本发明属于生物技术领域，涉及质粒提取技术，具体涉及一种无内毒素质粒的大量提取技术。
背景技术：
质粒是一类小的、双链环装DNA分子，携带染色体以外的遗传信息。由于质粒具有自我复制功能，一个细胞可含有多个拷贝的质粒。过去的数十年中，质粒已经成为遗传学、分子生物学等领域最重要的工具，尤其是近些年来，更成为基因治疗和基因疫苗等医药领域必不可少的工具。当前质粒DNA在基因治疗和基因疫苗等临床研究中的应用越来越重要。随之而来的是，治疗领域对质粒的生产技术的要求要求越来越高。既要求具有高产量，也要求高纯度和杂质含量低至复合临床治疗用途的标准。现有技术中，商品化的质粒纯化试剂盒不适用于制备足量的克级及以上的质粒产品。更重要的是，最终质粒产物的数量和纯度都不是完全能够重复的，这也是规模化生产的先决条件，尤其是在药物领域的应用。同时，根据世界卫生组织(WHO)标准，质粒DNA的纯化过程不能使用动物源的酶(RNase A和蛋白酶K)；不能使用对人畜有毒的苯酚、氯仿等有机溶剂；避免大量使用易燃、易爆的无水乙醇和异丙醇等有机溶剂。所纯化的质粒DNA纯度要求高，参照人医的评价标准，其A260/A280在1.75-1.85之间,用1％琼脂糖凝胶电泳检测不到RNA；二辛可宁酸检测蛋白的含量在0.001ug/ug质粒DNA；宿主基因组的含量应小于10ng/ug质粒DNA；超螺旋质粒纯度应大于90％。现有技术生物技术基因治疗行业尚需开发一种产量高，无内毒素的质粒大量提取方法
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种无内毒素质粒大量制备工艺，满足基因治疗和疫苗生产领域的需要
本发明实现上述目的技术方案如下:
第一方面，本发明提供了一种无内毒素质粒的大量制备方法，其包括步骤：
(1)菌种发酵；
(2)菌体细胞的收集；
(3)菌体的裂解；
(4)菌体裂解产物固液分离，收集液体部分；
(5)菌体裂解产物液体部分的纯化；
所述步骤(5)包括添加去除内毒素的缓冲液，低温处理和电离层析去除杂质和其他质粒，收集目标质粒；
所述内毒素去除缓冲液包含pH7.0,Triton X100,MOPS,NaCl，所述 Triton X100浓度为5～15％,所述MOPS含量为30～80mM,所述NaCl 浓度为500～100Mm。
所述菌体裂解产物液体部分的纯化采用自动分离层析系统，所述层析包含阴离子交换层析，所述阴离子交换层析柱平衡缓冲液和洗杂缓冲液都和洗脱缓冲液pH都是7.0，包含选自3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS),氯化钠(NaCl)和异丙醇，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton 100) 的三到四种，所述阴离子交换层析柱的平衡缓冲液中MOPS含量为30～80mM,NaCl浓度为500～1000mM；Triton X100浓度0.8～0.22％，所述阴离子交换层析柱平衡缓冲液、洗杂缓冲液都包含MOPS,pH7.0, NaCl,异丙醇和Triton 100，所述柱平衡缓冲液中MOPS含量为 30～80mM,所述NaCl浓度为500～1000mM；异丙醇为10％～20％， Triton 100浓度为0.8～0.22％，所述洗杂缓冲液中MOPS含量为 30～80mM,所述NaCl浓度为750～1500mM；异丙醇含量为10～15％；所述洗脱缓冲液包含NaCl,异丙醇和Triton 100，所述洗脱缓冲液中 NaCl的浓度为为1500～2000mM,异丙醇的浓度为10～15％所述Triton 100的浓度为为10～20％。
根据本发明的无内毒素质粒的大量制备方法，其中步骤(1)所述发酵包括摇瓶发酵和发酵罐发酵。
在一实施例中，质粒生产菌的发酵为摇瓶发酵；在一大规模生产实施例中，质粒生产菌的发酵为发酵罐发酵
根据本发明的无内毒素质粒的大量制备方法，其中步骤(2)所述的菌体收集包括离心和膜过滤。
根据本发明的无内毒素质粒的大量制备方法，其中步骤(4)所述的裂解产物的固液分离方法包括离心法和膜过滤法。
根据本发明的无内毒素质粒的大量制备方法，其中步骤(5)所述的低温处理选自冰浴或4℃保持30分钟。
根据本发明的无内毒素质粒的大量制备方法，其中步骤(5)所述纯化包括弃去RNA、超螺旋质粒、其他构型质粒、基因组DNA和其他构型质粒在不同时段出现洗脱峰，收集超螺旋质粒洗脱峰。
本发明还提供了第一方面所述的方法在基因治疗和疫苗生产领域中的应用。
有益效果
本发明所描述的质粒纯化方法不使用动物源性的RNase A和蛋白酶K,以及对人体和动物有毒副作用的苯酚、氯仿；按本发明所纯化的质粒的各项指标能达到或接近相关领域如美国食品和药品管理局(FDA)的质量标准；同时本发明的纯化方法可以线性放大。为真核生物产品的工厂化生产和基因治疗产业的发展提供了重要的技术手段。
具体实施方式
下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制。
实施例1：无内毒素慢病毒质粒的十克级及以下小规模制备
制备十克级及以下规模的慢病毒纯化质粒，菌体发酵选择摇瓶摇菌，离心机收集菌体，裂解后的澄清裂解液用冷冻高速离心机离心，柱层析用1ml或5ml阴离子交换预装柱。
1、摇瓶发酵
从种子库中取出一支重组菌种，在抗性平板上划线，将单菌落于含有相应抗生素的5mL液体培养基中进行扩大培养8h，然后以1:10 00的比例接种到装有1L培养基的3L摇瓶中，37℃180-220rpm震荡培养16h。
2、菌体收集
冷冻高速离心机8000g 4℃3min离心收集菌体，称量菌体湿重。
3、菌体裂解
按照每克菌体(湿重)加入10ml溶液I(50mM Tris·Cl,10mM EDTA pH8.0)将菌体充分重悬，然后按照1:1的比例加入溶液II(0.2M NaOH， 1％SDS)和溶液III(3M乙酸钾，pH5.5)进行变性和复性5分钟。
4、澄清
冷冻高速离心机20000g 4℃15min离心收集上清。
5、柱层析
用住平衡缓冲液平衡冲洗柱子20分钟。柱平衡缓冲液:50mM MOPS,pH7.0,750mM NaCl,15％异丙醇，0.15％Triton。加入1/10的 10×内毒素去除Buffer(10％Triton X100,50mM MOPS,pH7.0,750mM NaCl)，混匀后冰浴或4℃30min。在自动分离层析系统上，过1ml 或5ml Fractogel DMAE阴离子交换预装柱(merck millipore,默克密理博)(按2g/ml结合量选择预装柱柱体积)，RNA、超螺旋质粒、其他构型质粒、基因组DNA会在不同洗脱时间出峰，收集超螺旋质粒洗脱液。洗杂缓冲液:50mM MOPS,pH7.0,1000mM NaCl,15％异丙醇。洗脱缓冲液：50mM Tris,pH8.0,2000mM NaCl,15％异丙醇。盐浓度1M-2M线性梯度洗脱。
收集液经鲎试剂检测，内毒素﹤40EU/mg质粒，1％琼脂糖凝胶电泳检测超螺旋率﹥90％，1％琼脂糖凝胶电泳目测未见基因组DNA及RN A条带。
实施例2：无内毒素慢病毒质粒十克级以上规模制备
对于十克级以上慢病毒纯化质粒的制备，摇瓶发酵受制于其产量限制，所以要用发酵罐发酵，发酵罐可以大规模提高单位培养基的菌体产量，而且可以平行放大；裂解后的澄清可以选择冷冻高速离心机，比较耗时，也可以选择TFF,二者比较，TFF更适合规模化生产，但耗材成本较高；柱层析柱体积的选择可参考2g/ml的结合量来选择。
1、发酵罐发酵菌体
从种子库中取出一支重组菌种，在抗性平板上划线，将单菌落于含有相应抗生素的液体培养基中进行扩大培养，再以1:10的比例接种到100L发酵罐中，OD600监测生长状态，待细菌达到对数生长期时停止发酵。发酵参数：通气量20L/min，搅拌速率400–700rpm(取决于溶氧量)，温度37℃，压力0.5bar，pH7.0(25％,m/v,NH4OH和25％, m/v,H2SO4调节)。
2、菌体收集
1000KD TFF膜包收集菌体。
3、菌体裂解
按照每克菌体(湿重)加入10ml溶液I(50mM Tris·Cl,10mM EDTA pH8.0)将菌体充分重悬，然后向混合器中加入溶液II(0.2M NaOH， 1％SDS)和溶液III(3M乙酸钾，pH5.5)进行变性和复性各5分钟，期间用pH计检测值来自动调节溶液II和溶液III的进料比例和搅拌速率。
4、澄清
300KD TFF模板对裂解液上清进行过滤和浓缩。
5、柱层析
加入1/10的10×内毒素去除Buffer(20％NP40,50mM MOPS, pH7.0,750mM NaCl)，混匀后冰浴或4℃30min。在自动分离层析系统SCG上，过Fractogel DMAE阴离子交换柱(按2g/ml结合量选择预装柱柱体积)，RNA、超螺旋质粒、其他构型质粒、基因组DNA会在不同洗脱时间出峰，收集超螺旋质粒洗脱液。柱平衡Buffer:50mM MOPS,pH7.0,750mM NaCl,15％异丙醇，0.15％Triton。洗杂Buffer: 50mM MOPS,pH7.0,1000mM NaCl,15％异丙醇。洗脱Buffer：50mM Tris, pH8.0,2000mM NaCl,15％异丙醇。盐浓度1M-2M线性梯度洗脱。
收集液经鲎试剂检测，内毒素﹤40EU/mg质粒，1％琼脂糖凝胶电泳检测超螺旋率﹥90％，1％琼脂糖凝胶电泳目测未见基因组DNA及RN A条带。
实施例3：培养基优选来提高质粒产率
比较了LB、SB、TSB、TB四种培养基在相同培养条件下，单位体积培养基的菌体湿重和质粒得率，从其中优选出高质粒得率的培养基。以下四种培养基，在相同条件下摇瓶摇菌，各取25ml菌液，用无内毒素质粒大提试剂盒抽提质粒。
LB培养基配方：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物， 1％(W/V)NaCl。
SB培养基配方：3.5％(W/V)胰蛋白胨，2.0％(W/V)酵母提取物，0.5％(W/V)NaCl，0.5％(V/V)1M NaOH。
TSB培养基配方：1.5％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)大豆蛋白胨，0. 5％(W/V)NaCl，调节pH为7.2±0.2。
TB培养基配方：1.2％(W/V)胰蛋白胨，2.4％(W/V)酵母提取物， 0.4％(V/V)甘油，17mM KH2PO4，72mM K2HPO4。
实验流程：
1、摇菌
从种子库中取出一支重组菌种，在抗性平板上划线，将单菌落于含有相应抗生素的5mL液体培养基中进行扩大培养8h，然后以1:10 00的比例接种到装有1L培养基的3L摇瓶中，37℃180-220rpm震荡培养16h。
2、菌体收集
取25ml菌液，用冷冻高速离心机8000g 4℃3min离心收集菌体，称量菌体湿重。
3、用无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒抽提
用TIANGEN的EndoFree Maxi Plasmid Kit(DP117)进行质粒大抽，具体流程参照产品说明书。
4、质粒定量
用Nanodrop对大抽质粒进行定量，计算：单位菌液的菌体湿重，单位菌液的质粒产量，单位菌体湿重的质粒产量。
表1：不同培养基质粒得率
根据表1数据，单位菌液质粒产量TB﹥SB＝TSB﹥LB。TB培养基的单位菌液质粒产量约是LB培养基的3倍。