一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法及应用与流程

本发明涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法及应用。

背景技术：

高致病性猪链球Ⅱ型菌(Streptococcus suisserotype 2，SS2)可引起一系列急性败血症、脑膜炎和关节炎等传染性疾病，致残、致死率较高，是一种重要的人畜共患性病原。

细胞外因子(Extracellular protein factor，EF)是SS2的主要标志性毒力因子和重要的保护性抗原之一。

猪链球菌病在各地均有发生，给养猪业造成了极大的影响和较大的经济损失，目前没有有效的抗体疫苗，因此对猪链球菌细胞外因子的研究需要加强，目前很少有针对含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的宿主菌人工保藏的稳定性的研究。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法，通过本检测方法，可以对猪溶血素基因的遗传稳定性有较为可靠的认识，为猪链球菌细胞外因子基因的研究提供可靠的支持。

本发明的第二目的在于提供上述猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法在猪溶血素基因研究中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法，包括：

于液体培养基中培养含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的宿主菌菌液；

连续传代培养宿主菌菌液；

间隔取样传代培养的宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。

上述猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法在在猪链球菌细胞外因子基因研究中的应用。

本发明的有益效果为：本发明通过复苏培养含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的宿主菌菌液，并进行连续多代的传代培养，间隔一定的代数取样并检测，通过检测人工保藏的猪链球菌细胞外因子基因的质粒的宿主菌的遗传稳定性，为研究猪链球菌细胞外因子基因提供可靠的支撑和保障；将上述检测方法应用到猪链球菌细胞外因子基因研究中，也可以为猪链球菌细胞外因子基因的研究和培养提供参考和借鉴，具有重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例4提供的第5代大肠杆菌的菌落形态图；

图2为本发明实验例4提供的第15代大肠杆菌的菌落形态图；

图3为本发明实验例4提供的第25代大肠杆菌的菌落形态图；

图4为本发明实验例4提供的第40代大肠杆菌的菌落形态图；

图5为本发明实验例4提供的第5代大肠杆菌PCR电泳结果图；

图6为本发明实验例4提供的第15代大肠杆菌PCR电泳结果图；

图7为本发明实验例4提供的第25代大肠杆菌PCR电泳结果图；

图8为本发明实验例4提供的第40代大肠杆菌PCR电泳结果图；

图9为本发明实验例4提供的第5代大肠杆菌生化实验结果图；

图10为本发明实验例4提供的第15代大肠杆菌生化实验结果图；

图11为本发明实验例4提供的第25代大肠杆菌生化实验结果图；

图12为本发明实验例4提供的第40代大肠杆菌生化实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

溶血素是猪链球菌的主要毒力因子，猪感染猪链球菌后，溶血素发挥作用，严重影响其生长发育；对生猪养殖带来巨大的影响，因此对猪溶血素检测研究就是必要的；而含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的遗传稳定性尤其是人工保藏条件的遗传稳定性也是必要的。

下面对本发明实施例的一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法及应用进行具体说明。

一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法，包括：

于液体培养基中培养含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的宿主菌菌液；

连续传代培养宿主菌菌液；

间隔取样传代培养的宿主菌菌液并进行遗传稳定性检测。

选用常用的克隆载体pEASY-Blunt为载体，将猪链球菌细胞外因子基因：CATGCTAACACAGTGACAGAAGCAGAGACAGCTGTAG CACCAGCTAACCAAGACCTTGGAAATGAGACTAAAACGGAAG AAGAACCCAAGGAACCAATCGAAGCAGTTCGCACGGACATGG AAAACCGTGCAGCTGAAATCTTGCCGGAGGCGCTGAATGCTAG TGTAACAAACCAAGCACCAGTTATTCCGACTATTGGAGATCTTC CTAAAGATGCGAGTGGTCAGAATGTTCATGGTAAGGCAACGGA TAATAAGATTTATCGTGTTGTATACGTTTTTGGTAATGTAGCAGG GACTACGGAGACAGAAGATGGTAAACAAAATGTTGCTCCAACA TTTAACAGAAATGATGCAACTAAAACTTTTCCAATCACAGATCC AGATAGCGACATTCAAACTATTTCATACGAAGTTCCAGCTGATA TTGCAAGCTATACCTTGGATGATCCAAACTCAATTGTTACTAAT GGCACCTCACCTGGTCCAGTATCTTACTTAGATGGTCCAAATGG GTCAGCCACTCTCACACAAGATGGTTATCTAAC克隆连接到克隆载体pEASY-Blunt上。

使用引物进行检测，检测引物为：

EF上游引物基因序列：5’ CACAGTGACAGAAGCAGAGACAG3’；

EF下游引物基因序列：5’CATCTTGTGTGAGAGTGGCTG3’。

引物扩增的片段长度为530bp。

进一步地，宿主菌菌液的接种量为液体培养基的体积的3％-7％。

宿主菌与液体培养基保持一个合理的接种比例，可以保证菌液能较快的复苏和进入对数期，可以较大的节约实验的时间，加快实验进程。

进一步地，宿主菌菌液为甘油菌液。

通常甘油菌为低温保藏，由于甘油有防冻的效果，通过添加甘油，可以有效的保护菌株在低温条件不被破坏；而且由于甘油具有保湿的效果，可以较好的保证菌液的水分，保证菌种的活性。

进一步地，甘油菌液的制备包括：

将含猪链球菌细胞外因子基因的质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过鉴定引物检测鉴定，得到阳性的重组大肠杆菌；

培养重组大肠杆菌，并添加甘油制成甘油菌种保藏。

进一步地，大肠杆菌感受态细胞为TOP10细胞、DH5α细胞和 BL21(DE3)细胞中的一种。

由于大肠杆菌的生长迅速，将大肠杆菌作为宿主菌，通过简单的复苏培养和传代培养，可以较快获得大量的菌液，即可以获得大量的猪链球菌细胞外因子基因；大肠杆菌也是常用的克隆和表达的宿主菌，具有较多的优点。

进一步地，含猪链球菌细胞外因子基因的质粒与大肠杆菌感受态细胞的体积比为2-6:100。

通过控制质粒与大肠杆菌感受态细胞的比例，可以提高质粒的转化效率。

进一步地，含猪链球菌细胞外因子基因的质粒浓度为 2.5-7.1ng/μL。

进一步地，转化方法为：混合含猪链球菌细胞外因子基因的质粒和大肠杆菌感受态细胞，冰上放置25-37min；热激40-60s，冰上放置2-3min。

进一步地，热激的温度为42℃。

热激可以将连接有猪链球菌细胞外因子基因的重组质粒高效的转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后培养重组宿主菌，达到转化克隆猪链球菌细胞外因子基因的质粒的目的。

上述的猪链球菌细胞外因子基因遗传稳定性的检测方法在猪溶血素基因研究中的应用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法，猪链球菌细胞外因子基因遗传稳定性的检测方法，包括将猪链球菌细胞外因子基因的质粒转化到宿主菌细胞中，然后将含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的宿主菌制成甘油菌，通过培养和传代甘油菌，鉴定传代甘油菌的遗传稳定性。

本实施例中选用DH5α的感受态细胞作为大肠杆菌感受态细胞，当然在其他的实施方式中也可以选用其他的大肠杆菌感受态细胞进行试验，如TOP10细胞或BL21(DE3)细胞。

质粒的转化具体步骤如下：

1.1取100μL大肠杆菌DH5α的感受态细胞加入到EP管中，并于冰上融化；

1.2取2μL浓度为7.1ng/μL的猪链球菌细胞外因子基因的质粒 (pEASY-Blunt-EF)加入到EP管里已经融化的大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，冰上放置25min；

1.3将EP管于42℃的温度条件下热激40s，将EP管快速转移至冰上冷却2min；

1.4在EP管中加入200μL的不含抗生素的液体LB培养基， 150rpm培养45min；

1.5取50μL的菌液均匀涂布到LB固体培养基(Amp⁺)上，37℃培养16h。

阳性宿主菌的鉴定

从步骤1.5的LB固体培养基(Amp⁺)上分别挑取10个单斑，于LB液体培养基中培养，然后进行菌液PCR鉴定，将具有条带的阳性样本进行扩大培养。

制备甘油菌进行菌种保藏

2.1配制30％的甘油的备用；

2.2取对数生长期的菌液400μL，2000rpm离心收集菌体；

2.3加入200μL的新鲜LB液体培养基，将菌体吹散形成菌悬液；

2.4加入等体积的30％的甘油，混匀即可。

实施例2

本实施例提供一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法，猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法包括将猪链球菌细胞外因子基因的质粒转化到宿主菌细胞中，然后将含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的宿主菌制成甘油菌，通过培养和传代甘油菌，鉴定传代甘油菌的遗传稳定性。

本实施例中选用TOP10的感受态细胞作为大肠杆菌感受态细胞，当然在其他的实施方式中也可以选用其他的大肠杆菌感受态细胞进行试验，如DH5α细胞或BL21(DE3)细胞。

质粒的转化具体步骤如下：

1.1取100μL大肠杆菌TOP10的感受态细胞加入到EP管中，并于冰上融化；

1.2取6μL浓度为0.8ng/μL的猪链球菌细胞外因子基因的质粒 (pEASY-Blunt-EF)加入到EP管里已经融化的大肠杆菌TOP10的感受态细胞中，冰上放置37min；

1.3将EP管于42℃的温度条件下热激60s，将EP管快速转移至冰上冷却3min；

1.4在EP管中加入200μL的不含抗生素的液体LB培养基， 150rpm培养45min；

1.5取50μL的菌液均匀涂布到LB固体培养基(Amp⁺)上，37℃培养16h。

阳性宿主菌的鉴定

从步骤1.5的LB固体培养基(Amp⁺)上分别挑取10单斑，于 LB液体培养基中培养，然后进行菌液PCR鉴定；将具有条带的阳性样本进行扩大培养。

制备甘油菌进行菌种保藏

2.1配制30％的甘油的备用；

2.2取对数生长期的菌液400μL，2000rpm离心收集菌体；

2.3加入200μL的新鲜LB液体培养基，将菌体吹散形成菌悬液；

2.4加入等体积的30％的甘油，混匀即可。

实施例3

本实施例提供一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法，猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法包括将猪链球菌细胞外因子基因的质粒转化到宿主菌细胞中，然后将含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的宿主菌制成甘油菌，通过培养和传代甘油菌，鉴定传代甘油菌的遗传稳定性。

本实施例中选用TOP10的感受态细胞作为大肠杆菌感受态细胞，当然在其他的实施方式中也可以选用其他的大肠杆菌感受态细胞进行试验，如DH5α细胞或BL21(DE3)细胞。

质粒的转化具体步骤如下：

1.1取100μL大肠杆菌TOP10的感受态细胞加入到EP管中，并于冰上融化；

1.2取4μL浓度为2.1ng/μL的猪链球菌细胞外因子基因的质粒 (pEASY-Blunt-EF)加入到EP管里已经融化的大肠杆菌TOP10的感受态细胞中，冰上放置31min；

1.3将EP管于42℃的温度条件下热激45s，将EP管快速转移至冰上冷却3min；

1.4在EP管中加入200μL的不含抗生素的液体LB培养基， 150rpm培养45min；

1.5取50μL的菌液均匀涂布到LB固体培养基(Amp⁺)上，37 培养16h。

阳性宿主菌的鉴定

从步骤1.5的LB固体培养基(Amp⁺)上分别挑取10单斑，于 LB液体培养基中培养，然后进行菌液PCR鉴定；将具有条带的阳性样本进行扩大培养。

PCR扩增反应体：菌液2μL作为模板、PCR反应缓冲液2.5μL、 dNTPS0.5μL、上游引物0.25μL、下游引物0.25μL以及Taq DNA聚合酶0.25μL，加水补足到25μL。反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环，72℃延伸3min。

制备甘油菌进行菌种保藏

2.1配制30％的甘油的备用；

2.2取对数生长期的菌液400μL，2000rpm离心收集菌体；

2.3加入200μL的新鲜LB液体培养基，将菌体吹散形成菌悬液；

2.4加入等体积的30％的甘油，混匀即可。

实施例4

本实施例提供一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法，本实施例中取用实施例3中制备得到的含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌的甘油菌作为菌种进行试验，具体步骤如下：

1.1在试管中加入3mL的LB液体培养基(含有100mg/L的氨苄青霉素)；

1.2按照3％的接种量将甘油菌菌种接种到试管中；

1.3于37℃的条件下120rpm振荡培养；

1.4进行连续传代培养，分别取第5代、第15代、第25代和第 40代的样品进行试验。

菌落形态比较

配制适量曙红亚甲蓝培养基，121℃高温高压灭菌15min，在无菌环境下制备平板，分别取5、15、25、40代菌液进行划线培养，37℃培养24h，观察菌落形态。

结果如图1到图4所示，从菌落形态观察，第5代、第15代、第25代和第40代的含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌样品的菌落形态一致，没有明显的差别，且均能够长出单斑，说明含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌依然保有活力。

PCR分子鉴定

取第5代、第15代、第25代和第40代含有戊型肝炎病毒质粒的大肠杆菌样品分别进行PCR反应，PCR反应体系和反应程序参照实施例3的PCR反应体系和反应程序。

PCR反应结果如图5到图8所示，条带大小530bp，符合预期目的片段的大小，图中M表示DNAMarker，1为检测样本，2为阴性对照；图5中传代5代的大肠杆菌的PCR产物电泳结果，图6为传代15代的大肠杆菌的PCR产物电泳结果；图7中为传代25代的大肠杆菌的PCR产物电泳结果，图8为传代40代的大肠杆菌的PCR 产物电泳结果；传代5代、15代、25代和40代的大肠杆菌依然能检测到含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒，说明含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌在传代5代、15代、25代和40代均能保持其遗传稳定性。

大肠杆菌的生化反应实验

将含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌在传代5代、 15代、25代和40代后取样，进行靛基质实验、MR(甲基红)实验、 VP实验和柠檬酸盐实验进行鉴定。

含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌的第五代生化实验结果如图9所示，其中图左上方两张图为靛基质实验前后的对比图，右上方两张图为VP实验前后对比图；其中图左下方两张图为 MR实验前后的对比图，右下方两张图为柠檬酸盐实验前后对比图；表明含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌在传代5代能保持其遗传稳定性。

含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌的第十五代生化实验结果如图10所示，其中图左上方两张图为靛基质实验前后的对比图，右上方两张图为VP实验前后对比图；其中图左下方两张图为MR实验前后的对比图，右下方两张图为柠檬酸盐实验前后对比图；表明含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌在传代15 代能保持其遗传稳定性。

含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌的第二十五代生化实验结果如图11所示，其中图左上方两张图为靛基质实验前后的对比图，右上方两张图为VP实验前后对比图；其中图左下方两张图为MR实验前后的对比图，右下方两张图为柠檬酸盐实验前后对比图；表明含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌在传代25 代能保持其遗传稳定性。

含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌的第四十代生化实验结果如图12所示，其中图左上方两张图为靛基质实验前后的对比图，右上方两张图为VP实验前后对比图；其中图左下方两张图为MR实验前后的对比图，右下方两张图为柠檬酸盐实验前后对比图；表明含有猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌在传代40 代能保持其遗传稳定性。

实施例5

本实施例提供一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法，本实施例中取用实施例3中制备得到的猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌的甘油菌作为菌种进行试验，具体步骤如下：

1.1在试管中加入3mL的LB液体培养基(含有100mg/L的氨苄青霉素)；

1.2按照10％的接种量将甘油菌菌种接种到试管中；

1.3于37℃的条件下120rpm振荡培养；

1.4进行连续传代培养，分别取第5代、第15代、第25代和第 40代的样品进行试验。

连续传代的猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌的遗传稳定性检测，包括菌落形态比较、革兰氏染色和PCR鉴定以及生化检测。

综上所述，本发明实施例通过将猪链球菌细胞外因子基因的质粒转化到大肠杆菌，然后制成甘油菌，通过培养甘油菌并连续传代，测定不同代的猪链球菌细胞外因子基因的质粒的大肠杆菌的遗传稳定性，为猪链球菌细胞外因子基因的研究提供可靠的保证。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 哈尔滨瀚邦医疗科技有限公司

<120> 一种猪链球菌细胞外因子基因的质粒遗传稳定性的检测方法及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> Streptococcus suisserotype

<400> 1

catgctaaca cagtgacaga agcagagaca gctgtagcac cagctaacca agaccttgga 60

aatgagacta aaacggaaga agaacccaag gaaccaatcg aagcagttcg cacggacatg 120

gaaaaccgtg cagctgaaat cttgccggag gcgctgaatg ctagtgtaac aaaccaagca 180

ccagttattc cgactattgg agatcttcct aaagatgcga gtggtcagaa tgttcatggt 240

aaggcaacgg ataataagat ttatcgtgtt gtatacgttt ttggtaatgt agcagggact 300

acggagacag aagatggtaa acaaaatgtt gctccaacat ttaacagaaa tgatgcaact 360

aaaacttttc caatcacaga tccagatagc gacattcaaa ctatttcata cgaagttcca 420

gctgatattg caagctatac cttggatgat ccaaactcaa ttgttactaa tggcacctca 480

cctggtccag tatcttactt agatggtcca aatgggtcag ccactctcac acaagatggt 540

tatctaac 548

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<213> 人工序列

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catcttgtgt gagagtggct g 21