本发明涉及一种利用复合酶水解辅助胍盐离子液体双水相萃取柠檬皮渣中柠檬苦素的方法，属于果蔬加工副产品综合利用及功能性物质提取领域。
背景技术：
近来，研究者在国家自然基金项目和重庆市基础与前沿研究计划项目的资助下，对胍盐离子液体双水相萃取柠檬皮渣中柠檬苦素的工艺进行了研究，并辅以复合酶的水解技术做预处理，成功提取并富集了柠檬苦素，积累了相关数据和经验，形成了本发明技术方案。
柠檬苦素(Limonin)是大量存在于柑橘、柠檬、柚子等芸香科水果中的高分子萜类化学物，具有极强的自由基清除能力、抑制癌细胞扩增、防止动脉硬化、降低胆固醇含量、除湿镇痛、杀菌和抗过敏等生理活性，保健价值较大；但同时，柠檬苦素过多残留也会导致柑橘类果汁苦味残留严重，感官品质严重下降。因此，从果实提取柠檬苦素一方面可增加产品附加值，另一方面也可改善果实的加工特性。柠檬果实(Citrus limon(L.)Burm.F.)为芸香科柑橘属常绿小乔木植物的分化果实，色泽亮黄、味极酸、风味浓郁，同时富含矿物质、维生素、氨基酸、类黄酮和类胡萝卜素等各种功能性成分，营养价值高。柠檬果实味觉酸度极大、鲜食比例低，但却具有出汁率高、果肉褐变速度慢等优良加工特性，故大量柠檬鲜果被用来进行榨取果汁，制作冻干片、即食片、果酱等产品以及开发化妆品，导致加工副产品——柠檬果渣的大量产生。柠檬果渣开发利用难度大，通常直接丢弃或焚烧，形成巨大的资源浪费和环境污染。因此，合理利用柠檬皮渣提取分离柠檬苦素，不仅有利于柠檬果实资源的充分利用，也有助于柠檬深加工技术的升级，提高柠檬加工品附加值。
离子液体(Ionic liquid)是由有机阳离子和无机或有机阴离子所构成的低沸点缓冲盐溶液，具有调控性高、熔融特性优良、pH缓冲范围大且溶解性好等特点。但单一离子液体性状不够稳定，因而通常将其与无机盐形成离子液体双水相体系，该体系除具有离子液体的优点外，还具有挥发度和乳化性低、回收率高、平衡度高、易于放大进行工业化生产且对环境友好等特点，可被用于色谱分析、萃取分离、提取物纯化及蛋白质或核酸电泳等众多工艺流程。在构成离子液体的众多有机阳离子中，胍盐由于其阳离子热和化学性质稳定、电荷范围大、基团调节范围广等特点，使其成为良好的阳离子供体。
技术实现要素：
本发明是为充分利用柠檬果实加工副产品的柠檬皮渣，通过设计一种复合酶水解辅助胍盐离子液体双水相萃取的提取工艺方法，以高效、温和和简便的提取柠檬皮渣中柠檬苦素，从而综合利用柠檬资源。
为实现上述目的，本发明采取操作步骤：
(1)柠檬皮渣烘干、粉碎：柠檬皮渣经烘干调节水分含量至20％以下，用粉碎机粉碎后经100～120目筛网过滤后去除未滤过的皮渣备用。
(2)酶解：步骤(1)中的柠檬皮渣粉末加入浓度小于10％的乙醇溶液，调节液料比至20:1～25:1。随后添加复合酶对皮渣进行水解，水解完成后过滤得到酶解滤液，备用。
(3)对步骤(2)的酶解滤液进行脱盐处理，后减压浓缩：将脱盐处理后的酶解液在40℃、压强为0.02～0.03MPa下蒸馏并浓缩至原先体积的10％～15％。
(4)胍盐离子液体双水相萃取：在步骤(3)中的浓缩液中加入胍盐离子液体和无机盐，形成胍盐离子液体双水相萃取体系，随后加入KBr，调节pH值，超声振荡以加速溶质溶解，脱气。随后，在10～12℃下静置10～12h，取上层液体离子相，其中富含柠檬苦素。
(5)复合有机溶剂萃取：将步骤(4)制取的离子液体相用复合有机溶剂进行萃取，分离上层有机相。
(6)减压蒸馏：将步骤(5)分离的上层有机相在40℃、压强为0.01～0.02MPa下蒸馏并浓缩至原先体积5％～10％。
(7)冷冻干燥：将步骤(6)中制取的浓缩液用冷冻干燥机干燥制取柠檬苦素粗粉末。
(8)纯化：将步骤(7)中制取的富含柠檬苦素的冻干粗粉末用体积浓度40％～50％的乙醇溶液溶解，调节pH至5.0～5.5。在1～4℃、5000～10000rpm转速下离心15～20min，取上清液冷冻干燥后制得微黄色柠檬苦素粉末。
其中：步骤(2)中，复合酶由纯度99％以上的固体溶菌酶、固体纤维素酶、固体6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、固体木瓜蛋白酶、固体柠檬酸裂解酶和固体二磷酸酮糖裂合酶组成，其质量比例为0.5：1.5：3：4：0.5：0.5，用质量为200倍的无菌蒸馏水溶解；复合酶添加量为柠檬皮渣粉末溶解于乙醇溶液后总质量的1.2％～1.5％，酶解温度为35～40℃，pH值5.5～6.0，酶解时间2～2.5h。采用透析方法脱盐。
步骤(3)中脱盐是通过将酶解液转移到8000～14000截留分子量的透析袋中，于体积2000倍以上的无菌蒸馏水中静置24h以脱去微量无机盐。
步骤(4)中涉及的胍盐离子液体双水相萃取体系，所述胍盐离子液体为[BMG][BF4]、[BMG][PF6]、[TMG][Cl]、[TMG][Br]、[PHMG][PF6]其中的一种，但不限于以上胍盐离子液体；所述无机盐为KH2PO4、NaH2PO4或K3PO4其中的一种，但不限于以上无机盐。其中[BMG][BF4]为甲基丁基胍的四氟硼酸盐，[BMG][PF6]为甲基丁基胍的六氟磷酸盐，[PHMG][PF6]为聚六亚甲基胍的六氟磷酸盐，[TMG][Cl]为四甲基胍的盐酸盐，[TMG][Br]为四甲基胍的溴酸盐。
步骤(4)中加入KBr使两相界面张力及电动势产生差异，可提高柠檬苦素在离子相中的分配系数。
步骤(5)中复合有机溶剂由乙醇、环已烷、甲酸、丁烷、丙烷和乙酸乙酯组成。将步骤(4)中分离的上层离子液体相用10倍体积的复合有机溶剂萃取并分离出上层有机相。
步骤(7)和(8)中冷冻干燥时，压强为10～50Pa、温度-50～-60℃、步骤(7)中冷冻干燥时间为12～16h；步骤(8)中冷冻干燥时间为8～10h。
步骤(4)中调节pH值时所选试剂为磷酸，步骤(8)中调节pH值时所选试剂为醋酸。
本发明提供一种从柠檬皮渣中提取柠檬苦素的方法，其优点和积极效果有：
(1)绿色环保。本发明所涉及的柠檬皮渣中柠檬苦素的提取工艺，可充分利用柠檬果实加工副产品柠檬皮渣，开发功能性产品，减少农业固体废弃物污染，促进循环农业和绿色农业的发展。
(2)技术新。本发明涉及的胍盐离子液体稳定性高且具有一定的分子识别能力，近年来越来越受到科研工作者重视。本发明涉及的萃取剂是由水溶性有机胍基分子和无机盐在水相中经充分混合和互溶后形成双水相萃取体系，该两相体系制作简单、稳定性高、提取效果好、萃取液回收容易且挥发性小，同时操作温度低，有利于功能性生物大分子的提取。
(3)经济价值高，生产技术易于推广。本发明所涉及的复合酶水解辅助胍盐离子液体双水相萃取柠檬皮渣中柠檬苦素的方法，可充分提取柠檬皮渣中的柠檬苦素，产率高。考虑到本发明所用柠檬皮渣原料成本极低，因此分离出的产品毛利率较高，具有广阔商业应用前景。同时，本发明所涉及的相关提取方法简便可行，无需高值复杂仪器，相关操作人员无需经过专业培训，易于推广。
附图说明
图1为实施例三制备的柠檬苦素HPLC检测色谱图。
具体实施方式
下面通过非限定的实施例对本发明作进一步的阐述。但是应该理解，这些描述只是示例的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
为了充分公开本发明的一种从柠檬皮渣中提取柠檬苦素的方法，下面结合实例加以说明，但是本发明不仅限于此。
实施例一：
从某柠檬加工企业随机购买榨取柠檬汁废弃物——柠檬皮渣为原料，含水量(88.8±3.17)％，采取以下方法制备柠檬苦素：
(1)柠檬皮渣烘干、粉碎：将柠檬皮渣在40～45℃下加热以烘干水分，加热时间以柠檬皮渣水分含量降至20％为止。随后，用粉碎机对烘干后的皮渣进行研磨粉碎，用装配有100～120目筛网过滤机过滤后备用。
(2)酶解：制备固体复合酶，纯度99％以上的固体溶菌酶、固体纤维素酶、固体6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、固体木瓜蛋白酶、固体柠檬酸裂解酶和固体二磷酸酮糖裂合酶按质量比例为0.5：1.5：3：4：0.5：0.5进行混合，用质量为200倍的无菌蒸馏水溶解。
将步骤(1)中筛选好的柠檬皮渣粉末加入浓度小于10％的乙醇溶液，调节液料比至20:1～25:1，随后进行酶解。酶解条件为：复合酶添加量为柠檬皮渣粉末溶解于乙醇溶液后总质量的1.2％～1.5％，酶解温度为35～40℃，pH值5.5～6.0，酶解时间2～2.5h。酶解结束后过滤得到滤液转移到8000～14000截留分子量的透析袋中，置于体积2000倍以上的无菌蒸馏水中静置24h以脱去微量无机盐。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中制取的酶解液中在40℃下减压(0.02～0.03MPa)浓缩至原先体积10％～15％。
(4)胍盐离子液体双水相萃取：在步骤(3)中的浓缩液中加入浓缩液10倍体积的2.23～2.37mol/L的[BMG][BF4]溶液充分混匀，再加入浓缩液10倍体积1.8～2.0mol/L的KH2PO4溶液充分混匀，再加入质量分数1％～1.2％的2.0～2.1mol/L的KBr溶液；随后置于超声波振荡器中进行超声振荡，超声频率30kHz(功率180W)、温度40℃、时间1～1.5h；再用真空脱气机在0.04～0.06MPa的操作压强下脱气5～10min；最后，用0.5mol/L磷酸将溶液将提取溶液pH值调至3.7～4.0，在10～12℃下静置10～12h待提取溶液分层，下层为水相，上层为离子相，分离上层离子相备用。
(5)复合有机溶剂萃取：复合有机溶剂由用乙醇、环已烷、甲酸、丁烷、丙烷和乙酸乙酯组成，其比例为0.4:0.05:0.15:0.2:0.2:1.0。将步骤(4)中分离的离子液体相用10倍体积的复合有机溶剂进行萃取，分离上层有机相。
(6)减压蒸馏：将步骤(5)分离的上层有机相在40℃下减压(0.01～0.02MPa)蒸馏并浓缩至原先体积5％～10％。
(7)冷冻干燥：将步骤(6)中制取的浓缩液用冷冻干燥机在压强为10～50Pa和温度-50～-60℃的条件下，冷冻干燥时间12～16h以制取柠檬苦素粗粉末。
(8)纯化：将步骤(7)中制取的富含柠檬苦素的冻干粗粉末用体积浓度40％～50％的乙醇溶液溶解，用体积浓度20％～25％的醋酸调节pH至5.0～5.5。随后，在1～4℃、5000～10000rpm转速下离心得到上清液，用冷冻干燥机在压强为10～50Pa和温度-50～-60℃的条件下冷冻干燥时间8～10h以制取高纯度柠檬苦素粉末。
实施例二：
从某柠檬加工企业随机购买榨取柠檬汁废弃物——柠檬皮渣为原料，含水量(88.8±3.17)％，采取以下方法制备柠檬苦素：
(1)柠檬皮渣烘干、粉碎：将柠檬皮渣在40～45℃下加热以烘干水分，加热时间以柠檬皮渣水分含量降至20％为止。随后，用粉碎机对烘干后的皮渣进行研磨粉碎，用装配有100～120目筛网过滤机过滤后备用。
(2)酶解：制备固体复合酶，纯度99％以上的固体溶菌酶、固体纤维素酶、固体6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、固体木瓜蛋白酶、固体柠檬酸裂解酶和固体二磷酸酮糖裂合酶按质量比例为0.5：1.5：3：4：0.5：0.5进行混合，用质量为200倍的无菌蒸馏水溶解。
将步骤(1)中筛选好的柠檬皮渣粉末加入浓度小于10％的乙醇溶液，调节液料比至20:1～25:1，随后进行酶解。酶解条件为：复合酶添加量为柠檬皮渣粉末溶解于乙醇溶液后总质量的1.2％～1.5％，酶解温度为35～40℃，pH值5.5～6.0，酶解时间2～2.5h。酶解结束后过滤得到滤液转移到8000～14000截留分子量的透析袋中，置于体积2000倍以上的无菌蒸馏水中静置24h以脱去微量无机盐。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中制取的酶解液中在40℃下减压(0.02～0.03MPa)浓缩至原先体积10％～15％。
(4)胍盐离子液体双水相萃取：在步骤(3)中的浓缩液中加入20倍体积的1.7～2.1mol/L的[PHMG][PF6]溶液充分混匀，再加入浓缩液5倍体积0.9～1.0mol/L的K3PO4溶液充分混匀，再加入质量分数1％～1.2％的2.0～2.1mol/L的KBr溶液；随后置于超声波振荡器中进行超声振荡，超声频率70kHz(功率310W)、温度45℃、时间3～3.5h；再用真空脱气机在0.01～0.03MPa的操作压强下脱气20～25min；最后，用0.1mol/L磷酸将溶液将提取溶液pH值调至5.1～5.4，在10～12℃下静置10～12h待提取溶液分层，下层为水相，上层为离子相，分离上层离子相备用。
(5)复合有机溶剂萃取：复合有机溶剂由用乙醇、环已烷、甲酸、丁烷、丙烷和乙酸乙酯组成，其比例为0.3:0.2:0.2:0.1:0.1:1.1。将步骤(4)中分离的离子液体相用10倍体积的复合有机溶剂进行萃取，分离上层有机相。
(6)减压蒸馏：将步骤(5)分离的上层有机相在40℃下减压(0.01～0.02MPa)蒸馏并浓缩至原先体积5％～10％。
(7)冷冻干燥：将步骤(6)中制取的浓缩液用冷冻干燥机在压强为10～50Pa和温度-50～-60℃的条件下，冷冻干燥时间12～16h以制取柠檬苦素粗粉末。
(8)纯化：将步骤(7)中制取的富含柠檬苦素的冻干粗粉末用体积浓度40％～50％的乙醇溶液溶解，用体积浓度10％～15％的醋酸调节pH至5.0～5.5。随后，在1～4℃、5000～10000rpm转速下离心得到上清液，用冷冻干燥机在压强为10～50Pa和温度-50～-60℃的条件下冷冻干燥时间8～10h以制取高纯度柠檬苦素粉末。
实施例三：
从某柠檬加工企业随机购买榨取柠檬汁废弃物——柠檬皮渣为原料，含水量(88.8±3.17)％，采取以下方法制备柠檬苦素：
(1)柠檬皮渣烘干、粉碎：将柠檬皮渣在40～45℃下加热以烘干水分，加热时间以柠檬皮渣水分含量降至20％为止。随后，用粉碎机对烘干后的皮渣进行研磨粉碎，用装配有100～120目筛网过滤机过滤后备用。
(2)酶解：制备固体复合酶，纯度99％以上的固体溶菌酶、固体纤维素酶、固体6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、固体木瓜蛋白酶、固体柠檬酸裂解酶和固体二磷酸酮糖裂合酶按质量比例为0.5：1.5：3：4：0.5：0.5进行混合，用质量为200倍的无菌蒸馏水溶解。
将步骤(1)中筛选好的柠檬皮渣粉末加入浓度小于10％的乙醇溶液，调节液料比至20:1～25:1，随后进行酶解。酶解条件为：复合酶添加量为柠檬皮渣粉末溶解于乙醇溶液后总质量的1.2％～1.5％，酶解温度为35～40℃，pH值5.5～6.0，酶解时间2～2.5h。酶解结束后过滤得到滤液转移到8000～14000截留分子量的透析袋中，置于体积2000倍以上的无菌蒸馏水中静置24h以脱去微量无机盐。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中制取的酶解液中在40℃下减压(0.02～0.03MPa)浓缩至原先体积10～15％。
(4)胍盐离子液体双水相萃取：在步骤(3)中的浓缩液中加入20倍体积的0.7～1.0mol/L的[TMG][Cl]溶液充分混匀，再加入浓缩液10倍体积1.2～1.5mol/L的NaH2PO4溶液充分混匀，再加入质量分数1％～1.2％的1.2～1.4mol/L的KBr溶液；随后置于超声波振荡器中进行超声振荡，超声功率为50kHz(功率260W)、温度35℃、时间0.5～1h；再用真空脱气机在0.02～0.03MPa的操作压强下脱气10～20min；最后，用0.5mol/L磷酸将溶液将提取溶液pH值调至2.8～3.1，在10～12℃下静置10～12h待提取溶液分层，下层为水相，上层为离子相，分离上层离子相备用。
(5)复合有机溶剂萃取：复合有机溶剂由乙醇、环已烷、甲酸、丁烷、丙烷和乙酸乙酯组成，其比例为0.1:0.15:0.15:0.2:0.2:1.2。将步骤(4)中分离的离子液体相用10倍体积的复合有机溶剂进行萃取，分离上层有机相。
(6)减压蒸馏：将步骤(5)分离的上层有机相在40℃下减压(0.01～0.02MPa)蒸馏并浓缩至原先体积5％～10％。
(7)冷冻干燥：将步骤(6)中制取的浓缩液用冷冻干燥机在压强为10～50Pa和温度-50～-60℃的条件下，冷冻干燥时间12～16h以制取柠檬苦素粗粉末。
(8)纯化：将步骤(7)中制取的富含柠檬苦素的冻干粗粉末用体积浓度40％～50％的乙醇溶液溶解，用体积浓度30％～35％的醋酸调节pH至5.0～5.5。随后，在1～4℃、5000～10000rpm转速下离心得到上清液，用冷冻干燥机在压强为10～50Pa和温度-50～-60℃的条件下，冷冻干燥时间8～10h以制取高纯度柠檬苦素粉末。
依据本发明实施例三制备的柠檬苦素粉末100mg用1L甲醇溶解后，用液相色谱进行检测，其色谱图见图1。色谱柱为反相C18色谱柱；流动相A液为甲醇、B液为水，流速0.8mL/min；梯度洗脱，流动相中A液在40min内从0％线性增加至40％，A液在30min内从100％线性下降至60％；柱温35℃，检测波长为215nm。
由图可知，本专利提取的柠檬苦素粉末中杂质极少，柠檬苦素含量极高，经测定该粉末中柠檬苦素纯度达到91.2％。
以上这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明的记载的内容之后，技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。