本发明属于血液代用品制备技术领域，具体为一种双聚合血红蛋白的制备方法。尤其是一种制备平均分子量较低、分子量分布范围较窄且有效转化率较高、二聚体含量较少的双聚合血红蛋白的方法。
背景技术：
因为未经修饰的血红蛋白失去红细胞内2，3-二磷酸甘油酸调节，使血红蛋白氧亲和力升高，影响氧的释放，不能向组织有效地供氧；同时，未经修饰的血红蛋白在血浆中胶体渗透压高；以及未经修饰的血红蛋白由于无细胞膜的包被，四聚体在体内的循环半寿期仅为2～4小时，迅速分解成二聚体和单体并从肾脏滤过，形成血红蛋白尿，造成肾中毒等，因此，未经修饰的无基质血红蛋白不能直接应用于人体。鉴于以上原因，血红蛋白类载氧体(HBOCs)已经成为目前国际血液代用品研究领域的主流方向。
近几十年来，人们主要通过对血红蛋白进行聚合和五磷酸吡哆醛(PLP)修饰等方式来提高HBOCs制品的安全性和延长其在体内的作用时间。经过几十年的研究，该项领域的技术已取得了重大突破，美国、加拿大等国的部分血液制品已进行了Ⅲ期临床试验。但是，HBOCs在实验动物或者临床应用中暴露出诸多问题，如平均动脉压升高、血管阻力上升、微循环血流量减小、组织血氧不足和免疫原性增大等不良反应。引起此类血管性疾病和免疫方面问题的原因很多，分子量过大且分子量分布不均是其中的重要原因之一。
美国FDA在对Biopure公司聚合牛血红蛋白Ⅲ期临床实验的批文中明确要求要降低制品的平均分子量。因此，尽管目前对HBOCs制品的最佳分子量还没有统一的公认标准，但适当降低HBOCs制品的分子量已经成为研究学者们的共识。这与血浆代用品如羟乙基淀粉制品分子量从早期的480kD(美国杜邦公司的HESSPan)逐渐下降至200kD(HES)和130KD(Voluven)，即从高分子量逐渐向中分子量发展的趋势相吻合。
为了制备分子量较小、分子量分布均匀、聚合率较高、二聚体含量较低的HBOCs制品，本领域的技术人员已经付出非常多的努力和尝试，然而效果并不明显，或者较好的效果需要较高的成本和复杂的操作才能获得。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种双聚合血红蛋白的制备方法，通过本发明方法制备得到的双聚合血红蛋白平均分子量较低、有效转化率较高、二聚体含量较少，且方法简单、操作可控，可以满意地解决上述现有技术中存在的问题。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
一种双聚合血红蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)在惰性气体和搅拌条件下，将双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液缓慢滴加至无基质人脱氧血红蛋白水性液体中进行分子内交联反应，制得第一聚合制品；
2)将醛基型双功能交联剂送入步骤1)制备得到的第一聚合制品中，搅拌下进行分子间交联反应，制备得到双聚合血红蛋白。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，所述双聚合血红蛋白的平均分子量为130～250kD，优选为150～200kD。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，步骤1)中，所述搅拌速度为150～1000rpm；优选为600～950rpm。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，步骤1)中所述双阿司匹林与无基质人脱氧血红蛋白的摩尔比为3～6:1，优选为4～5:1；所述分子内交联反应的温度为20℃～37℃，时间为60～180min。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，步骤2)中，所述搅拌速度为250～1000rpm；优选为500～750rpm。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，步骤2)中，所述醛基型双功能交联剂与第一聚合制品的摩尔比为6～8:1，优选为7:1；所述分子间交联反应的温度为0℃～10℃，时间为30～150分钟。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，所述醛基型双功能交联剂为开环棉子糖、戊二醛中的一种，优选为戊二醛；所述醛基型双功能交联剂通过钛棒滤芯送入第一聚合制品中。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，所述双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液pH为8.0～10.0。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，所述无基质人脱氧血红蛋白水性液体中血红蛋白的重量含量为4～14％，优选为8～12％。
作为本发明所述一种双聚合血红蛋白的制备方法的一个具体实施例，所述无基质人脱氧血红蛋白来源于人外周血红蛋白或者人胎盘血血红蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明上述方法可制备得到平均分子量较低130～250kD，优选分子量为150～200kD的聚合血红蛋白产物，有效转化率可达到90.0％，二聚体含量低于9％。而且本发明制备方法操作简单，是解决戊二醛制备低平均分子量聚合血红蛋白聚合产物二聚体含量过高一种有效方式。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合具体制备过程及原理对本发明一种双聚合血红蛋白的制备方法进行详细解释说明。
一种双聚合血红蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)、在惰性气体和搅拌条件下，将双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液缓慢滴加至无基质人脱氧血红蛋白水性液体中进行分子内交联反应，制得第一聚合制品。
具体地，在惰性气体和搅拌条件下，将双阿司匹林(DBBF)的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)溶液缓慢的滴加至无基质人脱氧血红蛋白(即T态学血红蛋白)水性液体中，在20℃～37℃进行分子内交联反应，制得第一聚合制品。
所述惰性气体为氮气或者氩气。
DBBF属于血红蛋白分子分子内交联剂，其结构中存在两个相同的醛基基团，可与血红蛋白分子中的固定位点反应。当与氧合血红蛋白反应时，反应部位发生在血红蛋白的两个β链，而当与脱氧血红蛋白反应时，交联反应发生在血红蛋白的α链，因为在脱氧的状态下阻止了β链的82位Lys以及1位的Val的残基，只能在α的99位，并使得2，3-DPG的位点仍然可以反应，可以有效的提升分子内的交联，并能降低对氧的亲和力。该类产品以Baxter产品为代表，但是，由于其对NO的清除作用，会诱发高血压，并具有较高的死亡率。
进一步，步骤1)中，所述搅拌速度为150～1000rpm；优选为600～950rpm。所述双阿司匹林与无基质人脱氧血红蛋白的摩尔比为3～6:1，优选为4～5:1；所述分子内交联反应的温度为20℃～37℃，优选为25℃～35℃；时间为60～180min，优选为90～120min。
进一步，所述双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液pH为8.0～10.0，更进一步优选为8.5～9.0。血红蛋白在pH超过11.0的环境中，血红蛋白的较易发生变性，pH低于8.0，不利于双阿司匹林与人胎盘血红蛋白进行交联反应。
进一步，所述无基质人脱氧血红蛋白水性液体中血红蛋白的重量含量为4～14％，优选为8～12％。水性液体中的血红蛋白含量不宜过低，以避免在聚合反应过程中反应速度太慢，或者无法反应。而DBBF与血红蛋白反应属于定点修饰聚合反应，原料溶液中的血红蛋白含量过高一般不会产生超大分子。
进一步，所述无基质人脱氧血红蛋白来源于人外周血红蛋白或者人胎盘血血红蛋白。具体地，本发明所述的无基质人脱氧血红蛋白，可以采用中国专利CN1333296A的方法制备得到的包括由人外周血红蛋白(包括过期的血红蛋白)，人胎盘血血红蛋白，特别是由提取了干细胞后的人胎盘血等多种血液来源提取得到的相应血红蛋白。由于胎盘血的血红蛋白以HbF(α2γ2)为主，HbF氧亲和力高，可以携带更多的氧进入缺氧组织，而且胎盘血红细胞的含量高(比成人静脉血高出30～50％)，可以分离到更多的血红蛋白，而免疫原性又远低于成人外周血。因此以人胎盘血红蛋白为原料提取的血红蛋白不仅更为理想，也是开发利用人胎盘血的一种有价值的途径。本发明上述制备方法的原料，优选为人胎盘血血红蛋白。
另外，本发明所述的血红蛋白水性液体，优选采用以生理盐水与无基质人脱氧血红蛋白配制成的血红蛋白液体。此外，也可以由以超纯水或者PBS溶液等配置的血红蛋白液体作为原料。由于生理盐水可具有与血红蛋白在体内同样的离子浓度，有利于其功效的更好发挥，且廉价易得。
2)、将醛基型双功能交联剂送入步骤1)制备得到的第一聚合制品中，搅拌下进行分子间交联反应，制备得到双聚合血红蛋白。
具体地，经钛棒滤芯将醛基型双功能交联剂送入步骤1)制备的第一聚合制品中，搅拌下进行分子间交联反应，制得平均分子量为130～250kD的双聚合血红蛋白。
应当申明，本发明制备方法步骤2)依然在惰性气体环境下进行。且本发明所述的惰性气体优选为氮气或者氩气。
进一步，所述双聚合血红蛋白的平均分子量优选为150～200kD。
进一步，步骤2)中，所述搅拌速度为250～1000rpm；优选为500～750rpm。所述醛基型双功能交联剂与第一聚合制品的摩尔比为6～8:1，优选为7:1；所述分子间交联反应的温度为0℃～10℃，优选为2～6℃，时间为30～150min，优选为60～90min。
醛基型双功能交联剂，例如戊二醛是一种广谱同型双功能交联剂，其分子结构中含有两个相同活性的醛基基团，可与血红蛋白分子中的氨基发生共价键合作用形成Schiff氏碱，在空间位置较为接近的两个含氨基的氨基酸残基之间搭桥，形成血红蛋白分子内和分子间的交联。由于血红蛋白分子中含有44个氨基，而且戊二醛中的醛基与血红蛋白分子中的氨基具有很高的反应活性，因而使得血红蛋白的交联聚合是一个非常复杂而快速的反应过程。目前此类反应存在的一大技术难题是，如要求产率高(即有效转化率高)，则会使平均分子量过大，特别是超大分子产物的含量比例会增加，从而会导致制品保存不稳定，输用中也易于形成微血管流动不畅甚至栓塞。
进一步，所述醛基型双功能交联剂通过钛棒滤芯送入第一聚合制品中。用于送入交联剂的钛棒滤芯，是目前已有报道和/或使用的主要用于粗过滤的产品，在医药领域中已有很多的报道和使用(如CN1813746，CN1965816，CN202349500U等)。特别是其钛合金材料比较稳定，耐酸碱等腐蚀，不会影响血红蛋白及其它反应试剂的活性。由于钛棒的表面上有许多密集的小孔，交联剂通过这些无数的小孔被送入血红蛋白原料溶液中，是保证其能以更加迅速和均匀的方式分散到血红蛋白溶液中的重要条件。在配合相应的搅拌条件，是实现本发明制备平均分子量较低、且有效转化率较高的聚合血红蛋白产物的重要保证。
进一步地，所述醛基型双功能交联剂包括但不限于开环棉子糖和戊二醛，优选为戊二醛。当交联剂为戊二醛时，该交联聚合反应的复杂性和快速性是导致分子量易过大和分布不均匀的原因，也是其实际应用中的重要制约因素，而本发明将血红蛋白先做分子分子内交联处理，再利用钛棒滤芯加入双功能交联剂，并配合相应的搅拌，使交联剂能较迅速而均匀地在第一聚合制品血红蛋白溶液中分散，特别是在不影响搅拌和安全的情况下尽量靠近钛棒滤芯的附近进行搅拌(如采用转子型磁力搅拌器等)，并通过控制血红蛋白与交联剂的适当比例，可以将交联聚合反应的速度控制在较好的范围内，在使所得的双聚合血红蛋白产物平均分子量较小和有效转化率较高间，得到了满意的平衡，以简单的方式解决了目前制备方法周期长，步骤繁琐，成本高等问题。
本发明通过将无基质人脱氧血红蛋白先与DBBF进行分子分子内交联，再进行分子间交联制得双聚合血红蛋白，降低对NO的影响，缓解其诱发的高血压问题，另一方面先进行分子内交联后使血红蛋白与醛基型双功能交联剂的交联反应变得容易控制，反应产物平均分子量小、有效转化率高、特别是对于二聚体含量的控制起到重要作用，能使产品中二聚体含量降低到9.0％以下。先进行分子分子内交联制备第一聚合制品，再进行分子间交联制备得到的双聚合血红蛋白与直接将交联剂与血红蛋白反应制备得到的双聚合血红蛋白产品中二聚体含量降低20％以上。
根据本发明的发明人研究发现，影响本发明最终双聚合血红蛋白平均分子量和转化率的关键因素包括：步骤1)中DBBF与无基质人脱氧血红蛋白的摩尔比，以及反应的搅拌速度；步骤2)中醛基型双功能交联剂与第一聚合制品的摩尔比，以及反应的第一聚合制品的溶液浓度。
在加入DBBF或醛基型双功能交联剂的过程中，同时配合搅拌，通过使交联剂更均匀的分散，既可以控制反应速度，也有利于提高聚合产物分子量的均一性。因此，搅拌速度过慢无疑会减弱其应具有的这些有利作用。此外，血红蛋白是产物中具有生物学活性的重要和主要成分，为避免对其生物学活性造成过多不利影响(包括血红蛋白变性等)，过高的搅拌速度同样是应尽量避免的。
本申请将双阿司匹林和无基质人脱氧血红蛋白的摩尔比优选为3～6:1，过小则会导致二聚体含量增加，过大则会增加成本，降低氧的亲和力，影响产品质量。将醛基型双功能交联剂与第一聚合制品的摩尔比优选为6～8:1，当醛基型双功能交联剂的加入量低于6:1时，制备得到的产品中二聚体含量会增多，有效聚合率降低，当交联剂含量高于8:1时，制备得到的产品的超大分子含量过高，制品的平均分子量过高，产品质量不佳。
同时，为了更好的控制本发明方法获得双聚合血红蛋白的平均分子量和转化率，需要将两步反应的反应时间和温度进行严格的把控。
步骤1)的反应温度控制在20℃～37℃，更好的反应温度为25℃～35℃；反应时间一般为60～180min；更优选的聚合反应时间为90～120min。步骤2)的反应温度控制在0～10℃；更好的反应温度为2～6℃；反应时间一般可为30～150min；更优选的反应时间为60～90min。步骤2)反应温度过低，例如温度低于0℃时，血红蛋白溶液可能会凝固，无疑会影响反应的进行。但反应温度过高，尽管聚合反应是在惰性气体保护的环境中，但仍会增大已混入反应溶液的氧使血红蛋白转变为高铁血红蛋白而失去活性的速度和比例而带来不利。
本发明的所述方法在聚合反应完成后，可以通过采用加入硼氢化钠溶液(含1.56wt％硼氢化钠的0.001M/L的氢氧化钠溶液)，或目前已有报道和/或使用的其它适当方式终止反应，然后按常规方式进行后续的进一步处理。
本发明上述方法可制备得到平均分子量较低130～250kD，优选为150～220kD的聚合血红蛋白产物，有效转化率可达到90.0％(本发明中定义的有效转换率是指有效制品的占总制品百分比，其中制品包括超大分子，有效制品分子，二聚体)，二聚体含量低于9.0％，该方法操作简单，是解决戊二醛制备聚合血红蛋白聚合产物不均一缺陷的一种有效方式。
下面结合具体示例对本发明一种双聚合血红蛋白的制备方法进行进一步说明。示例1
本示例双聚合血红蛋白的制备过程如下：
1)在惰性气体氮气和搅拌条件下，将pH为9.0的双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液缓慢滴加至血红蛋白含量为6.0％(重量)的无基质人胎盘血血红蛋白水性液体中进行分子内交联反应，制得第一聚合制品。其中，搅拌速度为700rpm，双阿司匹林与人胎盘血红蛋与的摩尔比为4:1，分子内交联反应的温度为30℃，时间为100min。
2)在惰性气体氮气条件下，经钛棒滤芯将戊二醛送入上述步骤1)制备得到的第一聚合制品中(戊二醛与第一聚合制品的摩尔比为6:1)，搅拌速度为700rmp，温度为4℃的条件下进行分子间交联反应70min，并加入NaBH4溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。
本示例制备得到的双聚合血红蛋白的平均分子量为190kD，二聚体含量为8.7％整个反应的有效转化率为91.3％。
示例2
本示例双聚合血红蛋白的制备过程如下：
1)在惰性气体氮气和搅拌条件下，将pH为9.5的双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液缓慢滴加至血红蛋白含量为10％(重量)的无基质人胎盘血血红蛋白水性液体中进行分子内交联反应，制得第一聚合制品。其中，搅拌速度为900rpm，双阿司匹林与人胎盘血红蛋与的摩尔比为5:1，分子内交联反应的温度为28℃，时间为110min。
2)在惰性气体氮气条件下，经钛棒滤芯将戊二醛送入上述步骤1)制备得到的第一聚合制品中(戊二醛与第一聚合制品的摩尔比为8:1)，搅拌速度为600rmp，温度为6℃的条件下进行分子间交联反应80min，并加入NaBH4溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。
本示例制备得到的双聚合血红蛋白的平均分子量为220kD，二聚体含量为7.0％整个反应的有效转化率为93.0％。
示例3
本示例双聚合血红蛋白的制备过程如下：
1)在惰性气体氮气和搅拌条件下，将pH为9.0的双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液缓慢滴加至血红蛋白含量为9.0％(重量)的无基质人胎盘血血红蛋白水性液体中进行分子内交联反应，制得第一聚合制品。其中，搅拌速度为900rpm，双阿司匹林与人胎盘血红蛋与的摩尔比为3:1，分子内交联反应的温度为30℃，时间为90min。
2)在惰性气体氮气条件下，经钛棒滤芯将开环棉子糖与送入上述步骤1)制备得到的第一聚合制品中(开环棉子糖与与第一聚合制品的摩尔比为7:1)，搅拌速度为700rmp，温度为4℃的条件下进行分子间交联反应70min，并加入NaBH4溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。
本示例制备得到的双聚合血红蛋白的平均分子量为200kD，二聚体含量为10.0％，整个反应的有效转化率为90.0％。
示例4
本示例双聚合血红蛋白的制备过程如下：
1)在惰性气体氮气和搅拌条件下，将pH为10.0的双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液缓慢滴加至血红蛋白含量为14％(重量)的无基质人胎盘血血红蛋白水性液体中进行分子内交联反应，制得第一聚合制品。其中，搅拌速度为900rpm，双阿司匹林与人胎盘血血红蛋与的摩尔比为5:1，分子内交联反应的温度为35℃，时间为60min。
2)在惰性气体氮气条件下，经钛棒滤芯将开环棉子糖送入上述步骤1)制备得到的第一聚合制品中(开环棉子糖与第一聚合制品的摩尔比为6:1)，搅拌速度为700rmp，温度为6℃的条件下进行分子间交联反应80min，并加入NaBH4溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。
本示例制备得到的双聚合血红蛋白的平均分子量为200kD，二聚体含量为8.5％，整个反应的有效转化率为90.5％，超大分子未超过1.0％。
对比例1
本示例双聚合血红蛋白的制备过程如下：
1)在惰性气体氩气和搅拌条件下，将pH为8.0的双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液缓慢滴加至血红蛋白含量为9％(重量)的无基质人胎盘血血红蛋白水性液体中进行分子内交联反应，制得第一聚合制品。其中，搅拌速度为600rpm，双阿司匹林与人胎盘血血红蛋的摩尔比为3:1，分子内交联反应的温度为25℃，时间为120min。
2)在惰性气体氩气条件下，经钛棒滤芯将戊二醛送入上述步骤1)制备得到的第一聚合制品中(戊二醛与第一聚合制品的摩尔比为5:1)，搅拌速度为600rmp，温度为8℃的条件下进行分子间交联反应60min，并加入NaBH4溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。
本示例制备得到的双聚合血红蛋白的平均分子量为170kD，二聚体含量为16.3％，整个反应的有效转化率为83.7％。
对比例2
本示例双聚合血红蛋白的制备过程如下：
1)在惰性气体氩气和搅拌条件下，将pH为8.5的双阿司匹林的二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷溶液缓慢滴加至血红蛋白含量为12.0％(重量)的无基质人胎盘血血红蛋白水性液体中进行分子内交联反应，制得第一聚合制品。其中，搅拌速度为900rpm，双阿司匹林与人胎盘血红蛋与的摩尔比为2:1，分子内交联反应的温度为35℃，时间为60min。
2)在惰性气体氩气条件下，经钛棒滤芯将戊二醛送入上述步骤1)制备得到的第一聚合制品中(戊二醛与第一聚合制品的摩尔比为4:1)，搅拌速度为550rmp，温度为4℃的条件下进行分子间交联反应120min，并加入NaBH4溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。
本示例制备得到的双聚合血红蛋白的平均分子量为150kD，二聚体含量为27.5％，整个反应的有效转化率为72.5％。
对比例3
本对比例采用单纯的戊二醛与血红蛋白聚合反应
量取4℃的100ml游离的血红蛋白浓度为6.0％的无基质人胎盘血血红蛋白液体，加入到150ml的已经充满N2的置于冰浴中的抽滤瓶中，通氮大约30min，使血红蛋白处于脱氧状态；将装有血红蛋白的抽滤瓶放置于磁力搅拌器上方，搅拌速度为700rpm，继续通氮20min，以通过钛棒加样的方式加入戊二醛，使得戊二醛与血红蛋白的摩尔比为6:1，70min取样，并加入NaBH4溶液，待无气泡产生后，密封，放入4℃的冰箱内，待检测。
本对比例制备得到的聚合血红蛋白的平均分子量为170kD，二聚体含量为40％，有效转化率为57％，超大分子为3.0％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。