本发明属于植物油脂提取技术领域，具体涉及一种牡丹籽油的提取方法。
背景技术：
牡丹（peoniasuffruticosaandr．）属芍药科(paeoniaceae)芍药属(paeonia)牡丹组(sectmoutandc)落叶灌木，是原产中国的一种名贵花卉。凤丹是野生种杨山牡丹的变种，广泛栽植于山东、河南、安徽、陕西、四川、重庆、湖南等地，传统以采收根皮药用为多。凤丹种子产量较高，一般能够达2250－3000kg/hm2。牡丹籽仁含油量高达30%，并且富含不饱和脂肪酸，可广泛用于医药工业、保健食品、高级化妆品、润滑油等行业，作为新木本油料资源具有重要的开发利用价值。油用牡丹栽植经济价值高，栽植后第三年开始结籽，结籽高产期为5－30年，产籽寿命可达40年以上。研究表明，牡丹籽营养价值很高，其含油量29－34%，蛋白含量为18－22%[1]。牡丹籽油是一种浅黄色或金黄色、具有牡丹籽特有香味的木本坚果油，其不饱和脂肪酸含量达到90%以上，主要为亚麻酸，亚油酸和油酸，亚麻酸含量高达31.56－66.85%。亚麻酸和亚油酸都是人体必需脂肪酸，具有多种活性功能，如降胆固醇、降血压、预防动脉粥样硬化、抗疲劳、增强免疫力等。
现阶段牡丹籽油的主要提取方法有：溶剂浸出法、压榨法、超临界co2流体萃取技术，以及亚临界溶剂萃取法，工业生产中,提取植物油脂的主要方法是压榨法和浸出法。这些方法制油,虽然出油率高,但存在设备复杂,溶剂回收和溶剂残留等问题。随着人们对食品安全意识的提高,考虑到环境、经济和安全等多方面的因素,应用水酶法提取植物油的技术得到广泛的关注及应用。与传统工艺相比,水酶法提油不仅提高了出油效率,简化工艺,还符合可持续发展的节能、环保的原则。随着工艺的发展，越来越多的不同种类的酶应用到水酶法提取的工艺中，例如：纤维素酶，果胶酶，蛋白酶等。之前单宁酶主要应用茶叶中多酚类物质的提取。据文献报道，单宁酶常用于葡萄酒和茶叶的处理过程中，但单宁酶在水酶法提取牡丹籽油的应用尚未有报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种水酶法提取牡丹籽油的方法，该方法采用单宁酶结合蛋白酶，单宁酶先处理牡丹籽粉末，再用蛋白酶进行提取。单宁酶可以一定程度的破坏植物的细胞壁结构，可以提高蛋白酶的提取效率，单宁酶水解单宁可以产生酚类物质，增加提取液中酚类物质的含量，可以更好的保护提取过程中，牡丹籽油不被氧化，增加水酶法提取的牡丹籽油的抗氧化性和营养价值。单宁酶水解鞣质可以一定程度的减少牡丹籽油中特有的涩味，改善牡丹籽油的口感。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种水酶法提取牡丹籽油的方法，包括如下步骤：
1）将牡丹籽烘干，脱去外壳，粉碎得牡丹籽粉末；
2）将牡丹籽粉末加水混匀，加入单宁酶进行酶解，酶解温度为40~50℃，ph为4~6，酶解0.5~2h后，灭酶；
3）加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解温度为50~60℃，ph为7~9,酶解时间为3~5h；
4）离心分离乳化层和油层，冷冻破乳后，离心合并两次清油，获得牡丹籽油毛油；
5）对步骤4）获得的牡丹籽油毛油碱炼后，真空旋蒸干燥，除去油相中水，得到牡丹籽油。
步骤1）中牡丹籽烘干至含水量不超过4%，粉碎的牡丹籽粉末颗粒不超过300μm。例如可以是，烘干温度50℃，烘干8-12h至含水量不超过4%；筛选目数为50目，牡丹籽粉颗粒小于300μm；
步骤2）中加入单宁酶，单宁酶用量为牡丹籽粉重量的0.1－2%,优选为0.5%。
单宁酶的酶解条件为：温度40~50℃，ph为4~6，时间为0.5~2h；进一步优选为温度45℃，ph6.0，时间为1h。酶解结束后灭酶条件为90℃灭酶5min；
步骤3）中碱性蛋白酶的酶解条件为温度50~60℃，ph为7~9，时间为3~5h，碱性蛋白酶的酶量为牡丹籽粉重量的2~3%。进一步优选为：酶解温度55℃，ph为8.5，时间为4h，用量为2.5%。
冷冻破乳条件为：冷冻温度为-20℃，时间为12~18h，解冻温度为50℃，时间为1~2h。
冷冻破乳后离心的转速为5000~8000rpm，时间为10~30min。
碱炼过程中进行一次碱炼，两次水洗的过程。碱炼温度为70~80℃,时间1h，两次水洗温度为70~80℃，时间为15min。
单宁酶（又称鞣酸酶），是一种单宁酰基水解酶，该酶对带有两个苯酚基的酸，如鞣酸具有水解作用，可以一定程度上的降解植物细胞壁，具有一定的破壁效果。本发明所述单宁酶可由霉菌，如黑曲霉、米曲霉生产，也可以从市场购买所得；单宁酶水解释放细胞内的鞣质，可以增加提取液中酚类物质含量，从而增加提取的牡丹籽油中酚类物质的含量，增加牡丹籽油的抗氧化性，减少提取过程中牡丹籽的氧化，提高牡丹籽油的营养价值，同时可以减轻牡丹籽油的涩味，改善牡丹籽油的口感。
本发明所采用的碱性蛋白酶，指在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶，碱性蛋白酶的可以从微生物提取获得，比如芽孢杆菌、链霉菌等，或者从市场上购买所得，比如诺维信公司。
ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质，比如酶，细胞受体或是微生物)的半量。ic50值可以用来衡量牡丹籽油抗氧化的能力，即能力越强，该数值越低。
根据单宁酶的作用原理，利用单宁酶对植物细胞壁有一定的破坏作用，破坏植物细胞结构，提高水酶法的提取效率，并且在水酶法提取牡丹籽油的过程中，单宁酶的使用可以增加提取液和油中酚类抗氧化物质的含量，减少牡丹籽油提取过程中营养物质的损失。
有益效果：
本发明采用单宁酶结合蛋白酶，单宁酶先处理牡丹籽粉末，再用蛋白酶进行提取。单宁酶可以一定程度的破坏植物的细胞壁结构，可以提高蛋白酶的提取效率，单宁酶水解牡丹籽仁细胞内的单宁物质，破坏细胞结构，增加蛋白酶对牡丹籽细胞的破壁效果，同时单宁酶可以水解牡丹籽粉末中残留的种皮上的单宁类物质，单宁水解的物质溶解于水中，随着离心过程为除去，减少了油脂中单宁物质的含量，改善牡丹籽油的口味，同时可以省去脱皮和去苦的工艺。增加提取液中酚类物质的含量，可以更好的保护提取过程中，牡丹籽油不被氧化，增加水酶法提取的牡丹籽油的抗氧化性和营养价值。单宁酶水解鞣质可以一定程度的减少牡丹籽油中特有的涩味，改善牡丹籽油的口感。
本发明中，牡丹籽油较单独蛋白酶的提取效率提升20%，牡丹籽油中酚类物质的含量提升了66.7%，不饱和脂肪酸含量提升5%。牡丹籽油的ic50值减少了20%，说明牡丹籽油自身的抗氧化能力大幅度提升。适合生产抗氧化活性更高，品质更好的牡丹籽油。
具体实施方式
牡丹籽来源：菏泽产5年以上凤丹种子，含油量：28.31%；
酶来源:碱性蛋白酶购自诺维信（中国）生物技术有限公司，单宁酶购自北京卫诺恩生物技术有限公司。
实施例1
将牡丹籽置于50℃的恒温烘箱中烘干8h至含水量低于4%，然后将烘干的牡丹籽加入脱壳机中脱壳，用药用粉碎机进行粗磨，将牡丹籽仁磨碎，筛选目数为50目，筛选粒径小于300μm的牡丹籽粉末。精确称取50g磨碎的牡丹籽粉末，将牡丹籽粉末加入三角瓶中，按1：5的料液比加入250ml纯净水，加入牡丹籽重量1%单宁酶催化1h，酶解温度为45℃，酶解ph为5.5，之后90℃灭酶5min，冷却至55℃后，加入牡丹籽重量2.5%碱性蛋白酶催化4h，酶解温度为55℃，酶解ph为8.5，酶解后以7000r/min离心20min，取上清游离油层和乳化层。乳化层-20℃冷冻破乳16h后，50℃解冻1h，7000rpm/min离心10min，离心后合并两次游离油。加入一定量10%氢氧化钠75℃碱炼1h，之后用无菌水75℃水洗15min，水洗重复两次，80℃旋蒸去水获得其牡丹籽油。其提取率为90%,酚类物质的含量为0.2013mg/ml,不饱和脂肪酸含量为89%,ic50为7.841mg/ml。
实施例2
将牡丹籽置于50℃的恒温烘箱中烘干8h至含水量低于4%，然后将烘干的牡丹籽加入脱壳机中脱壳，用药用粉碎机进行粗磨，将牡丹籽仁磨碎，筛选粒径小于300μm的牡丹籽粉末，精确称取50g磨碎的牡丹籽末，将牡丹籽粉末加入三角瓶中，按1：6的料液比加入300ml纯净水，加入牡丹籽重量0.5%单宁酶催化2h，酶解温度为50℃，酶解ph为5.0，之后90℃灭酶5min，冷却至60℃后，加入牡丹籽重量2%碱性蛋白酶催化5h，酶解温度为60℃，酶解ph为9.0，酶解后以7000r/min离心20min，取上清游离油层和乳化层。乳化层-20℃冷冻破乳18h后，50℃解冻1.5h，6000rpm/min离心20min，离心后合并两次游离油。加入一定量10%氢氧化钠80℃碱炼1h，之后用无菌水80℃水洗15min，水洗重复两次，80℃旋蒸去水获得其牡丹籽油。其牡丹籽油提取率为88%，酚类物质的含量为0.1927mg/ml，不饱和脂肪酸含量为87%，ic50为7.962mg/ml。
实施例3
将牡丹籽置于50℃的恒温烘箱中烘干8h至含水量低于4%，然后将烘干的牡丹籽加入脱壳机中脱壳，用药用粉碎机进行粗磨，将牡丹籽仁磨碎，筛选粒径小于300μm的牡丹籽粉末，精确称取50g磨碎的牡丹籽末，将牡丹籽粉末加入三角瓶中，按1：5的料液比加入250ml纯净水，加入牡丹籽重量1.5%单宁酶催化0.5h，酶解温度为50℃，酶解ph为6.0，之后90℃灭酶5min，冷却至55℃后，加入牡丹籽重量3%碱性蛋白酶催化3h，酶解温度为55℃，酶解ph为8.0，酶解后以7000r/min离心20min，取上清游离油层和乳化层。乳化层-20℃冷冻破乳18h后，50℃解冻2h，6500rpm/min离心15min，离心后合并两次游离油。加入一定量10%氢氧化钠70℃碱炼1h，之后用无菌水70℃水洗15min，水洗重复两次，80℃旋蒸去水获得其牡丹籽油。其牡丹籽油提取率为85%,酚类物质的含量为0.2201mg/ml,不饱和脂肪酸含量为91%.ic50为8.157mg/ml。
对比例1
将牡丹籽置于50℃的恒温烘箱中烘干8h至含水量低于4%，然后将烘干的牡丹籽加入脱壳机中脱壳，用药用粉碎机进行粗磨，将牡丹籽仁磨碎，筛选粒径小于300μm的牡丹籽粉末，精确称取50g磨碎的牡丹籽粉末，将牡丹籽粉末加入三角瓶中，按1：5的料液比加入250ml纯净水，不加酶调节ph为8.5，55℃水浴3h，7000r/min离心20min，取上清游离油层和乳化层。乳化层-20℃冷冻破乳18h后，50℃解冻2h，7000rpm/min离心15min，离心合并两次游离油，加入一定量10%氢氧化钠75℃碱炼1h，之后用无菌水75℃水洗15min，水洗重复两次，80℃旋蒸去水获得其牡丹籽油。牡丹籽油提取率为31%,酚类物质的含量为0.0578mg/ml,不饱和脂肪酸含量为80%，ic50为17.126mg/ml。
对比例2
将牡丹籽置于50℃的恒温烘箱中烘干8h至含水量低于4%，然后将烘干的牡丹籽加入脱壳机中脱壳，用药用粉碎机进行粗磨，将牡丹籽仁磨碎，筛选粒径小于300μm的牡丹籽粉末，精确称取50g磨碎的牡丹籽粉末，将牡丹籽粉末加入三角瓶中，按1：5的料液比加入250ml纯净水，调节ph为8.5，加入2.5%的诺维信碱性蛋白酶，55℃水浴4h，7000r/min离心20min，取上清游离油层和乳化层。乳化层-20℃冷冻破乳16h后，50℃解冻1h，7000rpm/min离心10min，离心合并两次游离油，加入一定量10%氢氧化钠75℃碱炼1h，之后用无菌水75℃水洗15min，水洗重复两次，80℃旋蒸去水获得其牡丹籽油。牡丹籽油提取率为75%，酚类物质的含量为0.1208mg/ml,不饱和脂肪酸含量为83%，ic50为10.385mg/ml。