本发明涉及体外细胞分离和培养技术领域，具体涉及一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒及方法。
背景技术：
现有技术中，从孕小鼠12-16天胚胎中分离原代胚胎成纤维细胞的过程大致如下，取出胚胎，去掉头尾四肢内脏后，将剩下的部分尽量剪碎，加消化酶消化，中止后，离心获取细胞沉淀，用含血清的培养液打成单细胞悬液，分瓶培养传代。通常使用的消化酶为胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-edta)，用一种浓度在37摄氏度下作用一定时间，然后获得单细胞悬液。但这样的方法存在的问题是：剪碎组织块有大有小，细胞从组织块中消化出来的时间不一，而消化液浓度和时间只有一种，有时可能因未消化不够，获得的单细胞量不够，或可能消化过度，有的细胞受损，使细胞贴壁或传代效率降低。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒，该用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒既能富集细胞数量又能避免对细胞的过度消化而使细胞损伤。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的方法，该方法既能富集细胞数量又能避免对细胞的过度消化而使细胞损伤。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒，含有以下四种浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，分别为a液、b液、c液和d液，其中，a液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.15％，b液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.08％，c液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.04％，d液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.02％。
所述消化液试剂盒需要在-20℃下存放，并且需要在4℃下融化分装。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的方法，通过使用上述所述的一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒进行分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，具体包括以下步骤：
步骤一，剪碎：将去掉头尾四肢和内脏的小鼠胚胎剪碎后放入a液中，并在室温下继续进行剪碎，得到剪碎组织；
步骤二，a液消化：步骤一的剪碎组织在a液中进行消化作用一定时间，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；
步骤三，b液消化：将步骤二中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入b液中进行消化作用一定时间，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；
步骤四，c液消化：将步骤三中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入c液中进行消化作用一定时间，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；
步骤五，d液消化：将步骤四中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入d液中进行消化作用一定时间，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；
步骤六，培养：将步骤二至步骤五中收集的并加入了培养液的上清液混合后，进行离心得到细胞沉淀，然后用培养液对细胞沉淀进行悬浮，然后接种在培养瓶上培养。
上述技术方案中，所述步骤一中，利用眼科剪进行剪碎。
上述技术方案中，所述步骤二至步骤五中，所述消化作用的温度均为36℃～38℃，所述消化作用的时间均为3min～7min。
上述技术方案中，所述步骤二至步骤五中，所述消化作用的温度均为37℃，所述消化作用的时间均为5min。
上述技术方案中，所述步骤二至步骤五中，所述培养液均为含胎牛血清的dmem。
上述技术方案中，所述培养液均为含体积分数为10％～20％的胎牛血清的dmem。
上述技术方案中，所述步骤六中，接种在培养瓶上培养的培养条件为：将培养瓶置于含体积分数5％的co2，温度为37℃的饱和湿度培养箱中培养。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
(1)本发明提供的一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒，由于含有四种浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，因此，该消化液试剂盒既能富集细胞数量又能避免对细胞的过度消化而使细胞损伤。
(2)本发明提供的一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的方法，通过使用含有四种浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液的消化液试剂盒进行分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，并将不同浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液按照浓度从高到低的顺序依次消化原代小鼠胚胎，因此，该方法既能富集细胞数量又能避免对细胞的过度消化而使细胞损伤。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒，含有以下四种浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，分别为a液、b液、c液和d液，其中，a液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.15％，b液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.08％，c液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.04％，d液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.02％。
其中，该消化液试剂盒需要在-20℃下存放，并且需要在4℃下融化分装。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的方法，通过使用上述的一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒进行分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，具体包括以下步骤：
步骤一，剪碎：将去掉头尾四肢和内脏的小鼠胚胎利用眼科剪剪碎后放入a液中，并在室温下继续利用眼科剪进行剪碎，得到剪碎组织；
步骤二，a液消化：步骤一的剪碎组织在a液中于37℃下进行消化作用5min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为10％的胎牛血清的dmem；
步骤三，b液消化：将步骤二中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入b液中于37℃下进行消化作用5min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为10％的胎牛血清的dmem；
步骤四，c液消化：将步骤三中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入c液中于37℃下进行消化作用5min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为10％的胎牛血清的dmem；
步骤五，d液消化：将步骤四中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入d液中于37℃下进行消化作用5min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为10％的胎牛血清的dmem；
步骤六，培养：将步骤二至步骤五中收集的并加入了培养液的上清液混合后，进行离心得到细胞沉淀，然后用培养液对细胞沉淀进行悬浮，然后接种在培养瓶上培养。其中，接种在培养瓶上培养的培养条件为：将培养瓶置于含体积分数5％的co2，温度为37℃的饱和湿度培养箱中培养。
实施例2。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒，含有以下四种浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，分别为a液、b液、c液和d液，其中，a液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.15％，b液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.08％，c液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.04％，d液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.02％。
其中，该消化液试剂盒需要在-20℃下存放，并且需要在4℃下融化分装。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的方法，通过使用上述的一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒进行分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，具体包括以下步骤：
步骤一，剪碎：将去掉头尾四肢和内脏的小鼠胚胎利用眼科剪剪碎后放入a液中，并在室温下继续利用眼科剪进行剪碎，得到剪碎组织；
步骤二，a液消化：步骤一的剪碎组织在a液中于36℃下进行消化作用7min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为15％的胎牛血清的dmem；
步骤三，b液消化：将步骤二中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入b液中于36℃下进行消化作用7min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为15％的胎牛血清的dmem；
步骤四，c液消化：将步骤三中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入c液中于36℃下进行消化作用7min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为15％的胎牛血清的dmem；
步骤五，d液消化：将步骤四中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入d液中于36℃下进行消化作用7min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为15％的胎牛血清的dmem；
步骤六，培养：将步骤二至步骤五中收集的并加入了培养液的上清液混合后，进行离心得到细胞沉淀，然后用培养液对细胞沉淀进行悬浮，然后接种在培养瓶上培养。其中，接种在培养瓶上培养的培养条件为：将培养瓶置于含体积分数5％的co2，温度为37℃的饱和湿度培养箱中培养。
实施例3。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒，含有以下四种浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，分别为a液、b液、c液和d液，其中，a液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.15％，b液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.08％，c液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.04％，d液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.02％。
其中，该消化液试剂盒需要在-20℃下存放，并且需要在4℃下融化分装。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的方法，通过使用上述的一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒进行分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，具体包括以下步骤：
步骤一，剪碎：将去掉头尾四肢和内脏的小鼠胚胎利用眼科剪剪碎后放入a液中，并在室温下继续利用眼科剪进行剪碎，得到剪碎组织；
步骤二，a液消化：步骤一的剪碎组织在a液中于38℃下进行消化作用3min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为20％的胎牛血清的dmem；
步骤三，b液消化：将步骤二中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入b液中于38℃下进行消化作用3min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为20％的胎牛血清的dmem；
步骤四，c液消化：将步骤三中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入c液中于38℃下进行消化作用3min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为20％的胎牛血清的dmem；
步骤五，d液消化：将步骤四中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入d液中于38℃下进行消化作用3min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为20％的胎牛血清的dmem；
步骤六，培养：将步骤二至步骤五中收集的并加入了培养液的上清液混合后，进行离心得到细胞沉淀，然后用培养液对细胞沉淀进行悬浮，然后接种在培养瓶上培养。其中，接种在培养瓶上培养的培养条件为：将培养瓶置于含体积分数5％的co2，温度为37℃的饱和湿度培养箱中培养。
实施例4。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒，含有以下四种浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，分别为a液、b液、c液和d液，其中，a液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.15％，b液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.08％，c液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.04％，d液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.02％。
其中，该消化液试剂盒需要在-20℃下存放，并且需要在4℃下融化分装。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的方法，通过使用上述的一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒进行分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，具体包括以下步骤：
步骤一，剪碎：将去掉头尾四肢和内脏的小鼠胚胎利用眼科剪剪碎后放入a液中，并在室温下继续利用眼科剪进行剪碎，得到剪碎组织；
步骤二，a液消化：步骤一的剪碎组织在a液中于36.5℃下进行消化作用6min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为13％的胎牛血清的dmem；
步骤三，b液消化：将步骤二中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入b液中于36.5℃下进行消化作用6min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为13％的胎牛血清的dmem；
步骤四，c液消化：将步骤三中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入c液中于36.5℃下进行消化作用6min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为13％的胎牛血清的dmem；
步骤五，d液消化：将步骤四中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入d液中于36.5℃下进行消化作用6min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为13％的胎牛血清的dmem；
步骤六，培养：将步骤二至步骤五中收集的并加入了培养液的上清液混合后，进行离心得到细胞沉淀，然后用培养液对细胞沉淀进行悬浮，然后接种在培养瓶上培养。其中，接种在培养瓶上培养的培养条件为：将培养瓶置于含体积分数5％的co2，温度为37℃的饱和湿度培养箱中培养。
实施例5。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒，含有以下四种浓度的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，分别为a液、b液、c液和d液，其中，a液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.15％，b液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.08％，c液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.04％，d液含有胰蛋白酶的质量浓度为0.02％。
其中，该消化液试剂盒需要在-20℃下存放，并且需要在4℃下融化分装。
一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的方法，通过使用上述的一种用于分离原代小鼠胚胎成纤维细胞的消化液试剂盒进行分离原代小鼠胚胎成纤维细胞，具体包括以下步骤：
步骤一，剪碎：将去掉头尾四肢和内脏的小鼠胚胎利用眼科剪剪碎后放入a液中，并在室温下继续利用眼科剪进行剪碎，得到剪碎组织；
步骤二，a液消化：步骤一的剪碎组织在a液中于37.5℃下进行消化作用4min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为18％的胎牛血清的dmem；
步骤三，b液消化：将步骤二中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入b液中于37.5℃下进行消化作用4min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为18％的胎牛血清的dmem；
步骤四，c液消化：将步骤三中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入c液中于37.5℃下进行消化作用4min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为18％的胎牛血清的dmem；
步骤五，d液消化：将步骤四中收集上清液后剩下的沉淀悬液加入d液中于37.5℃下进行消化作用4min，然后收集上清液，并往上清液中加入培养液以中止胰蛋白酶的消化；本实施例中，培养液为含体积分数为18％的胎牛血清的dmem；
步骤六，培养：将步骤二至步骤五中收集的并加入了培养液的上清液混合后，进行离心得到细胞沉淀，然后用培养液对细胞沉淀进行悬浮，然后接种在培养瓶上培养。其中，接种在培养瓶上培养的培养条件为：将培养瓶置于含体积分数5％的co2，温度为37℃的饱和湿度培养箱中培养。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。