专利名称：一种纯化血红蛋白的方法
技术领域：
本发明属于蛋白质分离纯化领域，尤其涉及一种采用扩张床吸附技术从动物的血红细胞裂解液中直接纯化血红蛋白的方法。
背景技术：
人血液代用品是国际科学界及企业界关注的研究热点和难点，世界各主要发达国家都将其列入跨世纪的重大项目。尤其近二十年，对天然血液供应安全性的焦虑以及预期的高回报潜力激起了人们对开发血液代用品的极大兴趣。目前所研究的人血液代用品可大致分为三大类全氟碳化合物，基于血红蛋白的血液代用品和通过血型转换而成的红细胞。其中由于全氟碳化合物不具备天然血红蛋白的生物学载氧特性，其研究与开发已不再是重点；通过血型转换成的红细胞具有贮存期短、不易运输等缺点，其研究与应用也受到极大的限制；基于血红蛋白的血液代用品由于具有天然血红蛋白的载氧、运输CO2和调节血液pH的功能，倍受研究人员关注，成为血液代用品研究的重点。
血红蛋白(Hb)存在于血红细胞中，血红细胞破裂可得到血红蛋白溶液。血液代用品的临床用量较大，其溶液中所残留的微量杂蛋白可能在患者体内形成抗体，并引发免疫反应。因此要尽量清除各种杂蛋白及其他杂质，产品纯度要求达到几乎100％。所以，高效分离纯化工艺是基于血红蛋白的血液代用品产业化的关键技术之一。
文献中已有的血红蛋白分离方法包括离心、透析、吸附等方法，都涉及两个以上步骤，其中至少有一步固液分离，即分离红细胞碎片和血红蛋白。1993年Shorr发展的膜过滤一层析法是迄今报道的制备血红蛋白的较好方法(Shorr，R.G.Process for hemoglobin extractionand purification.US Patent 5,264,555.1993.)。但该法具有膜污染和浓度极化问题，且膜分离过程耗时较长，从而增加了成本和污染的机会。目前，血红蛋白的分离纯化技术大都只适合实验室或小规模制备，因此有必要开发新的高效大规模制备血红蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简捷、高效的从人或动物新鲜血红细胞中大规模分离纯化血红蛋白的方法。
本发明提供的利用扩张床吸附技术(也称膨胀床吸附技术)从动物的血红细胞裂解液中直接纯化血红蛋白的方法包括如下步骤(如图1所示)1)床层平衡用pH值为5.0～8.0的平衡液缓冲液以2～5cm/min-1的线流速自下而上平衡扩张床吸附介质，直至扩张床层稳定；2)进料吸附将红细胞裂解液pH值调成5.0～8.0，以2～5cm/min-1的线流速自下而上进料，进料过程中注意保持适当高度和空隙率；3)淋洗进料完毕后，保持床层扩张状态，用pH值为5.0～8.0的平衡液缓冲液以2～5cm·min-1的线流速自下而上洗去滞留在床层中未结合的蛋白、细胞碎片等杂质和其它与介质结合不牢的物质；4)改变pH值洗脱将床层改为固定床操作，用pH值为6.0-8.0的平衡缓冲液以2～5cm·min-1的线流速自上而下流过床层，收集样品。
整个纯化过程控制在2～20℃。
所述的扩张床吸附介质为粒径分布在50～300μm之间的阳离子交换介质或金属亲和层析介质。优选离子交换介质为Sepharose BigBeads(Amersham Bioscience Biotech)、Spherosil(Biosepra.Inc)、Streamline SP(Amersham Bioscience Biotech)。金属亲和层析介质优选为固定了二价金属的亲和层析介质；进一步优选固定了Cu2+、Zn2+、或Ni2+等金属离子的亲和层析介质。金属亲和层析介质优选STREAMLINE介质(Pharmcia公司)。
优选在步骤4)之后还可进一步包括步骤5)高盐洗脱和步骤6)介质再生5)高盐洗脱用含有0.5～1.5mol/L-1钠盐的平衡缓冲液自上而下继续洗脱与介质结合较牢的物质；6)介质再生用5～10倍扩张床体积的0.01～0.5mol/L-1碱溶液，优选为NaOH溶液冲洗介质。
优选平衡缓冲液可以是PBS(K2HPO4/NaH2PO4)，巴比妥钠-盐酸，乙酸-乙酸钠缓冲液等；优选平衡缓冲液的盐浓度为10～80mmol/L-1。
优选步骤5)中的钠盐为NaCl或Na2SO4。
所述的血红细胞裂解液来源于人或牛、猪、羊等动物的新鲜血液，得到的血红细胞裂解液直接用于纯化血红蛋白。
本发明提供的直接从红细胞提取纯化血红蛋白的新方法，其特征在于裂解红细胞后，不经过离心、过滤或其它膜分离过程除细胞碎片，而直接采用扩张床吸附技术，以自下而上的进料方式使层析介质膨胀扩张，这不同于现有的吸附技术纯化血红蛋白。现有的吸附采用自上而下的进料方式，固体吸附介质压积在一起，不能直接用于吸附带固体的料液。本发明采用自下而上的进料方式，使吸附介质处于悬浮状态，颗粒之间存在较大空隙，使得料液中的固体能够通过。因此利用本发明，能够将含有细胞碎片、杂蛋白、血红蛋白的红细胞裂解液直接引入吸附柱，细胞碎片、杂蛋白直接通过，血红蛋白被介质吸附，实现从人或牛、猪、羊等动物的血红细胞裂解液中直接纯化血红蛋白。
实验证明，该技术省去离心去除碎片步骤，有效地控制了纯化过程中无载氧能力的高铁血红蛋白的生成，仅需一步操作，产品纯度达电泳纯，高铁血红蛋白含量不高于5.4％，与现有的较理想的膜过滤一层析纯化方法相比，扩张床吸附法操作时间短，提取收率高，产品活性损失小，是一种简捷、高效、适合工业化生产的天然血红蛋白制备方法。Shorr等人的膜过滤-层析法和本发明扩张床纯化血红蛋白的比较见表1。
表1
图1为扩张床吸附纯化血红蛋白流程2为Streamline SP扩张床纯化牛血红蛋白的洗脱图谱图3为纯化后血红蛋白的高效凝胶过滤色谱4为不同方法制备的血红蛋白的SDS-PAGE图谱其中的1表示电泳的样品是经扩张床纯化后的血红蛋白2，3表示电泳的样品是采用Shorr方法纯化得到的血红蛋白4表示电泳的样品为标准分子量蛋白图5 Streamline SP介质在扩张床中动态吸附容量测定层析图谱具体实施方式
实施例1(1)样品处理0.9％NaCl洗净的堆积牛红细胞1ml，按红细胞∶蒸馏水＝1∶29(体积比)的比例混合，置冰箱中在4℃条件下用磁力搅拌器缓慢搅拌30min，此时红细胞迅速溶胀以至破裂，胞内血红蛋白释放到溶液中，得到红细胞裂解液，溶液经Benesch等(Benesch，R.E.，Benesch.R.and Yung，Suzanna..Equationsfor the spectrophotometric analysis of hemoglobin mixture，Analytical Biochemistry.1973，55245-248)建立的多波长法检测，Hb浓度为8.0mg/ml-1。
(2)床层平衡用250ml平衡缓冲液40mmol/L-1PBS(K2HPO4/NaH2PO4，pH6.0)自下而上平衡扩张床介质，选用的扩张床介质为Streamline SP(Amersham Bioscience Biotech公司)，进料流速为3.5cm/min-1，使其形成稳定的扩张床。
(3)进料吸附取8.0mg/ml-1步骤(1)得到的红细胞裂解液5ml，调pH为6.0，以3.5cm/min-1的流速自下而上进料，血红蛋白吸附到扩张床介质上。
(4)淋洗用同样的PBS缓冲液淋洗，以3.5cm/min-1的流速自下而上淋洗，除去滞留在床层中未结合的蛋白、细胞碎片及其它与介质结合不牢的杂质，监测流出液的280nm紫外吸收值，淋洗至该波长无紫外吸收且不再变化。
(5)改变pH值洗脱调节PBS平衡缓冲液pH值为7.0，以3.5cm/min-1
的流速自上而下进行洗脱，收集血红蛋白峰即为最终纯品(图2)；35min后血红蛋白峰回落，基线走平。
整个操作过程温度为20℃。
经Streamline SP扩张床纯化的洗脱图谱见图2。对样品的监测是采用280nm，此时血红蛋白和脂类均有很强的吸收，收集峰后从其吸收光谱和电泳后的结果可知A峰为血红蛋白；经吸收光谱和考马斯亮蓝法检测可知B为非蛋白组分，初步判断为脂类(细胞破裂过程中，大量的脂类会从细胞膜上游离出来)，C为含量很低的杂蛋白峰。
纯化后的A峰血红蛋白用高效凝胶过滤色谱柱AlltechMacrosphrer GPC300检测，凝胶介质颗粒尺寸为7μm，柱尺寸为250×4.5mm；流动相为19mmol/L-1Tris-HCl(含75mmol/L-1NaCl，pH8.0)；进样量50μl，流速0.2ml/min-1，检测波长416nm，从检测结果图3可知血红蛋白为单峰。
从图4可知，血红蛋白峰(A)经SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有一条在16KD的带，即产品达到电泳纯。图4中的第2，3条电泳带是采用Shorr方法纯化得到的血红蛋白，电泳结果均有杂蛋白。可见本发明的纯化效果好于Shorr所报道的方法。根据Benesch建立的血红蛋白测定方法，计算出上样前的血红蛋白总量，用完全收集洗脱下来的血红蛋白样品，测定出血红蛋白含量，再除以上样前的血红蛋白量即得回收率，经计算得血红蛋白的回收率为94％。经Benesch的多波长法对无载氧活性的高铁血红蛋白的浓度进行测定，最终产品高铁血红蛋白含量仅为5.4％。
实施例2(1)样品处理经0.9％NaCl洗净的堆积人红细胞1ml，按红细胞∶蒸馏水＝1∶29(体积比)的比例混合，置冰箱中在4℃条件下用磁力搅拌器缓慢搅拌30min，此时红细胞迅速溶胀以至破裂，胞内血红蛋白释放到溶液中。
(2)床层平衡用3倍柱体积的平衡缓冲液(10mmol/L-1巴比妥钠-盐酸，pH6.9)自下而上平衡扩张床介质，选用的扩张床介质为Spherosil，进料线流速2cm/min-1，使其形成稳定的扩张床。
(3)进料吸附取8.0mg/ml-1步骤(1)得到的红细胞裂解液10ml，
调pH为5.0，以相同的流速2cm/min-1自下而上进料吸附到扩张床。
(4)淋洗然后用同样的缓冲液淋洗，以流速2cm/min-1，除去滞留在床层中未结合的蛋白、细胞碎片及其它与介质结合不牢的杂质，监测流出液的280nm紫外吸收值，淋洗至该波长无紫外吸收且不再变化。
(5)改变pH值洗脱调节缓冲液pH值为8.0，在2℃下以流速2cm/min-1，自上而下进行洗脱，收集血红蛋白峰即为最终纯品，直至血红蛋白峰回落，基线走平。
(6)高盐洗脱用含有1.0 mol/L-1NaCl的平衡缓冲液pH6.9洗脱与介质结合较牢固的杂质。
(7)介质再生步骤(5)之后还可进一步包括步骤(6)介质再生用5～10倍扩张床体积的0.1～1mol/L-1碱溶液，优选为NaOH溶液冲洗介质。
整个操作过程温度为2℃。
纯化后的血红蛋白产品达到电泳纯，回收率为88％，高铁血红蛋白含量仅为4.5％。
实施例3(1)样品处理经0.9％NaCl洗净的堆积猪红细胞1ml，按红细胞∶蒸馏水＝1∶29(体积比)的比例混合，置冰箱中在4℃条件下用磁力搅拌器缓慢搅拌30min，此时红细胞迅速溶胀以至破裂，胞内血红蛋白释放到溶液中。
(2)床层平衡用3倍柱体积的平衡缓冲液(80mmol/L-1乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.0)自下而上平衡扩张床介质，选用的扩张床介质为Streamline SP，进料流速5cm/min-1，使其形成稳定的扩张床。
(3)进料吸附取8.0mg/ml-1步骤(1)得到的红细胞裂解液5ml，调pH为8.0，以相同的流速自下而上进料。
(4)淋洗然后用同样的平衡缓冲液淋洗，除去滞留在床层中未结合的蛋白、细胞碎片及其它与介质结合不牢的杂质，监测流出液的280nm紫外吸收值，淋洗至该波长无紫外吸收且不再变化。
(5)改变pH值洗脱调节平衡缓冲液pH值为7.2，以流速5cm/min-1自上而下进行洗脱，收集血红蛋白峰即为最终纯品，直至血红蛋白峰回落，基线走平。
(6)高盐洗脱改换含有1.5mol/L-1NaCl的平衡洗脱液pH5.0，洗脱与介质结合较牢固的杂质。
整个操作过程温度为10℃。
纯化后的血红蛋白达到电泳纯，回收率达94％，高铁血红蛋白含量仅为4.9％。
实施例4(1)样品处理经0.9％NaCl洗净的堆积羊红细胞1ml，按红细胞∶蒸馏水＝1∶29(体积比)的比例混合，置冰箱中在4℃条件下用磁力搅拌器缓慢搅拌30min，此时红细胞迅速溶胀以至破裂，胞内血红蛋白释放到溶液中。
(2)床层平衡用3倍柱体积的平衡缓冲液(100mmol/L-1磷酸钠缓冲液，pH8.0)自下而上平衡扩张床介质，选用的扩张床介质为固定有Zn2+的STREAMLINE，进料流速5cm/min-1，使其形成稳定的扩张床。
(3)进料吸附取8.0mg/ml-1步骤(1)得到的红细胞裂解液5ml，调pH为7.0，以相同的流速自下而上进料。
(4)淋洗然后用同样的缓冲液淋洗，除去滞留在床层中未结合的蛋白、细胞碎片及其它与介质结合不牢的杂质，监测流出液的280nm紫外吸收值，淋洗至该波长无紫外吸收且不再变化。
(5)改变pH值洗脱调节缓冲液pH值为6.0，以流速5cm/min-1自上而下进行洗脱，收集血红蛋白峰即为最终纯品，直至血红蛋白峰回落，基线走平。
(6)高盐洗脱改换洗脱液为含有1.0mol/L-1NaCl的平衡缓冲液pH8.0，洗脱与介质结合较牢固的杂质。
(7)层析柱的再生洗脱完毕后，用30mmol/L-1EDTA洗下金属离子，用0.5mol/L-1NaOH洗脱，待记录走到基线时，用1倍体积0.5mol/L-1HCl清洗，用去离子水洗至流出液pH5.5左右时，用2倍床层体积0.2mol/L-1ZnSO4自上而下过柱，便可再生STREAMLINE介质。
整个操作过程温度为15℃。
纯化后的血红蛋白达到电泳纯，回收率达95％，高铁血红蛋白含量仅为3.6％。
实施例5介质在扩张床操作条件下从牛红血细胞裂解液中吸附血红蛋白的动态吸附容量的测定如图5所示，其中A为透过峰，B为洗脱峰。床层平衡、进料、淋洗条件与实施例1相同，但是进料采用的样品是纯度为99.9％的天然血红蛋白溶液(Sigma公司)，浓度为8.0mg/ml-1，pH6.0，进料流速3.5cm/min-1；40分钟后采用高盐液洗脱20mmol/L-1PBS加1.0mol/L-1NaCl，pH6.0。收集整个洗脱峰，经计算得在扩张床吸附中介质的动态吸附容量为70～75mg血红蛋白/ml湿吸附介质，说明本发明方法已达到制备级层析的要求，可用于工业上高效大规模制备血红蛋白。
权利要求
1.一种纯化血红蛋白的方法，包括如下步骤(1)床层平衡用pH值为5.0～8.0的平衡液缓冲液以2～5cm/min-1的线流速自下而上平衡扩张床吸附介质，直至扩张床层稳定后；其中扩张床吸附介质为粒径分布在50～300μm之间的阳离子交换介质或金属亲和层析介质；(2)进料吸附将红细胞裂解液pH值调成5.0～8.0，以2～5cm/min-1的线流速自下而上进料，进料过程中注意保持适当高度和空隙率；(3)淋洗进料完毕后，保持床层扩张状态，用pH值为5.0～8.0的平衡液缓冲液以2～5cm/min-1的线流速自下而上洗去滞留在床层中未结合的蛋白、细胞碎片等杂质和其它与介质结合不牢的物质；(4)改变pH值洗脱将床层改为固定床操作，在2～20℃温度情况下，用pH值为6.0-8.0的平衡缓冲液以2～5cm/min-1的线流速自上而下流过床层，收集样品，整个纯化过程控制在2-20℃。
2.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于步骤4)之后包括5)高盐洗脱用含有0.5～1.5mol/L-1钠盐的平衡缓冲液自上而下继续洗脱与介质结合较牢的物质；6)介质再生用5～10倍扩张床体积的0.01～0.5mol/L-1碱溶液，优选为NaOH溶液冲洗介质。
3.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述的平衡缓冲液可以是PBS，巴比妥钠-盐酸或乙酸-乙酸钠缓冲液。
4.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述的平衡缓冲液盐浓度为10～80mmol/L-1。
5.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述的金属亲和层析介质优选为固定了二价金属的亲和层析介质。
6.如权利要求5所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于所述的二价金属为Cu2+、Zn2+、或Ni2+。
7.如权利要求1所述的纯化血红蛋白的方法，其特征在于血红细胞裂解液来源于人或牛、猪、羊的血液。
全文摘要
本发明提供了一种纯化血红蛋白的方法。本方法采用扩张床吸附技术，以自下而上的进料方式使层析介质膨胀扩张，细胞碎片、杂蛋白等杂质直接通过床层，血红蛋白被介质吸附，实现从人或牛、猪、羊等动物的血红细胞裂解液中直接纯化血红蛋白。该技术省去离心或过滤去除碎片步骤，仅一步操作产品即达电泳纯，操作时间短，提取收率高，产品活性损失小，是一种简捷、高效、适合工业化生产的天然血红蛋白制备方法。
文档编号C07K14/805GK1491964SQ0214591
公开日2004年4月28日 申请日期2002年10月23日 优先权日2002年10月23日
发明者苏志国, 路秀玲, 金业涛, 赵东旭 申请人:中国科学院过程工程研究所