本发明属于重金属污染土壤控制与修复技术领域，涉及一种提高重金属污染土壤中植物抗性和修复效率的双接菌方法。
背景技术：
矿产资源的开采与冶炼，农药化肥的过量施用等活动，造成重金属积累于土壤中而不易被微生物所降解，长期以来对生态系统和人类健康造成很大的危害。重金属污染土壤的植物修复是一种环境友好型、低成本型修复技术，因易于实施且绿色健康而受到社会的广泛关注。而植物-微生物联合修复是在植物修复基础上,与微生物形成互惠互利的联合体,来增强植物抗性、增加植物生物量，从而提高土壤重金属污染的修复效率的新技术。
紫花苜蓿属于豆科、苜蓿属的多年生草本植物，其茎部笔直、多株丛生、根部粗壮、根茎发达。紫花苜蓿具有生长茂盛、枝叶繁多和适应力强等优势，同时也是我国重要的常见牧草之一，广泛分布于我国华北、西北、东北等地区。同时紫花苜蓿具有较好的重金属耐受性和富集性，是一种潜力较高的重金属污染土壤的修复植物。
重金属毒性和养分缺乏是重金属污染土壤农业生产力的重要限制因子，而其中氮素的缺乏又是养分不足的主要因素。因此，通过对豆科植物紫花苜蓿外源添加重金属抗性高的根瘤菌(s.meliloticcnwsx0020)，既可缓解重金属对植物的毒性又能促进污染土壤的养分循环。植物促生菌是土壤中另外一种重要的群落，既能促进植物生长，又能提高植物抗性。因此，紫花苜蓿外源添加植物促生菌芽孢杆菌(p.mucilaginosusaccc10013)不仅可以促进植物生长发育、提高生物量，还能显著促进根瘤菌结瘤固氮作用、提高土壤肥力和养分循环，改善矿区土壤质量。
已有报道大多关于单一的根瘤菌或促生菌接种对于提高植物的重金属抗性研究，至今未曾报道联合根瘤菌(s.meliloticcnwsx0020)和促生菌芽孢杆菌(p.mucilaginosusaccc10013)的复合接种来提高植物的重金属抗性、增加生物量和促进重金属修复效率的方法。
技术实现要素：
本发明目的在于解决非超累积植物苜蓿在提取重金属中生物量小，生长易受重金属毒害及重金属污染地区土壤养分缺乏等问题，而提出的新型双接菌方法来提高重金属污染土壤的植物修复效率。该方法通过构建根瘤菌与促生菌双接种体系的方法增强植物对重金属的抗性、增加植物生物量、提高植物修复重金属污染土壤的能力，同时改善污染地区土壤养分循环和土壤质量，为矿区重金属污染土壤的生物修复技术及植物管理措施提供新的思路。
其技术方案如下：
一种提高重金属污染土壤中植物抗性的双接菌方法，包括以下步骤：
步骤一：菌株的培养与菌悬液的获取：
双接种体系所用的菌株为野生型根瘤菌(s.meliloticcnwsx0020)和植物促生菌胶冻样芽孢杆菌(p.mucilaginosusaccc10013)。根瘤菌s.meliloticcnwsx0020由本课题组从陕西省凤县铜尾矿区生长的天蓝苜蓿根瘤分离，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心，其保藏号为accc19736；植物促生菌胶冻样芽孢杆菌p.mucilaginosusaccc10013由中国农业微生物保藏中心提供，保藏号为accc10013。
菌株培养过程中所用培养基如下：
甘露醇酵母固体培养基(yma)：甘露醇(10g/l)，酵母粉(3g/l)，k2hpo4(0.5g/l)，mgso4·7h2o(0.2g/l)，nacl(0.1g/l)，琼脂(17g/l)，ph约为6.8～7.2。
酵母胰蛋白胨液体培养基(ty)：胰蛋白胨(5.0g/l)，酵母粉(3.0g/l)，cacl2·2h2o(0.7g/l)，ph约为6.8～7.2。
改良accc55固体培养基：蔗糖(10.0g/l)，酵母粉(0.5g/l)，k2hpo4·3h2o(0.5g/l)，nacl(0.2g/l)，mgso4·7h2o(0.2g/l)，caco3(1.0g/l)，琼脂(15.0～20.0g/l)，ph约为7.0～7.2。
优化液体培养基：麦芽糖(2.5g/l)，胰蛋白胨(1.0g/l)，mgso4·7h2o(0.73g/l)，k2hpo4·3h2o(0.4g/l)，nacl(0.06g/l)，fecl3(0.6mg/l)，水杨酸(10mg/l)，caco3(1.0g/l)，ph约为7.0～7.2。
步骤一：菌株的培养与菌悬液的获取
s.meliloticcnwsx0020菌株的培养首先在yma固体培养基中活化。将根瘤菌菌种s.meliloticcnwsx0020接种到yma固体培养基平板上，28℃培养3d后，挑取菌落，转化，使菌株活化，并纯化分离出单一菌落。把活化好的菌株接种于ty液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h直至od600约为0.8，培养液于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗2～3次，重新悬浮于去离子水中的即为实验所需菌悬液。菌悬液需现用现配。
p.mucilaginosus菌株的培养首先在改良的accc55固体培养基中活化。将p.mucilaginosus菌株接种到accc55固体培养基平板上，28℃培养3d后，挑取菌落，转化，使菌株活化，并纯化分离出单一菌落。把活化好的菌株接种于优化液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h直至od600约为0.8，培养液于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗2～3次，重新悬浮于去离子水中的即为实验所需菌悬液。菌悬液需现用现配。
步骤二：苜蓿种子催芽处理
步骤三：双接菌处理
将1.3kg左右矿区污染农业土壤装入花盆中，花盆下面垫上细纱网以防土壤以及土壤中重金属淋失，控制土壤含水量为土壤田间持水量70％，土壤平衡一周后，将已经催芽至1-2cm左右的20株苜蓿植入土壤中。待紫花苜蓿长出第一片真叶，分别将20mls.meliloti菌悬液和p.mucilaginosus菌悬液通过注射器添加到植物根部，每隔一周接菌一次，共接菌3次。
进一步，步骤二中苜蓿种子催芽处理，具体为：
(1)选择优良的苜蓿种子，尽量保证种子大小均匀。
(2)将步骤(1)中挑选的苜蓿种子用75％的乙醇溶液浸泡10min，之后用蒸馏水冲洗3-5次，接着用20％的次氯酸钠溶液浸泡10min，再用蒸馏水冲洗3-5次，最后用蒸馏水浸泡30min，直到种子处于鼓胀状态。
(3)将步骤(2)消过毒的种子平铺放到装有琼脂液的培养皿中，然后将培养皿放到25℃的培养箱里面培养催芽1d。
(4)用镊子将步骤(3)中培养的苜蓿种芽植入矿区污染土壤。
本发明的有益效果为：
本发明采用双接菌可以更好地提高南方铜矿区和北方铅锌矿区污染农业土壤中植物对重金属的抗性及植物修复效率。双接菌法可以提高植物的光合作用、显著增加植物的生物量；抑制植物体内的过氧化氢含量，减少过氧化氢在植物体内的累积，避免植物过多的被损伤，增强植物的防御性能，缓解重金属对植株的毒害；显著促进重金属在植物体内积累，大大地提高植物提取重金属的能力，从而促进矿区污染土壤的植物修复效率。
附图说明
图1为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿生长表型的影响。a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。
图2为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿植株叶绿素的影响。a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。
图3为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿植株生物量的影响。a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。
图4为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿植株损伤分子-脂膜过氧化产物和氧自由基的影响。a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。其中，图4a植株地上(shoot)和地下(root)部丙二醛(mda)含量，图4b植株地上(shoot)和地下(root)部过氧化氢(h2o2)含量，图4c植株地上(shoot)和地下(root)部o-2含量。
图5为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对植物体内cu浓度和每盆植物总提取cu量的影响。a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。其中，图5a植株地上(shoot)和地下(root)部cu含量，图5b每盆植物总提取cu量。
图6为铅锌矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿植株叶绿素的影响。a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。
图7为铅锌矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿植株生物量的影响。a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。
图8为铅锌矿区农业土壤中外源接菌处理对每盆植物总提取pb和cd量的影响，a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。其中，图8a植物总提取pb量，图8b植物总提取cd量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施案例1：
一种提高重金属污染土壤中植物抗性的双接菌方法，包括以下步骤：
步骤一：菌株的培养与菌悬液的获取：
双接种体系所用的菌株为根瘤菌(s.meliloticcnwsx0020)和促生菌胶冻样芽孢杆菌(p.mucilaginosusaccc10013)，其中根瘤菌s.meliloticcnwsx0020由本课题组从陕西凤县铜尾矿区生长的天蓝苜蓿根瘤分离，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心，其保藏号为accc19736；促生菌胶冻样芽孢杆菌p.mucilaginosus由中国农业微生物保藏中心提供，保藏号为accc10013。
菌株培养过程中所用的培养基如下：
甘露醇酵母固体培养基(yma)：甘露醇(10g/l)，酵母粉(3g/l)，k2hpo4(0.5g/l)，mgso4·7h2o(0.2g/l)，nacl(0.1g/l)，琼脂(17g/l)，ph约为6.8～7.2。
酵母胰蛋白胨液体培养基(ty)：胰蛋白胨(5.0g/l)，酵母粉(3.0g/l)，cacl2·2h2o(0.7g/l)，ph约为6.8～7.2。
改良accc55固体培养基：蔗糖(10.0g/l)，酵母粉(0.5g/l)，k2hpo4·3h2o(0.5g/l)，nacl(0.2g/l)，mgso4·7h2o(0.2g/l)，caco3(1.0g/l)，琼脂(15.0～20.0g/l)，ph约为7.0～7.2。
优化液体培养基：麦芽糖(2.5g/l)，胰蛋白胨(1.0g/l)，mgso4·7h2o(0.73g/l)，k2hpo4·3h2o(0.4g/l)，nacl(0.06g/l)，fecl3(0.6mg/l)，水杨酸(10mg/l)，caco3(1.0g/l)，ph约为7.0～7.2。
s.meliloticcnwsx0020菌株的培养首先在yma固体培养基中活化。将根瘤菌菌种s.meliloticcnwsx0020接种到yma固体培养基平板上，28℃培养3d后，挑取菌落，转化，使菌株活化，并纯化分离出单一菌落。把活化好的菌株接种于ty液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h直至od600约为0.8，培养液于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗2～3次，重新悬浮于去离子水中的即为实验所需菌悬液。菌悬液需现用现配。
p.mucilaginosus菌株的培养首先在改良的accc55固体培养基中活化。将p.mucilaginosus菌株接种到accc55固体培养基平板上，28℃培养3d后，挑取菌落，转化，使菌株活化，并纯化分离出单一菌落。把活化好的菌株接种于优化液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h直至od600约为0.8，培养液于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗2～3次，重新悬浮于去离子水中的即为实验所需菌悬液。菌悬液需现用现配。
步骤二：苜蓿种子催芽处理
(1)选择优良的苜蓿种子，尽量保证种子大小均匀。
(2)将步骤(1)中挑选的苜蓿种子用75％的乙醇溶液浸泡10min，之后用蒸馏水冲洗3-5次，接着用20％的次氯酸钠溶液浸泡10min，再用蒸馏水冲洗3-5次，最后用蒸馏水浸泡30min，直到种子处于鼓胀状态。
(3)将步骤(2)消过毒的种子平铺放到装有琼脂液的培养皿中，然后将培养皿放到25℃的培养箱里面培养催芽1d。
步骤三：双接菌处理
试验土壤取自湖北省黄石市的废弃铜矿区附近农用地0～20cm表层土壤(总铜量700.12mgkg-1，ph为5.65，总氮量1.37gkg-1，有效磷12.34mgkg-1，速效钾69.81mgkg-1，有机质含量24.39gkg-1)。根据我国的土壤环境质量标准(gb15618-1995)可知铜矿区土壤中的cu含量超过土壤三级标准，铜矿区土壤主要受cu的污染。称取1.3kg左右试验土壤装入花盆中，花盆下面垫上细纱网以防土壤以及土壤中重金属淋失，控制土壤含水量为土壤田间持水量的70％。土壤平衡一周后，将已经催芽至1-2cm左右的20株苜蓿植入土壤中。待紫花苜蓿长出第一片真叶，分别将20mls.meliloti菌悬液和p.mucilaginosus菌悬液通过注射器添加到植物根部，每隔一周接菌一次，共接菌3次。
为了证明本发明的有益效果，进行了一系列原位实验，图1为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿生长表型的影响。可以看出未接种菌株的苜蓿植株生长矮小，接种单菌株处理的苜蓿植株生长较好，而双接种菌株处理苜蓿植株生长更好，枝叶更加繁茂。从表型上来看，接种根瘤菌和促生菌后均能促进植株生长，且双接菌的促生效果更好。这直接表明双接菌可以更好地提高铜矿区污染土壤中植物的抗性、促进植物生长。
图2为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿叶绿素含量的影响。发现单接根瘤菌和胶质类芽孢杆菌能明显增加叶绿素含量，而双接菌处理增加效果更加明显。结果说明双接菌处理可以显著提高植物的光合作用。
图3为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿植株生物量的影响。发现单接根瘤菌和芽孢杆菌都能明显增加苜蓿植株生物量，而双接菌提高效果更加明显。结果表明双接菌处理显著增加植物的生物量，促进植物生长。
图4为铜矿区农业土壤外源接菌处理对苜蓿植株损伤分子(脂膜过氧化产物和氧自由基)的影响。丙二醛(mda)是膜脂过氧化最重要的产物之一，是反应膜系统受损程度以及植物的抗逆性的重要指标，而h2o2和o-2是反应植物体内氧自由基水平(ros)的重要指标。图四表明双接菌处理显著降低植物体内mda、h2o2和o-2的含量，说明双接菌抑制植物体内的过氧化氢含量，减少过氧化氢的累积，避免植物过多的被损伤，从而显著提高植株抗性。
图5为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对植株cu含量和cu提取量的影响。发现双接菌处理显著促进了cu在植物体内积累，显著提高了植物对cu的提取效率。
表1为铜矿区农业土壤中外源接菌处理对植株cu富集系数的影响。a代表无接菌处理；a+p代表单接菌p.mucilaginosus；a+s代表单接菌s.meliloti；a+p+s代表双接菌处理。发现双接菌显著地提高植物地上和地下富集cu的能力，增强cu的植物提取效率。
表1
实施案例2：
一种提高重金属污染土壤中植物抗性的双接菌方法，包括以下步骤：
步骤一：菌株的培养与菌悬液的获取：
双接种体系所用的菌株为根瘤菌(s.meliloticcnwsx0020)和促生菌胶冻样芽孢杆菌(p.mucilaginosusaccc10013)，其中根瘤菌s.meliloticcnwsx0020由本课题组从陕西凤县铜尾矿区生长的天蓝苜蓿根瘤分离，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心，其保藏号为accc19736；促生菌胶冻样芽孢杆菌p.mucilaginosus由中国农业微生物保藏中心提供，保藏号为accc10013。
菌株培养过程中所用的培养基如下：
甘露醇酵母固体培养基(yma)：甘露醇(10g/l)，酵母粉(3g/l)，k2hpo4(0.5g/l)，mgso4·7h2o(0.2g/l)，nacl(0.1g/l)，琼脂(17g/l)，ph约为6.8～7.2。
酵母胰蛋白胨液体培养基(ty)：胰蛋白胨(5.0g/l)，酵母粉(3.0g/l)，cacl2·2h2o(0.7g/l)，ph约为6.8～7.2。
改良accc55固体培养基：蔗糖(10.0g/l)，酵母粉(0.5g/l)，k2hpo4·3h2o(0.5g/l)，nacl(0.2g/l)，mgso4·7h2o(0.2g/l)，caco3(1.0g/l)，琼脂(15.0～20.0g/l)，ph约为7.0～7.2。
优化液体培养基：麦芽糖(2.5g/l)，胰蛋白胨(1.0g/l)，mgso4·7h2o(0.73g/l)，k2hpo4·3h2o(0.4g/l)，nacl(0.06g/l)，fecl3(0.6mg/l)，水杨酸(10mg/l)，caco3(1.0g/l)，ph约为7.0～7.2。
s.meliloticcnwsx0020菌株的培养首先在yma固体培养基中活化。将根瘤菌菌种s.meliloticcnwsx0020接种到yma固体培养基平板上，28℃培养3d后，挑取菌落，转化，使菌株活化，并纯化分离出单一菌落。把活化好的菌株接种于ty液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h直至od600约为0.8，培养液于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗2～3次，重新悬浮于去离子水中的即为实验所需菌悬液。菌悬液需现用现配。
p.mucilaginosus菌株的培养首先在改良的accc55固体培养基中活化。将p.mucilaginosus菌株接种到accc55固体培养基平板上，28℃培养3d后，挑取菌落，转化，使菌株活化，并纯化分离出单一菌落。把活化好的菌株接种于优化液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h直至od600约为0.8，培养液于8000rpm，4℃离心5min收集菌体，菌体用无菌去离子水清洗2～3次，重新悬浮于去离子水中的即为实验所需菌悬液。菌悬液需现用现配。
步骤二：苜蓿种子催芽处理
(1)选择优良的苜蓿种子，尽量保证种子大小均匀。
(2)将步骤(1)中挑选的苜蓿种子用75％的乙醇溶液浸泡10min，之后用蒸馏水冲洗3-5次，接着用20％的次氯酸钠溶液浸泡10min，再用蒸馏水冲洗3-5次，最后用蒸馏水浸泡30min，直到种子处于鼓胀状态。
(3)将步骤(2)消过毒的种子平铺放到装有琼脂液的培养皿中，然后将培养皿放到25℃的培养箱里面培养催芽1d。
步骤三：双接菌处理
试验土壤取自陕西省凤县的铅锌矿区附近农用地0～20cm表层土壤(总pb量651.68mgkg-1，总cd量4.95mgkg-1，ph为8.08，总氮量25.81gkg-1，全磷量1.59gkg-1，全钾量0.31gkg-1，有机质含量25.81gkg-1)。根据我国的土壤环境质量标准(gb15618-1995)可知铅锌矿区土壤中的pb和cd含量都超过土壤三级标准，铅锌矿区土壤主要受pb和cd的污染。称取1.3kg左右试验土壤装入花盆中，花盆下面垫上细纱网以防土壤以及土壤中重金属淋失，控制土壤含水量为土壤田间持水量的70％。土壤平衡一周后，将已经催芽至1-2cm左右的20株苜蓿植入土壤中。待紫花苜蓿长出第一片真叶，分别将20mls.meliloti菌悬液和p.mucilaginosus菌悬液通过注射器添加到植物根部，每隔一周接菌一次，共接菌3次。
为了证明本发明的有益效果，进行了一系列原位实验，图6为铅锌矿区农业土壤中外源接菌处理对苜蓿植株叶绿素含量的影响。发现接种根瘤菌和芽孢杆菌增加苜蓿植株叶绿素含量，而双接菌对苜蓿植株叶绿素含量增加的效果更显著。双接菌处理促进植物生长。
图7为铅锌矿区农业土壤中外源接菌处理对植物生物量的影响。发现接种根瘤菌和芽孢杆菌能明显增加植物生物量，而双接菌对植物生物量的增加效果更明显。双接菌处理显著增加铅锌矿区污染土壤中植物的生物量，促进植物生长。
图8为铅锌矿区农业土壤中外源接菌处理对每盆植物提取pb和cd量的影响。发现双接菌处理显著提高植物提取重金属pb和cd的能力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。