种治疗患者肥胖的方法。本发明提供一种对需要治疗的患者治疗ii型糖尿病的方法，包括给予患者有效量的式ii化合物或其药学上可接受的盐。优选地，患者为人类。本发明提供一种对需要此类治疗的患者治疗非酒精性脂肪肝炎的方法，包括给予患者有效量的式ii化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供根据式ii的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肥胖。本发明提供根据式ii的化合物或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，所述药物用于治疗以提供治疗性重量减轻。
本文中使用的术语“治疗”是指抑制、减缓或终止存在的症状、病况或病症的发展或缓解存在的症状、病况或病症的严重性。优选的是“治疗”包括减缓罹患与调节dpp-iv和metap2相关联的病况的患者的症状。优选地，“治疗”包括增加罹患ii型糖尿病的患者的胰岛素水平。优选地，“治疗”包括提供有需要的患者的治疗性重量减轻。
本文中所使用的术语“有效量”是指本发明化合物或其药学上可接受的盐的量或剂量，其在单剂量或多剂量给予患者时为患者提供期望的效果。优选地，有效量为每剂量500mg或更少。理解为医师根据相关情况包括待治疗的病况、选择的给药途径、给予的实际活性剂、年龄、体重和各患者的响应和患者症状的严重度和其他相关情况确定实际给予的活性剂的量。
本发明化合物优选配制成通过使化合物生物可利用的任何途径给予的药物组合物。最优选地，此类组合物用于口服给药。此类药物组合物和用于制备它们的方法是本领域中熟知的。参见例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy,l.v.allen编,第22版,pharmaceuticalpress,2012。
本发明化合物能够作为药学上可接受的盐提供。“药学上可接受的盐”是指被认为是临床和/或兽医使用可接受的本发明化合物的盐。药学上可接受的盐和用于制备它们的常用方法是本领域熟知的。参见例如p.stahl等人,handbookofpharmaceuticalsalts:properties,selectionanduse,(vcha/wiley-vch,2002)；s.m.berge等人,"pharmaceuticalsalts,"journalofpharmaceuticalsciences,vol.66,no.1,1977年1月。
本文中使用的缩写根据aldrichimicaacta,vol.17,no.1,1984定义。其他缩写如下定义：“acn”是指乙腈；“amc”是指7-酰胺基-4-甲基香豆素氢溴酸盐；“boc”是指叔丁氧基羰基；“bsa”是指牛血清白蛋白；“dcm”是指二氯甲烷；“dmf”是指n,n-二甲基甲酰胺；“dio”是指饮食引发的肥胖；“dmac”是指n,n-二甲基乙酰胺；“edta”是指乙二胺四乙酸；“et”是指乙基；“etoac”是指乙酸乙酯；“hec”是指羟乙基纤维素；“hepes”是指4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸；“hfd”是指高脂饮食；“hoac”是指乙酸；“hplc”是指高效液相色谱；“ic50”是指产生试剂能够实现的最大抑制响应的50%的试剂浓度；“i-proh”是指异丙醇或异丙基醇；“lihmds”是指六甲基二硅基氨基锂；“meoh”是指甲醇或甲基醇；“rt”是指保留时间；“sfc”是指超临界流体色谱法；“tfa”是指三氟乙酸；“thf”是指四氢呋喃；“tris”是指三(羟甲基)氨基甲烷；和“triton™x-100”是指聚乙二醇叔辛基苯基醚。
下文中的方案和制备例中所述的中间体可以包含一定数量的氮、羟基和酸保护基例如酯。可变的保护基在每种情况下可以相同或不同，取决于特定的反应条件和特定的待进行的转换。保护和脱保护条件是本领域技术人员熟知的并记载于文献中。参见例如greene’sprotectivegroupinorganicsynthesis,第5版,peterg.mwuts,johnwileyandsons,inc.,2014。
本领域普通技术人员可以在合成本发明化合物中在任何方便的点通过方法例如选择性结晶技术或手性色谱分离或拆分各种异构体、对映异构体和非对映异构体（参见例如j.jacques等人,"enantiomers,racemates,andresolutions",johnwileyandsons,inc.,1981，和e.l.elielands.h.wilen,”stereochemistryoforganiccompounds”,wiley-interscience,1994）。
本发明化合物或其盐可以通过本领域已知的各种程序制备，其一些示例于下文的制备例和实施例中。所述的各个途径的特定合成步骤可以不同的方式组合，以制备本发明化合物或其盐。各步骤的产物能够通过本领域熟知的常规方法回收，包括萃取、蒸发、沉淀、层析、过滤、研磨和结晶。试剂和起始原料对于本领域普通技术人员是容易获得的。其他的可以通过类似于已知的结构类似的化合物的合成的有机和杂环化学的标准技术以及下文中的制备例和实施例中所述的程序（包括任何新程序）制备。
除非另外指明，否则全部取代基都如前文定义。试剂和起始原料一般来说对于本领域普通技术人员是容易获得的。其他的可以通过类似于已知的结构类似的化合物的合成的有机和杂环化学的标准技术以及下文中的制备例和实施例中所述的程序（包括任何新程序）制备。
制备例1
n-(3-氯-5-氟苄基)-2-氧代吡咯烷-3-甲酰胺
将化合物2-氧代吡咯烷-3-甲酸乙酯(180.00g,929.61mmol)和(3-氯-5-氟苯基)甲胺(148.36g,929.61mmol)在二甲苯(4.00l)中的溶液加热至130℃持续16小时。lcms示出起始原料仍然存在。将反应混合物冷却至10℃并在30分钟之后沉淀出固体。过滤悬浮液并用二甲苯(3×500ml)、石油醚(2×500ml)洗涤滤饼，并在真空下干燥以提供期望的产物(81g)。在减压下浓缩滤液并将二甲苯(3l)中的残余物加热至130℃持续40小时。将反应混合物冷却至10℃并在30分钟之后沉淀出固体。过滤悬浮液并用二甲苯(2×500ml)、石油醚(2×500ml)洗涤滤饼，并在真空下干燥以提供标题产物(81.38g)，将其与第一批合并以提供白色固体形式的标题产物(164.38g,607.26mmol,65.32%收率)。es/msm/z270.9(m+1)。
制备例2
n-(3-氯-5-氟苄基)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-3-甲酰胺
在80℃下经30分钟的时间将n-(3-氯-5-氟苄基)-2-氧代吡咯烷-3-甲酰胺(164.38g,607.26mmol)溶解于t-buoh(6.00l)中。将反应混合物冷却至15℃。添加naoet(206.62g,3.04mol)，溶液颜色从无色转变成黄色。在25℃下将叔丁基过氧化氢(626.98ml,4.25mol,65%纯度)添加至该混合物。溶液颜色从黄色变成白色并沉淀出固体。将悬浮液加热至40℃持续1小时。用饱和na2so3水溶液(1500ml)淬灭白色悬浮液并用4nhcl(100ml)将ph调节至7并分离。用dcm/i-proh(3/1,2×400ml)萃取水层。在减压下浓缩合并的有机萃取物。将残余物溶解于dcm/i-proh(3/1,3l)中并用水(500ml)、盐水(500ml)洗涤和在减压下浓缩。在15℃下用dcm(400ml)将黄色固体制浆持续15分钟并过滤。用dcm(3×150ml)洗涤滤饼并在真空下干燥以提供白色固体形式的标题化合物(169.00g,583.59mmol,96.10%收率)。es/msm/z286.9(m+h)。
制备例3
(3r)-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺
通过手性sfc（仪器：sfc-7；柱：ad(250mm*50mm,10µm)；流动相：aco2和bmeoh；梯度：b45%；柱温：38℃；流速：200ml/min；被压：100bar；波长：220nm）分离n-(3-氯-5-氟苄基)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-3-甲酰胺(164.00g,572.05mmol)以提供白色固体形式的标题化合物作为第一洗脱异构体(58.86g,205.31mmol,35.89%收率,rt=4.45min)。
基本上通过(3r)-n-[(3-氯-5-氟-苯基)-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺的方法制备下文的中间体。第一洗脱异构体用于化合物制备。
表1
制备例10
4-(5-溴嘧啶-2-基)-3,6-二氢-2h-吡啶-1-甲酸叔丁酯
在20℃下搅拌4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-3,6-二氢-2h-吡啶-1-甲酸叔丁酯(22.0g,71.2mmol)、5-溴-2-碘-嘧啶(20.3g,71.2mmol)、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(ii)(4.78g,6.40mmol)、碳酸钠(22.6g,213mmol)在水(80ml)和1,4-二氧杂环己烷(400ml)中的混合物并用n2(3×)吹扫。在n2气氛下，将该溶液加热至90℃并搅拌16小时。将该悬浮液浓缩至干并加入水(800ml)。用etoac(3×500ml)萃取该混合物。用饱和盐水(500ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。通过硅胶层析法用pe:etoac(10:1)洗脱来纯化残余物以提供灰白色固体形式的标题化合物(12.0g,70.2质量%,35%收率)。es/ms(esi)m/z285.9[m+h-56]+。
制备例11
5-溴-2-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)嘧啶
向4-(5-溴嘧啶-2-基)-3,6-二氢-2h-吡啶-1-甲酸叔丁酯(12.0g,35.3mmol)在dcm(50.0ml)中的溶液添加tfa(50.0ml)。在25℃下搅拌所得混合物0.5小时。向残余物添加饱和碳酸氢钠水溶液(300ml)，用etoac(3×200ml)萃取该混合物。用盐水(100ml)洗涤合并的萃取物，干燥，并浓缩以提供灰白色固体形式的标题化合物(5.84g,69%)，其不经进一步纯化直接使用。es/ms(esi)m/z239.9[m+h]+。
制备例12
n-[[(3r,5s,6r)-5-(叔丁氧基羰基氨基)-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基]氨基甲酸叔丁酯
在25℃下搅拌n-[(2r,3s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(12.0g,36.7mmol)和n-氨基氨基甲酸叔丁酯(5.81g,44.0mmol)在hoac(110ml)中的溶液10分钟。缓慢添加氰基硼氢化钠(4.85g,73.3mmol)并在25℃下搅拌该混合物3小时。用水稀释该反应混合物并通过添加5nnaoh将ph调节至9，同时保持反应温度低于20℃。过滤所得悬浮液，用水(250ml)洗涤滤饼并在真空下干燥。通过硅胶combi-flashdcm:meoh(20:1)经75分钟纯化粗产物以提供白色固体形式的标题化合物(12.5g,76.9%)。es/ms(m/z)466.1[m+na]+)。
制备例13
(2r,3s,5r)-2-(2,5-二氟苯基)-5-肼基-四氢吡喃-3-胺二盐酸盐
向n-[[(3r,5s,6r)-5-(叔丁氧基羰基氨基)-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基]氨基甲酸叔丁酯(12.5g,28.2mmol)在dcm(100ml)中的溶液缓慢加入hcl(4mol/l)/etoac(90.0ml)。在16℃下搅拌所得混合物2小时。在减压下蒸发溶剂以提供白色固体形式的标题化合物(8.50g,95.4%)。
制备例14
n-[(2r,3s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羟基-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
在-20℃下将硼氢化钠(4.85g,128mmol)缓慢添加至(2s)-4-氧代吡咯烷-1,2-二甲酸o1-叔丁酯o2-甲酯(14.0g,42.8mmol)在乙醇(280ml)中的溶液。在-20℃下搅拌该溶液2小时。用1nhcl将该反应混合物调节至ph=6并用dcm(3×500ml)萃取该混合物。用盐水(200ml)洗涤合并的有机萃取物，经硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩以提供灰白色固体形式的标题化合物(14.0g,93.3质量%,92.7%收率)，其不经进一步纯化直接使用。es/ms(m/z)273.9[m+h-56]+。
制备例15
[(3s,5s,6r)-5-(叔丁氧基羰基氨基)-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]4-硝基苯甲酸酯
将n-[(2r,3s,5r)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羟基-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(11.0g,33.4mmol)、4-硝基苯甲酸(27.9g,167mmol)和三苯基膦(43.8g,167mmol)一起加入thf(220ml)中并将该混合物冷却至0℃。向反应混合物中缓慢加入偶氮二甲酸二乙酯(29.1g,167mmol)。在0℃下搅拌该反应混合物15分钟，然后温热至25℃并再搅拌16小时。加入水(500ml)，用etoac(4×400ml)萃取该混合物，用饱和盐水(300ml)洗涤，经na2so4干燥并浓缩至干。通过硅胶层析法采用pe:etoac(5:1)洗脱纯化残余物以提供白色固体形式的标题化合物(15.0g,71.4%)。es/ms(m/z)379.0[m+h-100]+。
制备例16
n-[(2r,3s,5s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羟基-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
向[(3s,5s,6r)-5-(叔丁氧基羰基氨基)-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]4-硝基苯甲酸酯(15.0g,31.4mmol)在thf(150ml)中的搅拌溶液加入氢氧化锂(6.57g,157mmol)在水(150ml)中的溶液。在25℃下搅拌该混合物2小时。加入水(150ml)并用etoac(3×200ml)萃取该混合物。用饱和盐水(200ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过硅胶快速层析法采用dcm:meoh(20:1)洗脱纯化残余物以提供白色固体形式的标题化合物(7.00g,75.1质量%,50.9%收率)。es/ms(m/z)230.0[m+h-100]+。
制备例17
(2r,3s,5r)-5-(4-溴吡唑-1-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-胺
向(2r,3s,5r)-2-(2,5-二氟苯基)-5-肼基-四氢吡喃-3-胺二盐酸盐(8.50g,26.9mmol)和2-溴丙二醛(5.02g,32.3mmol)在hoac(170ml)中的溶液加入甲苯磺酸水合物(255mg,1.34mmol)并在19℃下搅拌该混合物3小时。将该反应混合物倾倒入5nnaoh中将ph调节至12，并保持反应混合物温度低于20℃。采用dcm(3×550ml)萃取该混合物，用盐水洗涤，干燥并浓缩以提供黄色油形式的标题化合物(6.70g,69.6%)，其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z)359.9[m+h]+。
制备例18
n-[(2r,3s,5r)-5-(4-溴吡唑-1-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
向(2r,3s,5r)-5-(4-溴吡唑-1-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-胺(6.50g,18.1mmol)和三乙胺(9.27g,90.7mmol)在dcm(200ml)中的溶液加入二碳酸二叔丁酯(10.0g,45.4mmol)并在12℃下搅拌该混合物16小时。加入水(300ml)并用dcm(3×300ml)萃取该混合物，用0.05nhcl溶液(100ml)、盐水洗涤，干燥并浓缩至干。通过硅胶combi-flash采用pe:etoac(5:1)洗脱纯化粗产物以提供黄色固体形式的标题化合物(3.70g,92.8质量%,41.3%收率)。es/ms(m/z)(79br/81br)358.1/360.1[m+h-100]+。
制备例19
n-[(2r,3s,5r)-5-(3-溴吡唑-1-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
向n-[(2r,3s,5s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羟基-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(0.500g,1.50mmol)、3-溴-1h-吡唑(0.331g,2.25mmol)和三苯基膦(0.591g,2.25mmol)在thf(10.0ml)中的悬浮液加入偶氮二甲酸二乙酯(0.393g,2.25mmol)。在25℃下搅拌该反应16小时，然后浓缩至干。加入水(50ml)并用etoac(3×40ml)萃取该混合物。用饱和盐水(40ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩至干。通过硅胶快速层析法采用pe:etoac(5:1)洗脱纯化残余物以提供白色固体形式的标题化合物(0.150g,93.7质量%,20.4%收率)，其不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z)(79br/81br)359.9/361.9[m+h-100]+。
制备例20
n-[(2r,3s,5r)-5-(4-溴三唑-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
向n-[(2r,3s,5s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-羟基-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(7.00g,21.3mmol)、4-溴-1h-三唑(3.30g,22.3mmol)和三苯基膦(8.36g,31.9mmol)在thf(140ml)中的悬浮液加入偶氮二甲酸二乙酯(5.55g,31.9mmol)。在25℃下搅拌该反应16小时。浓缩该混合物并加入水(400ml)。采用etoac(3×300ml)萃取该混合物。采用饱和盐水(300ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。通过硅胶快速层析法采用pe:etoac(5:1)洗脱纯化残余物以提供白色固体形式的标题化合物(2.70g,26.4%)。es/ms(m/z)(79br/81br)359.0/361.0[m+h-100]+。
制备例21
n-[(2r,3s,5r)-5-(5-溴异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
向5-溴异吲哚啉盐酸盐(3.00g,12.5mmol)和n-[(2r,3s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(4.14g,12.7mmol)在dmac(120ml)中的溶液加入三乙胺(3.5ml,25.1mmol)。在10℃下搅拌所得混合物15分钟。然后加入hoac(2.26g,37.6mmol)并搅拌该混合物1小时。在0℃下将三乙酰氧基硼氢化钠(10.6g,50.1mmol)加入该溶液。在10℃下搅拌所得混合物16小时。采用1mhcl水溶液将该反应混合物的ph调节至5~6。用水(800ml)稀释所得溶液并用etoac(3×300ml)萃取。用盐水(3×500ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。通过硅胶快速层析法采用dcm:meoh(50:1)洗脱纯化粗产物以提供棕色固体形式的标题化合物(5.50g,84.4%)。es/ms(m/z)(79br/81br)511.4/513.4[m+h]。
制备例22
n-[(2r,3s,5r)-2-(2,5-二氟苯基)-5-[4-(5-碘嘧啶-2-基)哌嗪-1-基]四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
向5-碘-2-哌嗪-1-基-嘧啶(10.0g,33.4mmol)和n-[(2r,3s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(11.5g,35.1mmol)在dmac(100ml)中的溶液加入hoac(2.01g,33.4mmol)并在8℃下搅拌该混合物1小时。在0℃下将三乙酰氧基硼氢化钠(17.7g,83.6mmol)加入该溶液并在8℃下搅拌所得混合物16小时。将反应混合物倾倒入水(500ml)。通过过滤收集沉淀物并在真空下干燥固体以提供粗产物。通过硅胶快速层析法采用pe:etoac(1:1)洗脱纯化粗产物以提供白色固体形式的标题化合物(3.80g,18.9%)。es/ms(m/z)602.1[m+h]。
制备例23
n-[(2r,3s,5r)-5-[4-(5-溴嘧啶-2-基)-3,6-二氢-2h-吡啶-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
向5-溴-2-(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)嘧啶(5.84g,24.3mmol)和n-[(2r,3s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(7.96g,24.3mmol)在dmac(120ml)中的悬浮液加入hoac(1.61g,26.8mmol)并在0℃下搅拌该混合物30分钟。按份加入三乙酰氧基硼氢化钠(10.3g,48.6mmol)。在25℃下搅拌所得混合物16小时。将该反应混合物倾倒入饱和碳酸氢钠水溶液(500ml)中并用etoac(3×300ml)萃取。用盐水(200ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤，并浓缩至干。通过硅胶柱层析法采用dcm:meoh(20:1)洗脱纯化残余物以提供灰白色固体形式的标题化合物(9.00g,67.5质量%,45%收率)。es/ms(esi)m/z553.1[m+h]+。
制备例24
4-[5-[(3s)-3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]-2-吡啶基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在n2下将4-(5-碘-2-吡啶基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(300mg,0.771mmol)、(3r)-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺(242mg,0.848mmol)和cs2co3(739mg,2.31mmol)在dmf(4.00ml)和acn(2ml)中的混合物搅拌15分钟。顺序地加入n,n'-二甲基乙二胺(20mg,0.231mmol)和cui(191mg,1.00mmol)。在85℃下搅拌所得混合物2小时。过滤该混合物并将滤液倾倒入水(20ml)中并用etoac(2×20ml)萃取。用饱和盐水(10ml)洗涤合并的有机萃取物并经na2so4干燥，过滤并蒸发滤液以提供粗产物。通过硅胶快速层析法采用dcm:meoh(100:0~20:1)洗脱纯化粗产物以提供灰白色固体形式的标题化合物(300mg,71.0%)。es/ms(m/z)548.0[m+h]+。
制备例25
(3s)-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-1-(6-哌嗪-1-基-3-吡啶基)吡咯烷-3-甲酰胺
向4-[5-[(3s)-3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]-2-吡啶基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(300mg,0.5474mmol)在meoh(2.00ml)中的溶液逐滴加入hcl/meoh(1.00ml,4.00mmol,4mol/l)。在15℃下搅拌该反应混合物3小时并浓缩以提供淡黄色固体形式的标题产物(250mg,97.7%)。该产物不经进一步纯化即使用。es/ms(m/z)448.2[m+h]+。
制备例26
n-[(2r,3s,5r)-2-(2,5-二氟苯基)-5-[5-[3-羟基-2-氧代-3-[(2,3,5-三氟苯基)甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基]异吲哚啉-2-基]四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯，异构体1
向n-[(2r,3s,5r)-5-(5-溴异吲哚啉-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(4.00g,7.70mmol)在acn(40ml)和dmf(40ml)中的溶液加入3-羟基-2-氧代-n-[(2,3,5-三氟苯基)甲基]吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1(2.22g,7.70mmol)、cui(1.91g,10.0mmol)、cs2co3(5.01g,15.4mmol)和n,n'-二甲基乙二胺(0.204g,2.31mmol)，然后采用n2吹扫该反应混合物并在90℃下在n2气氛下搅拌8小时。将该反应混合物冷却至室温，用etoac(200ml)稀释并用nh3.h2o(2×500ml)洗涤。用etoac(2×200ml)萃取水层。用盐水(2×500ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水na2so4干燥，并在减压下浓缩以提供棕色固体形式的粗产物。通过硅胶快速层析法采用dcm:meoh(50:1)洗脱纯化粗产物以提供棕色固体形式的标题化合物(3.62g,4.65mmol,92质量%,60.4%收率)。es/ms(m/z)717.3[m+h]。
制备例27
n-[(2r,3s,5r)-5-[4-[3-[(3,5-二氯-2-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]吡唑-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯，异构体1
向n-[(3,5-二氯-2-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1(110mg,0.325mmol)在acn(3.00ml)和dmf(3.00ml)中的溶液加入n-[(2r,3s,5r)-5-(5-溴异吲哚-2-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(200mg,0.240mmol,55质量%)、cui(125mg,0.656mmol)、cs2co3(325mg,0.997mmol)和n,n'-二甲基乙二胺(20.0mg,0.227mmol)。用氮气吹扫该反应混合物并在85℃下在氮气气氛下搅拌2小时。将该反应混合物冷却至室温，用etoac(20ml)和nh3.h2o(50ml)稀释。用etoac(2×20ml)萃取水层。用盐水(3×50ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以提供黄色固体形式的粗产物(300mg)。通过硅胶快速层析法采用dcm:meoh(20:1)洗脱纯化粗产物以提供淡黄色固体形式的标题产物(65.0mg,90质量%,34.9%收率)。es/ms(esi)m/z598.1[m-boc]+。
基本上通过n-[(2r,3s,5r)-2-(2,5-二氟苯基)-5-[5-[3-羟基-2-氧代-3-[(2,3,5-三氟苯基)甲基氨基甲酰基]吡咯烷-1-基]异吲哚啉-2-基]四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯，异构体1的方法使用合适的试剂采用约85℃至90℃的反应温度和2至16小时的反应时间制备下文的中间体。
表2
替代制备例27
在氮气气氛下将n-[(2r,3s,5r)-5-(4-溴吡唑-1-基)-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(15.01g)溶解于无水1,4-二氧杂环己烷(226ml)中。然后，在氮气气氛下，将n-[(3,5-二氯-2-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1(11.71g)、碳酸铯(19.21g)、碘化钠(8.34g)和碘化亚铜(1.247g)加入该混合物。在氮气下将该混合物脱气五次。加入反式-n,n'-二甲基环己烷-1,2-二胺(1.60ml)并在105ºc下加热该混合物24小时。用etoac(226ml)稀释该混合物，搅拌5分钟，并通过硅藻土过滤。将氯化铵饱和水溶液(226ml,226ml)加入滤液并在22ºc下搅拌该混合物30分钟。分离有机层，采用氯化铵饱和水溶液(4×226ml)洗涤并蒸发至干。采用硅胶过滤采用0%至40%dcm/甲基叔丁基醚的梯度洗脱纯化残余物以提供灰白色固体形式的标题化合物。ms(m/z):598[m+h]。
制备例31
n-[(2r,3s)-5-[4-[5-[(3s)-3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]-2-吡啶基]哌嗪-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
向(3s)-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-1-(6-哌嗪-1-基-3-吡啶基)吡咯烷-3-甲酰胺(200mg,0.4465mmol)和n-[(2r,3s)-2-(2,5-二氟苯基)-5-氧代-四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(175mg,0.536mmol)在dmac(4.00ml)中的溶液加入三乙胺(90.2mg,0.8931mmol)。在室温下搅拌该混合物15分钟以提供澄清溶液。加入hoac(80.4mg,1.34mmol)并搅拌该混合物60分钟。在-10℃下将三乙酰氧基硼氢化钠(376.8mg,1.79mmol)加入该混合物，在16℃下搅拌该混合物16小时。采用etoac(2×100ml)稀释该混合物并用饱和盐水(2×50ml)洗涤。经na2so4干燥有机层，过滤并蒸发以提供粗产物。通过硅胶快速层析法采用dcm:meoh(100:0~20:1~10:1)洗脱纯化粗产物以提供淡黄色固体形式的标题产物(130mg,38.35%)。es/ms(m/z)759.1[m+h]+。
制备例32
n-[(2r,3s,5r)-5-[4-[5-[(3s)-3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]嘧啶-2-基]-3,6-二氢-2h-吡啶-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯
用n2流将n-[(2r,3s,5r)-5-[4-(5-溴嘧啶-2-基)-3,6-二氢-2h-吡啶-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(8.00g,14.5mmol)、(3r)-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺(4.16g,14.5mmol)和cs2co3(14.2g,43.5mmol)在dmf(160ml)和acn(80.0ml)中的溶液脱气15分钟。顺序地加入n,n'-二甲基甲二胺(384mg,4.35mmol)和cui(3.59g,18.9mmol)，并在85℃下搅拌所得混合物4小时。加入浓缩的氢氧化铵(80ml)和水(400ml)。用etoac(3×300ml)萃取该混合物并用饱和盐水(200ml)洗涤合并的有机萃取物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩至干。通过硅胶快速层析法采用dcm:meoh(10:1)洗脱纯化残余物以提供黄色固体形式的混合物(7.0g)。通过制备型hplc(柱：phenomenexsynergimax-rp250*50mm*10µm，流动相：15-56%b(a=0.1%tfa,b=acn)，流速：25ml/min，uv检测器220nm)纯化该固体以提供黄色固体形式的标题产物(3.5g)。然后，通过手性sfc进一步纯化该固体以提供黄色固体形式的标题化合物(2.40g,21%,rt=1.893min)。es/ms(esi)m/z757.3[m+h]+。
实施例1
1-[2-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]异吲哚啉-5-基]-3-羟基-2-氧代-n-[(2,3,5-三氟苯基)甲基]吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1盐酸盐
在10℃下向n-[(2r,3s,5s)-5-[6-[3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]吡嗪-2-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯，异构体1(3.62g,4.65mmol,92质量%)在etoac(20ml)中的溶液加入hcl/etoac(40ml,4.0mol/l)，在10℃下搅拌该反应混合物1小时，并将该混合物浓缩至干。通过制备型hplc使用溶剂梯度(柱：phenomenexsynergic18150*25*10µm，条件：20-50%b(a:水/0.05%hcl,b:acn，流速：100ml/min)纯化粗物质以提供标题产物。将包含期望产物的各级分浓缩至50ml水中。将该溶液冻干以提供白色固体形式的标题化合物(2.51g,3.84mmol,82.7%收率)。es/ms(m/z)617.3[m+h],1hnmr(400mhz,d4-meoh)δ8.82(t,j=6.0hz,1h),7.90(br.s.,1h),7.72(d,j=8.3hz,1h),7.50(d,j=8.3hz,1h),7.36(d,j=3.3hz,1h),7.25(d,j=4.5hz,2h),7.11-6.97(m,2h),4.87-4.72(m,5h),4.63-4.44(m,3h),4.18-3.89(m,4h),3.73(t,j=10.8hz,1h),2.94(d,j=5.3hz,1h),2.80-2.70(m,1h),2.36-2.20(m,2h)。
基本上通过1-[2-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]异吲哚啉-5-基]-3-羟基-2-氧代-n-[(2,3,5-三氟苯基)甲基]吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1盐酸盐的方法制备下文的化合物。
表3
实施例3
1-[2-[4-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]哌嗪-1-基]嘧啶-5-基]-n-[(2,3-二氟苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1盐酸盐
在8℃下向n-[(2r,3s,5r)-2-(2,5-二氟苯基)-5-[4-[5-[3-[(2,3-二氟苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]嘧啶-2-基]哌嗪-1-基]四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(3.00g,3.95mmol)在etoac(10ml)中的溶液加入hcl(20ml,4.0mol/l在etoac中)，在8℃下搅拌该反应混合物1.5小时。通过过滤收集沉淀物。将该固体溶解于水(100ml)中并冻干以提供白色固体形式的标题化合物(2.60g,96.2%)。es/ms(m/z)644.1[m+h].1hnmr(400mhz,d4-meoh)δ8.79(s,2h),7.36-7.29(m,1h),7.28-7.21(m,2h),7.19-7.07(m,3h),4.75(d,j=12.0hz,1h),4.69-4.44(m,4h),4.05-3.34(m,12h),2.91(d,j=8.0hz,1h),2.80-2.70(m,1h),2.35-2.19(m,2h)。
基本上通过1-[2-[4-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]哌嗪-1-基]嘧啶-5-基]-n-[(2,3-二氟苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1盐酸盐的方法制备下文的化合物。
表4
实施例5
(3s)-1-[6-[4-[(3s,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]哌嗪-1-基]-3-吡啶基]-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺,盐酸盐
向n-[(2r,3s)-5-[4-[5-[(3s)-3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]-2-吡啶基]哌嗪-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(130mg,0.159mmol,93.0质量%)在etoac(2.00ml)中的溶液加入hcl/etoac(2.00ml,8.00mmol,4.00mol/l)。在26℃下搅拌该反应混合物3小时。过滤该反应混合物并蒸发以提供混合物形式的产物。通过sfc(phenomenexas250*30mm*5µm:40%b(b=0.05%二乙胺/meoh)，流速50ml/min)分离该混合物。通过制备型hplc(bostongreenods150*30mm*5µm:10-40%b(a=0.05%hcl水,b=acn)，流速：25ml/min)纯化产物。将包含期望化合物的各级分蒸发至干以提供标题产物(30.1mg,28.4%)。es/ms(esi)m/z659.2[m+h]+,1hnmr(400mhz,d4-meoh)δ8.63(s,1h),8.40(d,j=9.2hz,1h),7.49(d,j=9.2hz,1h),7.38-7.18(m,4h),7.08(t,j=9.2hz,2h),4.77(d,j=10.0hz,1h),4.66-4.48(m,2h),4.42-4.34(m,1h),4.24-3.86(m,8h),3.70(d,j=5.6hz,5h),3.02-2.87(m,1h),2.83-2.62(m,1h),2.40-2.17(m,2h)。
实施例6
1-[1-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]吡唑-4-基]-n-[(3,5-二氯苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1盐酸盐
向n-[(2r,3s,5r)-5-[4-[3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]吡唑-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯，异构体1(2.90g,4.13mmol)在etoac(60.0ml)中的溶液缓慢加入hcl(4mol/l)/etoac(30.0ml)。在18℃下搅拌所得混合物2小时。在减压下蒸发该溶剂。采用etoac(10ml)洗涤粗产物以提供白色固体形式的标题化合物(2.04g,78.5%)。es/ms(m/z)580.0[m+h]+,1hnmr(400mhz,d4-meoh)δ8.20(s,1h),7.83(s,1h),7.40-7.34(m,1h),7.34-7.29(m,3h),7.28-7.21(m,2h),4.80-4.67(m,2h),4.51-4.42(m,1h),4.41-4.24(m,2h),3.94-3.81(m,3h),3.73-3.61(m,1h),2.80-2.64(m,2h),2.44(q,j=12.1hz,1h),2.29(td,j=8.0,13.4hz,1h)。
实施例7
1-[1-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]吡唑-4-基]-n-[(3,5-二氯-2-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺，异构体1盐酸盐
在0℃下向n-[(2r,3s,5r)-5-[4-[3-[(3,5-二氯-2-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]吡唑-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯，异构体1(65.0mg,0.0838mmol,90质量%)在etoac(5.00ml)中的溶液加入hcl(10.0ml,40.0mmol,4mol/l)。在10℃下搅拌该反应混合物30分钟。在减压下除去溶剂并通过制备型hplc(柱：bostongreenods150*30mm*5µm，条件如下：25~55%b(a:水(0.05%hcl),b:acn,rt=0.578min)；流速：25ml/min)纯化粗产物以提供标题产物，其溶解于水/ch3cn(v/v,2:1,15ml)中，并冻干以提供白色固体形式的标题产物(41.9mg,77.2%)。1hnmr(400mhz,d4-meoh)δ8.19(s,1h),7.81(s,1h),7.45(dd,j=2.6,6.1hz,1h),7.41-7.32(m,2h),7.30-7.18(m,2h),4.79-4.69(m,2h),4.58-4.40(m,2h),4.29(dd,j=3.3,11.0hz,1h),3.93-3.81(m,3h),3.72-3.62(m,1h),2.81-2.64(m,2h),2.44(q,j=12.0hz,1h),2.29(td,j=7.9,13.5hz,1h)es/ms(esi)m/z597.9[m+h]+。
实施例8
(3s)-1-[2-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]三唑-4-基]-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺,盐酸盐
向n-[(2r,3s,5r)-5-[4-[(3s)-3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]三唑-2-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(1.50g,2.26mmol)在etoac(20.0ml)中的溶液缓慢加入hcl(4mol/l)/etoac(20.0ml)。在25℃下搅拌所得混合物1.5小时。浓缩该混合物以除去部分溶剂，并过滤所得沉淀物以提供灰白色固体形式的标题化合物(1.20g,86.5%)。es/ms(m/z)565.1[m+h]+.将标题化合物（与基本上同样制备的材料合并）(2.20g,3.66mmol)溶解于水(32ml)和acn(8.0ml)的溶液中。将该溶液冻干以提供灰白色固体形式的标题化合物(1.97g,87.9%)。es/ms(m/z)565.1[m+h]+,1hnmr(400mhz,d4-meoh)δ8.17(s,1h),7.44-7.37(m,1h),7.32-7.23(m,2h),7.21(s,1h),7.12-7.03(m,2h),5.04(s,1h),4.79(d,j=10.0hz,1h),4.55-4.35(m,3h),4.07-3.88(m,3h),3.79-3.69(m,1h),2.91-2.74(m,2h),2.49(q,j=12.0hz,1h),2.39-2.27(m,1h)。
基本上通过(3s)-1-[2-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]三唑-4-基]-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺,盐酸盐的方法制备下文化合物。
表6
实施例12
(3s)-1-[1-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]吡唑-3-基]-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺,盐酸盐
向混合物形式的n-[(2r,3s,5r)-5-[3-[(3s)-3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]吡唑-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(0.0800g,0.117mmol)在etoac(10.0ml)中的溶液缓慢加入hcl(4mol/l)/etoac(10.0ml)。在25℃下搅拌该混合物1.5小时并浓缩。通过制备型hplc(柱：phenomenexsynergic18150*30mm*4µm，流动相：20-40%b(a=0.05%hcl,b=acn),流速：25ml/min，uv检测器220nm)纯化粗材料以提供白色固体形式的标题化合物(25.9mg,35.0%)。1hnmr(400mhz,d4-meoh)δ7.71(d,j=2.2hz,1h),7.39(br.s.,1h),7.30-7.19(m,3h),7.08(t,j=9.5hz,2h),6.82(d,j=2.2hz,1h),4.80-4.64(m,2h),4.55-4.35(m,2h),4.29(dd,j=4.4,11.2hz,1h),4.09-3.89(m,3h),3.74-3.62(m,1h),2.78-2.62(m,2h),2.50(m,1h),2.32-2.20(m,1h)。
基本上通过(3s)-1-[1-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]吡唑-3-基]-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺,盐酸盐的方法制备下文化合物。
表7
实施例17
(3s)-1-[2-[1-[(3r,5s,6r)-5-氨基-6-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]-3,6-二氢-2h-吡啶-4-基]嘧啶-5-基]-n-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-3-甲酰胺,盐酸盐
向n-[(2r,3s,5r)-5-[4-[5-[(3s)-3-[(3-氯-5-氟-苯基)甲基氨基甲酰基]-3-羟基-2-氧代-吡咯烷-1-基]嘧啶-2-基]-3,6-二氢-2h-吡啶-1-基]-2-(2,5-二氟苯基)四氢吡喃-3-基]氨基甲酸叔丁酯(2.40g,3.17mmol)在etoac(40.0ml)中的溶液缓慢加入hcl(4mol/l)/etoac(40.0ml)。在25℃下搅拌所得混合物1.5小时。过滤该混合物并将该固体溶解于20%acn/水(150ml)中并冻干以提供黄色固体形式的标题化合物(2.026g,91%)。es/ms(esi)m/z657.1[m+h]+,1hnmr(400mhz,d4-meoh)δ9.22(s,2h),7.40-7.33(m,1h),7.32-7.19(m,4h),7.12-7.04(m,2h),4.79(d,j=10.0hz,1h),4.67-4.58(m,1h),4.55-4.35(m,2h),4.24(br.s.,2h),4.15-3.83(m,5h),3.72(dt,j=3.8,10.7hz,1h),3.62-3.39(m,1h),3.27-3.03(m,2h),2.98-2.87(m,1h),2.84-2.77(m,1h),2.42-2.19(m,2h)。
生物测定
metap2的酶活性测定
本文中示例的化合物基本上如下文所述测试并展现出表1中所示的针对人类和小鼠metap2测定的ic50。
使用类似于biochemistry2003,42,5035-5042中记载的程序由sf9细胞产生全长metap2（人类和小鼠）蛋白。分别在5mmmncl2和2mmcocl2存在下纯化metap2，并在使用前在-78℃下存储。
通过借助于lc/ms监控由底物肽（met-gly-lys-val-lys-val-gly-val-asn-gly）形成产物肽（gly-lys-val-lys-val-gly-val-asn-gly）测量人类和小鼠metap2的催化活性被本发明化合物的抑制。典型地，通过将酶、测试化合物和底物(150µm)温育在测定缓冲液(100µl)（50mmhepes,100mmnacl,50mg/mlbsa,0.17mmtriton™x-100，在ph7.5下）中40分钟进行该反应。在通过添加acn(200µl)终止反应之后，采用质谱仪量化产物和剩余底物的水平。典型地，使用4参数方程由10点剂量滴定曲线计算ic50值。
示例的实施例化合物的针对人类和小鼠metap2测定的ic50低于1000nm（参见表8）。低于1000nm的针对人类和小鼠metap2测定的ic50支持示例化合物抑制metap2。
的酶活性测定
通过用于测定的凝胶色谱纯化人类dpp-4((39-766)-his)和小鼠dpp-4((29-760)-his)。测定中的hdpp-4和mdpp-4的最终浓度分别为0.04nm和0.22nm。
通过在envision板读数器上由底物gly-pro-amc(sigma,g2761)形成产物荧光amc监控人类和小鼠dpp-4的催化活性被本发明化合物的抑制。典型地，通过在测定缓冲液(75µl)（0.01%bsa,0.1mmedta,50μmtris-hcl,0.01%triton™-x100,0.1mnacl，在ph7.5下）中温育酶、测试化合物和底物(10µm)30分钟进行反应。在通过添加znso4(25µl,10mm)终止反应之后，在envision板读数器上测量荧光产物amc的形成，其中激发波长为355nm和发射波长为460nm。典型地，使用4参数逻辑斯谛方程由10点剂量滴定曲线计算ic50值。在表5中示出吲唑化合物的ic50。
在人类和小鼠dpp-4测定中，示例的实施例化合物的ic50低于1000nm，并且在表2中示出结果。该数据支持化合物抑制dpp-4。
表8针对metap2和dpp-4的ic50
化合物的治疗性重量减轻效果测量
为了测定治疗性重量减轻效果和代谢参数的改善，在hfd喂养引发的肥胖小鼠模型（dio小鼠）中测试本发明化合物。在这个模型中，采用60%hfd（d12492i,researchdiets）喂养c57/bl6j雄性小鼠16至28周以形成体重达到约50g的肥胖。小鼠逐渐地增加它们的体重至约50g并保持这个肥胖状态的重量。在研究持续期间，将测试化合物（通过0.5%hec加0.25%tween®-80媒介物，以5ml/kg）口服给予肥胖dio小鼠，每日一次或两次。针对每日一次以20mg/kg的实施例1的口服治疗，在第14天相比于媒介物组，肥胖dio小鼠的剂量依赖性重量减轻为约8.9%重量减轻。针对每日一次以40mg/kg的实施例7的口服治疗，在第14天相比于媒介物组，肥胖dio小鼠的剂量依赖性重量减轻为约4.8%重量减轻。该数据支持实施例1和实施例7的化合物与期望的重量减轻相关联并能够提供治疗性重量减轻效果。
小鼠中的dpp-4药效学测定
为了测定metap2加dpp-4双重抑制剂化合物在体内的dpp-4抑制，在饱食状态下将所述化合物给予c57b/l6瘦且健康的小鼠，然后测量血浆中dpp-4靶接合(targetengagement)。
将动物称重并按体重随机分配。在3pm，通过口服填喂法采用媒介物或用媒介物配制的测试化合物对各小鼠给药一次。在给药之后在第二天9am结束之前对小鼠禁食18小时。在给药之后2小时和在结束时收集血液样品。将最终浓度为5mm的edta-k2用作抗凝剂。将与血液样品分离的血浆用于测定血浆dpp-4酶活性。
借助于spectramaxm5酶标仪通过由底物甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺(nanjingnorris,103213-34-9)形成对硝基苯胺的速率监控本发明的血浆dpp-4酶活性。典型地，通过在37℃下在测定缓冲液(100µl)（100mmhepes,0.1mg/mlbsa，在ph7.5下）中温育血浆(40µl)和底物(400µm)并通过在390nm下吸光度随时间增加测量对硝基苯胺的释放进行反应。由反应速度计算血浆dpp-4活性。相对于设定为0%抑制的媒介物组中血浆dpp-4活性归一化百分比血浆dpp-4抑制。
在口服给予20mg/kg之后2小时，在测定条件下，实施例1的血浆dpp-4抑制为85%。在口服给予20mg/kg之后2小时，在测定条件下，实施例7的血浆dpp-4抑制为75%。该数据支持实施例1和实施例7的化合物与能够产生治疗性血糖控制的期望的dpp-4抑制相关联。