上皮肿瘤细胞培养物的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年5月31日提交的pct/cn2017/086556和于2016年11月21日提交的pct/cn2016/106619的优先权，其中的每一个均通过引用以其全文并入。

本公开的实施例涉及用于对来自癌组织源球体(ctos)的源自患者的原发性上皮肿瘤细胞进行富集和有条件的重新编程的细胞培养物和相关方法。还包括评估上皮肿瘤细胞对一种或多种治疗剂的应答性的方法。

背景技术：

尽管为改进诊断和治疗不断做出努力，但癌症在世界各地仍是主要死因。癌症的多样性或异质性阻碍了新疗法的开发并且还使得难以鉴定可能的应答者。此外，许多癌症疗法受到原发性耐药性和获得性耐药性的挑战，包含另外的点突变和绕过治疗剂的靶标的替代途径。

未来成功的疗法将会很可能依赖于对肿瘤进展和转移过程背后的事件的全面分析以及可以被容易地操纵以准确地评估化疗剂和靶向治疗剂的功效的源自患者的原发性肿瘤细胞的快速且非选择性生成的发展。

作为一个实例，使用经过辐照的饲养细胞和rho激酶抑制剂y27632的癌细胞原代培养物已经被描述成促进异质性上皮肿瘤细胞的生长并调查各个患者的药物敏感性(参见例如liu等人,《美国病理学杂志(amjpathol)》180:599-607,(2012))。然而，当仅接种从患者肿瘤中分离的单个细胞时，这些共培养条件会饱受基质细胞过度生长的困扰。

解决这一基质细胞污染的一种方法是使用facs来纯化上皮细胞粘附分子(epcam)阳性细胞亚群。但是基于细胞表面标志物表达的纯化增加了源自原始患者肿瘤的肿瘤细胞的克隆选择的风险并且因此常常无法公平地表示原始患者肿瘤的克隆多样性。

因此，有必要发展用于在饲养细胞和rock抑制剂系统中富集原发性上皮肿瘤细胞的经过改进的培养条件，所述培养条件不仅减少了基质细胞生长，还保持了原始肿瘤样本的克隆多样性。

技术实现要素：

本公开的实施例包含一种细胞培养基，其包括

(a)人类离体衍生的癌组织源球体(ctos)，其被解离成基本上单细胞悬浮液，其中所述ctos包括人类上皮肿瘤细胞，

(b)饲养细胞；以及

(c)限定性细胞培养基，其包括至少一种rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂；以及任选的

(d)补充的血清白蛋白(sa)，

其中在共培养解离的ctos与(b)和(c)之后约14天内，所述细胞培养基提供增殖至少约10％的所述上皮肿瘤细胞。

在一些例子中，所述限定性细胞培养基不包括或基本上不含如头蛋白等骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂和如r-脊椎蛋白-1等wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂。

在某些实施例中，所述人类离体衍生的ctos由从人类癌症患者体内取出的含肿瘤样本培养得到，所述含肿瘤样本例如选自手术样本、活检样本、胸腔积液样本和腹水样本。在某些实施例中，所述人类患者患有选自结肠癌、肺癌、胃癌和乳腺癌的癌症。

在某些实施例中，在共培养所述解离的ctos与(b)和(c)之后约14天内，所述上皮肿瘤细胞基本上保留从所述人类患者体内取出的所述含肿瘤样本的克隆多样性。

在一些实施例中，所述人类上皮肿瘤细胞选自结肠癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞和乳腺癌细胞。

在一些实施例中，在共培养所述解离的ctos与(b)和(c)之后约14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天内，所述细胞培养基提供增殖至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述人类上皮肿瘤细胞。在某些实施例中，在共培养所述解离的ctos与(b)和(c)之后约7天内，所述细胞培养基提供增殖至少约20-30％的所述人类上皮肿瘤细胞。在某些实施例中，在共培养所述解离的ctos与(b)和(c)之后约7天内，所述细胞培养基提供增殖至少约60％的所述人类上皮肿瘤细胞。

在某些实施例中，在共培养所述解离的ctos与(b)和(c)之后约14天内，所述细胞培养基提供约或至少约5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、200:1、500:1或1000:1的所述人类上皮肿瘤细胞与人类基质细胞之比，其中所述人类上皮肿瘤细胞例如以上皮细胞粘附分子(epcam)和/或cd133的细胞表面表达为特征。

在一些实施例中，所述限定性培养基包括血清，例如胎牛血清(fbs)。在一些实施例中，所述血清的浓度在约1-5％的范围内或者为约1％、2％、3％、4％或5％。

在一些实施例中，所述rock抑制剂选自y27632、ha1100盐酸盐、ha1077和gsk429286中的一种或多种。在一些实施例中，y27632的浓度范围为约0.1-1000μm、0.5-1000μm、1-1000μm、5-1000μm、10-1000μm、50-1000μm、100-1000μm、500-1000μm；或约0.1-500μm、0.5-500μm、1-500μm、5-500μm、10-500μm、50-500μm、100-500μm；或约0.1-100μm、0.5-100μm、1-100μm、5-100μm、10-100μm、50-100μm；或约0.1-50μm、0.5-50μm、1-50μm、5-50μm、10-50μm；或约0.1-40μm、0.5-40μm、1-40μm、5-40μm、10-40μm；或约0.1-30μm、0.5-30μm、1-30μm、5-30μm、10-30μm；或约0.1-20μm、0.5-20μm、1-20μm、5-20μm、10-20μm；或约0.1-10μm、0.5-10μm、1-10μm、5-10μm；或约0.1-5μm、0.5-5μm、1-5μm；或者约0.1-1μm或0.5-1μm。

在一些实施例中，所述补充的sa选自牛血清白蛋白(bsa)和人血清白蛋白(hsa)。在某些实施例中，所述补充的sa的浓度为约0.5mg/ml到约20mg/ml或者约、小于约或不超过约0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml、2.0mg/ml、2.2mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.8mg/ml、3.0mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.6mg/ml、3.8mg/ml、4.0mg/ml、4.2mg/ml、4.4mg/ml、4.6mg/ml、4.8mg/ml、5.0mg/ml、5.2mg/ml、5.4mg/ml、5.6mg/ml、5.8mg/ml、6.0mg/ml、6.2mg/ml、6.4mg/ml、6.6mg/ml、6.8mg/ml、7.0mg/ml、7.2mg/ml、7.4mg/ml、7.6mg/ml、7.8mg/ml、8.0mg/ml、8.2mg/ml、8.4mg/ml、8.6mg/ml、8.8mg/ml、9.0mg/ml、9.2mg/ml、9.4mg/ml、9.6mg/ml、9.8mg/ml、10.0mg/ml、10.2mg/ml、10.4mg/ml、10.6mg/ml、10.8mg/ml、11.0mg/ml、11.2mg/ml、11.4mg/ml、11.6mg/ml、11.8mg/ml、12.0mg/ml、12.2mg/ml、12.4mg/ml、12.6mg/ml、12.8mg/ml、13.0mg/ml、13.2mg/ml、13.4mg/ml、13.6mg/ml、13.8mg/ml、14.0mg/ml、14.2mg/ml、14.4mg/ml、14.6mg/ml、14.8mg/ml、15.0mg/ml、15.2mg/ml、15.4mg/ml、15.6mg/ml、15.8mg/ml、16.0mg/ml、16.2mg/ml、16.4mg/ml、16.6mg/ml、16.8mg/ml、17.0mg/ml、17.2mg/ml、17.4mg/ml、17.6mg/ml、17.8mg/ml、18.0mg/ml、18.2mg/ml、18.4mg/ml、18.6mg/ml、18.8mg/ml、19.0mg/ml、19.2mg/ml、19.4mg/ml、19.6mg/ml、19.8mg/ml或20mg/ml。

在一些实施例中，所述饲养细胞是非增殖成纤维细胞，例如人成纤维细胞。

还包括具有低细胞结合表面的组织培养板，其包括本文所描述的细胞培养基。

一些实施例包含在体外细胞培养基中培养或扩增人类上皮肿瘤细胞的方法，其包括

(a)将包括人类上皮肿瘤细胞的人类离体衍生的癌组织源球体(ctos)解离成基本上单细胞悬浮液；以及

(b)在限定性细胞培养基中共培养解离的ctos与饲养细胞，所述限定性细胞培养基包括至少一种rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂，

其中所述方法在步骤(a)和(b)之后约14天内在所述细胞培养基中提供增殖至少约10％的所述上皮肿瘤细胞。

在一些例子中，所述限定性细胞培养基不包括或基本上不含如头蛋白等骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂和如r-脊椎蛋白-1等wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂。在一些实施例中，所述细胞培养基包括补充的血清白蛋白(sa)。

在一些实施例中，基本上解离的ctos在具有低细胞结合表面的组织培养板中共培养。

在一些实施例中，所述人类离体衍生的ctos由从人类癌症患者体内取出的肿瘤样本培养得到，例如，所述肿瘤样本选自手术样本、活检样本、胸腔积液样本和腹水样本。在一些实施例中，所述人类患者患有选自结肠癌、肺癌、胃癌和乳腺癌的癌症。在一些实施例中，在步骤(a)和(b)之后约14天内，所述上皮肿瘤细胞基本上保留从所述人类患者体内取出的所述肿瘤样本的克隆多样性。

在一些实施例中，所述人类上皮肿瘤细胞选自结肠癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞和乳腺癌细胞。

在一些实施例中，所述方法或细胞培养基在步骤(a)和(b)之后约14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天或5天内在所述细胞培养基中提供增殖至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的所述人类上皮肿瘤细胞。在一些实施例中，所述方法或细胞培养基在步骤(a)和(b)之后约7天内提供增殖至少约20-30％的所述人类上皮肿瘤细胞。在一些实施例中，所述方法或细胞培养基在步骤(a)和(b)之后约7天内提供增殖至少约60％的所述人类上皮肿瘤细胞。

在特定实施例中，所述方法或细胞培养基在步骤(a)和(b)之后约14天内在所述细胞培养基中提供至少约5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、200:1、500:1或1000:1的所述人类上皮肿瘤细胞与人类基质细胞之比，其中所述人类上皮肿瘤细胞例如以上皮细胞粘附分子(epcam)和/或cd133的细胞表面表达为特征。

在一些实施例中，所述限定性细胞培养基包括血清，任选地胎牛血清(fbs)。在一些实施例中，所述血清的浓度在约1-5％的范围内或者为约1％、2％、3％、4％或5％。

在一些实施例中，所述rock抑制剂选自y27632、ha1100盐酸盐、ha1077和gsk429286中的一种或多种。在一些实施例中，所述rock抑制剂例如y27632的浓度范围为约0.1-1000μm、0.5-1000μm、1-1000μm、5-1000μm、10-1000μm、50-1000μm、100-1000μm、500-1000μm；或约0.1-500μm、0.5-500μm、1-500μm、5-500μm、10-500μm、50-500μm、100-500μm；或约为0.1-100μm、0.5-100μm、1-100μm、5-100μm、10-100μm、50-100μm；或约0.1-50μm、0.5-50μm、1-50μm、5-50μm、10-50μm；或约0.1-40μm、0.5-40μm、1-40μm、5-40μm、10-40μm；或约0.1-30μm、0.5-30μm、1-30μm、5-30μm、10-30μm；或约0.1-20μm、0.5-20μm、1-20μm、5-20μm、10-20μm；或约0.1-10μm、0.5-10μm、1-10μm、5-10μm；或约0.1-5μm、0.5-5μm、1-5μm；或者约0.1-1μm或0.5-1μm。

在一些实施例中，所述补充的sa选自牛血清白蛋白(bsa)和人血清白蛋白(hsa)。在某些实施例中，所述补充的sa的浓度为约0.5mg/ml到20mg/ml或者约、小于约或不超过约0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml、2.0mg/ml、2.2mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.8mg/ml、3.0mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.6mg/ml、3.8mg/ml、4.0mg/ml、4.2mg/ml、4.4mg/ml、4.6mg/ml、4.8mg/ml、5.0mg/ml、5.2mg/ml、5.4mg/ml、5.6mg/ml、5.8mg/ml、6.0mg/ml、6.2mg/ml、6.4mg/ml、6.6mg/ml、6.8mg/ml、7.0mg/ml、7.2mg/ml、7.4mg/ml、7.6mg/ml、7.8mg/ml、8.0mg/ml、8.2mg/ml、8.4mg/ml、8.6mg/ml、8.8mg/ml、9.0mg/ml、9.2mg/ml、9.4mg/ml、9.6mg/ml、9.8mg/ml、10.0mg/ml、10.2mg/ml、10.4mg/ml、10.6mg/ml、10.8mg/ml、11.0mg/ml、11.2mg/ml、11.4mg/ml、11.6mg/ml、11.8mg/ml、12.0mg/ml、12.2mg/ml、12.4mg/ml、12.6mg/ml、12.8mg/ml、13.0mg/ml、13.2mg/ml、13.4mg/ml、13.6mg/ml、13.8mg/ml、14.0mg/ml、14.2mg/ml、14.4mg/ml、14.6mg/ml、14.8mg/ml、15.0mg/ml、15.2mg/ml、15.4mg/ml、15.6mg/ml、15.8mg/ml、16.0mg/ml、16.2mg/ml、16.4mg/ml、16.6mg/ml、16.8mg/ml、17.0mg/ml、17.2mg/ml、17.4mg/ml、17.6mg/ml、17.8mg/ml、18.0mg/ml、18.2mg/ml、18.4mg/ml、18.6mg/ml、18.8mg/ml、19.0mg/ml、19.2mg/ml、19.4mg/ml、19.6mg/ml、19.8mg/ml或20mg/ml。

在一些实施例中，所述饲养细胞是非增殖成纤维细胞，例如人成纤维细胞。

在一些实施例中，所述人类离体衍生的ctos由从人类癌症患者体内取出的含肿瘤样本培养得到，包括例如

切碎和在组织消化培养基中培育所述含肿瘤样本，以及

将所述含肿瘤样本在包括烟酰胺、wnt3a、骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂和rock抑制剂的限定性无血清无饲养物ctos生长培养基中培养足以形成所述ctos的时间。

在一些实施例中，所述组织消化培养基包括选自胶原酶i、胶原酶ii、中性非梭菌蛋白酶及其任何组合中的一种或多种的蛋白酶。

在一些实施例中，烟酰胺的浓度范围为约0.1-1000mm、0.5-1000mm、1-1000mm、5-1000mm、10-1000mm、50-1000mm、100-1000mm、500-1000mm；或约0.1-500mm、0.5-500mm、1-500mm、5-500mm、10-500mm、50-500mm、100-500mm；或约0.1-100mm、0.5-100mm、1-100mm、5-100mm、10-100mm、50-100mm，或约0.1-50mm、0.5-50mm、1-50mm、5-50mm、10-50mm；或约0.1-40mm、0.5-40mm、1-40mm、5-40mm、10-40mm；或约0.1-30mm、0.5-30mm、1-30mm、5-30mm、10-30mm；或约0.1-20mm、0.5-20mm、1-20mm、5-20mm、10-20mm；或约0.1-10mm、0.5-10mm、1-10mm、5-10mm；或约0.1-5mm、0.5-5mm、1-5mm；或约0.1-1mm或者0.5-1mm。

在一些实施例中，wnt3a的浓度范围为约0.1-10,000或1-1000ng/ml；或约0.1-1000ng/ml、1-1000ng/ml、10-1000ng/ml、20-1000ng/ml、30-1000ng/ml、40-1000ng/ml、50-1000ng/ml、60-1000ng/ml、70-1000ng/ml、80-1000ng/ml、90-1000ng/ml、100-1000ng/ml、200-1000ng/ml、300-1000ng/ml、400-1000ng/ml、500-1000ng/ml、600-1000ng/ml、700-1000ng/ml、800-1000ng/ml、900-1000ng/ml；或约0.1-500ng/ml、1-500ng/ml、10-500ng/ml、20-500ng/ml、30-500ng/ml、40-500ng/ml、50-500ng/ml、60-500ng/ml、70-500ng/ml、80-500ng/ml、90-500ng/ml、100-500ng/ml、200-500ng/ml、300-500ng/ml、400-500ng/ml；或约0.1-400ng/ml、1-400ng/ml、10-400ng/ml、20-400ng/ml、30-400ng/ml、50-400ng/ml、40-400ng/ml、60-400ng/ml、70-400ng/ml、80-400ng/ml、90-400ng/ml、100-400ng/ml、200-400ng/ml、300-400ng/ml；或约0.1-300ng/ml、1-300ng/ml、10-300ng/ml、20-300ng/ml、30-300ng/ml、40-300ng/ml、50-300ng/ml、60-300ng/ml、70-300ng/ml、80-300ng/ml、90-300ng/ml、100-300ng/ml、200-300ng/ml；或约0.1-200ng/ml、1-200ng/ml、10-200ng/ml、20-200ng/ml、30-200ng/ml、40-200ng/ml、50-200ng/ml、60-200ng/ml、70-200ng/ml、80-200ng/ml、90-200ng/ml、100-200ng/ml；或约0.1-150ng/ml、1-150ng/ml、10-150ng/ml、20-150ng/ml、30-150ng/ml、40-150ng/ml、50-150ng/ml、60-150ng/ml、70-150ng/ml、80-150ng/ml、90-150ng/ml、100-150ng/ml；或约0.1-120ng/ml、1-120ng/ml、10-120ng/ml、20-120ng/ml、30-120ng/ml、40-120ng/ml、50-120ng/ml、60-120ng/ml、70-120ng/ml、80-120ng/ml、90-120ng/ml、100-120ng/ml；或约0.1-100ng/ml、1-100ng/ml、10-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、60-100ng/ml、70-100ng/ml、80-100ng/ml、90-100ng/ml。

在一些实施例中，所述bmp抑制剂是头蛋白，并且在一些实施例中，所述bmp抑制剂的浓度范围为约0.1-10,000ng/ml或1-1000ng/ml；或约0.1-1000ng/ml、1-1000ng/ml、10-1000ng/ml、20-1000ng/ml、30-1000ng/ml、40-1000ng/ml、50-1000ng/ml、60-1000ng/ml、70-1000ng/ml、80-1000ng/ml、90-1000ng/ml、100-1000ng/ml、200-1000ng/ml、300-1000ng/ml、400-1000ng/ml、500-1000ng/ml、600-1000ng/ml、700-1000ng/ml、800-1000ng/ml、900-1000ng/ml；或约0.1-500ng/ml、1-500ng/ml、10-500ng/ml、20-500ng/ml、30-500ng/ml、40-500ng/ml、50-500ng/ml、60-500ng/ml、70-500ng/ml、80-500ng/ml、90-500ng/ml、100-500ng/ml、200-500ng/ml、300-500ng/ml、400-500ng/ml；或约0.1-400ng/ml、1-400ng/ml、10-400ng/ml、20-400ng/ml、30-400ng/ml、50-400ng/ml、40-400ng/ml、60-400ng/ml、70-400ng/ml、80-400ng/ml、90-400ng/ml、100-400ng/ml、200-400ng/ml、300-400ng/ml；或约0.1-300ng/ml、1-300ng/ml、10-300ng/ml、20-300ng/ml、30-300ng/ml、40-300ng/ml、50-300ng/ml、60-300ng/ml、70-300ng/ml、80-300ng/ml、90-300ng/ml、100-300ng/ml、200-300ng/ml；或约0.1-200ng/ml、1-200ng/ml、10-200ng/ml、20-200ng/ml、30-200ng/ml、40-200ng/ml、50-200ng/ml、60-200ng/ml、70-200ng/ml、80-200ng/ml、90-200ng/ml、100-200ng/ml；或约0.1-150ng/ml、1-150ng/ml、10-150ng/ml、20-150ng/ml、30-150ng/ml、40-150ng/ml、50-150ng/ml、60-150ng/ml、70-150ng/ml、80-150ng/ml、90-150ng/ml、100-150ng/ml；或约0.1-120ng/ml、1-120ng/ml、10-120ng/ml、20-120ng/ml、30-120ng/ml、40-120ng/ml、50-120ng/ml、60-120ng/ml、70-120ng/ml、80-120ng/ml、90-120ng/ml、100-120ng/ml；或约0.1-100ng/ml、1-100ng/ml、10-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、60-100ng/ml、70-100ng/ml、80-100ng/ml、90-100ng/ml。

在一些实施例中，所述wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂是r-脊椎蛋白-1，并且在一些实施例中，所述wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂的浓度范围为约0.1-10,000ng/ml或1-1000ng/ml或100-1000ng/ml；或约0.1-10,000ng/ml、1-10,000ng/ml、10-10,000ng/ml、20-10,000ng/ml、30-10,000ng/ml、40-10,000ng/ml、50-10,000ng/ml、60-10,000ng/ml、70-10,000ng/ml、80-10,000ng/ml、90-10,000ng/ml、100-10,000ng/ml、200-10,000ng/ml、300-10,000ng/ml、400-10,000ng/ml、500-10,000ng/ml、1000-10,000ng/ml、5000-10,000ng/ml；或约0.1-5000ng/ml、1-5000ng/ml、10-5000ng/ml、20-5000ng/ml、30-10,000ng/ml、40-5000ng/ml、50-5000ng/ml、60-5000ng/ml、70-5000ng/ml、80-5000ng/ml、90-5000ng/ml、100-5000ng/ml、200-5000ng/ml、300-5000ng/ml、400-5000ng/ml、500-5000ng/ml、1000-5000ng/ml；或约0.1-1000ng/ml、1-1000ng/ml、10-1000ng/ml、20-1000ng/ml、30-1000ng/ml、40-1000ng/ml、50-1000ng/ml、60-1000ng/ml、70-1000ng/ml、80-1000ng/ml、90-1000ng/ml、100-1000ng/ml、200-1000ng/ml、300-1000ng/ml、400-1000ng/ml、500-1000ng/ml、600-1000ng/ml、700-1000ng/ml、800-1000ng/ml、900-1000ng/ml；或约0.1-800ng/ml、1-800ng/ml、10-800ng/ml、20-800ng/ml、30-800ng/ml、40-800ng/ml、50-800ng/ml、60-800ng/ml、70-800ng/ml、80-800ng/ml、90-800ng/ml、100-800ng/ml、200-800ng/ml、300-800ng/ml、400-800ng/ml、500-800ng/ml、600-800ng/ml、700-800ng/ml；或约0.1-700ng/ml、1-700ng/ml、10-700ng/ml、20-700ng/ml、30-700ng/ml、40-700ng/ml、50-700ng/ml、60-700ng/ml、70-700ng/ml、80-700ng/ml、90-700ng/ml、100-700ng/ml、200-700ng/ml、300-700ng/ml、400-700ng/ml、500-700ng/ml、600-700ng/ml；或约0.1-600ng/ml、1-600ng/ml、10-600ng/ml、20-600ng/ml、30-600ng/ml、40-600ng/ml、50-600ng/ml、60-600ng/ml、70-600ng/ml、80-600ng/ml、90-600ng/ml、100-600ng/ml、200-600ng/ml、300-600ng/ml、400-600ng/ml、500-600ng/ml；或约0.1-500ng/ml、1-500ng/ml、10-500ng/ml、20-500ng/ml、30-500ng/ml、40-500ng/ml、50-500ng/ml、60-500ng/ml、70-500ng/ml、80-500ng/ml、90-500ng/ml、100-500ng/ml、200-500ng/ml、300-500ng/ml、400-500ng/ml。

在一些实施例中，所述rock抑制剂是y27632，并且在一些实施例中，所述rock抑制剂的浓度范围为约0.1-1000μm、0.5-1000μm、1-1000μm、5-1000μm、10-1000μm、50-1000μm、100-1000μm、500-1000μm；或约0.1-500μm、0.5-500μm、1-500μm、5-500μm、10-500μm、50-500μm、100-500μm；或约0.1-100μm、0.5-100μm、1-100μm、5-100μm、10-100μm、50-100μm；或约0.1-50μm、0.5-50μm、1-50μm、5-50μm、10-50μm；或约0.1-40μm、0.5-40μm、1-40μm、5-40μm、10-40μm；或约0.1-30μm、0.5-30μm、1-30μm、5-30μm、10-30μm；或约0.1-20μm、0.5-20μm、1-20μm、5-20μm、10-20μm；或约0.1-10μm、0.5-10μm、1-10μm、5-10μm；或约0.1-5μm、0.5-5μm、1-5μm；或者约0.1-1μm或0.5-1μm。

还包含测试人类患者对治疗剂的应答性的方法，其包括

向本文所描述的细胞培养基或共培养物或者向通过本文所描述的方法制备的细胞培养基或共培养物施用所述治疗剂；以及

测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡，

其中上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮肿瘤细胞凋亡的诱导指示所述人类患者对所述治疗剂的应答性，并且其中缺乏上皮肿瘤细胞增殖的减少和/或上皮肿瘤细胞凋亡的诱导指示所述人类患者对所述治疗剂的耐药性。

某些方法包括在共培养解离的ctos的同一天施用所述治疗剂。某些方法包括在共培养所述解离的ctos之后至少一天施用所述治疗剂。某些方法包括在共培养所述解离的ctos之后约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天时或内施用所述治疗剂。一些方法包括测量在施用所述治疗剂约14天内的上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。特定方法包括测量在施用所述治疗剂约14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天或5天内的上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。某些方法包括测量在施用所述治疗剂约7天、6天或5天内的上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。

在一些实施例中，测量上皮肿瘤细胞增殖的步骤包括测量细胞增殖标志物。在一些实施例中，所述细胞增殖标志物选自³h-胸苷、溴脱氧尿苷(brdu)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(edu)、ki-67和增殖细胞核抗原(pcna)中的一种或多种。

在一些实施例中，测量上皮肿瘤细胞凋亡的步骤包括测量细胞凋亡标志物。在一些实施例中，所述细胞凋亡标志物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(flica)、半胱天冬酶活化、聚adp核糖聚合酶(parp)裂解、draq5、draq7和末端脱氧核苷酰转移酶(tdt)dutp缺口标记(tunel)测定中的一种或多种。

还包括样本制备试剂盒，其包括以下的任何组合：

-限定性无血清无饲养物癌组织源球体(ctos)生长培养基；

-组织消化培养基；

-具有低细胞结合表面的组织培养板；

-限定性细胞培养基；

-冷冻的饲养细胞；

-rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂；以及任选的

-细胞增殖标志物和/或细胞凋亡标志物。

在一些试剂盒中，所述ctos生长培养基包括烟酰胺、wnt3a、骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂和/或rock抑制剂

在一些试剂盒中，所述组织消化培养基包括选自胶原酶i、胶原酶ii、中性非梭菌蛋白酶及其任何组合中的一种或多种的蛋白酶。

在一些试剂盒中，所述限定性培养基包括血清，例如胎牛血清(fbs)，其浓度在约1-5％的范围内或者为约1％、2％、3％、4％或5％。在一些试剂盒中，所述冷冻的饲养细胞是非增殖成纤维细胞，例如人成纤维细胞。

某些试剂盒包括例如用于添加到所述ctos生长培养基和/或所述限定性细胞培养基的补充的sa。在一些实施例中，所述ctos生长培养基和/或所述限定性细胞培养基包括补充的sa。在一些实施例中，所述补充的sa选自牛血清白蛋白(bsa)和人血清白蛋白(hsa)。在某些实施例中，所述ctos生长培养基和/或所述限定性细胞培养基中所述补充的sa的浓度为约0.5mg/ml到20mg/ml或者约、小于约或不超过约0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml、2.0mg/ml、2.2mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.8mg/ml、3.0mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.6mg/ml、3.8mg/ml、4.0mg/ml、4.2mg/ml、4.4mg/ml、4.6mg/ml、4.8mg/ml、5.0mg/ml、5.2mg/ml、5.4mg/ml、5.6mg/ml、5.8mg/ml、6.0mg/ml、6.2mg/ml、6.4mg/ml、6.6mg/ml、6.8mg/ml、7.0mg/ml、7.2mg/ml、7.4mg/ml、7.6mg/ml、7.8mg/ml、8.0mg/ml、8.2mg/ml、8.4mg/ml、8.6mg/ml、8.8mg/ml、9.0mg/ml、9.2mg/ml、9.4mg/ml、9.6mg/ml、9.8mg/ml、10.0mg/ml、10.2mg/ml、10.4mg/ml、10.6mg/ml、10.8mg/ml、11.0mg/ml、11.2mg/ml、11.4mg/ml、11.6mg/ml、11.8mg/ml、12.0mg/ml、12.2mg/ml、12.4mg/ml、12.6mg/ml、12.8mg/ml、13.0mg/ml、13.2mg/ml、13.4mg/ml、13.6mg/ml、13.8mg/ml、14.0mg/ml、14.2mg/ml、14.4mg/ml、14.6mg/ml、14.8mg/ml、15.0mg/ml、15.2mg/ml、15.4mg/ml、15.6mg/ml、15.8mg/ml、16.0mg/ml、16.2mg/ml、16.4mg/ml、16.6mg/ml、16.8mg/ml、17.0mg/ml、17.2mg/ml、17.4mg/ml、17.6mg/ml、17.8mg/ml、18.0mg/ml、18.2mg/ml、18.4mg/ml、18.6mg/ml、18.8mg/ml、19.0mg/ml、19.2mg/ml、19.4mg/ml、19.6mg/ml、19.8mg/ml或20mg/ml。

在一些试剂盒中，所述rock抑制剂选自y27632、ha1100盐酸盐、ha1077和gsk429286中的一种或多种。在一些试剂盒中，所述细胞增殖标志物选自³h-胸苷、溴脱氧尿苷(brdu)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(edu)、ki-67和增殖细胞核抗原(pcna)中的一种或多种。在一些试剂盒中，所述细胞凋亡标志物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(flica)、半胱天冬酶活化、聚adp核糖聚合酶(parp)裂解、draq5、draq7和末端脱氧核苷酰转移酶(tdt)dutp缺口标记(tunel)测定中的一种或多种。

附图说明

图1a到图1d示出了从患者结直肠肿瘤手术样本中分离并在限定性生长培养基中悬浮培养以形成癌组织源球体(ctos)的肿瘤细胞。

图2a到图2b示出了从正常结直肠组织手术样本中分离的单细胞。

图3a到图3b示出了从正常结直肠组织手术样本中分离并在饲养细胞/rock抑制剂(y27632)共培养系统中接种的细胞。细胞增殖通过edu掺入进行测量。蓝染色是dapi，黄染色是epcam并且红染色是edu。

图4a到图4f示出来自解离的六种不同的源自患者的癌组织源球体(ctos)并在饲养细胞/rock抑制剂(y27632)选择性共培养系统中接种的单肿瘤细胞。细胞增殖通过edu掺入进行测量。蓝染色是dapi，黄染色是epcam并且红染色是edu。

图5a到图5d示出了从患者结直肠肿瘤手术样本中分离并在饲养细胞/rock抑制剂(y27632)选择性共培养系统中接种的非富集单细胞。细胞增殖通过edu掺入进行测量。

图6示出了原发性上皮肿瘤细胞被用于测试对药物和药物组合的应答性的富集后共培养系统。蓝染色是dapi，黄染色是epcam并且红染色是edu。顶行到底行如下：氟尿嘧啶(5-fu)；奥沙利铂；奥沙利铂+5-fu(10μm)；sn-38；sn-38+5-fu(10μm)；sn-38+5-fu(10μm)+奥沙利铂(2.5μm)。柱从左到右示出了测试的主药的浓度的减少。

图7a到图7b示出了来自八个患者的上皮肿瘤细胞对某些化疗剂及其组合的的应答简况，包含基于auc的肿瘤生长抑制(7a)和药物敏感性定量得分(7b)。

图8a到8f示出了从两个不同患者的正常结直肠组织手术样本中分离、接种并在具有以下的饲养细胞/rock抑制剂(y27632)共培养系统中生长的细胞：(8a到8b)完全培养基、(8c到8d)不含wnt-3a-头蛋白的完全培养基、(8e到8f)不含r-脊椎蛋白和头蛋白的完全培养基、以及(8g到8h)不含wnt-3a、r-脊椎蛋白和头蛋白的完全培养基。细胞增殖通过edu掺入进行测量。蓝染色是dapi，黄染色是epcam并且红染色是edu。正常结直肠上皮细胞不在图8e到8f的选择性培养基或图8g到8h的选择性培养基中生长。

图9a到9f示出了从解离的源自患者的癌组织源球体(ctos)中分离并在具有以下的饲养细胞/rock抑制剂(y27632)共培养系统中接种的肿瘤细胞：(9a到9b)完全培养基、(9c到9d)不含wnt-3a-头蛋白的完全培养基、(9e到9f)不含r-脊椎蛋白和头蛋白的完全培养基、以及(9g到9h)不含wnt-3a、r-脊椎蛋白和头蛋白的完全培养基。细胞增殖通过edu掺入进行测量。蓝染色是dapi，黄染色是epcam并且红染色是edu。与正常细胞相比，肿瘤结直肠上皮细胞在图9e到9f的选择性培养基和图9g到9h的选择性培养基中生长。

图10示出了补充的牛血清白蛋白(bsa)支持人上皮肿瘤细胞的生长。df12:dmem/f12基培养基。补充有bsa的df12+bsa:dmem/12基培养基。细胞增殖通过edu掺入进行测量。误差条表示标准偏差(sd)。

具体实施方式

本公开的实施例涉及发现用于通过对癌组织源球体(ctos)进行有条件的重新编程来富集源自患者的上皮肿瘤细胞的方法和组合物。本文所描述的方法和组合物不仅减少了饲养细胞共培养物中基质细胞的过度生长，还保持了原始肿瘤样本的克隆多样性。这些方法和组合物允许及时纯化和增殖直接源自患者的原发性肿瘤细胞并且可以用于例如评估患者肿瘤细胞对一种或多种治疗剂的潜在应答性。这样提供了在相对较短的时间帧内例如在自初始培养时间起不到一周或两周内鉴别出患者的最佳治疗选择的优势。

定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然在实践或测试本发明时可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是本文中描述了某些优选的方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和参考文献，包含但不限于专利和专利申请，均通过引用以其全文并入本说明书，如同每个单独的出版物或参考文献均被明确且单独地指明通过引用并入一样。出于本发明的目的，下文中定义了以下术语。

冠词“一个/一种(a/an)”在本文中指代冠词的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)语法宾语。举例来说，“要素”意指一个/种要素或多于一个/种要素。

“约”意指相对于参考数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。

贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise/comprises/comprising)”将被理解为暗示包含所陈述的步骤或要素或者步骤或要素组，但不排除任何其它的步骤或要素或者步骤或要素组。“由……组成”意指包含并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”指示所列要素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它要素。“基本上由……组成”意指包含短语之后列出的任何要素并限于不干扰或促进本公开中针对所列要素指定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于所述其它要素是否实质上影响所列要素的活性或作用。

“分离”意指基本上不含在其天然状态中通常伴随其的组分的物质。

术语“调节”包含“增加”或“加强”以及“减少”或“降低”，通常是以相对于对照物统计学上显著的或生理学上显著的量。“增加”或“加强”量通常是“统计学上显著的”量并且可以包含增加约或至少约1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或者约或至少约5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％，所述量在无组合物时或者由对照组合物、样本或测试受试者产生(包含其间的所有整数和范围)。“减少”或“降低”量通常是“统计学上显著的”量并且可以包含减少约或至少约1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、1000倍或者约或至少约5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％，所述量在无组合物时或者由对照组合物、样本或测试受试者产生(包含其间的所有整数和范围)。

在某些实施例中，可以明确地限定上皮肿瘤细胞在细胞培养物中的“纯度”。例如，某些培养基或培养物可以包括与其它患者细胞类型例如如基质细胞等非癌性细胞相比纯度为约或至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％的上皮肿瘤细胞(包括其间的所有整数和范围)。

“统计学上显著的”意味着结果不可能是偶然发生的。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法来确定。常用的显著性度量包含p值，如果零假设为真，则p值是观察到的事件会发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平限定在0.05或更小的p值。

“基本上(substaintially/essentially)”意指几乎完全或彻底，例如某个给定数量的95％、96％、97％、98％、99％或更大。

如上文指出的，某些实施例涉及细胞培养基以及相关共培养物和用于对已解离成基本上单细胞悬浮液的癌组织源球体进行有条件的重新编程的方法。术语“癌组织源球体”(或“ctos”)指代在高度纯化且有活力的肿瘤细胞之间保留了细胞-细胞接触的原发性上皮肿瘤细胞球体簇(参见例如kondo等人,《美国国家科学院院刊(pnasusa)》108:6235-6240,(2011))；endo等人,《胸部肿瘤学杂志(jthoraconcol)》8:131-9,(2013))。用于制备ctos的示例性方法在本领域中是已知的(同上)并且在本文中进行了描述。例如，用于对上皮细胞进行有条件的重新编程的细胞培养条件描述于wo2012065067和liu等人,《美国病理学杂志(amjpathol)》180:599-607,(2012)中。

因此，某些实施例涉及细胞培养基，所述细胞培养基包括：(a)被解离成基本上单细胞悬浮液的人类离体衍生的癌组织源球体(ctos)，其中所述ctos包括人类上皮肿瘤细胞；(b)饲养细胞；以及(c)包括至少一种rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂的限定性细胞培养基，其中在共培养解离的ctos与(b)和(c)之后约14天内，所述细胞培养基提供增殖至少约10％的上皮肿瘤细胞。在一些实施例中，细胞培养基不包括或基本上不含如头蛋白等骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂和如r-脊椎蛋白-1等wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂。在一些实施例中，细胞培养基包括补充的血清白蛋白(sa)。术语“补充的”指代不同于、异质于或除了任何给定动物血清例如胎牛血清(fetalbovineserum)(fbs)或胎小牛血清(fetalcalfserum)(fcs)中存在的sa之外的sa。

还包含在体外细胞培养基中培养或扩增人类上皮肿瘤细胞的方法，所述方法包括：(a)将包括人类上皮肿瘤细胞的人类离体衍生的癌组织源球体(ctos)解离成基本上单细胞悬浮液；以及(b)在包括至少一个rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂的限定性细胞培养基中共培养解离的ctos与饲养细胞。

在一些实施例中，共培养或生长培养基不包括或基本上不含另外的因子或补充物，例如外源因子或补充物，如烟酰胺、wnt3a、如头蛋白等骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、如r-脊椎蛋白-1等wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂及其任何组合。

在一些实施例中，ctos从人类癌症患者体内取出的含肿瘤样本中培养。除本领域中已知的其它样本之外，含肿瘤样本的非限制性实例还包含手术样本、活检样本、胸腔积液样本、腹水样本。在特定实施例中，人类患者患有选自结肠癌、肺癌、胃癌和乳腺癌的癌症，并且人类上皮肿瘤细胞选自结肠癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞和乳腺癌细胞。

在某些实施例中，在共培养解离的ctos与(b)和(c)之后约14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天内(包含其间的所有组合、整数和范围)，上皮肿瘤细胞基本上保留从人类患者体内取出的含肿瘤样本的克隆多样性(例如，约或至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％)。肿瘤细胞群的克隆多样性可以根据本领域中已知的技术进行测量(参见例如shibata,《自然遗传学(naturegenetics)》38:402-403,2006；maley等人,《自然遗传学》38:468-473,2006；以及merlo等人,《癌症预防研究(cancerprevres)》3:1388-1397,2010)。

在一些实施例中，在共培养解离的ctos与(b)和(c)之后或在步骤(a)和(b)之后约14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天内(包含其间的所有组合、整数和范围)，细胞培养基和方法提供增殖至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人类上皮肿瘤细胞。

例如，在共培养解离的ctos与(b)和(c)之后或在步骤(a)和(b)之后例如约14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天或5天内或者约5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天、12-14天或13-14天内或者约5-13天、6-13天、7-13天、8-13天、9-13天、10-13天、11-13天或12-13天内或者约5-12天、6-12天、、7-12天、8-12天、9-12天、10-12天或11-12天内或者约5-11天、6-11天、7-11天、8-11天、9-11天或10-11天内或者约5-10天、6-10天、7-10天、8-10天或9-10天内或者约5-9天、6-9天、7-9天或8-9天内或者约5-8天、6-8天或7-8天内或者约5-7天或6-7天内或者约5-6天内，特定细胞培养基和方法提供增殖约或至少约10-15％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％或10-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约15-20％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％或15-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约20-25％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％或20-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约25-30％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％或25-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约至少约30-35％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％或30-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约35-40％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％或35-100％的上皮肿瘤细胞，或者约或至少约40-45％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％或40-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约45-50％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％或45-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约50-55％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％或50-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约55-60％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％或55-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约60-65％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％或60-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约65-70％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％或65-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约70-80％、70-85％、70-90％、70-95％或70-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约75-80％、75-85％、75-90％、75-95％或75-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约80-85％、80-90％、80-95％或80-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约85-90％、85-95％或85-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约90-95％或90-100％的上皮肿瘤细胞，或者增殖约或至少约95-100％的上皮肿瘤细胞，包含其所有组合。在共培养解离的ctos与(b)和(c)之后或在步骤(a)和(b)之后，具体实施例在约7天内提供增殖至少约20-30％的上皮肿瘤细胞或在约7天内提供增殖至少约60％的上皮肿瘤细胞。

在一些实施例中，在共培养解离的ctos与(b)和(c)之后或在步骤(a)和(b)之后约4天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天内(包含其间的所有组合、整数和范围)，细胞培养基和方法提供至少约5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、200:1、500:1、1000:1的人类上皮肿瘤细胞与人类基质细胞之比。在一些实施例中，人类上皮肿瘤细胞以上皮细胞粘附分子(epcam)和/或cd133的细胞形态和/或细胞表面表达为特征。在一些实施例中，基质细胞以波形蛋白和/或α-平滑肌肌动蛋白(sma)细胞形态和/或细胞表面表达为特征。

在一些实施例中，细胞培养基包括“限定性培养基”。在某些实施例中，“限定性培养基”是适于所有化学组分均已知的人类或动物细胞的体外或离体细胞培养的生长培养基。在一些实施例中，限定性培养基包括血清，例如胎牛血清(fbs)或胎小牛血清(fcs)。在一些实施例中，血清的浓度在约1-5％的范围内或者为约1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施例中，限定性培养基“无血清”或“基本上无血清”，即培养基缺乏或基本上缺乏添加血清，例如fbs或胎小牛血清fcs。

在一些实施例中，限定性培养基包括基础培养基如dmem、f12、rpmi1640、hescsfm或其组合如dmem/f12，所述基础培养基补充有另外的组分，例如生长因子、抗氧化剂和/或能量源。因此，在特定实施例中，限定性培养基包括杜氏改良依格尔培养基(dulbecco'smodifiedeaglesmedium)(dmem)、汉姆斯营养混合物(ham'snutrientmixture)(f12)、rpmi1640、dmem/f12或hescsfm。在一些实施例中，限定性培养基包括dmem/f12，例如比例为约10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10。

在一些实施例中，如上文指出的，在某些实施例中，细胞培养基包括或方法利用rock抑制剂，例如rock-1抑制剂和/或rock-2抑制剂。rock抑制剂的非限制性实例包含y27632、ha1100盐酸盐、ha1077和gsk429286。在特定实施例中，rock抑制剂(例如，y27632)的浓度范围为约0.1-1000μm、0.5-1000μm、1-1000μm、5-1000μm、10-1000μm、50-1000μm、100-1000μm、500-1000μm；或者约0.1-500μm、0.5-500μm、1-500μm、5-500μm、10-500μm、50-500μm、100-500μm；或者约0.1-100μm、0.5-100μm、1-100μm、5-100μm、10-100μm、50-100μm；或者约0.1-50μm、0.5-50μm、1-50μm、5-50μm、10-50μm；或者约0.1-40μm、0.5-40μm、1-40μm、5-40μm、10-40μm；或者约0.1-30μm、0.5-30μm、1-30μm、5-30μm、10-30μm；或者约0.1-20μm、0.5-20μm、1-20μm、5-20μm、10-20μm；或者约0.1-10μm、0.5-10μm、1-10μm、5-10μm；或者约0.1-5μm、0.5-5μm、1-5μm；或者约0.1-1μm或0.5-1μm。

在一些实施例中，如上文指出的，细胞培养基包括或方法利用补充的sa，例如bsa和/或has。在某些实施例中，补充的sa的浓度为约0.5mg/ml到20mg/ml或者约、小于约或不超过约0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml、2.0mg/ml、2.2mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.8mg/ml、3.0mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.6mg/ml、3.8mg/ml、4.0mg/ml、4.2mg/ml、4.4mg/ml、4.6mg/ml、4.8mg/ml、5.0mg/ml、5.2mg/ml、5.4mg/ml、5.6mg/ml、5.8mg/ml、6.0mg/ml、6.2mg/ml、6.4mg/ml、6.6mg/ml、6.8mg/ml、7.0mg/ml、7.2mg/ml、7.4mg/ml、7.6mg/ml、7.8mg/ml、8.0mg/ml、8.2mg/ml、8.4mg/ml、8.6mg/ml、8.8mg/ml、9.0mg/ml、9.2mg/ml、9.4mg/ml、9.6mg/ml、9.8mg/ml、10.0mg/ml、10.2mg/ml、10.4mg/ml、10.6mg/ml、10.8mg/ml、11.0mg/ml、11.2mg/ml、11.4mg/ml、11.6mg/ml、11.8mg/ml、12.0mg/ml、12.2mg/ml、12.4mg/ml、12.6mg/ml、12.8mg/ml、13.0mg/ml、13.2mg/ml、13.4mg/ml、13.6mg/ml、13.8mg/ml、14.0mg/ml、14.2mg/ml、14.4mg/ml、14.6mg/ml、14.8mg/ml、15.0mg/ml、15.2mg/ml、15.4mg/ml、15.6mg/ml、15.8mg/ml、16.0mg/ml、16.2mg/ml、16.4mg/ml、16.6mg/ml、16.8mg/ml、17.0mg/ml、17.2mg/ml、17.4mg/ml、17.6mg/ml、17.8mg/ml、18.0mg/ml、18.2mg/ml、18.4mg/ml、18.6mg/ml、18.8mg/ml、19.0mg/ml、19.2mg/ml、19.4mg/ml、19.6mg/ml、19.8mg/ml或20mg/ml。

在具体实施例中，细胞培养基包括或方法利用饲养细胞。如本文所使用的，“与解离的ctos共培养”意味着饲养细胞与ctos共享相同的培养基和相同的容器或培养板。在一些实施例中，饲养细胞是非增殖饲养细胞。例如，在一些例子中，处理饲养细胞以抑制增殖但保持代谢活性。在具体例子中，饲养细胞用γ辐照进行辐照和/或用丝裂霉素c进行处理，这样阻止了细胞分裂但保持了细胞的代谢活性。在一些实施例中，饲养细胞未处理用于抑制增殖。例如，在一些例子中，饲养细胞被放置在防止与ctos物理接触的多孔过滤器上并且在不需要处理饲养细胞以抑制其增殖的情况下与ctos共培养。

饲养细胞可以从任何哺乳动物获得，并且饲养细胞的动物源不一定是与正在培养的ctos相同的动物源。例如，饲养细胞的示例性源包含但不限于小鼠饲养细胞、大鼠饲养细胞、犬科动物饲养细胞、猫科动物饲养细胞、牛科动物饲养细胞、马饲养细胞、猪饲养细胞、非人灵长类动物饲养细胞和人饲养细胞。特定类型的饲养细胞包含脾细胞、巨噬细胞、胸腺细胞和成纤维细胞。在一些实施例中，脾细胞、巨噬细胞、胸腺细胞和/或成纤维细胞是非增殖的。一个具体实例包含j2细胞，所述j2细胞是源自确立的swiss3t3细胞系的小鼠成纤维细胞的亚克隆。在一些实施例中，j2细胞受γ辐照。在特定实施例中，用丝裂霉素c来处理j2细胞。在具体实施例中，饲养细胞是非增殖成纤维细胞，例如人成纤维细胞。

在某些实施例中，细胞培养基或方法排除或以其它方式不包括细胞外基质(ecm)成分。ecm的特定实例包含胶原、基质胶、层粘连蛋白和纤连蛋白。

在一些实施例中，解离成基本上单细胞悬浮液的人类离体衍生的ctos与饲养细胞的共培养物被培养于低细胞结合板中或具有低细胞结合表面的组织培养板中。非限制性实例包含具有低细胞结合表面的6孔板、12孔板、24孔板、48孔板以及微量滴定板如96孔板、384孔板和1536孔板。低细胞结合板是可商购的(参见例如nunc^tm低细胞结合板或微板)。例如，使用低细胞结合板可以减少细胞附着和不想要的干细胞分化并且相对于上皮肿瘤细胞优先耗尽正常的上皮细胞和基质细胞。因此，某些实施例涉及具有低细胞结合表面的组织培养板，包括本文所描述的细胞培养基或共培养物。某些方法采用具有低细胞结合表面的组织培养板，例如用于一个或多个共培养步骤。

在某些实施例中，如上文指出的，人类离体衍生的ctos由从人类癌症患者体内取出的肿瘤样本培养得到，这包括切碎和在组织消化培养基中培育含肿瘤样本以及将所述含肿瘤样本在限定性无血清(或基本上无血清)无饲养物ctos生长培养基中培养足以形成ctos的时间，所述限定性无血清无饲养物ctos培养基包括烟酰胺、wnt3a、骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂和rock抑制剂。在具体实施例中，ctos生长培养基是补充有烟酰胺、wnt3a、头蛋白、r-脊椎蛋白-1和y27632的hescsfm(限定性无血清无饲养物培养基(sfm))。在具体实施例中，ctos生长培养基是补充有烟酰胺、wnt3a和y27632并且不包括或基本上不含头蛋白、r-脊椎蛋白-1的hescsfm(限定性无血清无饲养物培养基(sfm))。在具体实施例中，ctos生长培养基是补充有烟酰胺和y27632并且不包括或基本上不含头蛋白、r-脊椎蛋白-1和wnt3a的hescsfm(限定性无血清无饲养物培养基(sfm))。

在一些实施例中，组织消化培养基或组织解离培养基包括一种或多种蛋白酶。蛋白酶的实例包含胶原酶i、胶原酶ii、中性非梭菌蛋白酶及其任何组合。可商购组织消化培养基或组织解离培养基的非限制性实例包含liberase^tm、liberase^tmtl、liberase^tmtm和liberase^tmdh等。

在一些实施例中，ctos生长培养基中烟酰胺的浓度范围为约0.1-1000mm、0.5-1000mm、1-1000mm、5-1000mm、10-1000mm、50-1000mm、100-1000mm、500-1000mm；或者约0.1-500mm、0.5-500mm、1-500mm、5-500mm、10-500mm、50-500mm、100-500mm；或者约0.1-100mm、0.5-100mm、1-100mm、5-100mm、10-100mm、50-100mm；或者约0.1-50mm、0.5-50mm、1-50mm、5-50mm、10-50mm；或者约0.1-40mm、0.5-40mm、1-40mm、5-40mm、10-40mm；或者约0.1-30mm、0.5-30mm、1-30mm、5-30mm、10-30mm；或者约0.1-20mm、0.5-20mm、1-20mm、5-20mm、10-20mm；或者约0.1-10mm、0.5-10mm、1-10mm、5-10mm；或者约0.1-5mm、0.5-5mm、1-5mm；或者约0.1-1mm或0.5-1mm。

在某些实施例中，ctos生长培养基中wnt3a的浓度范围为约0.1-10,000ng/ml或1-1000ng/ml；或者约0.1-1000ng/ml、1-1000ng/ml、10-1000ng/ml、20-1000ng/ml、30-1000ng/ml、40-1000ng/ml、50-1000ng/ml、60-1000ng/ml、70-1000ng/ml、80-1000ng/ml、90-1000ng/ml、100-1000ng/ml、200-1000ng/ml、300-1000ng/ml、400-1000ng/ml、500-1000ng/ml、600-1000ng/ml、700-1000ng/ml、800-1000ng/ml、900-1000ng/ml；或者约0.1-500ng/ml、1-500ng/ml、10-500ng/ml、20-500ng/ml、30-500ng/ml、40-500ng/ml、50-500ng/ml、60-500ng/ml、70-500ng/ml、80-500ng/ml、90-500ng/ml、100-500ng/ml、200-500ng/ml、300-500ng/ml、400-500ng/ml；或者约0.1-400ng/ml、1-400ng/ml、10-400ng/ml、20-400ng/ml、30-400ng/ml、50-400ng/ml、40-400ng/ml、60-400ng/ml、70-400ng/ml、80-400ng/ml、90-400ng/ml、100-400ng/ml、200-400ng/ml、300-400ng/ml；或者约0.1-300ng/ml、1-300ng/ml、10-300ng/ml、20-300ng/ml、30-300ng/ml、40-300ng/ml、50-300ng/ml、60-300ng/ml、70-300ng/ml、80-300ng/ml、90-300ng/ml、100-300ng/ml、200-300ng/ml；或者约0.1-200ng/ml、1-200ng/ml、10-200ng/ml、20-200ng/ml、30-200ng/ml、40-200ng/ml、50-200ng/ml、60-200ng/ml、70-200ng/ml、80-200ng/ml、90-200ng/ml、100-200ng/ml；或者约0.1-150ng/ml、1-150ng/ml、10-150ng/ml、20-150ng/ml、30-150ng/ml、40-150ng/ml、50-150ng/ml、60-150ng/ml、70-150ng/ml、80-150ng/ml、90-150ng/ml、100-150ng/ml；或者约0.1-120ng/ml、1-120ng/ml、10-120ng/ml、20-120ng/ml、30-120ng/ml、40-120ng/ml、50-120ng/ml、60-120ng/ml、70-120ng/ml、80-120ng/ml、90-120ng/ml、100-120ng/ml；或者约0.1-100ng/ml、1-100ng/ml、10-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、60-100ng/ml、70-100ng/ml、80-100ng/ml、90-100ng/ml。

在一些实施例中，ctos生长培养基中的bmp抑制剂是头蛋白。在特定实施例中，bmp抑制剂例如头蛋白的浓度范围为约0.1-10,000ng/ml或1-1000ng/ml；或者约0.1-1000ng/ml、1-1000ng/ml、10-1000ng/ml、20-1000ng/ml、30-1000ng/ml、40-1000ng/ml、50-1000ng/ml、60-1000ng/ml、70-1000ng/ml、80-1000ng/ml、90-1000ng/ml、100-1000ng/ml、200-1000ng/ml、300-1000ng/ml、400-1000ng/ml、500-1000ng/ml、600-1000ng/ml、700-1000ng/ml、800-1000ng/ml、900-1000ng/ml；或者约0.1-500ng/ml、1-500ng/ml、10-500ng/ml、20-500ng/ml、30-500ng/ml、40-500ng/ml、50-500ng/ml、60-500ng/ml、70-500ng/ml、80-500ng/ml、90-500ng/ml、100-500ng/ml、200-500ng/ml、300-500ng/ml、400-500ng/ml；或者约0.1-400ng/ml、1-400ng/ml、10-400ng/ml、20-400ng/ml、30-400ng/ml、50-400ng/ml、40-400ng/ml、60-400ng/ml、70-400ng/ml、80-400ng/ml、90-400ng/ml、100-400ng/ml、200-400ng/ml、300-400ng/ml；或者约0.1-300ng/ml、1-300ng/ml、10-300ng/ml、20-300ng/ml、30-300ng/ml、40-300ng/ml、50-300ng/ml、60-300ng/ml、70-300ng/ml、80-300ng/ml、90-300ng/ml、100-300ng/ml、200-300ng/ml；或者约0.1-200ng/ml、1-200ng/ml、10-200ng/ml、20-200ng/ml、30-200ng/ml、40-200ng/ml、50-200ng/ml、60-200ng/ml、70-200ng/ml、80-200ng/ml、90-200ng/ml、100-200ng/ml；或者约0.1-150ng/ml、1-150ng/ml、10-150ng/ml、20-150ng/ml、30-150ng/ml、40-150ng/ml、50-150ng/ml、60-150ng/ml、70-150ng/ml、80-150ng/ml、90-150ng/ml、100-150ng/ml；或者约0.1-120ng/ml、1-120ng/ml、10-120ng/ml、20-120ng/ml、30-120ng/ml、40-120ng/ml、50-120ng/ml、60-120ng/ml、70-120ng/ml、80-120ng/ml、90-120ng/ml、100-120ng/ml；或者约0.1-100ng/ml、1-100ng/ml、10-100ng/ml、20-100ng/ml、30-100ng/ml、40-100ng/ml、50-100ng/ml、60-100ng/ml、70-100ng/ml、80-100ng/ml、90-100ng/ml。

在特定实施例中，ctos生长培养基中的wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂是r-脊椎蛋白-1。在一些实施例中，wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂例如r-脊椎蛋白-1的浓度范围为约0.1-10,000ng/ml或1-1000ng/ml或100-1000ng/ml；或者约0.1-10,000ng/ml、1-10,000ng/ml、10-10,000ng/ml、20-10,000ng/ml、30-10,000ng/ml、40-10,000ng/ml、50-10,000ng/ml、60-10,000ng/ml、70-10,000ng/ml、80-10,000ng/ml、90-10,000ng/ml、100-10,000ng/ml、200-10,000ng/ml、300-10,000ng/ml、400-10,000ng/ml、500-10,000ng/ml、1000-10,000ng/ml、5000-10,000ng/ml；或者约0.1-5000ng/ml、1-5000ng/ml、10-5000ng/ml、20-5000ng/ml、30-10,000ng/ml、40-5000ng/ml、50-5000ng/ml、60-5000ng/ml、70-5000ng/ml、80-5000ng/ml、90-5000ng/ml、100-5000ng/ml、200-5000ng/ml、300-5000ng/ml、400-5000ng/ml、500-5000ng/ml、1000-5000ng/ml；或者约0.1-1000ng/ml、1-1000ng/ml、10-1000ng/ml、20-1000ng/ml、30-1000ng/ml、40-1000ng/ml、50-1000ng/ml、60-1000ng/ml、70-1000ng/ml、80-1000ng/ml、90-1000ng/ml、100-1000ng/ml、200-1000ng/ml、300-1000ng/ml、400-1000ng/ml、500-1000ng/ml、600-1000ng/ml、700-1000ng/ml、800-1000ng/ml、900-1000ng/ml；或者约0.1-800ng/ml、1-800ng/ml、10-800ng/ml、20-800ng/ml、30-800ng/ml、40-800ng/ml、50-800ng/ml、60-800ng/ml、70-800ng/ml、80-800ng/ml、90-800ng/ml、100-800ng/ml、200-800ng/ml、300-800ng/ml、400-800ng/ml、500-800ng/ml、600-800ng/ml、700-800ng/ml；或者约0.1-700ng/ml、1-700ng/ml、10-700ng/ml、20-700ng/ml、30-700ng/ml、40-700ng/ml、50-700ng/ml、60-700ng/ml、70-700ng/ml、80-700ng/ml、90-700ng/ml、100-700ng/ml、200-700ng/ml、300-700ng/ml、400-700ng/ml、500-700ng/ml、600-700ng/ml；或者约0.1-600ng/ml、1-600ng/ml、10-600ng/ml、20-600ng/ml、30-600ng/ml、40-600ng/ml、50-600ng/ml、60-600ng/ml、70-600ng/ml、80-600ng/ml、90-600ng/ml、100-600ng/ml、200-600ng/ml、300-600ng/ml、400-600ng/ml、500-600ng/ml；或者约0.1-500ng/ml、1-500ng/ml、10-500ng/ml、20-500ng/ml、30-500ng/ml、40-500ng/ml、50-500ng/ml、60-500ng/ml、70-500ng/ml、80-500ng/ml、90-500ng/ml、100-500ng/ml、200-500ng/ml、300-500ng/ml、400-500ng/ml。

在一些实施例中，ctos生长培养基中的rock抑制剂是y27632。在一些实施例中，rock抑制剂例如y27632的浓度范围为约0.1-1000μm、0.5-1000μm、1-1000μm、5-1000μm、10-1000μm、50-1000μm、100-1000μm、500-1000μm；或者约0.1-500μm、0.5-500μm、1-500μm、5-500μm、10-500μm、50-500μm、100-500μm；或者约0.1-100μm、0.5-100μm、1-100μm、5-100μm、10-100μm、50-100μm；或者约0.1-50μm、0.5-50μm、1-50μm、5-50μm、10-50μm；或者约0.1-40μm、0.5-40μm、1-40μm、5-40μm、10-40μm；或者约0.1-30μm、0.5-30μm、1-30μm、5-30μm、10-30μm；或者约0.1-20μm、0.5-20μm、1-20μm、5-20μm、10-20μm；或者约0.1-10μm、0.5-10μm、1-10μm、5-10μm；或者约0.1-5μm、0.5-5μm、1-5μm；或者约0.1-1μm或0.5-1μm。

如本文所描述的，在一些实施例中，消化的或解离的含肿瘤样本在ctos生长培养基中培养约或不到约6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时或者约或不到约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天以形成ctos，之后基本上解离成单细胞悬浮液并且与饲养细胞和rock抑制剂共培养。

如上文指出的，本文所描述的细胞培养基和方法尤其可以用于测试或评估患者肿瘤对一种或多种治疗剂的潜在应答性，并且提供了在相对较短的时间帧内例如在不到一周或两周内鉴别出患者的最佳治疗选择的优势。因此，某些实施例包含测试人类患者对治疗剂(例如，药物或候选药物)的应答性的方法，所述方法包括：(a)向本文所描述的细胞培养基或向通过本文所描述的方法制备的细胞培养基施用治疗剂；以及(b)测量上皮肿瘤细胞增殖和/或上皮肿瘤细胞凋亡。

在一些实施例中，上皮肿瘤细胞增殖的减少(例如，统计学上显著的减少)指示人类患者(即，人类患者的肿瘤)对治疗剂的应答性，并且在一些实施例中，缺乏上皮肿瘤细胞增殖的减少(例如，缺乏统计学上显著的减少)指示人类患者(即，人类患者的肿瘤)对治疗剂的耐药性和可能无应答性。在一些实施例中，上皮肿瘤细胞凋亡的诱导(例如，统计学上显著的增加)指示人类患者(即，人类患者的肿瘤)对治疗剂的应答性。在特定实施例中，缺乏上皮肿瘤细胞凋亡的增加(例如，缺乏统计学上显著的增加)指示人类患者(即，人类患者的肿瘤)对治疗剂的耐药性和可能无应答性。在某些实施例中，上皮肿瘤细胞增殖的减少和上皮肿瘤细胞凋亡的诱导指示人类患者对治疗剂的应答性，并且缺乏上皮肿瘤细胞增殖的减少指示人类患者对治疗剂的耐药性和可能无应答性。

在一些实施例中，测试应答性的方法包含在细胞培养基中解离和共培养ctos的同一天(例如，同时或基本上同时)施用治疗剂。某些实施例包含在细胞培养基中解离和共培养ctos约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时内或时施用治疗剂。还包含在细胞培养基中解离和共培养ctos之后约或约1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天时或内施用治疗剂的方法，包含在细胞培养基中解离和共培养ctos之后约1-7天、1-6天、1-5天、1-4天、1-3天、1-2天后2-7天、2-6天、2-5天、2-4天、2-3天或3-7天、3-6天、3-5天、3-4天或4-7天、4-6天、4-5天或5-7天、5-6或6-7天时或内施用治疗剂的方法。

某些实施例包含测量在施用治疗剂约14天内肿瘤细胞群中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡的步骤，例如在施用治疗剂约14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天或5天内。具体实施例包含测量在施用治疗剂约5-14天、6-14天、7-14天、8-14天、9-14天、10-14天、11-14天、12-14天或13-14天内、或者约5-13天、6-13天、7-13天、8-13天、9-13天、10-13天、11-13天或12-13天内、或者约5-12天、6-12天、7-12天、8-12天、9-12天、10-12天或11-12天内、或者约5-11天、6-11天、7-11天、8-11天、9-11天或10-11天内、或者约5-10天、6-10天、7-10天、8-10天或9-10天内、或者约5-9天、6-9天、7-9天或8-9天内、或者约5-8天、6-8天或7-8天内、或者约5-7天或6-7天内、或者约5-6天内肿瘤细胞群中的肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡的步骤。

在某些实施例中，用于测试的治疗剂或治疗药物是小分子。示例性小分子包含细胞毒素剂、化疗剂和抗血管生成剂，如被视为对治疗各种癌症有用的那些药剂。特定类别的小分子包含但不限于烷化剂、抗代谢物、蒽环类、抗肿瘤抗生素、铂、i型拓扑异构酶抑制剂、ii型拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱类和紫杉烷类。

小分子的具体实例包含苯丁酸氮芥、环磷酰胺、西仑吉肽、环己亚硝脲(ccnu)、美法仑、甲基苄肼、噻替派、卡莫司汀(bcnu)、恩扎妥林(enzastaurin)、白消安、柔红霉素、阿霉素、吉非替尼、埃罗替尼、伊达比星、替莫唑胺、表柔比星、米托蒽醌、博来霉素、顺铂、卡铂、奥沙利铂、喜树碱类、伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、替西罗莫司、依维莫司、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、ct52923和紫杉醇以及以上中的任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。小分子的其它实例包含伊马替尼、克唑替尼、达沙替尼、索拉非尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、瓦他拉尼、吉非替尼、埃罗替尼、aee-788、二氯乙酸盐、它莫西芬、法舒地尔、sb-681323和司马沙尼(su5416)(参见chico等人,《自然·药物发现综述(natrevdrugdiscov)》8:829-909,(2009))。

小分子的另外的实例包含：烷化剂，如噻替派、环磷酰胺(cytoxan^tm)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡和泊舒凡；氮丙啶类，如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基胺类，包含六甲蜜胺、三亚乙基密胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲密胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosurea)，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-fu；雄激素类，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百垂布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依落氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；psk；雷佐生；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(百时美施贵宝公司肿瘤学部门(bristol-myerssquibboncology)，普林斯顿，新泽西州)和多烯紫杉醇(罗纳-普朗罗勒(rhne-poulencrorer)，安东尼(antony)，法国)苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素c；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；视黄酸衍生物，如targretin^tm(贝沙罗汀)、panretin^tm(阿利维a酸)；ontak^tm(地尼白介素(denileukindiftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨；以及以上中的任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

还包含用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素类，包含例如它莫西芬、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基它莫西芬、曲沃昔芬、雷洛西芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及以上中的任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

在一些实施例中，治疗剂是抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段或者其它多肽与癌症相关抗原或癌抗原例如由正在测试的肿瘤细胞簇表达的癌抗原特异性地结合。示例性癌抗原包含细胞表面蛋白，如细胞表面受体。也包括与这种细胞表面蛋白或受体结合的配体作为作为癌症相关抗原。在具体实施例中，抗体或抗原结合片段与细胞内癌抗原特异性地结合。在一些实施例中，与癌抗原相关的癌症是以下中的一种或多种：乳腺癌、转移性脑癌、前列腺癌、胃肠癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、鳞状细胞癌、cns或脑癌、黑色素瘤、非黑色素瘤癌、甲状腺癌、子宫内膜癌、上皮性肿瘤、骨癌或造血性癌症。

在特定实施例中，抗体或抗原结合片段或者其它多肽特异性地结合于至少一种癌症相关抗原或癌抗原，如人her2/neu、her1/egf受体(egfr)、her3、a33抗原、b7h3、cd5、cd19、cd20、cd22、cd23(ige受体)、c242抗原、5t4、il-6、il-13、血管内皮生长因子vegf(例如，vegf-a)、vegfr-1、vegfr-2、cd30、cd33、cd37、cd40、cd44、cd51、cd52、cd56、cd74、cd80、cd152、cd200、cd221、ccr4、hla-dr、ctla-4、npc-1c、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(igf-1r)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(igf-1)、碳酸酐酶9(ca-ix)、癌胚抗原(cea)、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白nmb、成纤维细胞活化蛋白α(fap)、糖蛋白75、tag-72、muc1、muc16(或ca-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(pmsa)、nr-lu-13抗原、trail-r1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(tnfrsf10b或trail-r2)、slam家族成员7(slamf7)、egp40泛癌抗原、b细胞活化因子(baff)、血小板衍生的生长因子受体、糖蛋白epcam(17-1a)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(pdi)、肝再生磷酸酶-3(prl-3)、前列腺酸性磷酸酶、lewis-y抗原、gd2(表达在神经外胚层源肿瘤上的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)和/或间皮素。

在某些实施例中，抗体是治疗抗体，如抗癌治疗抗体，包含如以下等抗体：3f8、8h9、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿赛珠单抗(alacizumab)(培(pegol))、阿麦妥昔单抗(amatuximab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、莫比伐单抗(bivatuzumab)(美登素(mertansine))、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、美坎珠单抗(cantuzumab)(美登素(mertansine))、美坎珠单抗(cantuzumab)(拉坎珠(ravtansine))、卡罗单抗(capromab)(喷地肽(pendetide))、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西他土珠单抗(citatuzumab)(泊西他(bogatox))、西妥木单抗(cixutumumab)、可利妥珠单抗(clivatuzumab)(四昔坦(tetraxetan))、可那木单抗(conatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、地莫单抗(detumomab)、卓齐妥单抗(drozitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依屈洛单抗(edrecolomab)、伊洛珠单抗(elotuzumab)、恩伐珠单抗(enavatuzumab)、恩师妥昔单抗(ensituximab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、依他珠单抗(etaracizumab)、法鲁珠单抗(farletuzumab)、fbta05、菲妥木单抗(figitumumab)、法兰妥单抗(flanvotumab)、加利昔单抗(galiximab)、格图单抗(gemtuzumab)、甘露单抗(ganitumab)、格图单抗(gemtuzumab)(奥佐米星(ozogamicin))、吉妥昔单抗(girentuximab)、维格列巴单抗(glembatumumab)(维多汀(vedotin))、替伊莫单抗替西坦(ibritumomabtiuxetan)、伊鲁库单抗(icrucumab)、伊戈伏单抗(igovomab)、吲妥昔单抗拉坎珠(indatuximabravtansine)、英妥木单抗(intetumumab)、伊珠单抗奥佐米星(inotuzumabozogamicin)、伊匹木单抗(ipilimumab)(mdx-101)、伊妥木单抗(iratumumab)、拉贝珠唑单抗(labetuzumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、莫洛伐妥单抗(lorvotuzumab)(美登素(mertansine))、卢卡珠单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、米妥珠单抗(mitumomab)、莫加利单抗(mogamulizumab)、莫昔单抗(moxetumomab)(帕苏托克斯(pasudotox))、他那可单抗(nacolomab)(塔芬托克斯(tafenatox))、萘妥莫单抗(naptumomab)(伊斯塔芬(estafenatox)、纳妥单抗(narnatumab)、奈米单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、纳武单抗(nivolumab)、(具有或不具有放射性碘)、nr-lu-10、阿法单抗(ofatumumab)、奥拉他单抗(olaratumab)、阿那妥单抗(onartuzumab)、阿曲单抗(oportuzumab)(莫那托克斯(monatox)、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕特利单抗(patritumab)、培马单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、普鲁米单抗(pritumumab)、拉托单抗(racotumomab)、拉德鲁单抗(radretumab)、拉莫鲁单抗(ramucirumab)、利妥珠单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗巴单抗(robatumumab)、沙马利单抗(samalizumab)、西布曲单抗(sibrotuzumab)、西妥昔单抗(siltuximab)、他巴单抗(tabalumab)、阿替莫单抗(taplitumomab)(阿利毒素偶联物(paptox))、替纳单抗(tenatumomab)、替帕珠单抗(teprotumumab)、tgn1412、替昔单抗(ticilimumab)、曲美单抗(tremelimumab)、替加妥单抗(tigatuzumab)、tnx-650、托西单抗(tositumomab)、trbs07、曲妥珠单抗(trastuzumab)、图卡珠单抗(tucotuzumab)(西莫白介素(celmoleukin))、乌布妥昔单抗(ublituximab)、乌洛单抗(urelumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、伏罗昔单抗(volociximab)、伏妥莫单抗(votumumab)以及扎鲁莫单抗(zalutumumab)。还包括这些抗体的片段、变体和衍生物。

某些实施例包含测试对两种或更多种治疗剂的组合的应答性。因此，某些方法包含向培养基悬浮液施用两种或更多种治疗剂，包含上述示例性治疗剂中的两种或更多种的组合。

可以使用本领域中已知的任何不同的方法来测量肿瘤细胞增殖和/或肿瘤细胞凋亡。例如，测量肿瘤细胞增殖的某些方法包含测量一个或多个细胞增殖标志物。示例性细胞增殖标志物包含³h-胸苷、溴脱氧尿苷(brdu)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(edu)、ki-67和增殖细胞核抗原(pcna)。因此，在某些实施例中，测量肿瘤细胞增殖的步骤包括测量细胞增殖标志物，所述细胞增殖标志物选自例如³h-胸苷、brdu、edu、ki-67和pcna中的一种或多种，包含其组合。

同样地，可以使用本领域中已知的任何不同的方法来测量肿瘤细胞凋亡。“细胞凋亡”通常指代多细胞生物体内发生的程序性细胞死亡过程，包含导致特征细胞变化(例如，形态)和细胞死亡的生化事件。示例性变化包含起泡、细胞收缩、核碎裂、染色质凝聚、染色体dna断裂和全局性mrna衰变。测量肿瘤细胞凋亡的某些方法包含测量细胞凋亡标志物。示例性细胞凋亡标志物包含荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(flica)、半胱天冬酶活化、聚adp核糖聚合酶(parp)裂解、draq5、draq7和末端脱氧核苷酰转移酶(tdt)dutp缺口标记(tunel)测定。因此，在某些实施例中，测量肿瘤细胞凋亡的步骤包括测量细胞凋亡标志物，所述细胞凋亡标志物选自例如flica、parp、draq5、draq7和tunel测定中的一种或多种，包含其组合。

在某些方面，在诊断实验室执行这些应答性测试或方法，并且然后将结果提供给患者或提供给在患者的医疗和癌症治疗中发挥作用的医师或其它医疗服务提供者。因此，特定实施例包含用于向患者或者向医师或其它医疗服务提供者提供肿瘤细胞簇应答性测试的结果的方法。这些结果或数据可以是硬拷贝或纸质拷贝的形式或者是电子形式如计算机可读媒体。

还包含包括本文所描述的各种组分中的一种或多种的试剂盒。例如，这种试剂盒可以用于制备共培养物以进行有条件的重新编程和/或用于由自人类癌症患者体内取出的含肿瘤样本制备ctos。

因此，某些实施例涉及样本制备试剂盒，所述样本制备试剂盒包括以下的任何组合：

-限定性无血清无饲养物癌组织源球体(ctos)生长培养基；

-组织消化或解离培养基；

-具有低细胞结合表面的组织培养板；

-限定性细胞培养基；

-冷冻的饲养细胞；

-rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制剂；以及

-细胞增殖标志物和/或细胞凋亡标志物。

在一些实施例中，试剂盒提供或ctos生长培养基包括烟酰胺、wnt3a、骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂、wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂和/或rock抑制剂。某些试剂盒包括或提供例如用于添加到ctos生长培养基和/或限定性细胞培养基的补充的sa。在一些实施例中，ctos生长培养基和/或限定性细胞培养基包括补充的sa。在一些实施例中，补充的sa选自牛血清白蛋白(bsa)和人血清白蛋白(hsa)。在某些实施例中，ctos生长培养基和/或限定性细胞培养基中补充的sa的浓度为约0.5mg/ml到20mg/ml或者约、小于约或不超过约0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml、2.0mg/ml、2.2mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.8mg/ml、3.0mg/ml、3.2mg/ml、3.4mg/ml、3.6mg/ml、3.8mg/ml、4.0mg/ml、4.2mg/ml、4.4mg/ml、4.6mg/ml、4.8mg/ml、5.0mg/ml、5.2mg/ml、5.4mg/ml、5.6mg/ml、5.8mg/ml、6.0mg/ml、6.2mg/ml、6.4mg/ml、6.6mg/ml、6.8mg/ml、7.0mg/ml、7.2mg/ml、7.4mg/ml、7.6mg/ml、7.8mg/ml、8.0mg/ml、8.2mg/ml、8.4mg/ml、8.6mg/ml、8.8mg/ml、9.0mg/ml、9.2mg/ml、9.4mg/ml、9.6mg/ml、9.8mg/ml、10.0mg/ml、10.2mg/ml、10.4mg/ml、10.6mg/ml、10.8mg/ml、11.0mg/ml、11.2mg/ml、11.4mg/ml、11.6mg/ml、11.8mg/ml、12.0mg/ml、12.2mg/ml、12.4mg/ml、12.6mg/ml、12.8mg/ml、13.0mg/ml、13.2mg/ml、13.4mg/ml、13.6mg/ml、13.8mg/ml、14.0mg/ml、14.2mg/ml、14.4mg/ml、14.6mg/ml、14.8mg/ml、15.0mg/ml、15.2mg/ml、15.4mg/ml、15.6mg/ml、15.8mg/ml、16.0mg/ml、16.2mg/ml、16.4mg/ml、16.6mg/ml、16.8mg/ml、17.0mg/ml、17.2mg/ml、17.4mg/ml、17.6mg/ml、17.8mg/ml、18.0mg/ml、18.2mg/ml、18.4mg/ml、18.6mg/ml、18.8mg/ml、19.0mg/ml、19.2mg/ml、19.4mg/ml、19.6mg/ml、19.8mg/ml或20mg/ml。

在一些实施例中，限定性培养基包括血清，例如胎牛血清(fbs)，其浓度在约1-5％的范围内或者为约1％、2％、3％、4％或5％。在一些实施例中，rock抑制剂选自y27632、ha1100盐酸盐、ha1077和gsk429286中的一种或多种。在某些实施例中，细胞增殖标志物选自³h-胸苷、溴脱氧尿苷(brdu)、5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(edu)、ki-67和增殖细胞核抗原(pcna)中的一种或多种。在特定实施例中，细胞凋亡标志物选自荧光染料标记的半胱天冬酶抑制剂(flica)、半胱天冬酶活化、聚adp核糖聚合酶(parp)裂解、draq5、draq7和末端脱氧核苷酰转移酶(tdt)dutp缺口标记(tunel)测定中的一种或多种。

试剂盒还可以包括书面说明书，例如关于如何由患者样本制备ctos、共同培养ctos以富集肿瘤上皮细胞和/或测试肿瘤上皮细胞对一种或多种治疗剂的应答性。

本说明书中引用的所有出版物、专利申请和发布的专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或发布的专利被明确且单独地指明通过引用并入一样。

尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式对上述发明进行了一些详细描述，但是对于普通技术人员而言应当显而易见的是，可以在不偏离本说明书或随附权利要求书的精神或范围的情况下对其进行某些改变和修改。以下实例仅通过说明的方式而非限制的方式提供。本领域技术人员应当容易识别可以被改变或修改以产生基本上类似的结果的各种非关键参数。

实例

实例1

源自患者的癌组织源球体(ctos)的分离和有条件的重新编程为单细胞培养物

在得到患者同意后，从北京肿瘤医院(beijingtumorhospital)获得结肠直肠癌患者的正常和肿瘤手术样本。

简单地说，为了制备ctos培养物，从肿瘤标本中小心地取出非肿瘤组织和坏死级分。用剪刀将正常组织和肿瘤组织切割成直径小于1mm的小块。将切碎的肿瘤级分转移到带磁力搅拌棒的无菌的100-ml三角形玻璃烧瓶中。向切碎的肿瘤组织中加入含有0.25u/mlliberasedh(呈限定比例的胶原酶i和胶原酶ii，以及中性非梭菌蛋白酶)的10-15ml消化培养基以开始酶消化。在适度搅拌下将酶混合物在37℃下培育1-2小时。将部分消化的肿瘤细胞簇过滤通过100-μm细胞保留器。将滤液再过滤通过40-μm细胞限制器。收集保留在40-μm细胞限制器上的肿瘤细胞簇，用hbss洗涤两次，然后重新悬浮在补充有细胞生长因子和小分子抑制剂的的限定性生长培养基中。在限定性生长培养基中回收肿瘤细胞簇整夜。限定性完全生长培养基是补充有以下的hescsfm(限定性无血清无饲养物培养基(sfm))：烟酰胺、wnt3a、头蛋白(骨形态发生蛋白(bmp)抑制剂)、r-脊椎蛋白-1(wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂)和y27632(rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(rock-1)抑制剂)。

还对选择性生长培养基进行测试，所述选择性生长培养基包含未补充有r-脊椎蛋白-1和头蛋白并且在一些例子中还未补充有wnt3a的上述限定性完全生长培养基(见图8a到8h和图9a到9h)。正常上皮细胞在限定性完全生长培养基中生长(图8a到8d)，但不在选择性生长培养基中生长(图8e到8h)。相比之下，肿瘤上皮细胞在限定性完全生长培养基(图9a到9d)和选择性生长培养基(图9e到9h)中都生长。

对于有条件的重新编程，解离并以每孔约3000个细胞在具有饲养细胞/rock抑制剂(y27632)共培养系统的低细胞结合板中接种回收的ctos(见图4a到4f)。

在初始接种之后，用解离的肿瘤上皮细胞在以下限定性选择性生长培养基中进行药物测试：补充有烟酰胺和y27632(rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶(rock-1)抑制剂)的hescsfm(限定性无血清无饲养物培养基(sfm))。

对于离体药物测试，将接种的肿瘤细胞暴露于药物或药物组合物持续72小时。在dmso中制备药物，并且dmso在培养基中的最终浓度为0.1％。通过十个点的连续稀释对药物和药物组合物进行测试(见图6)。用药物暴露之后，用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(edu)标记上皮肿瘤细胞以估算肿瘤细胞增殖速率。在药物暴露存在的情况下，标记持续24小时。在对照组中，上皮肿瘤细胞在培养基改变的情况下未接受药物暴露，但类似地用edu标记。将标记的肿瘤细胞固定并在4℃下在含有0.5％tritonx-100和3％bsa的阻断缓冲液中用hoechst33342染色整夜。将肿瘤细胞在室温下与epcam抗体(1:4000)一起培育2小时并用pbst冲洗。随后，将肿瘤细胞在室温下与alexa647结合的山羊抗小鼠第二抗体一起培育30分钟并用pbst冲洗。

通过克里克-it反应(click-itreaction)检测掺入的edu，其中在黑暗中用含有1x克里克-itedu反应缓冲剂、cuso4和叠氮化物结合的alexafluor染料的反应混合物来培育固定细胞。将染色细胞用pbs洗涤多次，之后分配到黑壁板中进行图像采集和分析。

对于正常组织，在上述部分酶消化下并未观察到肿瘤簇。收集并以每孔约3000个细胞在饲养细胞和rock抑制剂y27632中接种单细胞。使正常细胞生长72小时，之后用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(edu)进行标记以估算肿瘤细胞增殖速率。将正常细胞用epcam抗体染色以鉴别上皮细胞。

对于图像采集和分析，通过高内涵筛选(hcs)平台(赛默科技细胞组学阵列扫描xtihcs读取器(thermoscientificcellomicsarrayscanxtihcsreader))对染色肿瘤细胞进行成像。用10x物镜收集图像。对每个孔进行二十五个视野的成像，并且捕获多于3000多个细胞以供分析。从hcs读取器中获得图像的三种荧光信号。蓝色荧光信号记录用hoechst33342染色的核信号，绿色荧光信号检测掺入到新合成的dna中的edu，并且红色荧光信号检测epcam阳性上皮细胞群。将edu阳性亚群细胞百分比计算为总上皮细胞计数的百分比。

如图7a到7b所示，生成八个不同的患者的药物和药物组合物中edu掺入的百分比的剂量应答数据以及药物敏感性定量得分(7b)。数据可以用具有以下的逻辑s型函数来表示：最大效应水平(amax)、化合物在半最大活性下的浓度(ec50)、表示领主型转变的希尔系数以及用于基于活性面积捕获多参数剂量-应答关系以鉴别选择性药物-应答模式的定量评分方法(dss)。

amax(edu)＝micmax/mic

dss(auc)＝∫mi(x)dx

amax、ec50和dss可以用于确立患者对被检测药物或药物组合物的应答预测模型。