与番茄雄性不育基因紧密连锁的SNP分子标记及其获得方法和应用与流程

本发明属于生物遗传育种技术领域，具体公开一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp分子标记及其获得方法和应用。

背景技术：

杂种优势是生物界的普遍现象，是改良作物、大幅度提高产量的重要途径。从20世纪初开始，在各种作物中已先后发现了雄性不育现象，并且在生产上利用雄性不育生产杂交种。在一些作物中，如玉米、高粱、水稻等作物上已经取得了较大成就。番茄是自花授粉作物，杂种优势十分明显，杂交种比普通品种增产20％-30％以上，而且整齐度高，抗逆性强。随着番茄高产、优质、抗逆等多目标育种难度的增加，利用杂种互补效应实现番茄产量、品质、抗性等性状的同步突破，已成为番茄育种研究的一个重要发展方向。由于目前番茄雄性不育系利用上尚存在一定困难，生产上大面积推广的杂交种，仍然以人工去雄为主，制种成本过高已成为番茄杂种优势利用的主要限制因素之一。因此，杂种番茄的大规模推广利用仍有待于高效率、低投入的制种方法突破。

由于生物的遗传多样性，研究人员一直在不懈努力寻找个体及群落之间的差异，从而为能更好的解读遗传的复杂过程和本质。遗传标记(geneticmarkers)是指与目标性状紧密连锁，同该性状共同分离且易于识别的可遗传的等位基因变异。遗传标记的发展从形态学、细胞学、生物化学到目前研究中常用的dna分子标记，历经了从表型到微观分子水平的发展过程。snp(singlenucleotidepolymorphism)，即为单核苷酸多态性，是继rflp、ssr之后新的分子标记技术。通常呈双等位基因多态性，一般有2个等位基因和3种基因型，又称为双等位基因标记(biallelicmarker)。并根据多态性，可绘制出插入或缺失的遗传图谱，同时也可通过分析pcr产物大小，来有效鉴别各个体的基因型。

目前，在番茄中已经开发出来的分子标记已经超过2300个，为构建高密度的分子遗传图谱提供了重要保障。但由于分子标记技术使用成本较高、不易操作、很难获得有效地分子标记，虽然分子标记辅助选择被认为是作物改良中表型选择最有效的替代手段，在寻找与性状连锁的分子标记方面也投入了巨大的资金，但是至今为止分子标记辅助选择还没有被作为一个常规程序应用到大多数番茄育种项目中。因此，在进行番茄分子标记开发的时候，要力争获得信息量大、操作简单和使用成本低的分子标记。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的实际问题，本申请提供并揭示了一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp位点及分子标记，并提供了一种操作简单，成本低廉的获取该特异性dna片段的方法，从而深刻的打开了该分子标记开发利用的应用场景和想象空间，为基于图谱克隆基因的实际应用奠定了基础。

技术方案：一、一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp分子标记，其具有seqidno.3所示的序列。

进一步，确定snp223位点，seqidno.3所示的序列中第144位snp位点n＝a或t，定义为snp223，基因型为a/a纯合、t/t纯合或a/t杂合，其中当n＝a时，该分子标记为不育的特异性dna片段；当n＝t时，该分子标记为可育的特异性dna片段。

二、用于扩增所述snp分子标记的特异性引物对，包括其具有上游引物序列如seqidno.1和下游引物序列seqidno.2所示。利用在线软件primer3在该snp223位点的两端设计特异性扩增引物：上游引物：5’-ggtgatggcgtcagtgatta-3’；下游引物5’-aatggaattccccagtaccc-3’，所述分子标记的扩增产物为335bp。

三、一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp分子标记的获取方法，以雄性不育系by-17为母本(原编号为2-031，从番茄遗传中心引进，这是个开放的机构，一般普通研究人员均可申请引进材料)，以雄性可育系ky-113为父本(原编号为la0012，也是从番茄遗传中心引进)，构建30×30f2群体的dna池；通过简化基因组测序，检测不育亲本、可育亲本、不育池和可育池基因组间特定位置的特异性dna片段，筛选存在snp位点多态性的特异性dna片段；通过关联分析，获得与番茄雄性不育基因相关联的snp223位点；利用snp223位点所在的特异性dna片段，设计snp分子标记的特异性引物对，获得与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp223分子标记。

四、一种与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp分子标记的应用，该snp分子标记可应用于番茄雄性不育品系的辅助选择育种。

五、一种检测与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp223位点的试剂盒，含有上述特异性引物对。

上述试剂盒采用pcr方法进行检测，其20μl反应体系为：

进一步，所述试剂盒采用pcr方法进行检测，其20μl反应体系最佳方案为：

上述试剂盒中pcr扩增工作程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。进一步，试剂盒中所述最佳退火温度为55℃。

本发明的积极性效果及应用如下：

1、本发明使用的pcr扩增及测序体系，不需要特殊的pcr和测序仪器，普通的实验室均能达到要求；2、本发明获得与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp位点及标记，是在对番茄雄性不育种质by-17、可育种质ky-113及其f2遗传群体分析而获得的新标记，该标记与雄性不育基因紧密连锁，pcr扩增重复性好，稳定性强，可以用于番茄雄性不育品种鉴定和番茄雄性不育后代的分子辅助选择，进而加快雄性不育品种的育种进程；3、为克隆番茄雄性不育基因、基因序列分析以及转雄性不育基因的番茄研究奠定了良好的基础。

附图说明

附图1显示在番茄第2条染色体上多态性snp位点(定义为snp223)在不育亲本、可育亲本、不育基因池及可育基因池间snp拟合值分布图，其中，图中曲线(2)表示最大拟合值，图中直线(1)表示最大拟合值99％的阈值线，图中曲线(4)表示snp拟合值，图中直线(3)表示snp拟合值99％的阈值线；筛选拟合值同时在两个阈值以上的标记位点为多态性标记位点；附图2显示snp223特异引物的扩增序列及突变位点；“wild”为可育的扩增序列；“mutant”为不育的扩增序列。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp位点获得及标记开发的方法，包括以下步骤：

(1)以番茄雄性不育系by-17为母本(原编号为2-031，从番茄遗传中心引进，这是个开放的机构，一般普通研究人员均可申请引进材料)，以雄性可育系ky-113为父本(原编号为la0012，也是从番茄遗传中心引进)，构建f2遗传群体；

(2)待到番茄开花期分别提取30株f2代雄性不育单株和30株f2代雄性可育单株的基因组dna，建成雄性不育基因池和雄性可育基因池，同时提取父母本的基因组dna，建立父母本基因池；

(3)利用酶切位点预测软件对参考基因组进行系统分析，主要根据基因组大小、gc含量、重复序列比例和基因结构特点等信息，设计候选酶切方案，保证分子标记在全基因组范围内开发的密度及均匀性。本发明采取rsai限制性内切酶，酶切片段的长度范围为414-464bp。将处理好的样品进行精确定量，然后连接测序接头在芯片表面进行pcr，使dna片段扩增为单分子簇。单分子dna簇完成后开始测序；

(4)对测序获得的简化基因组dna片段(seqidno.3)标签，依据等位基因数和基因型序列之间的差异性进行多态性分析。当基因型数高于物种等位基因数时，判断该标签为重复序列；当基因型数为1或样品间基因型无差异则该dna片段标签无多态性；基因型序列间存在差异snp位点(seqidno.3中第144位)的标签为多态性snp分子标记；

(5)将多态性的snp分子标记在不育、可育基因池间，不育、可育亲本间进行关联分析，发现有1个snp位点(seqidno.3中第144位)在不育基因型和可育基因型间存在着显著的关联，不育基因型的snp位点为脱氧核苷酸a，可育基因型的snp位点为脱氧核苷酸t，将该snp位点标记为snp223；

(6)根据此snp223位点所在的dna片段，设计特异性引物：上游引物：5’-ggtgatggcgtcagtgatta-3’；下游引物5’-aatggaattccccagtaccc-3’。使用该引物扩增雄性不育亲本、雄性可育亲本以及它们的60个f2遗传群体，再将每个扩增产物进行测序，统计snp223位点的基因型，经连锁性鉴定，发现该标记与番茄雄性不育基因紧密连锁。

实施例2、与番茄雄性不育基因紧密连锁snp位点及标记的检测和鉴定

以番茄雄性不育系by-17为母本，以雄性可育系ky-113为父本进行杂交，再将f1代自交产生f2代，以f2代群体为对象，利用分子标记snp223的特异引物扩增每个单株的基因组dna，再将扩增产物测序，检测snp223位点的基因型，就可以在幼苗期判断该单株是否为雄性不育株。

鉴定番茄雄性不育的方法包括使用特异性引物：上游引物：5’-ggtgatggcgtcagtgatta-3’；下游引物5’-aatggaattccccagtaccc-3’进行扩增的步骤。将扩增产物进行测序，检测snp223位点的基因型。

实施例3、根据多态性snp位点开发snp分子标记，并计算snp标记与雄性不育基因的连锁距离，其方法是：

(1)利用简化基因组测序在雄性不育亲本、雄性可育亲本、雄性不育基因池、雄性可育基因池中进行特异dna片段上snp位点的多态性分析；

(2)通过关联分析获得与雄性不育基因显著关联的snp位点snp223，snp223位点的基因型为a/a纯合、t/t纯合或a/t杂合；

(3)利用snp223位点所在的dna片段序列，设计特异性引物，获得snp223分子标记；

(3)snp223分子标记的连锁性分析：对不育亲本与可育亲本获得的f2单株在开花期进行田间鉴定，调查f2单株的育性，分别提取单株dna，用snp223引物进行单株pcr扩增，扩增产物进行测序，统计不育、可育单株snp223多态性位点的出现频率和交换类型并计算交换值，计算标记与雄性不育基因之间的遗传距离。

实施例4、snp分子标记的连锁性鉴定：在60个f2遗传群体中，通过花期鉴定不育单株为14株，可育单株为46株；再利用snp223标记的特异引物扩增每个单株的基因组dna，将扩增产物进行测序，结果发现：不育的14株单株，其snp223位点的基因型均为a/a纯合型；可育的46株单株中，其中16株snp223位点的基因型为t/t纯合型，剩余30株snp223位点的基因型为a/t杂合型。经卡平方测验，14:30:16符合1:2:1的单隐性基因分离规律。此结果证明标记snp223与雄性不育基因紧密连锁。

实施例5、snp223标记在鉴定苗期番茄是否为雄性不育型的应用

1、鉴定番茄是否含雄性不育基因

(1)基因组dna的提取：提取表1所示的32份番茄材料的基因组dna；

表1：32份番茄材料表型及标记基因型鉴定表

注：(a)表1中dna编号1-20，31，32为普通育种材料，21-28为不育和可育材料杂交产生的分离单株；(b)标记snp223列中“a/a”表示雄性不育纯合基因型，“t/t”表示雄性可育纯合基因型，“a/t”表示雄性可育杂合基因型；

(2)pcr扩增：将上述各基因组dna放入如下体系中扩增反应：

20μlpcr反应体系包括：含基因组dna50ng/μl1.0μl，正、反向引物10mm/l分别1.0μl，2×pcrtaqmix10.0μl，ddh2o7.0μl；

pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。pcr扩增产物通过abi公司的abi3500测序仪进行测序检测。

数据记录：利用chromas2.0软件读取基因型数据，纯合位点的基因型数据记录为allele1/allele1或者allele2/allele2，杂合位点的基因型数据记录为allele1/allele2，其中allele1和allele2分别代表变异位点上的两个等位脱氧核苷酸a和t，因此allele1/allele1代表的基因型为a/a，allele2/allele2代表的基因型为t/t，allele1/allele2代表的基因型为a/t。

判断：若待测番茄基因组上的snp223位点基因型为a/a，则待测番茄基因组含有纯合的雄性不育基因，表型为雄性不育；若待测番茄基因组上的snp223位点基因型为t/t或a/t，则待测番茄基因组不含雄性不育基因或含有杂合的雄性不育基因，表型均为雄性可育。

snp223结果如表1所示，检测到14种番茄为a/a基因型、14种番茄为t/t基因型、4种番茄为a/t基因型，a/a基因型的番茄均表现为雄性不育的表型，t/t基因型和a/t基因型的番茄均表现为雄性可育的表型。

经鉴定，表型鉴定结果和snp223鉴定结果一致，证明本发明的方法正确。

实施例7、snp223位点及其特异引物在鉴定番茄雄性不育系中的应用

1、番茄雄性不育表型判定

选择表1所示的32份不同来源的番茄材料，在田间种植后，待花期进行表型观察，观察发现不育植株花器官退化较轻，花冠外表正常，花药稍瘪，花药中没有花粉，花柱稍长于花药筒；同时，采用洋红染色法进行花粉活力的检测，结果发现可育植株的花粉经洋红染色后，在显微镜下呈红色；而不育植株的花粉经洋红染色后呈无色；通过这两种方法就可判定番茄的雄性不育表型。

2、snp位点及其特异引物组合鉴定番茄苗期的雄性不育

(1)基因组dna的获得：在番茄幼苗期利用叶片提取32份不同类型的番茄基因组dna；(2)pcr扩增：将上述基因组dna分别在如下体系中进行扩增反应：

20μlpcr反应体系包括：含基因组dna50ng/μl1.0μl，正、反向引物10mm/l分别1.0μl，2×pcrtaqmix10.0μl，ddh2o7.0μl。pcr扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。pcr扩增产物通过abi公司的abi3500测序仪进行测序检测。若待测番茄基因组上的snp223位点基因型为a/a，则待测番茄为雄性不育；若待测番茄基因组上的snp223位点基因型为t/t或a/t，则待测番茄为雄性可育。

结果如表1所示，分子标记检测结果与田间花期表型鉴定结果完全一致。

snp223鉴定为a/a纯合基因型的14种番茄雄性不育株，花期表型也均为雄性不育株；snp223鉴定为t/t纯合基因型的14种番茄雄性可育株，花期表型也均为雄性可育株；snp223鉴定为a/t杂合基因型的4种番茄雄性可育株，花期表型均为雄性可育株。

可以看出，本发明snp223标记鉴定基因型和表型的准确率为100％。因此，本发明的snp223标记可用于番茄雄性不育基因的鉴定及分子标记辅助育种。

序列表

<110>新疆农业科学院园艺作物研究所

<120>与番茄雄性不育基因紧密连锁的snp分子标记及其获得方法和应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

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<212>dna

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<210>3

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<212>dna

<213>人工序列()

<220>

<221>conflict

<222>(144)

<223>n=a或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(144)..(144)

<223>nisa,c,g,toru

<400>3

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ttttttagattttttttaaaaaaattcattctttatgaaactatgtaaagaatgaaggtt120

tttgattcattgcatttgttatgnttgggaccaatgagcgtaattgaagaagcctttcgc180

taagtttttgacgcctatttctctcagccttaaggttcttggatttgtattctttaactt240

caccatcaatttgcttccttttatctgttcttcttcctacttccctttcttcagagttgt300

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