本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母菌、其构建方法及其在发酵制备番茄红素中的应用。
背景技术：
番茄红素(lycopene)是一种抗氧化活性很强的萜类物质，具有猝灭单线态氧、清除自由基、抑制脂质过氧化等多种生理功能活性，在癌症预防，抗衰老，保护心脑血管和增强机体免疫力等方面有广泛应用，被世界卫生组织(who)和联合国粮农组织(fao)认定为a类营养素，市场前景较好。目前生产番茄红素常用的方法有直接提取法、化学合成法和微生物发酵法。由于原料番茄的供应受到气候与季节的影响，使得直接提取法生产成本较高。化学合成法一般以β-紫罗酮为原料，合成过程步骤繁琐，且化学试剂残留问题限制了产品的使用范围。而微生物发酵法由于不受气候和季节影响、生产周期短、易于大规模培养等优势逐渐受到人们的关注。酿酒酵母具有遗传可操作性以及成熟的大规模培养技术使其在食品工业中被广泛应用。作为安全的模式微生物，酿酒酵母存在能合成萜类的甲羟戊酸(mva)途径，已经作为生产青蒿酸、香紫苏醇、β-香树脂醇、人参皂苷等天然产物的优良宿主使用。通过强化酿酒酵母mva合成途径增加前体物供应和引入番茄红素合成的相关基因经模块化设计整合至酵母基因组上实现酿酒酵母生产番茄红素，将为酿酒酵母高效合成萜类物质提供技术支持。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，即番茄红素在植物中积累量低和化学合成困难的局限，提供了一种酿酒酵母菌、其构建方法及其在发酵制备番茄红素中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：提供了一株含有完整番茄红素生物合成途径的酿酒酵母菌，所述酿酒酵母菌命名为酿酒酵母w2(saccharomycescerevisiaew2)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(武汉大学，武汉市武昌珞珈山邮编：430072)，保藏时间为2018年03月13日，保藏编号为cctccno：m2018123。
本发明的第二个目的是提供了上述酿酒酵母菌w2的构建方法，是将来源于酿酒酵母cen.pk2-1c的甲羟戊酸途径的相关基因erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8和erg19分别构建形成基因表达盒，然后运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母cen.pk2-1c中，利用酵母同源重组能力组装形成强化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量的酿酒酵母工程菌w1；之后将来源于大肠杆菌的idi1、嗜酸热硫化叶菌的saggps、欧文氏菌的crtb和红法夫酵母的crti分别构建形成基因表达盒，然后运用醋酸锂转化法共转化基因表达盒于酿酒酵母工程菌w1中，利用酵母同源重组能力组装形成含有完整番茄红素生物合成途径的酿酒酵母菌w2。
进一步的，上述的一种酿酒酵母菌w2的构建方法，所述酿酒酵母工程菌w1提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子adh1p、ala1p、fba1p、tdh3p、tys1p、gpm1p和终止子sdh2t、ilv1t、vps8t、pim15t、rei1t、lrp1t控制erg10、erg13、thmg1、erg12、erg8和erg19基因的表达。
进一步的，上述的一种酿酒酵母菌w2的构建方法，所述酿酒酵母菌w2提供的基因表达盒的构建方法，是利用组成型启动子ala1p、adh1p、tef1p、fba1p和终止子rim15t、hog1t、cyc1t、tys1t控制idi1、saggps、crtb和crti基因的表达。
进一步的，上述的一种酿酒酵母菌w2的构建方法，所述各个基因表达盒的构建是通过两步重叠延伸pcr的方法连接的，多个基因表达盒通过酵母同源重组系统重组至酵母基因组的rdna和delta位点。
本发明的第三个目的是提供了上述酿酒酵母菌w2在发酵制备番茄红素中的应用。
本发明的酿酒酵母工程菌强化了酿酒酵母类异戊二烯合成途径代谢通量,实现了番茄红素的酿酒酵母高效合成。
本发明的有益效果为：
1、本发明构建的酿酒酵母工程菌，是将多个基因表达盒通过酵母强大的同源重组系统重组至酵母基因组的不同位点，表达遗传更稳定；
2、本发明构建的酿酒酵母工程菌w1为生产番茄红素提供优化的宿主细胞，并且此菌株强化了类异戊二烯合成途径代谢通量,可以作为生产别的萜类化合物的底盘宿主；
3、本发明构建的酿酒酵母工程菌w2合成番茄红素途径受组成型启动子控制，发酵过程无需添加诱导剂，节约了发酵成本，且发酵操作更加简单。
附图说明
图1和图2显示为菌落pcr验证结果。
由于直接以酿酒酵母单菌落为模板，酿酒酵母自身会影响引物与模板的结合，因此选择异源基因中的部分序列进行简便的菌落pcr验证阳性克隆。
图3显示为颜色筛选番茄红素菌株。
图4显示为摇瓶发酵后的结果。
其中，从左到右依次为转化到优化mva途径和番茄红素合成途径的菌株、未优化mva途径但优化番茄红素合成途径的菌株、未优化mva途径的cen.pk2-1c菌株。
具体实施方式
实施例1：
外源mva生物合成途径的构建：
1、重组同源臂的克隆：
以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，扩增rdna序列得到左同源臂nts2。
引物序列为：
seqno.1：引物1：5’>gaagtacctcccaactacttttcc<3’；
seqno.2：引物2：
5’>gttctattgtatatctcccctccgccacctacatgttaggatagtttaacggaaacgca<3’。
以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，扩增rdna序列得到右同源臂nts1。
引物序列为：
seqno.3：引物1：
5’>ttatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacggcggttgcggccatatctacca<3’；
seqno.4：引物2：5’>cgttgcaaagatgggttgaaagag<3’。
2、抗性筛选标记的克隆：
以质粒prs41h为模板，扩增获得潮霉素筛选标记tef1p-hphnt1-cyct。
引物序列为：
seqno.5：引物1：
5’>cttgtattgttctaacgatccgaccatttcatcctgaatgacatggaggcccagaatac<3’；
seqno.6：引物2：
5’>gacgggaaacggtgctttctggtagatatggccgcaaccgccgtcccaaaaccttctca<3’。
3、外源mva生物合成途径的组装：
将nts2-adh1p-erg10-sdh2t、ala1p-erg13-ilv1t、fba1p-thmg1-vps8t、tdh3p-erg12-pim1t、tys1p-erg8-rei1t、gpm1p-erg19-lrp1t和tef1p-hphnt1-cyct-nts1基因表达盒利用醋酸锂转化法转化到酿酒酵母cen.pk2-1c，利用酿酒酵母的同源重组能力将外源mva合成途径插入到酵母基因组rdna位点上。
实施例2：
番茄红素生物合成途径的构建：
1、重组同源臂的克隆：
以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，扩增delta1序列得到左同源臂delta1front。引物序列为：
seqno.7：引物1：5’>taagagataggttaattttt<3’；
seqno.8：引物2：5’>tagaatatagacgtatcagtgtgagtgcctctgttgatttatcaa
agaaggaataaaaa<3’。
以酿酒酵母cen.pk2-1c基因组为模板，扩增delta1序列得到右同源臂delta1rear。
引物序列为：
seqno.9：引物1：5’>cacaaattagagcttcaatttaattatatcagttattacttttgtc
atattatcctatt<3’；
seqno.10：引物2：5’>tgctgtaatgaacccctaag<3’。
2、从genbank基因库中查询获得大肠杆菌的ipp异构酶基因idi1基因片段，利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得idi1基因片段。
引物序列为：
seqno.11：引物1：5’>tctttcaagaagcaattaactacatcaactagaaccataatgc
aaacggaacacgtcat<3’；
seqno.12：引物2：5’>tttttttaattatctttatcttaaaatttatcagtgcgtttattta
agctgggtaaatg<3’。
3、从genbank基因库中查询获得嗜酸热硫化叶菌的saggps基因片段，利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得saggps基因片段。
引物序列为：
seqno.13：引物1：5’>tgcacaatatttcaagctataccaagcatacaatcaactatgtc
ttacttcgacaacta<3’；
seqno.14：引物2：5’>atcaaaaagaagtaagaatgagtggttagggacattaaattact
ttcttcttctgatag<3’。
4、从genbank基因库中查询获得欧文氏菌的crtb基因片段,利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得crtb基因片段。
引物序列为：
seqno.15：引物1：5’>aggatacagttctcacatcacatccgaacataaacaaccatga
acaacccatctttgtt<3’；
seqno.16：引物2：5’>gagggcgtgaatgtaagcgtgacataactaattacatgattaca
atggtctttgccaca<3’。
5、从genbank基因库中查询获得欧文氏菌的crti基因片段,利用酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，化学合成后扩增获得crti基因片段。
引物序列为：
seqno.17：引物1：5’>ttgtcatatataaccataaccaagtaatacatattcaaaatggg
taaggaacaagacca<3’；
seqno.18：引物2：5’>ttattatattatgaatcgtgaaaacggattaagctatgcttag
aaagccaaaacaccaa<3’。
6、营养缺陷型标记的克隆
以pesc-ura质粒为模板，扩增营养缺陷型标记ura基因
引物序列为
seqno.19：引物1：5’>catttaacaaaagcaaactattttaatagtagcatcctgagcttt
tcaattcaattcat<3’；
seqno.20：引物2：5’>atgcaaggattgataaaataataggataatatgacaaaagtaat
aactgatataattaa<3’。
7、番茄红素生物合成途径的组装
将delta1f-ala1p-idi1-rim15t、adh1p-saggps-hog1t、tef1p-crtb-cyc1t、fba1p-crti-tys1t和ura3-delta1r基因表达盒利用醋酸锂转化法转化到酿酒酵母工程菌w1中，利用酿酒酵母的同源重组能力将外源番茄红素生物合成途径插入到酵母基因组delta1位点上。
实施例3：
酿酒酵母工程菌的鉴定：
使用liac转化法，将构建好的基因表达盒转化酿酒酵母w1感受态细胞中，将转化后的菌株涂布到营养缺陷型固体培养基(sd/-his/-leu/-trp)上，30℃培养2-4天，用灭菌后的牙签挑取适当大小的单菌落，经菌落颜色变化(合成番茄红素的菌株显粉红色)和菌落pcr筛选获得阳性克隆菌株(附图)。
实施例4：
酿酒酵母工程菌发酵生产番茄红素的验证：
挑选实施例3筛选出的酿酒酵母工程菌，接种于含有2％的葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母粉的培养基中，30℃、220r/min振荡培养36h，然后以初始菌体浓度od600＝0.1转接于含50ml液体培养基的150ml锥形瓶中，30℃，220r/min振荡培养108h，采用改进的的谢等提取类胡萝卜素的方法，取发酵液50ml转入离心管中，8000r/min离心5min，无菌水清洗沉淀两次后加入10ml3mol/l的盐酸溶液，混合均匀后沸水浴4min，迅速放入冰水浴冷却，8000r/min离心5min，无菌水清洗沉淀两次，加入10ml丙酮，混合均匀后涡旋震荡细胞5min，最后充分萃取脂溶性代谢产物，8000r/min离心5min，上清液用0.22μm有机滤膜过滤后用高效液相色谱仪分析。结果显示，酿酒酵母工程菌发酵结束后番茄红素含量达到175.6mg/l。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。