本发明涉及一种n-酰基苯磺酰胺异羟肟酸类bcl-2、hdac双靶点抑制剂及其制备方法、药物组合物与医药用途，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：细胞凋亡是多细胞有机体重要的自稳机制，它能主动清除不需要或异常的细胞，对胚胎发育、维持内环境稳态以及抵抗病原体等正常生理进程发挥重要的作用。该机制的紊乱会诱发各种疾病，如癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病及神经退行性疾病等。研究表明bcl-2蛋白家族与细胞凋亡过程密切相关，而且也是治疗肿瘤的重要靶标。bcl-2家族蛋白有20多种，根据功能可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类。这些蛋白都拥有1～4个bcl-2同源结构域(bcl-2homologydomains，包括bh1，bh2，bh3和bh4)。抗凋亡蛋白bcl-2、bcl-xl、bcl-w、mcl-1、a1/bfl-1可与促凋亡蛋白结合，使肿瘤细胞逃避凋亡，其结构一般包含bh1-4四个结构域。促凋亡蛋白又分为bh3-only蛋白和多结构域蛋白两类，其中bim、bad、bid、puma和noxa等属于bh3-only蛋白，而bax和bak属于多结构域促凋亡蛋白(也称促凋亡效应器)。抗凋亡蛋白通过其疏水口袋(bh3结合口袋)与促凋亡蛋白的bh3结构域的螺旋结合。bcl-2蛋白家族成员之间通过蛋白-蛋白相互作用(protein-proteininteraction,ppi)，共同调控线粒体凋亡通路，来诱导细胞的凋亡。目前仅有venetoclax(abt-199)一个小分子抑制剂被美国fda批准上市。组蛋白去乙酰化酶(hdac)是最重要和研究最广泛的表观遗传学靶点之一。人体内组蛋白去乙酰化酶和组蛋白乙酰基转移酶(hat)协作维持正常的组蛋白乙酰化水平。其中，组蛋白去乙酰化酶通过移除组蛋白ε-n-乙酰化赖氨酸的乙酰基，使染色质结构变得紧密，抑制转录的发生。在肿瘤细胞中，组蛋白去乙酰化酶过度表达，使得组蛋白过度去乙酰化，抑制了细胞周期抑制因子p21waf1/cip1的表达，降低了肿瘤抑制因子p53的稳定性和活性，促进了肿瘤血管生成的细胞因子缺氧诱导因子-1(hif-1)和血管内皮生长因子(vegf)表达水平升高。人的组蛋白去乙酰化酶有18个亚型，分为zn2+依赖型(classi、ii、iv)和nad+依赖型(classiii)：classi(hdac1～3,8)，classii(iia,hdac4～5,7,9；iib,hdac6,10)，classii(sirt1～7)和classiv(hdac11)。各亚型在体内的组织分布及所起的作用各不相同。至今，美国fda已经批准了四个组蛋白去乙酰化酶泛抑制剂上市：vorinostat(saha)、romidepsin(fk-228)、belinostat(pxd-101)和panobinostat(lbh-589)。其中，vorinostat和3omidepsin用于皮肤t-细胞淋巴瘤的治疗，belinostat用于外周t-细胞淋巴瘤的治疗，panobinostat与其它药物联用治疗多发性骨髓瘤。但已上市的抑制剂仍有很多不足，特别是在正常剂量下对实体瘤无效且存在心脏毒性，从而导致该类药物的临床应用受到很大限制。将bcl-2抑制剂的部分结构引入以往的hdacs抑制剂中，可能会弥补组蛋白去乙酰化抑制剂的不足。因此，发展新型有效的双靶点抑制剂是抗肿瘤药物研究中具有挑战性和研究价值的课题。技术实现要素：本发明提供了一种n-酰基苯磺酰胺异羟肟酸类bcl-2、hdac双靶点抑制剂，本发明还提供该化合物的制备方法和应用。本发明的技术方案如下：一、n-酰基苯磺酰胺异羟肟酸类bcl-2、hdac双靶点抑制剂一种n-酰基苯磺酰胺异羟肟酸类bcl-2、hdac双靶点抑制剂，是具有通式i结构的化合物，以及其立体异构体、药学上可接受的盐，通式i中，r是氢、卤素、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基基团取代，c1-c12烷基、环烷基，或被以下一个或多个羟基、卤素、硝基、氰基、羧基基团取代的c1-c12烷基、环烷基，含有相同或不同的一个或多个如下取代基或没有取代的芳基、杂芳基、芳基烷基、杂芳基烷基：羟基，卤素，硝基，氰基，胍基，羧基，卤c1-c12烷基，c1-c12烷氧基，c1-c12烷基，c3-c12环烷基，芳基，杂芳基；通式i中，x为碳、氮、氧、硫；通式i中，z是芳基、杂芳基、环己基、杂环、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基；通式i中，nl是0-3，n2是0-5。根据本发明优选的，通式i中，r是氢、卤素、硝基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基基团取代；x是碳或氮；z是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基，环丙基、环丁基、环戊基、环己基；n1是0-3；n2是0-5。根据本发明，进一步优选的，上述通式i化合物是下列之一：2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-((2-(羟氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺(4a)、2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-((4-(羟基氨基甲酰基)苄基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺(4b)、1-(4-(n-(2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-硝基苯基)-n-羟基-4-甲酰胺(4c)、1-(4-(n-(2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-硝基苯基)-n-羟基-3-甲酰胺(4d)、(e)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5-，6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(3-(羟基氨基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(4e)。以上优选化合物，后面的括号内的编号是对应于下面反应路线及表1中的化合物结构的编号。发明详述本文中所用的术语和定义含义如下：“芳基”是指是指含有环系统的芳烃，如苯基或萘基，其可选地与环烷基稠合，所述环烷基优选地具有5-7个环原子，更优选具有5-6个环原子。优选的芳基含有5-15个碳原子。“杂芳基”是芳族杂环，可以是单环或双环基团。它们含有一个或多个，优选1-4个、更优选1-3个、甚至更优选1-2个杂原子，所述杂原子独立地选自o、s和n。杂芳基包括氧化的s或n，如亚磺酰基、磺酰基和三环氮的n氧化物。碳原子或氮原子是杂芳环结构的连接点，由此保持稳定的芳环。杂芳基的例子包括但不限于吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、中氮茚基、苯并[b]噻吩基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、恶唑基、噻唑基、噻吩基、异恶唑基、恶噻二唑基、异噻唑基、四唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基和吲哚基。“芳基烷基”是指c1-c6亚烷基连接的芳基。“杂芳基烷基”是指c1-c6亚烷基连接的杂芳基。“烷基(alkyl)”，单独地或联合地，是指衍生于烷烃的基团，含有1至20个碳原子，优选地含有1至12个碳原子(如果没有特别指明)。其为直链烷基或支链烷基，并且包括含有环烷基部分或者被环烷基部分中断的直链烷基或支链烷基。直链烷基或支链烷基在任何可及部位(availablepoint)连接以产生稳定的化合物。其示例包括但不限于，4-(异丙基)-环己基乙基或2-甲基-环丙基戊基。在许多实施方案中，烷基是含有1至15个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子、1至4个碳原子或1至2个碳原子的直链烷基或支链烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基和类似烷基。“亚烷基”是二价的烷烃衍生的碳原子基团，是直链或支链的，在其中，从相同的碳原子或不同的碳原子移去两个氢原子。亚烷基的例子包括但不限于-ch2-、-ch2ch2-和-ch2ch(ch3)-。“环烷基”是取代或未取代的，饱和或不饱和的环状基团，其含有碳原子和/或一个或多个杂原子。该环可以是单环或稠环，桥环或螺环的环系。每个环中的环原子数是3-8个、更优选3-6个，如环丙基、环戊基、环己基、金刚烷基和类似基团。“烷氧基”表示基团–o–烷基。“卤素”单独地或联合地，是指所有卤素，即氯(cl)、氟(f)、溴(br)或碘(i)。“药学上可接受的盐”是指通式i化合物具有疗效且无毒的盐形式。其可由任一酸性基团(如羧基)形成阴离子盐，或由任一碱性基团(如氨基)形成阳离子盐。本领域已知许多这样的盐。在任何酸性基团(如羧基)上形成的阳离子盐，或是在任何碱性基团(如氨基)上形成的阴离子盐。这些盐有许多是本领域已知的，如阳离子盐包括碱金属(如钠和钾)和碱土金属(如镁和钙)的盐以及有机盐(如铵盐)。还可通过使用相应的酸处理碱性形式的i方便地获得阴离子盐，这样的酸包括无机酸如硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、羟基乙酸、2-羟基丙酸、2-氧代丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、2-羟基-1,2,3-丙三酸、甲磺酸、乙磺酸、苯甲磺酸、4-甲基苯磺酸、环己基亚磺酸、2-羟基苯甲酸、4-氨基-2-羟基苯甲酸等。这些盐是熟练技术人员熟知的，熟练的技术人员可制备本领域知识所提供的任何盐。此外，熟练技术人员可根据溶解度、稳定性、容易制剂等因素取某种盐而舍另一种盐。这些盐的测定和最优化在熟练技术人员的经验范围内。本文所用的“立体异构体”定义了本发明化合物或其生理上的衍生物所有可能的立体异构体的形式。除非另有指示，本发明化合物的化学命名包括所有可能的立体化学形式的混合物，所属混合物包含基本结构分子的所有非对映体和对映体，以及基本纯净的本发明化合物的单个异构体形式，即其中含有低于10％，优选低于5％，特别是低于2％，最优选低于1％的其它异构体。本发明类肽化合物各种立体异构体形式均明显包含于本发明的范围内。通式i化合物还可以其它被保护的形式或衍生物的形式存在，这些形式对本领域技术人员而言是显而易见的，均应该包含于本发明的范围内。如上所述的取代基自身还可被一个或多个取代基取代。这样的取代基包括在c.hansch和a.leo,substituentconstantsforcorrelationanalysisinchemistryandbiology(1979)中列出的那些取代基。优选的取代基包括烷基，烯基，烷氧基，羟基，氧基，硝基，氨基，氨基烷基(如氨甲基等)，氰基，卤素，羧基，羰基烷氧基(如羰基乙氧基等)，硫基，芳基，环烷基，杂芳基，杂环烷基(如哌啶基，吗啉基，吡咯基等)，亚氨基，羟烷基，芳基氧基，芳基烷基及其结合。“药物组合物(pharmaceuticalcomposition)”是指含有治疗上显著量的活性药剂的制备物，其以适于给予患者的形式被制备。因此，所述制备物不含有这样量的任何一种组分或多种组分，即，适当谨慎的医疗实施者发现所述制备物不适于给予普通对象。在许多情况下，这种药物组合物是无菌制备物。本发明中所涉及的“室温”具体的温度范围是25-30℃。二、n-酰基苯磺酰胺异羟肟酸类bcl-2、hdac双靶点抑制剂的制备方法一种n-酰基苯磺酰胺异羟肟酸类bcl-2、hdac双靶点抑制剂的制备方法，包括步骤：不同取代的苯磺酰胺1a-1d在回流条件下与氨基化合物发生亲核取代反应得到中间体2a-2d，不同取代的苯磺酰胺1e通过与苯磺酰胺发生heck反应得到中间体2e，中间体2a-2e在室温条件下与酸发生酰胺缩合得到中间体3a-3e，中间体3a-3e在羟胺的甲醇溶液中反应得到目标化合物4a-4e。合成路线如下：其中，r、x、z、nl、n2的定义同上通式i所述；试剂和条件：a)各种胺，乙腈，n,n-二异丙基乙胺，82℃；b)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，二氯甲烷，室温；c)羟胺的甲醇溶液，室温；d)三乙胺，醋酸钯，三苯基膦，n,n-二甲基甲酰胺。上述所说的各种胺为甘氨酸甲酯、4-(氨基甲基)苯甲酸甲酯、4-哌啶羧酸甲酯、3-哌啶羧酸乙酯。合成路线中目标化合物的结构式如下表1所示：表1目标化合物的结构式根据本发明优选的，本发明化合物的制备方法以2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-((2-(羟氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺(4a)为例，具体制备步骤如下：(1)(2-硝基-4-氨磺酰基苯基)甘氨酸甲酯(2a)的合成将700mg4-氯-3-硝基苯磺酰氯溶于20ml乙腈中，分别加入800mg甘氨酸甲酯盐酸盐和1.64gdiea，于80℃反应10小时；反应结束后冷却至室温用乙酸乙酯稀释，有机相用1m柠檬酸和饱和食盐水分别洗两次，无水硫酸镁干燥，旋干；经硅胶柱纯化得黄色固体920mg，收率76.7％；(2)(4-(n-(2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3-1,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-硝基苯基)甘氨酸乙酯(3a)的合成将260mg2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸溶于10ml二氯甲烷中，分别加入110mgdmap、140mgedci和130mg2a；室温条件下反应12小时，反应结束后分别用1m柠檬酸和饱和食盐水洗两次，有机相用无水硫酸镁干燥，旋干，经硅胶柱纯化得黄色固体180mg，收率47.4％；(3)2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-((2-(羟氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺(4a)的合成羟胺甲醇溶液的制备：溶液a：将4.67g干燥好的盐酸羟胺溶于24ml甲醇中即得；溶液b：将5.61g氢氧化钾溶于14ml甲醇中即得；0℃时将溶液b滴加到溶液a中，滴加过程中不断搅拌，滴加结束后0℃继续反应30min后，过滤除掉固体得到无色透明的羟胺甲醇溶液，干燥备用；向30mg化合物3a中加入6ml羟胺甲醇溶液，室温下搅拌0.5h；旋除大部分有机溶剂，加入少量水，用2m稀盐酸调节ph至5-7，过滤；滤饼用水洗涤，干燥得到目标化合物4a，产率84.8％。所述化合物的具体操作步骤将在实施例中将加以详细说明。本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如t.greene,protectinggroupsinorganicsynthesis.三、n-酰基苯磺酰胺异羟肟酸类bcl-2、hdac双靶点抑制剂的应用活性筛选实验显示本发明化合物具有抗组蛋白去乙酰化酶及抑制bcl-2蛋白的活性，因此，本发明还提供了该系列化合物在制备预防或治疗因组蛋白去乙酰化酶表达异常和bcl-2蛋白表达异常导致的相关哺乳动物疾病药物中的应用。此外，本发明还包括一种适于口服给予哺乳动物的药物组合物，包含上述通式i的任一化合物，和药学上可接受载体，任选包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。此外，本发明还包括一种适于胃肠外给予哺乳动物的药物组合物，包含上述通式i的任一化合物，和药学上可接受载体，任选包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。应用荧光偏振技术对bcl-2家族蛋白小分子抑制剂的测试实验中，采用的具体测量体系中，荧光标记分子为5-fam标记的bid-bh3多肽，能够与bcl-2家族蛋白(bcl-xl，bcl-2和mcl-1)发生特异性结合，其解离常数(kd)在30-60nm左右，二者结合的结果会产生较高的极化值。如果待测化合物也能够与这些蛋白特异性结合，则会与荧光标记多肽发生竞争，抑制其与蛋白的结合，从而导致极化值降低。将加入待测化合物产生的极化值与阴性对照和阳性对照比较，如果极化值相对阴性对照的降低水平达到阴性与阳性值之差的一半左右，则认为待测化合物有明显活性，可以进一步准确测定其ic50值，进而导出其竞争性抑制常数ki。体外抑酶实验中，含乙酰化赖氨酸侧链的寡肽底物(colordelystmsubstrate)在hdac的作用下，发生去乙酰化作用。去乙酰化后的产物敏感性增加，在乙酰化反应检测试剂(colordelystmdeveloper)诱导下，在405nm处产生吸光度值，与待测化合物的hdacs抑制作用成比例。通过测定对照组和待测化合物组的405nm吸光度，可计算待测化合物的抑制率并求得ic50值。体外抑酶实验表明，本发明中的化合物对于bcl-2有较强抑制活性和选择性，所有化合物的活性与阳性对照abt-263相当。该类化合物，有很大的开发前景，并可用于指导发现新型高效的bcl-2，hdac双靶点抑制剂。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。实施例1.2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-((2-(羟氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺(4a)的合成(2-硝基-4-氨磺酰基苯基)甘氨酸甲酯(2a)的合成将700mg4-氯-3-硝基苯磺酰氯溶于20ml乙腈中，分别加入甘氨酸甲酯盐酸盐800mg和diea1.64g，于82℃反应10小时；反应结束后冷却至室温用乙酸乙酯稀释，有机相用1m柠檬酸和饱和食盐水分别洗两次，无水硫酸镁干燥，旋干。经硅胶柱纯化得黄色固体920mg，收率76.7％。1hnmr(400mhz,dmso)δ7.93(d,j＝8.4hz,2h),7.84(d,j＝8.4hz,2h),7.72(d,j＝16.1hz,1h),7.46(s,2h),6.79(d,j＝16.1hz,1h),3.75(s,3h).化合物2b-2d的合成参照2a。(4-(n-(2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3-1,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-硝基苯基)甘氨酸乙酯(3a)的合成将2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸260mg溶于10ml二氯甲烷中，分别加入dmap110mg、edci140mg和2a130mg。室温条件下反应12小时。反应结束后分别用1m柠檬酸和饱和食盐水洗两次。有机相用无水硫酸镁干燥，旋干。经硅胶柱纯化得黄色固体180mg，收率47.4％。1hnmr(400mhz,dmso)δ11.68(s,1h),11.40(s,1h),8.78(t,j＝5.0hz,1h),8.59(d,j＝1.9hz,1h),8.04(d,j＝2.4hz,1h),7.87–7.81(m,1h),7.57–7.53(m,1h),7.49(dd,j＝5.8,2.8hz,2h),7.34(d,j＝8.3hz,2h),7.04(d,j＝8.3hz,2h),6.99(d,j＝9.2hz,1h),6.67(dd,j＝8.9,1.5hz,1h),6.43–6.35(m,1h),6.18(d,j＝1.5hz,1h),4.33(d,j＝5.8hz,2h),3.72(s,3h),3.12–3.02(m,4h),2.76(s,2h),2.19(m,4h),2.16–2.11(m,2h)1.95(s,2h),1.38(t,j＝6.1hz,2h),0.92(s,6h).化合物3b-3e的合成参照3a。2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-((2-(羟氨基)-2-氧代乙基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺(4a)的合成羟胺甲醇溶液的制备：溶液a：将4.67g干燥好的盐酸羟胺溶于24ml甲醇中即得；溶液b：将5.61g氢氧化钾溶于14ml甲醇中即得；0℃时将溶液b滴加到溶液a中，滴加过程中不断搅拌，滴加结束后0℃继续反应30min后，过滤除掉固体得到无色透明的羟胺甲醇溶液，干燥备用；向30mg化合物3a中加入6ml羟胺甲醇溶液，室温下搅拌0.5h；旋蒸除掉大部分有机溶剂，加入少量水，用2m稀盐酸调节ph至5-7，过滤；滤饼用水洗涤，干燥得到目标化合物4a，产率84.8％。1hnmr(400mhz,dmso)δ11.73(s,1h),10.86(s,1h),10.06(s,1h),9.02(s,1h),8.81(t,j＝4.9hz,1h),8.59(s,1h),8.05(d,j＝2.1hz,1h),7.88–7.81(m,1h),7.56(s,1h),7.50(d,j＝8.7hz,2h),7.36(d,j＝8.0hz,2h),7.06(d,j＝7.9hz,2h),6.87(d,j＝9.2hz,1h),6.69(d,j＝8.5hz,1h),6.40(s,1h),6.21(s,1h),4.05(d,j＝5.2hz,2h),3.19(m,4h),2.98(s,2h),2.42(m,4h),2.21(s,2h),1.97(s,2h),1.40(s,2h),0.93(s,6h).化合物4b-4e的合成参照4a。实施例2.2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-((4-(羟基氨基甲酰基)苄基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰(4b)中间体和目标化合物制备方法如实施例1。产率：82.2％。1hnmr(400mhz,dmso)δ10.63(s,1h),10.07(s,1h),9.20(dd,j＝12.5,6.5hz,1h),8.60(s,1h),8.04(d,j＝2.0hz,1h),7.91(d,j＝7.9hz,1h),7.72(d,j＝7.1hz,2h),7.53(d,j＝6.1hz,2h),7.48(dd,j＝8.2,3.3hz,2h),7.43(d,j＝7.8hz,1h),7.36(d,j＝8.0hz,2h),7.06(d,j＝7.9hz,2h),6.91–6.80(m,1h),6.72–6.63(m,1h),6.43–6.35(m,1h),6.19(s,1h),4.83–4.66(m,2h),3.25–3.12(m,4h),2.99(s,2h),2.40(dd,j＝28.8,5.5hz,3h),2.21(s,2h),1.97(s,2h),1.40(t,j＝4.6hz,2h),0.93(s,6h).实施例3.1-(4-(n-(2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-硝基苯基)-n-羟基-4-甲酰胺(4c)中间体和目标化合物制备方法如实施例1。产率：81.5％。1hnmr(400mhz,dmso)δ11.76(s,1h),10.56(s,2h),10.10(s,2h),8.77(s,1h),8.27(d,j＝1.6hz,1h),8.06(d,j＝2.1hz,1h),7.84(dd,j＝8.8,1.5hz,1h),7.57(d,j＝1.9hz,1h),7.55–7.49(m,2h),7.37(d,j＝8.1hz,2h),7.26(d,j＝9.0hz,1h),7.07(d,j＝8.1hz,2h),6.69(d,j＝9.1hz,1h),6.42(s,1h),6.21(s,1h),3.27(s,4h),3.14(s,2h),2.98(dd,j＝8.1,5.9hz,2h),2.68–2.54(m,3h),2.26(d,j＝0.6hz,3h),1.98(s,2h),1.70(d,j＝0.8hz,4h),1.41(t,j＝5.7hz,2h),0.93(s,6h).实施例4.1-(4-(n-(2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)氨磺酰基)-2-硝基苯基)-n-羟基-3-甲酰胺(4d)中间体和目标化合物制备方法如实施例1。产率：80.1％。1hnmr(400mhz,dmso)δ11.74(s,1h),10.55(s,1h),10.04(s,1h),8.81(s,1h),8.26(d,j＝1.8hz,1h),8.06(d,j＝2.3hz,1h),7.84(dd,j＝8.9,1.7hz,1h),7.57(d,j＝2.1hz,1h),7.52(d,j＝8.6hz,2h),7.36(d,j＝8.2hz,2h),7.29(d,j＝9.0hz,1h),7.05(d,j＝8.2hz,2h),6.74–6.63(m,1h),6.42(d,j＝1.0hz,1h),6.19(s,1h),3.27(d,j＝12.5hz,2h),3.17(s,4h),3.12–3.01(m,2h),2.95(dd,j＝14.7,6.8hz,2h),2.47–2.32(m,4h),2.25–2.14(m,2h),1.97(s,2h),1.81(d,j＝6.8hz,1h),1.76–1.66(m,1h),1.59(ddd,j＝35.1,18.1,6.9hz,2h),1.40(t,j＝5.9hz,2h),0.93(s,6h).实施例5.(e)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((4'-氯-5,5-二甲基-3,4,5,6-四氢-[1,1'-联苯]-2-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(3-(羟基氨基)-3-氧代丙-1-烯-1-基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(4e)中间体和目标化合物制备方法如实施例1。产率：84.1％。1hnmr(400mhz,dmso)δ11.81(s,1h),11.06(s,1h),10.88(s,1h),10.34(s,5h),10.12(d,j＝1.2hz,1h),8.07(d,j＝0.5hz,1h),7.86(d,j＝7.9hz,2h),7.66(d,j＝7.8hz,1h),7.61–7.44(m,4h),7.39(d,j＝7.9hz,2h),7.10(d,j＝7.9hz,2h),6.72(d,j＝8.3hz,1h),6.64(s,1h),6.43(s,1h),6.27(s,1h),3.64(dd,j＝14.2,11.6hz,4h),3.37–3.16(m,4h),2.83–2.59(m,2h),2.37(s,2h),2.01(s,2h),1.50–1.37(m,2h),0.94(s,6h).实验例1.目标化合物对bcl-2蛋白的活性评价试验实验试剂：n端用5-fam进行了荧光标记的bid-bh3多肽(5-fam-qediirniarhlaqvgdsmdrsippg)，溶于1×pbs；测试缓冲液：1×pbs；校正溶液：1nmfluorescein，10mmnaoh。实验仪器：tecaninfinitef200pro多功能酶标仪。实验步骤：1)在测试缓冲液中加入靶蛋白和待测小分子化合物，混匀后室温避光孵育30min。再加入荧光标记的bidbh3多肽，使各溶液的总体积均为200μl，混匀后室温避光孵育20min。2)将上述溶液及校正溶液各取60μl转移至黑色384孔板中(平行三组)，立即在酶标仪上进行荧光偏振的检测，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，将校正溶液的荧光偏振值定为20mp。3)所有化合物首先在三个典型浓度下(1μm、10μm、50μm)进行初筛，每个化合物在同一块板上做3个复孔的平行测定，极化值的测定结果取平均值。根据阴性对照、阳性对照以及受测化合物极化值的测定结果推算抑制率。测定中通常采用的靶蛋白浓度为300～500nm，荧光标记多肽采用5-fam-bid-bh3多肽，阳性化合物采用gossypol或abt-263。如果测试结果显示化合物在50μm浓度下抑制率大于50％，而且其抑制率在测试的三个浓度下表现出明显的剂量依赖关系，则认为该化合物与靶蛋白具有特异性结合，需要进一步测定比较准确的ic50数值。4)对在初筛中显示出明显活性的化合物，在7个不同浓度下(1nm,10nm,100nm,1μm,10μm,50μm,100μm)进行完整结合曲线的测定。每个化合物均在同一块板上做3个复孔的平行测定，极化值测定结果取平均值。用graphpadprism软件处理数据和做图，得出该化合物的ic50值。根据测量中所使用的蛋白总浓度、荧光多肽的总浓度、蛋白-多肽复合物的解离常数以及检测化合物的ic50值，使用下列文献中的计算方法得出检测化合物的竞争性抑制常数ki。实验结果见表2。表2目标化合物对bcl-2体外抑制实验结果编号ic50(nm)aabt-263<104a<104b<104c<104d<104e<10a表中数值为三次试验结果的平均值结论：从表中可知，该系列5个化合物对bcl-2蛋白的抑制效果与阳性对照药相当。试验结果对于进一步开发活性更高的bcl-2小分子抑制剂有很重要的指导意义。实验例2.目标化合物对组蛋白去乙酰化酶抑制试验(invitro)术语说明：saha：伏立诺他。mm：毫摩尔/升。hela：宫颈癌细胞。colordelystmsubstrate：含乙酰化赖氨酸侧链的寡肽底物。colordelysdeveloper：去乙酰化反应检测试剂。hdacassaybuffer：缓冲液，ph8.0，含50mmtris-hcl,137mmnacl,2.7mmkcl,1mmmgcl2。trichostatina：hdac抑制剂。ic50：半数抑制浓度。1.[材料]目标化合物和阳性对照saha的储备液(50mm，溶于二甲基亚砜)；酶(hela细胞提取物，主要成分是hdac1和hdac2)；colordelystmsubstrate；colordelysdeveloper(developer)；hdacassaybuffer(buffer)；trichostatina(tsa，0.2mm，溶于二甲基亚砜)；96孔板；thermovarioskanflash全波长多功能酶标仪。2.[方法]按照试剂盒的使用说明书进行实验准备：1)稀释酶：将hela细胞提取物与buffer按照1:2的体积比进行稀释；2)化合物稀释：用buffer将化合物(待测化合物以及阳性对照saha)稀释成5x终浓度；3)colordelystmsubstrate：用buffer将底物稀释50倍(1mm，2x终浓度)；4)colordelystmdeveloper：该检测试剂在使用的30min内配置。首先，用预冷的buffer将colordelystmdeveloper稀释20倍(如，50μl加950μl的buffer)；然后用新鲜配置的developer溶液将tsa稀释100倍(如10μl稀释成1ml，此时tsa浓度为2μm，2x终浓度，表示加到反应体系后的终浓度为1μm)。96孔板中，每孔分别加入15μl稀释后的酶和10μl待测化合物，37℃孵育5min后加入25μl的底物(空白孔不加酶及化合物，加buffer代替；对照孔化合物用buffer代替)。将96孔板置于37℃摇床中孵育30min。然后每孔加入50μl现配置的colordelystmdeveloper，继续孵育。30min后，酶标仪上测定405nm条件下的紫外吸收，通过测定对照组和目标化合物组的405nm吸收度，可计算目标化合物的抑制率并求得ic50值。实验结果见表3。表3目标化合物对hdac体外抑制实验结果编号ic50(μm)asaha0.3194a>14b>14c>14d>14e>1a表中数值为三次试验结果的平均值结论：从表中可以看出，目标化合物的活性并不是很理想，但其试验结果对于进一步开发活性更高的bcl-2、hdacs双靶点抑制剂有很好的指导意义。当前第1页12